Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis doi: 10.3791/1932 Published: May 16, 2010

Summary

Hayvan kapaklar eksprese gen ürün (ler), gelişmekte olan kanadını nakledilen

Abstract

Çoğu protein, embriyonik gelişim ikili bir rol oynarlar. Belirli bir doku düzenleyen hücre kaderinin belirlenmesinde de daha geniş bir bölge embriyonun gelişimi etkileyebilir. Bu analiz etmek zor, belli bir doku rolünü tanımlayan hale getirir. Örneğin,

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bölüm I. ACT Testi için Set-up

  1. Kloroform arıtma yöntemi (Uygulamalı Biosystems / Ambion, Austin, Teksas örneğin mMessage mMachine Kit), fenol kullanarak üretici tarafından önerilen enjeksiyon için kapaklı RNA oluşturun. Floresan proteini kodlayan RNA bir izleme olarak kullanılır. Biz ya sarı floresan protein (YFP) veya bir pCS2 + ifade vektör cDNA mCherry 5, yazıya.
  2. Mikropipet çektirmenin konik cam ipuçları oluşturmak için borosilikat cam kapiller tüplerin çekin. Biz Sutter Mikropipet Çektirme, P-97 (Sutter Instruments, Inc, Novato, CA), daha önce 6 tarif.
  3. KCl 20 mM, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, pH 7.5 ayarlanır, otoklava ve saklanan bir 10 X Marc Kullanıcı Modifiye Zil Kullanıcı (MMR) çözüm stok (10 mM MgCl 2 Tablo 1'de steril solüsyonların olun RT).
  4. Testisler erkek kurbağa izole etmek ve doku 1X MMR / gentamisin (50 mg / ml gentamisin sülfat; BioWhittaker, Kedi # 17-518Z) steril bir çözüm 4 ° C'de saklamak. Bu deney başlamadan önce bir hafta kadar yapılabilir, ancak zaman içinde etkinliğini kaybeder.
  5. Yumurtlama çözümü (1X: 150 mM NaCl, 2.62 mM KCl, 0.8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma baz, 2.62 mM NaHCO 3 ve 2.75 mM MgSO 4; pH 7.6 düzeltilmiş), 8X stok olarak kılınan 4 saklanabilir ° C iki hafta kadar Not: Bu çözüm kirlenme dikkat, bu yumurta kalitesini etkiler.
  6. Enjeksiyon tabak oluşturun. Bunu yapmak için, yavaşça kabarcıklarını engellemek ve yaklaşık soğuması için çözüm üstünde bir elastomer kalıp (Şekil 1) Penis, 60 mm tabak içine ~ 6 ml erimiş agaroz çözümü eklemek, bir mikrodalga 0.4X MMR% 1 agaroz eritebilir RT 20 dakika. Gerekli sayısını belirlemek için, deneysel koşullar sayısını düşünün (örneğin 1, YFP; 2, YFP + Noggin) ve nakledilen ana embriyoların sayısı gerekli. Deneyler için, biz her deneysel koşul için en az 20 nakledilen ev sahibi embriyolar üretmek. 18-19 ° C, embriyolar yaklaşık bir saat için 15 sahne olması. 20 nakli gerçekleştirmek için bir saat sürer, sonra iki gübreleme zaman noktalarında, ev sahibi embriyolar nakli kabul varsayarak ihtiyaç vardır. Bu nedenle, dört enjeksiyon yemekleri (2 exp x 2 gübreleme zaman noktalarında = 4) ihtiyaç duyulacaktır. Plakalar, bir haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
  7. Enjeksiyon plaka için gibi kalıpları ile% 1 agaroz + 0.7X MMR kullanarak kap izolasyon plakaları oluşturun. Kap izolasyon enjeksiyon plakaları artı bir ekstra başına döllenme zamanı noktası (4 + 2 gübreleme zaman noktalarında = 6) olarak aynı sayıda olun.
  8. Insan koryonik gonadotropin 500 adet mikroenjeksiyon önceki gün gün geç kadın enjekte edilir. Mağaza kadın ° C gecede 16-18.

