Systemisk och lokal Drug Delivery för behandling av sjukdomar i centrala nervsystemet i gnagarmodeller

Summary

Grundlig preklinisk testning av läkemedel som verkar på det centrala nervsystemet handlar ofta om att bedöma och jämföra droger biodistribution i samband med specifika administreringsvägar. Här är tre vanliga metoder för systemisk leverans (intravenös, intraperitoneal, och muntliga) samt en metod för lokal leverans (konvektion utökad leverans) påvisats hos möss.

Abstract

Grundlig preklinisk testning av centrala nervsystemet (CNS) Therapeutics ingår ett övervägande av administrationssätt och agent biodistribution i bedömningen av terapeutisk effekt. Mellan de två stora klassificeringar av förvaltningen, är lokala vs systemisk, systemisk leverans metoder ofta att föredra på grund av enkel administration. Dock kan systemiska leverans resultera i suboptimalt drogkoncentrationen uppnås i CNS, och leda till felaktiga slutsatser om agenten effekt. Lokala drug delivery-metoder är mer invasiva, men kan vara nödvändiga för att uppnå terapeutisk CNS-läkemedel nivåer. Här visar vi rätt teknik för tre sträckor på systemiska drug delivery: intravenös injektion, intraperitoneal injektion och oral sondmatning. Dessutom visar vi en metod för lokal leverans till hjärnan: konvektion utökad leverans (CED). Användningen av fluorescerande-märkta föreningar ingår för in vivo imaging och verifiering av korrekt Drug Administration. De metoder som presenteras med hjälp av musmodeller, men kan lätt anpassas för användning i råttor.

Protocol

1. Systemisk delivery-metoder

Även systemisk leverans av läkemedel är inte den mest effektiva metoden för att uppnå höga koncentrationer i CNS, systemisk leveranser är bekväma och väl accepteras av patienterna. Här kommer vi att visa korrekta förfaranden för tre som rutinmässigt används systembehandling metoder: intravenös injektion, intraperitoneal injektion och oral sondmatning.

A. intravenös injektion (svansvenen Injection)

1. Innan handläggningen bör kroppsvikt varje musen registreras. Som med alla prekliniska studier, skall kroppsvikten kontrolleras regelbundet (två gånger i veckan eller mer) för att utvärdera potentiella läkemedelstoxicitet. Inte mer än 1% av musens kroppsvikt i volym ska injiceras vid ett enskilt tillfälle. Till exempel bör inte mer än 0,2 mL av vätska injiceras i en 20g mus. Alla vätskor injiceras intravenöst bör steriliseras genom en lämplig metod.
2. Musen ska värmas i 5-10 minuter med hjälp av antingen en värmedyna eller en värmelampa för att vidga svansvenen. Om du använder en värme lampa, övervaka musen hela tiden för att undvika hypertermi.
3. Musen överförs till en hållare, som håller fast musen samtidigt som tillgång till svansvenen (se video). I musen svansen finns fyra synliga fartyg: fartyg på dorsala och laterala sidor är nerver, och fartyget på den ventrala sidan är en artär. För att komma åt svansvenen är svansen på musen hålls på den mest distala punkten och roteras 90 grader så att venen är vänt uppåt. Injektionsstället rengörs med en alkoholservett och en 28g insulin spruta in, fasade sidan uppåt, i en ven (se video). Om nålen är rätt placerad i venen, bör det röra sig fritt och utan tryck. Långsamt injicerar drogen med jämnt tryck på 5-10 sekunder. Om en blåsa visas på svansen, stoppa injicerar, eftersom detta indikerar att nålen inte längre är i venen.
4. Efter injektion, tryck lätt på injektionsstället tills blödningen stannar. Detta tar normalt 30-60 sekunder. Övervaka musen i 5-10 minuter efter injektion för att försäkra att det inte finns någon ytterligare blödning.

