Superexpressão de genes animais tampas de produto (s) são transplantadas para o flanco de desenvolver<em> Xenopus laevis</em> Embriões, a fim de estabelecer se o tecido é determinada.
Abstract
Muitas proteínas desempenham um duplo papel no desenvolvimento embrionário. Aqueles que regulam a determinação destino celular em um determinado tecido também pode afetar o desenvolvimento de uma região maior do embrião. Isso faz com que definir seu papel em um tecido especial difíceis de analisar. Por exemplo,<em> Noggin</em> Superexpressão em<em> Xenopus laevis</em> Embriões provoca a expansão de toda a região anterior, incluindo o olho<sup> 1,2</sup>. A partir deste resultado, não se sabe se Noggin desempenha um papel direto na determinação olho ou que, causando uma expansão do tecido neural, Noggin indiretamente afeta a formação do olho. Tendo este fenótipo complexo faz estudar o seu papel específico olho na determinação destino celular difícil de analisar. Temos desenvolvido um ensaio que supera este problema. Aproveitando-se da natureza pluripotentes da<em> Xenopus laevis</em> Animal cap<sup> 3</sup>, Temos desenvolvido um ensaio para testar a capacidade do produto gene (s), como<em> Noggin</em> Ou o olho fatores de transcrição de campo (EFTFs), para transformar as tampas em tecido especial ou tipos de células através do transplante desse tecido para o lado do embrião<sup> 4</sup>. Embora tenhamos encontrado um ou outro tratamento de proteína Noggin ou um conjunto de fatores de transcrição pode determinar o destino de células da retina em tampas de animal, este procedimento poderia ser usado para identificar produto do gene (s) envolvidos na especificação outros tecidos também.
Protocol
Parte I. Set-up para o ensaio ACT Gerar RNA tampado para injeção, como sugerido pelo fabricante, usando seus fenol: clorofórmio método de purificação (por exemplo, mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA que codifica uma proteína fluorescente é utilizado como marcador. Transcrevemos ou proteína fluorescente amarela (YFP) ou mCherry 5 cDNA, que está em um vetor de expressão pCS2 +. Puxe tubos de vidro de borosilicato capilar para formar dicas de vidr…
Discussion
Neste vídeo, demonstramos a nossa versão de técnicas clássicas utilizadas por biólogos Xenopus, que reorganizados para criar o animal ensaio transplante cap. À temperatura ambiente, os embriões Xenopus desenvolver muito rapidamente através de estágios 9 e 15. Colocando-os a 14 ° C, o desenvolvimento do embrião é lento e transplantes muito mais pode ser realizado em um experimento. Se for necessário para crescer os embriões para estágios mais velhos (> 42/43), então recomendamos o uso…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações da Pesquisa para prevenir a cegueira (prémios de carreira para o Desenvolvimento MEZ e ASV e uma subvenção de irrestrito ao Departamento de Oftalmologia), o E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ e ASV) e do National Eye Institute / NIH (MEZ , subvenções e R01EY015748 R01EY017964).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
mMessage mMachine SP6 Kit
Applied Biosystems/Ambion
AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)
Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).