Bölüm II. Xenopus laevis embriyoların RNA Mikroenjeksiyon

A. mikroenjeksiyon için hazırlanması

  1. Hormonal uyarılan kadın çıkarın ve 1X yumurtlama çözümü (ELS) Not içeren bireysel tankları koyun: ELS, yumurta kalitesi düşer olarak iki saatten fazla yumurta kullanmayın . Bu nedenle, sadece yeni yumurtlamada toplanır, böylece yaklaşık bir saat önce in vitro fertilizasyon, tankın tüm yumurta atmak.
  2. Mikroenjeksiyon için iğne ucu kapalı kırpma 25-35 mikron çapında elde etmek için hazırlayın. Picoinjector yerleştirin ve üzerine iğne, enjeksiyon başına 10 nL dağıtır, böylece kalibre.
  3. 14 ° C'ye kadar bir inkübatör ayarlayın
  4. Bir kez kadın yumurtladığı yaklaşık bir saat, bir transfer pipet kullanarak tank yumurta kaldırmak ve 60 mm Petri kapları içine yerleştirin. Mümkün olduğu kadar yumurtaları çok ELS olarak çıkarın ve 1X MMR ile değiştirin. Yumurtalar hemen döllenmiş veya bir saat için 1X MMR kalmak olabilir. Transplant tahlil için, üç ayrı gruplar halinde yaklaşık 11 am, öğle ve 13:00 iki çanak,% 80 kadar yumurta, tek katmanlı bir tam döllemek için en iyisidir. Enjeksiyondan sonra, 14 yaşında alınacaktır ° C kadar kap izolasyonu (evre 8,5-9) ve organ nakli için istenen aşamalarında büyüyecek (evre 15; yukarıda Ben # 6 Part).
  5. Testislerin kalite kontrol etmek için, biz, ilk sperm uygulanabilir değilse, bize başka bir erkek testis ayıklamak için sağlayan bir sabah erken fertilizasyon (~ 08:00), gerçekleştirir. Not: 1 ml 1X MMR ~ 0.25 testisler homojenize ve oosit plaka başına yaklaşık 5 ila 7 damla ekleyin.
  6. In vitro homojenize testisler ile yumurtaları döller ve bir saat sonra, de-jöle çözümü kullanarak yumurta jöle kat kaldırmak (164μl 1M DTT + 10 ml 1M Tris, pH 8.8, 50 ml otoklavlanmış nanopure su) . Oda sıcaklığında (22 ° C) ° C veya 1,5 saat 18 yaklaşık 2 saat sürer sıralama, başlamak için iki hücreli aşamaya ulaşmak kadar bekleyin.
  7. Bir transfer pipet, sıralama, düzgün pigmentli ve eşit olarak bölerek embriyolar, 0.4X MMR +% 6 Ficoll ile dolu bir enjeksiyon çanağı kuyuya, sol hayvan kap Şekil 3'te gösterilmiştir.

B. Mikroenjeksiyon

  1. 60 mm Petri kabı kapağı üstünden Parafilm gerin. Pipet 2 ul enjeksiyon iğnesi doldurmak için PLI-100 kullanarak Parafilm ve aspirat üzerine ilk RNA örnek. Iğne, enjeksiyon başlamadan önce örnek hala 10 nL dağıtım olduğunu kontrol etmek için emin olun.
  2. 7 başka bir çanak bir çanak 500 pg YFP RNA ve ilgi gen (örneğin 20 pg Noggin RNA) artı YFP RNA ile 20-30 iki hücreli dönem embriyoların (her iki blastomer) enjekte edilir.
  3. Ficoll solüsyonu ile başka bir enjeksiyon çanak zaman noktası başına koyun 100-200 olmayan enjekte embriyolar. Inkübatör enjekte edilen embriyolar gibi, aynı zamanda onları içeri ve dışarı. Bu Bölüm IV kullanılmak üzere bilgisayarların.
  4. Enjeksiyondan sonra, ° C gecede 14 embriyolar inkübe. Tüm zamanların puan için tekrarlayın.

Bölüm III. Enjekte edilen embriyolardan hayvan kapakları Isolate

  1. Embriyoların sahne için sabahın erken saatlerinde ulaşıyoruz. Erken bir zaman noktasında sahne 9 olmalıdır. Hayatta olmadığını, bu çıkarın. Gruplar halinde her zaman noktası ile çalışan aşağıdaki adımları ile devam edin.
  2. Her plaka Ficoll çözüm dökün ve geri 0.7X MMR / gentamisin çözeltisi ekleyin. Bir kap izolasyon çanak 0.7X MMR / gentamisin çözüm bol miktarda ekleyebilirsiniz. Bir transfer pipeti yeri ve taze hazırlanmış kapağı izolasyon çanak kullanarak enjeksiyon çanak kuyu embriyolar yerinden oynatın.
  3. Evreleme için 2 veya 3 sağlam embriyolar tutmak, 0.7X MMR + gentamisin çözüm hayvan kapakları izole edin. Sarı bir ucu 400 mm için eğildi, ya da bir çift keskin sayısı 5 forseps ile donatılmış Gastromaster, Ya kullanılabilir.
  4. Kapaklar, ertesi güne kadar 14 ° C inkübatör geri koyun. Donör dokusu aynı gelişim aşamasında onları tutmak için kapaklar aynı zamanda ev sahibi embriyolar inkübatör çıkarılmalıdır.

