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Biology

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis doi: 10.3791/1932 Published: May 16, 2010

Summary

Superexpressão de genes animais tampas de produto (s) são transplantadas para o flanco de desenvolver

Abstract

Muitas proteínas desempenham um duplo papel no desenvolvimento embrionário. Aqueles que regulam a determinação destino celular em um determinado tecido também pode afetar o desenvolvimento de uma região maior do embrião. Isso faz com que definir seu papel em um tecido especial difíceis de analisar. Por exemplo,

Protocol

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Parte I. Set-up para o ensaio ACT

  1. Gerar RNA tampado para injeção, como sugerido pelo fabricante, usando seus fenol: clorofórmio método de purificação (por exemplo, mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA que codifica uma proteína fluorescente é utilizado como marcador. Transcrevemos ou proteína fluorescente amarela (YFP) ou mCherry 5 cDNA, que está em um vetor de expressão pCS2 +.
  2. Puxe tubos de vidro de borosilicato capilar para formar dicas de vidro cônico utilizando um extrator micropipeta. Usamos Sutter Micropipeta Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), como descrito anteriormente 6.
  3. Faça soluções estéreis na Tabela 1 a partir de um 10 X Marc Modificado Ringer (MMR) solução estoque (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 HEPES mM; 1 M NaCl; ajustado para pH 7,5, autoclavado e armazenado a RT).
  4. Isolar os testículos de um sapo macho e armazenar o tecido a 4 ° C em uma solução estéril de 1X MMR / gentamicina (50 mcg / ml de sulfato de gentamicina; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Isto pode ser feito até uma semana antes do início do experimento, mas é perde a sua eficácia ao longo do tempo.
  5. Solução de postura (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma base, 2,62 mM NaHCO 3 e 2,75 mM MgSO 4, ajustada para pH 7,6) pode ser feita como um estoque de 8X, o que pode ser armazenado a 4 ° C por até duas semanas. Nota: cuidado com a contaminação nesta solução, pois isso afetará a qualidade de seus ovos.
  6. Gerar placas de injeção. Para fazer isso, derreta agarose 1% em 0.4X MMR no microondas, adicione ~ 6 mL de solução de agarose derretida em 60 placas mm, gentilmente unroll um molde de elastômero (Figura 1) no topo da solução para evitar bolhas e deixe esfriar por cerca de 20 minutos em temperatura ambiente. Para determinar o número necessário, considerar o número de condições experimentais (por exemplo, 1, YFP, 2, YFP Noggin +) eo número de embriões transplantados anfitrião necessário. Para nossos experimentos, nós geramos pelo menos 20 embriões anfitrião transplantadas para cada condição experimental. Em 18-19 ° C, os embriões serão no estádio de 15 para cerca de uma hora. Se demorar uma hora para realizar 20 transplantes, em seguida, dois momentos de fertilização são necessários, assumindo os embriões anfitrião aceitar todos os transplantes. Portanto, quatro pratos de injeção serão necessários (2 x 2 condições exp momentos de fertilização = 4). Armazenar as placas a 4 ° C por até uma semana.
  7. Gerar placas de isolamento usando boné de agarose 1% + 0.7X MMR com moldes como para a placa de injeção. Faça o mesmo número de isolamento cap como placas de injeção de mais um ponto extra por tempo de fertilização (4 + 2 pontos de tempo de fertilização = 6).
  8. Injetar fêmeas com 500 unidades gonadotrofina coriônica humana no final do dia, no dia anterior microinjeção. Fêmeas loja em 16-18 ° C durante a noite.

Parte II. RNA microinjeção de embriões Xenopus laevis

A. Preparação para a microinjeção

  1. Retire do sexo feminino hormonalmente induzido e colocá-los em tanques individuais contendo solução de 1X postura (ELS). Nota: nós não usamos ovos que foram na ELS mais de duas horas como a qualidade dos ovos é reduzida. Portanto, cerca de uma hora antes da fertilização in vitro, descartamos todos os ovos do tanque de modo que apenas ovos recém estabelecidos são coletados.
  2. Prepare a agulha para a microinjeção cortando fora a ponta para obter um diâmetro de 25-35 mM. Coloque a agulha na picoinjector e calibrá-lo para que ele dispensa 10 nL por injeção.
  3. Definir uma incubadora a 14 ° C.
  4. Uma vez que as fêmeas colocaram ovos por cerca de uma hora, retire os ovos do tanque usando uma pipeta e colocá-los em 60 milímetros pratos de Petri. Remover o ELS muito com os ovos quanto possível e substituí-1X MMR. Os ovos podem ser fertilizados imediatamente ou permanecer no MMR 1X por até uma hora. Para o ensaio de transplante, é melhor para fertilizar dois pratos, 80% de sua capacidade de uma única camada de ovos em até três lotes separados em cerca de 11 horas da manhã, meio-dia e 01:00. Após a injeção, eles serão colocados a 14 ° C para que possam crescer para os estágios desejado para o isolamento da tampa (estágio 8,5-9) e transplante (estágio 15; consulte a Parte I, n º 6 acima).
  5. Para verificar a qualidade dos testículos, realizamos uma fertilização da manhã (~ 08:00), o que nos permite extrair os testículos de outro macho, se o esperma do primeiro não é viável. Nota: nós homogeneizar ~ 0,25 testículos em 1 mL 1X MMR e adicionar cerca de 5 a 7 gotas por placa de oócitos.
  6. In vitro fertilizar os ovos com testículos homogeneizado e, uma hora depois, remova a camada de geléia sobre os ovos com geléia de-solução (164μl 1M TDT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 até 50 mL de água NanoPure autoclavado). Espere até que eles atinjam duas células estágio para começar a classificação, que leva cerca de 2 horas a 18 horas ou 1,5 ° C em temperatura ambiente (22 ° C).
  7. Usando uma transfer pipeta, os embriões tipo uniformemente pigmentada e uniformemente dividindo, como mostrado no cap animais deixados na Figura 3, no poço de um prato cheio de injeção 0.4X MMR Ficoll + 6%.

Microinjeção B.

  1. Estiramento Parafilm por cima de uma tampa 60 milímetros placa de Petri. Pipetar 2 mL da sua amostra de RNA primeiro para o Parafilm e aspirado usando o PLI-100 para preencher sua agulha de injeção. Certifique-se de verificar se a agulha é ainda dispensar 10 nL de amostra antes de iniciar a injeção.
  2. Injetar 20-30 embriões duas células-stage (ambos blastômeros) com 500 pg YFP RNA em um prato e seu gene de interesse (por exemplo, 20 pg Noggin RNA), mais RNA YFP no outro prato 7.
  3. Coloque 100-200 não injetados embriões por ponto de tempo em um outro prato de injeção com a solução de Ficoll. Movê-los dentro e fora da incubadora, ao mesmo tempo como os embriões injetados. Estes são os hosts para ser usado na Parte IV.
  4. Após a injeção, incubar todos os embriões de 14 ° C durante a noite. Repita o procedimento para todos os momentos.

Parte III. Isolar as tampas de animais a partir de embriões injetados

  1. Chegar no início da manhã para a fase de embriões. O ponto mais tempo deve ser a etapa 9. Remover aqueles que não sobreviveram. Prosseguir com os passos seguintes a trabalhar com cada momento em lotes.
  2. Decantar a solução de Ficoll de cada prato e adicione MMR volta 0.7X / solução gentamicina. A um prato de isolamento da tampa, adicione uma generosa quantidade de 0.7X solução MMR / gentamicina. Desalojar embriões de seus poços de injeção prato utilizando uma pipeta e coloque no prato recém-preparados tampa de isolamento.
  3. Isolar tampas animal em 0.7X MMR solução de gentamicina +, mantendo-se 2 ou 3 embriões intactos para o estadiamento. Ou o Gastromaster, equipado com uma ponta amarela dobrado para 400 m, ou um par de pinças afiadas número 5 pode ser usado.
  4. Coloque as tampas de volta em 14 ° C incubadora até o dia seguinte. Os embriões host devem ser retirados da incubadora, ao mesmo tempo como as tampas para mantê-los no mesmo estágio de desenvolvimento como o tecido do doador.

Parte IV. Transplante de tampas em flanco

  1. Retire as tampas e os embriões do primeiro ponto temporal a partir do 14 ° C incubadora e estágio dos embriões. De classificação para uniforme amarelo ou vermelho fluorescente-positivos bonés, dependendo da injetado marcador (Figura 2).
  2. Contar o número de tampas e remover o dobro do número de estágio 13/12 embriões para um prato de injeção preparados na hora com 0.7X MMR / solução gentamicina. Com uma pinça afiada # 5, remover a membrana vitelina de cada um. Transferi-los para o prato com as tampas, mas tenha cuidado. Sem suas membranas vitelínico, os embriões podem rapidamente se dissociam na superfície da água.
  3. Usando o gastromaster (ponta amarela, fio 200-250μm dobrado, configuração mais alta) ou # 5 fórceps, remover um 200 mM quadrado do lado do embrião em estágio 14-15 (Figura 3). Em seguida, corte uma tampa no meio (com o gastromaster ou o # 5 fórceps) e colocar o tecido no buraco feito no embrião hospedeiro. Gire o embrião contra o bem para permitir a cicatrização. Faça isso para embriões como muitos como você pode, enquanto eles estão na fase 15. Repita o procedimento para todos os momentos.
  4. O embrião heal geralmente dentro de 30 minutos. Remove as células mortas (branco) com um movimento suave escovação com uma pinça # 5. Cultivá-las a 18 ° C durante a noite.
  5. Sob o microscópio de fluorescência de dissecação, os embriões tipo fluorescente com marcado com tecido, transplantado. Colocá-los de volta a 18 ° C a crescer até o estágio 42-43.
  6. Anestesiar os animais em tricaina. Neste ponto, você pode tirar fotos sob um microscópio de fluorescência de dissecação. Depois de terminar, reparo, seção e immunostain ou executar hibridização in situ utilizando marcadores para o seu tecido de interesse.

Figura 1
Figura 1. Projeto de Plexiglass para a fundição do molde de elastômero usado para fazer pratos segurando embrião. A 38 x 38 mm quadrado redondo pontas (~ 5 mm de profundidade) foi derrotado fora de um pedaço de Plexiglass que é quadrado 50 x 50 mm e 25 mm de espessura. Circular, poços espaçados (1,5 mm de diâmetro) foram perfurados 1 mm de espessura no plástico. Para fazer o molde de elastômero para os pratos microinjeção, nós derramou elastômero Sylgard no Plexiglass e permitiu que a solidificar, conforme instruções do fabricante. Este molde de elastômero é utilizado para fazer a injeção e as placas de isolamento cap.

Figura 2
Figura 2. Cap animais triagem antes do transplante é importante, como expressão pode variar. Cap animais à esquerda expressa mCherry uniformemente em todo o tecido enquanto o explante na direita tem expressão irregular e serão descartados.

Figura 3
Figura 3. A tadp anfitriãoole desenvolveu uma estrutura de olhos, como no seu flanco a partir de células transplantadas cap animal. fluorescentes Uma imagem foi sobreposta na imagem de campo claro.

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Discussion

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Neste vídeo, demonstramos a nossa versão de técnicas clássicas utilizadas por biólogos Xenopus, que reorganizados para criar o animal ensaio transplante cap. À temperatura ambiente, os embriões Xenopus desenvolver muito rapidamente através de estágios 9 e 15. Colocando-os a 14 ° C, o desenvolvimento do embrião é lento e transplantes muito mais pode ser realizado em um experimento. Se for necessário para crescer os embriões para estágios mais velhos (> 42/43), então recomendamos o uso de animais transgênicos venus YFP, já que a injeção se desvanece proteína fluorescente sinal em girinos mais velhos. Usamos este ensaio para estabelecer que o tecido cap animais expressando EFTFs ou Noggin é especificado para formar os olhos como o tecido. Este ensaio pode ser usado como um teste simples para determinar se um gene (s) de interesse é necessário para determinar o destino celular particular.

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Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações da Pesquisa para prevenir a cegueira (prémios de carreira para o Desenvolvimento MEZ e ASV e uma subvenção de irrestrito ao Departamento de Oftalmologia), o E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ e ASV) e do National Eye Institute / NIH (MEZ , subvenções e R01EY015748 R01EY017964).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mMessage mMachine SP6 Kit Applied Biosystems AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) FHC, Inc. 27-30-1
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific BW17-528Z
Sylgard/elastomer Kit 1.1lb Fisher Scientific NC9644388
60 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0160
human chorionic gonadotropin Intervet Inc. 22219
Pico-Injector Microinjection Systems Harvard Apparatus 650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator Fisher Scientific 11-680-21
Transfer pipette Krackeler Scientific, Inc. 6290-20635A
Dumostar #5 Forceps Fisher Scientific 11295-10

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References

  1. Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
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  3. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. Humana Press. Towata, N.J. (1999).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
  5. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
  6. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (2008).
  7. Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. (2009).
Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio<em> Xenopus laevis</em
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Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).More

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).

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