Summary

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Published: May 16, 2010
doi:

Summary

Superexpressão de genes animais tampas de produto (s) são transplantadas para o flanco de desenvolver<em> Xenopus laevis</em> Embriões, a fim de estabelecer se o tecido é determinada.

Abstract

Muitas proteínas desempenham um duplo papel no desenvolvimento embrionário. Aqueles que regulam a determinação destino celular em um determinado tecido também pode afetar o desenvolvimento de uma região maior do embrião. Isso faz com que definir seu papel em um tecido especial difíceis de analisar. Por exemplo,<em> Noggin</em> Superexpressão em<em> Xenopus laevis</em> Embriões provoca a expansão de toda a região anterior, incluindo o olho<sup> 1,2</sup>. A partir deste resultado, não se sabe se Noggin desempenha um papel direto na determinação olho ou que, causando uma expansão do tecido neural, Noggin indiretamente afeta a formação do olho. Tendo este fenótipo complexo faz estudar o seu papel específico olho na determinação destino celular difícil de analisar. Temos desenvolvido um ensaio que supera este problema. Aproveitando-se da natureza pluripotentes da<em> Xenopus laevis</em> Animal cap<sup> 3</sup>, Temos desenvolvido um ensaio para testar a capacidade do produto gene (s), como<em> Noggin</em> Ou o olho fatores de transcrição de campo (EFTFs), para transformar as tampas em tecido especial ou tipos de células através do transplante desse tecido para o lado do embrião<sup> 4</sup>. Embora tenhamos encontrado um ou outro tratamento de proteína Noggin ou um conjunto de fatores de transcrição pode determinar o destino de células da retina em tampas de animal, este procedimento poderia ser usado para identificar produto do gene (s) envolvidos na especificação outros tecidos também.

Protocol

Parte I. Set-up para o ensaio ACT Gerar RNA tampado para injeção, como sugerido pelo fabricante, usando seus fenol: clorofórmio método de purificação (por exemplo, mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA que codifica uma proteína fluorescente é utilizado como marcador. Transcrevemos ou proteína fluorescente amarela (YFP) ou mCherry 5 cDNA, que está em um vetor de expressão pCS2 +. Puxe tubos de vidro de borosilicato capilar para formar dicas de vidr…

Discussion

Neste vídeo, demonstramos a nossa versão de técnicas clássicas utilizadas por biólogos Xenopus, que reorganizados para criar o animal ensaio transplante cap. À temperatura ambiente, os embriões Xenopus desenvolver muito rapidamente através de estágios 9 e 15. Colocando-os a 14 ° C, o desenvolvimento do embrião é lento e transplantes muito mais pode ser realizado em um experimento. Se for necessário para crescer os embriões para estágios mais velhos (> 42/43), então recomendamos o uso…

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por doações da Pesquisa para prevenir a cegueira (prémios de carreira para o Desenvolvimento MEZ e ASV e uma subvenção de irrestrito ao Departamento de Oftalmologia), o E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ e ASV) e do National Eye Institute / NIH (MEZ , subvenções e R01EY015748 R01EY017964).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
mMessage mMachine SP6 Kit   Applied Biosystems/Ambion AM1340  
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)   FHC, Inc 27-30-1  
Sutter Micropipette Puller   Sutter Instruments, Inc. P-97  
Gentamicin sulfate [50 mg/ml]   Fisher BW17-528Z  
Sylgard/elastomer Kit 1.1lb   Fisher NC9644388  
60 x 15 mm polystyrene petri dish   USA Scientific 8609-0160  
human chorionic gonadotropin   Intervet 22219  
Pico-Injector Microinjection Systems   Harvard Apparatus 650003  
Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator   Fisher 11-680-21  
Transfer pipette   Krackeler 6290-20635A  
Dumostar #5 Forceps   Fisher 11295-10  

References

  1. Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  2. Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
  3. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , (1999).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
  5. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
  6. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
  7. Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).

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Cite This Article
Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).

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