B. intraperitoneal injektion

1. Innan injektionen, bör preparatet sättas in i en spruta kopplad till en 28g nål. Se till att det finns utrymme i sprutan för att dra tillbaka kolven innan injektionen (t ex om injicerar 200μL, se till att sprutan kapaciteten är 300μL eller högre).
2. Ta bort musen ur buren genom sin svans och placera den på en strukturerad yta, så att musen har något att greppa. En bur lock är vanligen tillräcklig. Låt musen för att sträcka ut sin kropp och sedan använda din icke-dominanta handen, ta tag i huden på baksidan av musen, var noga med att försiktigt nypa så mycket hud som möjligt mellan tummen och pek-och långfingret (se video). Vänd musen över så att buken av musen är vänt uppåt. Om musen kan röra sig fritt huvudet, släpp greppet och försök igen, för att undvika att bli biten under injektionen.
3. Med din dominanta hand, ta upp sprutan och för in nålen i 30 graders vinkel i den nedre vänstra kvadranten av musen (se video). Håll musen lätt inverterade hjälper att flytta organ från injektionsstället. För att säkerställa att nålen är i intraperitoneala rummet, dra tillbaka sprutkolven. Om någon vätska eller blod syns i sprutan, då nålen inte är i intraperitoneal utrymme och bör tas bort. Om ingen vätska sugs upp i sprutan, sedan injicera sprutan innehåll med ett jämnt tryck över 1-5 sekunder och släpp.
4. Övervaka musen i 5-10 minuter efter injektion för att säkerställa att musen återgår till normal aktivitetsnivå.

C. oral sondmatning

1. Innan injektionen, spela in vikten på musen. Den maximala volym som kan levereras via oral sondmatning är 10mL per kilo kroppsvikt. Till exempel skulle den maximala volymen för en 20 g mus vara 200μL. Försök att injicera större volymer kan resultera i reflux, vilket kommer att ge upphov till ofullständig drug delivery. Om det är nödvändigt att administrera större volymer än vad som anges ovan kan så många som tre doser ges under 24 timmar.
2. För att undvika att punktera matstrupen är det viktigt att mäta längden på sondmatning nål för varje mus. Håll ett 18g SKARVNINGSTIPS böjda sondmatning nålen i sista revbenet av musen, och sedan markera längden på spetsen av musens huvud med en permanent spritpenna (se video). Under sondmatning, kommer detta märke vara ett stopp punkt som du sätter i nålen i munnen på musen.
3. Tygla musen med samma handtag som för en intraperitoneal injektion. Sätt in sondmatning nål i munnen, under tungan, och AdvaNCE nålen genom svalget. Stick inte in nålen förbi stannar märket. Nålen ska gå smidigt utan några påtryckningar (se video). Om du stöter på trycket, stoppa och dra tillbaka nålen för att undvika att injicera vätska i lungorna.
4. Med nålen på plats, tryck in kolven under 1-5 sekunder och ta sedan bort nålen i samma vinkel att den blev inmatad. Övervaka musen i 5-10 minuter, mycket uppmärksam på eventuella tecken på ansträngd andning vilket kan tyda på att vätska har kommit in i lungorna.

2. Lokal leverans

Akut Konvektion-utökade

A. Probe Konstruktion

En reflux-resistenta CED kanyl för gnagare är ännu inte kommersiellt tillgängliga. Här kommer vi att demonstrera en metod för kanyl konstruktion som var anpassad från en metod som först beskrevs av Krauze et al (Krauze 2005).

• Kanylen har tre delar (figur 1): 100uM diameter kiseldioxid slang genom vilken infusate flöden, en styv metall nål till strukturstöd och flexibla teflon slangar för lastning av infusate.
• För att få stel metall-nål, använd en öppen eld för att smälta plast på en Surflo IV kateter (24g stylet) och använder pincett bort metallen nålen. Resten av katetern kan kasseras. Skär en längd av kiseldioxid slang (OD 0.163mm), något längre än metall nålen, med en enda kant rakblad. Roll kvarts slang i en liten droppe cyanoakrylat baserade snabbverkande lim (t.ex. Krazy lim), noga med att inte få någon limma på ändarna av slangen. Sätt kvarts slangen i metallen nålen och låt torka i 5 minuter.
• När torr, bör kiseldioxid slangen vara väl fäst vid nålen. Ändarna på kvarts skulle trimmas så att 2mm av sticker kiseldioxid slang från den spetsiga änden av nålen och 3 mm i sticker kiseldioxid slang från den platta änden (se video).
• Skär en del av teflon slangar 20 cm i längd. Rulla metall nål i en liten droppe lim, återigen noga med att inte få lim på ändarna av kiseldioxid slang eftersom detta kommer att täppa till kanylen. Sätt in nålen i teflon slang till ett djup av 1 cm. Låt torka i 1 minut. Med hjälp av en limpistol, applicera en droppe het lim för att skarven mellan metallen nålen och Teflon slang (se video). Se till att hela det gemensamma är täckt på alla sidor och låt torka minst 1 timme. Kanyler kan göras upp till en vecka i förväg och förvaras i rumstemperatur.

B. Infusion Förfarande

• För att förbereda den kirurgiska området, bör alla ytor skall sprutas med ett desinfektionsmedel, t.ex. en 2% klorhexidin lösning. Sterila kirurgiska handskar bör användas under förfarandet. Ytorna täcks sedan med absorberande draperier. Följande varor bör placeras i operationsområdet:
  • Värmedyna för att bibehålla temperaturen mus kroppen
  • Två små petriskålar, en som innehåller 3% väteperoxid, och en innehållande 2% klorhexidin
  • Steril gasbinda och bomull kompresser
  • Sterila skalpeller (nummer 21)
  • Sterila 22g nålar
  • Mus stereotaxic ram
  • Kontrollerad hastighet sprutpump
  • Autoklaveras mus hud häftapparat, häftklamrar och klammerborttagare
• För att ställa upp de CED kanyl, bifoga en 1 ml spruta med Teflon slang hjälp av en uppsättning plastspruta adaptrar. Kanylen skall fästas på stereotaxic ramen så att den är vinkelrät mot den kirurgiska ytan (se video). För att desinficera kanylen, fyller 1 ml spruta med 70% etanol och tryck in kolven för att köra etanol genom kanylen. Upprepa denna process med steril koksaltlösning, och kontrollera eventuella läckage kring kanylen lederna. Att desinficera utsidan av kanylen, torka försiktigt med en 70% etanol torka.
• Fyll kanylen med steril koksaltlösning och sedan dra tillbaka sprutan så att en liten luftbubbla dras in i kanylen. Denna luftbubbla kommer att skilja infusate från koksaltlösning i kanylen. Sedan skjuta upp din infusate (se video). Anslut sprutan till sprutpumpen och fylla pumpen genom att kort kör kanylen.
• Stillsam musen med hjälp av en injiceras bedövningsmedel och förbereda huden genom att badda flera gånger (5-10 sekunder) med en bit steril gasbinda doppas i 2% klorhexidin lösning. Oftalmologiska salva ska appliceras på musen för att upprätthålla tillräcklig fuktighet under förfarandet. Med en steril skalpell, skapa en sagittal snitt längs mitten av skallen, ungefär 1,5 cm lång (se video). Skallen Ytan är då rengöras med en bomullspinne indränkt i en 3% väteperoxid lösning. Var noga med att undvika att bli väteperoxid i ögonen på musen. Den sutur linjer av skallen bör vara uppenbart vid det här laget: om de inte syns, torka försiktigt rent skallen med en frESH bomullsduk dränkt i 3% väteperoxid lösning.
• Identifiera bregma (figur 2) och sedan mäta 2mm till höger och 1 mm bakre delen av denna struktur för att lokalisera infusionsstället. Använda sterila 22g nål försiktigt skapa ett hål i skallen på denna punkt genom att vrida nålen mot skallen (se video). Undvik att tvinga nålen nedåt mot skallen.
• Vid det här laget bör musen placeras i stereotaxic ramen och börja få inandas anestesi (se video). Administrera narkos på en låg nivå (1%), och noggrant övervaka musen för förändringar i andningsfrekvens, justera narkos därefter.
• Placera kanylen över skallen hålet och sedan sänka 3mm under skallen ytan. Börja infusionen, med följande priser och löptider:

  0,1 mikroliter / min i 5 minuter
  0,2 mikroliter / min i 5 minuter
  0,5 mikroliter / min i 5 minuter
  0,8 ml / min för 7,5 minuter
  OFF under 1 minut

• I slutet av infusionen, sakta ut kanylen och torka av skallen med 3% väteperoxid. Applicera sterilt ben vax för att hålet (se video). Använd pincett, dra ihop huden över skallen och krampa att stänga. Buprenorfin bör ges för postoperativ smärtlindring.
• Övervaka musen postoperativt tills det återfår medvetandet och rörlighet. På grund av längden på förfarandet kan det ta upp till en timme för musen att återfå full aktivitet. Under denna tid placerar musen buren på en värmedyna för att undvika hypotermi, och inte hysa återhämtar musen med andra aktiva möss.
• Hud klammer bör tas bort en vecka efter operationen.

C. I Vivo Imaging

Fluorescerande-märkta infusate kan avbildas efter CED administration och kan övervakas för ändringar i signalstyrka samt signal-plats. Oftast är det bäst att vänta 2-3 timmar efter infusionen till bilden, så att musen för att återhämta sig från infusionen.

• För anestesi under avbildning, använd en låg nivå av en inhalerad narkos. Placera musen, ryggsidan upp, i en avbildning station (t.ex. IVIS Lumina, klave Life Sciences, Alameda, Kalifornien). Använda ett lämpligt filter inställning för fluor som håller på att avbildas, förvärva en bild. För CED bör en framgångsrik infusion visar att de flesta av materialet i hjärnan nära infusionsstället (Figur 3).

3. Representativa resultat

Brist på negativ reaktion på administrationen av terapi är en viktig indikator på framgångsrik injektion. Till exempel följande svansvenen injektion bör ingen förändring i utseende (t.ex. storlek, färg) av svansen. En bubbla eller blåsa efter svansvenen injektion skulle tyda subkutan snarare än intravenös, leverans av behandlingen. För intraperitoneal injektion kan en bula på huden eller missfärgning av buken visar subkutan injektion eller skador på inre strukturer. I oral sondmatning, arbetade en mus med andning eller hosta kan tyda på att vätska sprutas in i lungorna, snarare än till magsäcken.

För CED är neurologiska funktion viktig för att bedöma god administration av behandlingen. En mus som uppvisar anfall eller hemipares kan ha fått en felaktig infusion. Om en fluorescerande infusate används kan in vivo imaging tillämpas för bedömning av god administration (Figur 3). Om infusate inte är lokaliserad till injektionsstället, var infusionen inte lyckat.

Figur 1: CED kanyl och kirurgiska Set-up. De grundläggande delarna av konvektion utökad leverans kirurgiska set-up visas. En mikroinfusion pump (A) är ansluten till infusionen kanylen (B, visas förstorad på högsta). En stereotaxic ram (C) används för att placera sonden. Denna bild ingår inte värme-och bedövningsmedel utrustning används även under förfarandet.

Figur 2: Mus Skull Suture Lines. Den CED infusionsstället (röd stjärna) kan lokaliseras genom att identifiera korsningen mellan sagittala och koronala suturer (den bregma) och sedan mäta 2mm i sidled och 1 mm bakre delen av bregma.

Figur 3: representativa resultat från framgångsrika CED. Liposomes märkt med ett långt rött fluorescerande färg var infunderas i musen hjärnan genom CED och avbildat både in vivo och ex vivo. En framgångsrik infusion visar en fluorescerande signal lokaliserad till infusionsstället både in vivo (A) och ex vivo (B). Signalen ska vara lokaliserad till infunderas halvklotet utan läckage till kontralaterala hemisfären.