Bölüm IV. Kanadını üzerine kapaklar Nakli

  1. 14 ° C inkübatör ilk kez noktadan kapakları ve embriyolar çıkarın ve embriyoların aşamasında. Tracer enjekte (Şekil 2) bağlı olarak tek tip sarı veya kırmızı floresan pozitif kapaklar, sıralayın.
  2. Kapaklar sayısını ve 0.7X MMR / gentamisin çözeltisi ile taze hazırlanan enjeksiyon çanak sahne 12-13 embriyoların sayısı iki katına çıkarmak. Keskin # 5 forseps ile, her vitellin membran çıkarın. Kapaklar plaka aktarabilirsiniz, ancak dikkatli olun. Vitellin membranlar olmadan, embriyolar hızlı su yüzeyinde ayrılabilir.
  3. Gastromaster (sarı ucu, 200-250μm bükülmüş tel, en yüksek ayar) veya # 5 forseps kullanarak, embriyo aşamasında 14-15 (Şekil 3) tarafında kare 200 mikron çıkarın. Daha sonra, yarım kap kesmek (gastromaster veya # 5 forseps) ve ev sahibi embriyo yapılan delik doku. Iyileşmesini sağlamak için iyi karşı embriyo döndürün. Aşamada 15 yaşında iken, mümkün olduğunca çok sayıda embriyolar olarak bunu yapın. Tüm zamanların puan için tekrarlayın.
  4. Embriyo genellikle 30 dakika içinde iyileşir. # 5 forseps ile yumuşak bir fırçalama hareketi ile ölü hücreleri (beyaz) çıkarın. 18 ° C gecede bunları büyütün.
  5. Diseksiyon floresan mikroskop altında floresan etiketli, nakledilen doku tür embriyoların. Onları geri koyalım 18 ° C aşamada 42-43 kadar büyümeye.
  6. Tricaine hayvanların anestezisi. Bu noktada, floresan diseksiyon mikroskobu altında fotoğraf çekebilirsiniz. Yapıldıktan sonra, bölümünü düzeltmek ve ilgi doku belirteçleri kullanılarak in situ hibridizasyon immunostain veya gerçekleştirmek.

Şekil 1
Şekil 1. Tasarım embriyonun tutma yemekleri yapmak için kullanılan elastomer kalıp döküm için Pleksiglas. 38 x 38 mm yuvarlak köşeli kare (~ 5 mm derinliğinde) 50 x 50 mm kare ve 25 mm kalınlığında bir parça Pleksiglas yönlendirilir olmuştur. Dairesel, eşit aralıklı kuyuları (1.5 mm çap) 1 mm plastik derinliklerine delinmiştir. Mikroenjeksiyon yemekleri için elastomer kalıp yapmak için, üreticinin talimatlarına göre, Sylgard elastomer Pleksiglas içine dökülür ve katılaşmaya izin. Bu elastomer kalıp, enjeksiyon ve kap izolasyon plakaları yapmak için kullanılır.

Şekil 2
Şekil 2. Ifadesi değişebilir Hayvan kap nakli için önce sıralama önemlidir. Soldaki Hayvan kapağı doku boyunca eşit mCherry ifade sağda eksplant sivilceli bir ifade vardır ve atılır .

Şekil 3
Şekil 3. Bir ev sahibi tadpole, nakledilen hayvan kap hücrelerinden kanadında bir göz gibi bir yapı geliştirmiştir. floresan görüntü aydınlık görüntü üzerine yerleştirilmiştir olmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu video, hayvan kap nakli tahlil oluşturmak için yeniden düzenlenmiştir Xenopus biyologlar tarafından kullanılan klasik teknikleri, bizim sürümü göstermiştir. Oda sıcaklığında, Xenopus embriyolar evre 9 ve 15 ile çok hızlı bir şekilde gelişir. 14 yaşında yerleştirerek ° C, embriyo gelişimi yavaşladı ve çok daha fazla bir deneyde nakli yapılabilir. Yaşlı aşamaları (42/43) embriyolar büyümek için gerekli ise, o zaman biz büyük tetarlar enjekte floresan protein sinyal kaybolur beri, transgenik Venus YFP hayvanlar kullanarak tavsiye ederiz. Bu testte EFTFs veya Noggin göz gibi doku oluşturmak için belirtilen ifade, hayvan kap doku kurmak için kullanılır. Bu testte bir ilgi gen (ler), belirli bir hücre kaderinin belirlenmesinde için gerekli olup olmadığının belirlenmesi için basit bir test olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma, Körlük (Kariyer Geliştirme MEZ ve ASV Ödüller ve sınırsız ödenekle Göz Hastalıkları Bölümü), E. Matilda Zeigler Vakfı (MEZ ve ASV) ve Ulusal Göz Enstitüsü / NIH (MEZ Önlemek Araştırma hibeleri tarafından desteklenen , hibe R01EY015748 ve R01EY017964).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mMessage mMachine SP6 Kit Applied Biosystems AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) FHC, Inc. 27-30-1
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific BW17-528Z
Sylgard/elastomer Kit 1.1lb Fisher Scientific NC9644388
60 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0160
human chorionic gonadotropin Intervet Inc. 22219
Pico-Injector Microinjection Systems Harvard Apparatus 650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator Fisher Scientific 11-680-21
Transfer pipette Krackeler Scientific, Inc. 6290-20635A
Dumostar #5 Forceps Fisher Scientific 11295-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  2. Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
  3. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. Humana Press. Towata, N.J. (1999).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
  5. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
  6. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (2008).
  7. Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. (2009).
Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi<em> Xenopus laevis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).More

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter