רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em
Summary
בעלי חיים כמוסות overexpressing הגן המוצר (ים) שנמצאים מושתלים האגף לפיתוח<em> Xenopus laevis</em> עוברים על מנת לקבוע אם רקמת נקבע.
Abstract
חלבונים רבים משחקים תפקיד כפול ההתפתחות העוברית. אלה המווסתים את גורל קביעת תא ברקמה מסוימת יכול להשפיע גם על פיתוח של אזור גדול יותר של העובר. זה הופך את הגדרת תפקידה רקמה מסוימת קשה לנתח. לדוגמה,<em> Noggin</em> Overexpression ב<em> Xenopus laevis</em> עוברים גורמת להרחבת האזור הקדמי כולו, כולל העין<sup> 1,2</sup>. מתוך תוצאה זו, לא ידוע אם noggin ממלאת תפקיד ישיר בקביעת העין או על ידי גרימת הרחבה של רקמה עצבית, noggin משפיע בעקיפין היווצרות העין. אחרי זה פנוטיפ מורכבים עושה לומד תפקיד עין ספציפי שלה בקביעת גורל התא קשה לנתח. פיתחנו assay כי מתגבר על הבעיה הזו. ניצול של הטבע pluripotent של<em> Xenopus laevis</em> בעלי חיים כובע<sup> 3</sup>, פיתחנו assay לבחון את היכולת של המוצר גן (ים), כמו<em> Noggin</em> או את שדה עין גורמי תעתוק (EFTFs), להפוך כמוסות לרקמה מסוימת או סוגי תאים ידי השתלת רקמה זו על הצד של העובר<sup> 4</sup>. אמנם מצאנו גם חלבון noggin טיפול או אוסף של גורמי שעתוק יכולים לקבוע את גורל התא רשתית כמוסות חיה, הליך זה יכול לשמש כדי לזהות מוצר הגן (ים) מעורב ציון ברקמות אחרות.
Protocol
Discussion
בסרטון זה, יש לנו הפגינו הגרסה שלנו של טכניקות קלאסיות בשימוש על ידי ביולוגים Xenopus, שאנו מחדש ליצור את כובע חיה assay להשתלה. בטמפרטורת החדר, עוברים Xenopus לפתח מהר מאוד שלבים 9 ו -15. על ידי הצבת אותם על 14 מעלות צלזיוס, התפתחות העובר הוא האט השתלות רבות יותר ניתן לבצע…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר כדי למנוע עיוורון (פיתוח קריירה פרסים MEZ ו ASV ו מענק חופשית מחלקת עיניים), את מטילדה א זיגלר קרן (MEZ ו ASV) ואת העין לאומי / NIH (MEZ , מענקים R01EY015748 ו R01EY017964).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems/Ambion | AM1340 | ||
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc | 27-30-1 | ||
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instruments, Inc. | P-97 | ||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher | BW17-528Z | ||
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher | NC9644388 | ||
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | ||
| human chorionic gonadotropin | Intervet | 22219 | ||
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | ||
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher | 11-680-21 | ||
| Transfer pipette | Krackeler | 6290-20635A | ||
| Dumostar #5 Forceps | Fisher | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