Figur 4: representativ bild av Framgångsrik CED i Rat hjärnstammen. Fluorescerande-märkta liposomer var infunderas i råttan hjärnstammen. Hos råttor, kan så mycket som 20μL infunderas. Den ökade tjockleken på råtta skallen och djup injektion uteslutet in vivo imaging, men korrekt infusion plats kunde verifieras genom ex vivo avbildning av dissekeras hjärnan.

Discussion

Prekliniska utvärderingen av effekten av terapeutiskt medel måste ta hänsyn till farmakologiska egenskaperna hos agenten och målvävnaden av intresse. Även systemisk administreringssätt i allmänhet mer lättköpt och bättre tolererade av patienter kräver selektiviteten i blod-hjärnbarriären ofta lokal leverans av terapi för behandling av CNS-sjukdomar. Här har vi visat en metod för direkt leverans till hjärnan: CED. Andra former av lokal leverans till hjärnan inkludera direkt administrering till cerebrospinalvätskan, intratumoral bolusinjektion och ventrikulär injektion. För dessa metoder är diffusibility av terapeutiska avgörande betydelse, med dålig spridning begränsar regionen täckningen till ett par millimeter från injektionsstället (Jain 1989, Bobo 1994). Däremot CED använder positivt tryck för att öka arealen läkemedelsdistribution (Bobo 1994), medan andra kan terapeutiska riktade till specifika neuroanatomiska strukturer. I vårt laboratorium har vi framgångsrikt utfört CED i hjärnstammen samt i caudatus putamen hos gnagare (Figur 4).

Förmågan att leda CED i gnagarmodeller har blivit allt viktigare i samband med ökande intresse av att maximera terapeutisk effekt vid behandling av olika typer av CNS-sjukdom. CED kan användas för att leverera en mängd olika läkemedel, inklusive renade proteiner, små droger molekyl, och virus (Gill 2003, 2003 Degen, Szerlip 2007). Utbudet av sjukdomar som kan behandlas med CED inkluderar cancer i CNS (Yamashita 2007) samt neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom (Gill 2003). Som CED forskningen fortsätter att expandera, behovet av in vivo-avbildning av CED administreras terapi är lika ökar. Medan fluorescerande avbildning visat här förmodligen inte skulle vara synliga genom mänsklig skalle, är andra metoder som använder samtidig infusion av MR-kontrastmedel (Dickinson 2008) locka intresse för att bedöma tillämpbarhet för övervakning infunderade lösningarna hos patienter med CNS-sjukdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Chlorhexidine	Fisher Scientific	NC9756995	AKA Nolvasan”
20g Needle	BD Biosciences	305175
28g Needle (with syringe)	Fisher Scientific	22-004-270	AKA Insulin Syringe
3% Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H312P-4	Store away from light
Cotton Swabs	Fisher Scientific	23-400-100	Autoclave before use
Cyanoacrylate-based Adhesive	Fisher Scientific	NC9592632	AKA Krazy Glue”
Disposable Scalpels	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2975	No. 21
Gauze	Fisher Scientific	22028563	Autoclave before use
Heating Pad	Dunlap	HP950
I.V. Catheter	Fisher Scientific	14-841-20
Infusion Pump	BASi	MD-1000, MD-1001
Living Image Software	Caliper Life Sciences	Contact for Quote
Ophthalmic Ointment	Cardinal Health	1272830	AKA Akwa Tears”
Plastic Syringe Adaptors	Upchurch Scientific	P-604, P-200NX, P-215X, P-630	Fits on Luer Lock Syringes
Silica Tubing	Polymicro Technologies	2000020
Skin Stapler, Staples, Remover	Stoelting Co.	59020
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.	51725
Teflon Tubing	Upchurch Scientific	1520
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences	Contact for Quote