Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sequencing van het hele genoom voor snelle karakterisering van het rabiësvirus met behulp van nanoporietechnologie

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65414
Automatic Translation
1,2, 1,3,4,5, 1,6, 1, 1, 1,6, 7,8, 3,9, 1, 1,6
1School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, 2Research Institute for Tropical Medicine, 3University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, 4Tanzania Industrial Research Development Organization, 5Ifakara Health Institute, 6MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 7Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, 8African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, 9University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

Summary

Hier presenteren we een snelle en kosteneffectieve workflow voor het karakteriseren van genomen van het rabiësvirus (RABV) met behulp van nanoporietechnologie. De workflow is bedoeld om genomics-geïnformeerde surveillance op lokaal niveau te ondersteunen, door informatie te verstrekken over circulerende RABV-lijnen en hun plaatsing binnen regionale fylogenieën om rabiësbestrijdingsmaatregelen te begeleiden.

Abstract

Genomische gegevens kunnen worden gebruikt om de overdracht en geografische verspreiding van infectieziekten te volgen. De sequencingcapaciteit die nodig is voor genomische surveillance blijft echter beperkt in veel lage- en middeninkomenslanden (LMIC's), waar hondsdolheid en/of hondsdolheid die wordt overgedragen door dieren in het wild, zoals vampiervleermuizen, grote zorgen voor de volksgezondheid en de economie vormen. We presenteren hier een snelle en betaalbare sample-to-sequence-to-interpretation workflow met behulp van nanopore-technologie. Protocollen voor monsterafname en de diagnose van rabiës worden kort beschreven, gevolgd door details van de geoptimaliseerde sequencing-workflow voor het hele genoom, inclusief primerontwerp en optimalisatie voor multiplex polymerasekettingreactie (PCR), een aangepaste, goedkope sequencing-bibliotheekvoorbereiding, sequencing met live en offline base-calling, genetische afstammingsaanduiding en fylogenetische analyse. De implementatie van de workflow wordt gedemonstreerd en kritieke stappen voor lokale implementatie worden benadrukt, zoals pijplijnvalidatie, primeroptimalisatie, opname van negatieve controles en het gebruik van openbaar beschikbare gegevens en genomische tools (GLUE, MADDOG) voor classificatie en plaatsing binnen regionale en wereldwijde fylogenieën. De doorlooptijd voor de workflow is 2-3 dagen en de kosten variëren van $ 25 per monster voor een run van 96 samples tot $ 80 per sample voor een run van 12 samples. We concluderen dat het opzetten van genomische surveillance van het rabiësvirus in LMIC's haalbaar is en de vooruitgang kan ondersteunen in de richting van het wereldwijde doel van nul door honden gemedieerde sterfgevallen door hondsdolheid bij mensen tegen 2030, evenals verbeterde monitoring van de verspreiding van rabiës in het wild. Bovendien kan het platform worden aangepast voor andere ziekteverwekkers, waardoor een veelzijdige genomische capaciteit kan worden opgebouwd die bijdraagt aan de paraatheid bij epidemieën en pandemieën.

Introduction

Het rabiësvirus (RABV) is een lyssavirus uit de familie Rhabdoviridae dat een dodelijke neurologische aandoening veroorzaakt bijzoogdieren1. Hoewel hondsdolheid 100% te voorkomen is door vaccinatie, blijft het een groot probleem voor de volksgezondheid en de economie in endemische landen. Van de 60.000 menselijke sterfgevallen door hondsdolheid die naar schatting elk jaar voorkomen, bevindt meer dan 95% zich in Afrika en Azië, waar honden het primaire reservoir zijn. Daarentegen heeft hondenvaccinatie geleid tot de eliminatie van hondsdolheid in West-Europa, Noord-Amerika en een groot deel van Latijns-Amerika. In deze regio's zijn reservoirs van hondsdolheid nu beperkt tot dieren in het wild, zoals vleermuizen, wasberen, stinkdieren en wilde hondachtigen. In heel Latijns-Amerika is de gewone vampiervleermuis een problematische bron van hondsdolheid vanwege de regelmatige overdracht van vleermuizen naar zowel mensen als vee tijdens nachtelijkebloedvoeding. De jaarlijkse wereldwijde economische impact van hondsdolheid wordt geschat op $ 8,6 miljard, waarbij het verlies van vee goed is voor 6%5.

Sequentiegegevens van virale pathogenen in combinatie met metadata over de timing en bron van infecties kunnen robuuste epidemiologische inzichten opleveren6. Voor RABV is sequencing gebruikt om de oorsprong van uitbraken te onderzoeken7,8, gastheerassociaties met dieren in het wild of gedomesticeerde hondente identificeren 8,9,10,11,12 en bronnen van menselijke gevallen op te sporen 13,14. Uitbraakonderzoeken met behulp van fylogenetische analyse hebben aangetoond dat hondsdolheid is ontstaan in de voorheen rabiësvrije provincie Bali, Indonesië, door een enkele introductie uit de nabijgelegen endemische gebieden van Kalimantan of Sulawesi15. Ondertussen werd in de Filippijnen bewezen dat een uitbraak op het eiland Tablas, in de provincie Romblon, werd geïntroduceerd vanaf het hoofdeiland Luzon16. Virale genomische gegevens zijn ook gebruikt om een beter inzicht te krijgen in de dynamiek van de overdracht van pathogenen die nodig is om de bestrijdingsmaatregelen geografisch te richten. Genomische karakterisering van RABV illustreert bijvoorbeeld de geografische clustering van clades 17,18,19, co-circulatie van afstammingslijnen 20,21,22, mens-gemedieerde virale beweging 17,23,24 en metapopulatiedynamiek 25,26.

Ziektemonitoring is een belangrijke functie van genomische surveillance die is verbeterd met de wereldwijde toename van de sequencingcapaciteit als reactie op de SARS-CoV-2-pandemie. Genomische surveillance heeft de real-time tracking van zorgwekkende SARS-COV-2-varianten27,28 en de bijbehorende tegenmaatregelenondersteund 6. Vooruitgang in toegankelijke sequencingtechnologie, zoals nanopore-technologie, heeft geleid tot verbeterde en meer betaalbare protocollen voor de snelle sequencing van zowel menselijke 29,30,31,32 als dierlijke33,34,35 pathogenen. In veel landen waar rabiës endemisch is, zijn er echter nog steeds belemmeringen voor het operationaliseren van de genomische surveillance van pathogenen, zoals blijkt uit de wereldwijde verschillen in de sequentiecapaciteit van SARS-CoV-236. Beperkingen in laboratoriuminfrastructuur, toeleveringsketens en technische kennis maken het opzetten en routineren van genomische surveillance een uitdaging. In dit artikel laten we zien hoe een geoptimaliseerde, snelle en betaalbare workflow voor sequencing van het hele genoom kan worden ingezet voor RABV-surveillance in omgevingen met beperkte middelen.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Medical Research Coordinating Committee van het National Institute for Medical Research (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), het ministerie van Regionaal Bestuur en Lokaal Bestuur (AB.81/288/01) en de Ifakara Health Institute Institutional Review Board (IHI/IRB/No:22-2014) in Tanzania; het Instituut voor Tropische en Infectieziekten van de Universiteit van Nairobi (P947/11/2019) en het Kenya Medical Research Institute (KEMRI-SERU; protocol nr. 3268) in Kenia; en het Research Institute for Tropical Medicine (RITM), Department of Health (2019-023) in de Filippijnen. Sequentiebepaling van monsters afkomstig uit Nigeria werd uitgevoerd op gearchiveerd diagnostisch materiaal dat was verzameld als onderdeel van nationale surveillance.

OPMERKING: Sectie 1-4 zijn vereisten. In sectie 5-16 wordt de workflow van steekproef naar sequentie naar interpretatie voor RABV-sequencing van nanoporiën beschreven (Figuur 1). Voor volgende stappen in het protocol die pulscentrifugatie vereisen, centrifugeert u op 10-15.000 x g gedurende 5-15 s.

1. Opzetten van een computeromgeving voor sequencing en data-analyse

  1. Open de website van Oxford Nanopore Technology (ONT)37 en maak een account aan om toegang te krijgen tot nanopore-specifieke bronnen.
    1. Log in en installeer de ONT sequencing en basecalling software38.
  2. Open GitHub39 en maak een account aan.
    1. Ga naar de artic-rabv40 en MADDOG repositories41 en volg de installatie-instructies.

2. Ontwerp of update het multiplex primerschema

OPMERKING: Bestaande RABV-schema's zijn beschikbaar in de artic-rabv-repository40. Wanneer men zich op een nieuw geografisch gebied richt, moet een nieuwe regeling worden ontworpen of een bestaande regeling worden gewijzigd om extra diversiteit op te nemen.

  1. Kies een genoomreferentieset om de diversiteit in het studiegebied weer te geven; dit is meestal een reeks openbaar beschikbare sequenties (bijv. van NCBI GenBank) of voorlopige interne gegevens. Volg stap 2.1.1 om RABV-GLUE42, een RABV-sequentiegegevensbron, te gebruiken om NCBI-sequenties en bijbehorende metagegevens te filteren en te downloaden.
    OPMERKING: Kies referentiesequenties met volledige genomen (d.w.z. zonder gaten en gemaskeerde basen). Het wordt aanbevolen om maximaal 10 sequenties te kiezen als referentieset voor het ontwerp van de primer. Als de beschikbare sequentiegegevens onvolledig of niet representatief zijn voor het onderzoeksgebied, raadpleeg dan het advies43,44,45 in aanvullend dossier 1.
    1. Navigeer naar de pagina NCBI RABV Sequenties per Clade in het vervolgkeuzemenu Sequentiegegevens in RABV-GLUE. Klik op de link Rabiësvirus (RABV) om toegang te krijgen tot alle beschikbare gegevens of selecteer een bepaalde clade die u interesseert. Gebruik de filteroptie om filters toe te voegen die voldoen aan de gewenste criteria (bijv. land van herkomst, sequentieduur). Download sequenties en metadata.
  2. Genereer een primerschema voor multiplex polymerasekettingreactie (PCR) volgens de instructies van Primal Scheme46. Een schema van 400 bp met een overlapping van 50 bp wordt aanbevolen om monsters van lage kwaliteit te sequencen. Download en bewaar alle uitvoer (bewerk de bestands- of primernamen niet).
    OPMERKING: Het schema wordt geïndexeerd naar de eerste sequentie in de invoerfasta, hierna aangeduid als de 'indexreferentie' (Figuur 2). Zie Aanvullend bestand 1 voor opties om de prestaties van de primer te optimaliseren.

3. Opzetten van RAMPART en ARTIC bio-informatica pipelines

  1. Raadpleeg Aanvullend bestand 2 om een mappenstructuur in te stellen voor het beheren van de invoer-/uitvoerbestanden voor RAMPART en de ARTIC-bioinformaticapijplijn.

4. Bioveiligheid en laboratoriuminrichting

  1. Behandel potentieel rabiës-positieve monsters in bioveiligheidsniveau (BSL) 2 of 3 omstandigheden.
  2. Zorg ervoor dat het laboratoriumpersoneel de vaccinatie tegen hondsdolheid vóór blootstelling heeft voltooid en de immuniteit wordt gecontroleerd volgens de aanbevelingen van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO)3.
  3. Zorg ervoor dat er specifieke standaard operationele procedures en risicobeoordelingen zijn, volgens nationale of internationale richtlijnen, voor het laboratorium.
  4. Vereiste laboratoriumopstelling: Minimaliseer besmetting door fysieke scheiding te handhaven tussen pre- en post-PCR-gebieden. Gebruik in laboratoria met beperkte ruimte of laboratoriumomgevingen in het veld draagbare handschoenkastjes of geïmproviseerde laboratoriumstations om besmetting tot een minimum te beperken.
  5. Zorg ervoor dat in dit protocol afzonderlijke gebieden worden aangewezen voor:
    1. Monsterextractie: Zet een BSL2/3-kast/handschoenenkastje op om biologisch materiaal te verwerken en inactivatie en RNA-extractie uit te voeren.
    2. Sjabloongebied: Richt een BSL1-kast/handschoenenkastje in voor de toevoeging van sjabloon (RNA/cDNA) aan de vooraf voorbereide reactiemastermix.
    3. Master mix area: Richt een aangewezen clean area in (BSL1 kast/handschoenenkastje) voor de bereiding van reagens master mixen. Er zou geen sjabloon in dit gebied moeten zijn.
    4. Post-PCR-gebied: Richt een aparte ruimte in voor het werken aan amplicons en het opstellen van sequencing-bibliotheken.
      NOTITIE: Alle gebieden moeten voor en na gebruik worden gereinigd met een oppervlakteontsmettingsmiddel en ultraviolet (UV) worden gesteriliseerd.

5. Monstername en diagnose in het veld

NOTITIE: Monsters moeten worden verzameld door opgeleid en geïmmuniseerd personeel dat persoonlijke beschermingsmiddelen draagt en de genoemde standaardprocedures47,48,49 volgt.

  1. Verzamel het monster via het foramen magnum (d.w.z. de occipitale route), zoals in detail beschreven in Mauti et al.50.
  2. Diagnose van rabiës in het veld met snelle diagnostische tests en bevestig in het laboratorium met behulp van aanbevolen procedures47, zoals de directe fluorescerende antilichaamtest (DFA), de directe snelle immunohistochemische test (DRIT)51,52 of realtime reverse transcriptie (RT)-PCR53.
  3. Gebruik bevestigde positieve hersenmonsters voor RNA-extractie of bewaar ze in een vriezer bij -20 °C gedurende 2-3 maanden of -80 °C gedurende langere perioden. Bewaar RNA voor opslag en transport met behulp van een geschikt DNA/RNA-stabilisatiemedium.

6. Monstervoorbereiding en RNA-extractie (3 uur)

NOTITIE: Gebruik een op spinkolommen gebaseerde virale RNA-extractiekit die geschikt is voor het monstertype.

