Animal caps overexpressie genproduct (s) worden getransplanteerd om de flank van de ontwikkeling van<em> Xenopus laevis</em> Embryo's om vast te stellen of weefsel wordt bepaald.
Abstract
Veel eiwitten spelen een dubbele rol in de embryonale ontwikkeling. Degenen die lot van de cel bepalen regelen in een specifiek weefsel kan ook invloed hebben op de ontwikkeling van een groter gebied van het embryo. Dit maakt de definitie van zijn rol in een bepaald weefsel moeilijk te analyseren. Bijvoorbeeld:<em> Noggin</em> Overexpressie in<em> Xenopus laevis</em> Embryo's zorgt ervoor dat de expansie van de gehele voorste regio, waaronder het oog<sup> 1,2</sup>. Uit dit resultaat, is het niet bekend of Noggin speelt een directe rol in het oog van vaststelling of die door het veroorzaken van een uitbreiding van zenuwweefsel, indirect Noggin oog vorming beïnvloedt. Na dit complex fenotype maakt studeren in het oog specifieke rol in het lot van de cel bepaling moeilijk te analyseren. We hebben een test die dit probleem ondervangt. Profiterend van de pluripotente aard van de<em> Xenopus laevis</em> Dier cap<sup> 3</sup>, Hebben we een test van het vermogen van genproduct (s) te testen, zoals<em> Noggin</em> Of het oog veld transcriptiefactoren (EFTFs), om caps te zetten in het bijzonder weefsel of celtypes door het transplanteren van dit weefsel op de zijkant van het embryo<sup> 4</sup>. Hoewel we hebben gevonden of Noggin eiwit behandeling of een verzameling van transcriptiefactoren kan het netvlies lot van de cel bepalen in dierlijke caps, kan deze procedure worden gebruikt om de gen-product (en) die betrokken zijn bij het specificeren van andere weefsels en te identificeren.
Protocol
Deel I. Set-up voor de ACT-test Genereer afgetopt RNA voor injectie zoals voorgesteld door de fabrikant, met behulp van hun fenol: chloroform zuiveringsmethode (bijvoorbeeld mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA dat codeert voor een fluorescerend eiwit wordt gebruikt als een tracer. We overschrijven ofwel geel fluorescerend eiwit (YFP) of mCherry 5 cDNA, die in een pCS2 + expressievector. Trek borosilicaatglas capillaire buizen aan taps toelopende glas tips …
Discussion
In deze video, hebben we aangetoond onze versie van de klassieke technieken die worden gebruikt door Xenopus biologen, die we herschikt om het dier dop transplantatie assay te creëren. Bij kamertemperatuur, Xenopus embryo's ontwikkelen zich zeer snel door stadia 9 en 15. Door ze bij 14 ° C, de ontwikkeling van het embryo wordt vertraagd en nog veel meer transplantaties kunnen worden uitgevoerd in een experiment. Als het nodig is om de embryo's groeien naar oudere stadia (> 42/43), dan rade…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van onderzoek naar Blindness (Career Development Awards voor MEZ en ASV en een onbeperkte subsidie aan de afdeling Oogheelkunde), de E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ en ASV) en het National Eye Institute / NIH (MEZ voorkomen , subsidies R01EY015748 en R01EY017964).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
mMessage mMachine SP6 Kit
Applied Biosystems/Ambion
AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)
Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).