Weefsel Bepaling Met behulp van de Animal Cap Transplantatie (ACT) Assay in Xenopus laevis</em
Summary
Animal caps overexpressie genproduct (s) worden getransplanteerd om de flank van de ontwikkeling van<em> Xenopus laevis</em> Embryo's om vast te stellen of weefsel wordt bepaald.
Abstract
Veel eiwitten spelen een dubbele rol in de embryonale ontwikkeling. Degenen die lot van de cel bepalen regelen in een specifiek weefsel kan ook invloed hebben op de ontwikkeling van een groter gebied van het embryo. Dit maakt de definitie van zijn rol in een bepaald weefsel moeilijk te analyseren. Bijvoorbeeld:<em> Noggin</em> Overexpressie in<em> Xenopus laevis</em> Embryo's zorgt ervoor dat de expansie van de gehele voorste regio, waaronder het oog<sup> 1,2</sup>. Uit dit resultaat, is het niet bekend of Noggin speelt een directe rol in het oog van vaststelling of die door het veroorzaken van een uitbreiding van zenuwweefsel, indirect Noggin oog vorming beïnvloedt. Na dit complex fenotype maakt studeren in het oog specifieke rol in het lot van de cel bepaling moeilijk te analyseren. We hebben een test die dit probleem ondervangt. Profiterend van de pluripotente aard van de<em> Xenopus laevis</em> Dier cap<sup> 3</sup>, Hebben we een test van het vermogen van genproduct (s) te testen, zoals<em> Noggin</em> Of het oog veld transcriptiefactoren (EFTFs), om caps te zetten in het bijzonder weefsel of celtypes door het transplanteren van dit weefsel op de zijkant van het embryo<sup> 4</sup>. Hoewel we hebben gevonden of Noggin eiwit behandeling of een verzameling van transcriptiefactoren kan het netvlies lot van de cel bepalen in dierlijke caps, kan deze procedure worden gebruikt om de gen-product (en) die betrokken zijn bij het specificeren van andere weefsels en te identificeren.
Protocol
Discussion
In deze video, hebben we aangetoond onze versie van de klassieke technieken die worden gebruikt door Xenopus biologen, die we herschikt om het dier dop transplantatie assay te creëren. Bij kamertemperatuur, Xenopus embryo's ontwikkelen zich zeer snel door stadia 9 en 15. Door ze bij 14 ° C, de ontwikkeling van het embryo wordt vertraagd en nog veel meer transplantaties kunnen worden uitgevoerd in een experiment. Als het nodig is om de embryo's groeien naar oudere stadia (> 42/43), dan rade…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van onderzoek naar Blindness (Career Development Awards voor MEZ en ASV en een onbeperkte subsidie aan de afdeling Oogheelkunde), de E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ en ASV) en het National Eye Institute / NIH (MEZ voorkomen , subsidies R01EY015748 en R01EY017964).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems/Ambion | AM1340 | ||
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc | 27-30-1 | ||
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instruments, Inc. | P-97 | ||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher | BW17-528Z | ||
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher | NC9644388 | ||
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | ||
| human chorionic gonadotropin | Intervet | 22219 | ||
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | ||
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher | 11-680-21 | ||
| Transfer pipette | Krackeler | 6290-20635A | ||
| Dumostar #5 Forceps | Fisher | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