  1. Bereid twee keramische kralenbuisjes voor door een PCR-buisje van 2 ml te vullen met een buisje van ongeveer 200 μl vol met keramische kralen van 1,4 mm en label het buisje.
  2. Voeg het aanbevolen volume lysisbuffer in de RNA-extractiekit toe aan de gelabelde PCR-buis.
  3. Neem ongeveer een kubus van 3 mm uit het hersenmonster dat is bevestigd met een rabiësinfectie met behulp van een houten applicator en doe het in een gelabelde buis met monster-ID en 100 μL nucleasevrij water in de buis met het label negatieve controle.
    NOTITIE: Gebruik homogenisatie op basis van gesloten buisparels om de blootstelling van het monster te beperken. Als dit niet mogelijk is, gebruik dan andere geschikte mechanische verstoorders (bijv. op basis van een rotor) of een handmatige microstamper. Deze kunnen echter minder effectief zijn dan het kloppen van kralen op een hard oppervlak om weefsel te verstoren (weefselmonsters kunnen uitharden in bepaalde opslagmedia).
  4. Verstoor het hersenweefsel handmatig met behulp van een houten applicatorstick en draai vervolgens op maximale snelheid totdat volledige weefselhomogenisatie is bereikt.
  5. Centrifugeer het lysaat volgens de instructies van de fabrikant en gebruik een pipet om het supernatans over te brengen naar een nieuw gelabeld microcentrifugebuisje. Gebruik dit supernatans alleen in de volgende stappen.
  6. Volg de instructies voor de spinkolom van de RNA-extractiekit om gezuiverd RNA te verkrijgen.
  7. Voeg hier een negatieve extractiecontrole (NEC) toe en ga helemaal door naar de sequencingfase.

7. cDNA-bereiding (20 min)

  1. Bereid in het mastermixgebied een mastermix voor de eerste streng cDNA-synthese op basis van het aantal te verwerken monsters en controles (met een overtollig volume van 10% om te zorgen voor voldoende reagens; Tabel 1). In dit stadium moet een no-template control (NTC) worden opgenomen.
  2. Label 0,2 ml PCR-stripbuisjes en aliquot 5 μL van het mastermengsel in de buisjes.
  3. Breng de voorbereide buizen naar het sjabloongebied. Voeg 5 μL RNA toe aan elke gelabelde buis, inclusief de NEC. Voeg 5 μL nucleasevrij water (NFW) toe aan de NTC.
  4. Incubeer in een thermische cycler volgens de in tabel 1 vermelde omstandigheden.
    OPMERKING: Optioneel pauzepunt: cDNA kan indien nodig maximaal 1 maand bij -20 °C worden bewaard, maar overgaan tot PCR heeft de voorkeur.

8. Voorbereiding van de voorraad van de primerpool (1 uur)

OPMERKING: Deze stap is alleen nodig als er nieuwe voorraden worden gemaakt van afzonderlijke primers, waarna vooraf voorbereide voorraadoplossingen kunnen worden gebruikt.

  1. Bereid een primerpool van 100 μM bouillon voor in het mastermixgebied.
  2. Resuspendeer de gevriesdroogde primers in 1x tris-EDTA (TE)-buffer of NFW in een concentratie van 100 μM elk. Draai grondig en draai naar beneden.
    OPMERKING: In de volgende stappen worden afzonderlijke primers gescheiden in twee primerpools - oneven genummerd (genaamd Pool A) en even genummerd (genaamd Pool B) - om interacties tussen primers die ampliconoverlappingen flankeren te voorkomen. Deze pools van primers genereren overlappende amplicons van 400 bp die het doelgenoom overspannen.
  3. Schik alle oneven genummerde primers in een buizenrek. Genereer een primerpoolvoorraad door 5 μl van elke primer toe te voegen aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml met het label "naam primerschema - Pool A (100 μM)".
  4. Herhaal het proces voor alle even genummerde primers en label als "naam primerschema - Pool B (100 μM)".
  5. Verdun elke primerpool 1:10 in water van moleculaire kwaliteit om primervoorraden van 10 μM te genereren.
    OPMERKING: Maak meerdere aliquots van 10 μM primerverdunningen en vries deze in in geval van degradatie of vervuiling.

9. Multiplex PCR (5 uur)

  1. Bereid twee PCR-mastermixen voor, één voor elke primerpool in het mastermixgebied.
    1. Gebruik een eindconcentratie van 0,015 μM per primer. Bereken het vereiste volume van de primerpool voor de PCR-reactie (tabel 2) met behulp van de volgende formule:
      Primerpoolvolume = aantal primers x reactievolume x 0,015/concentratie (μM) primermateriaal
  2. Aliquot 10 μL elk van de hoofdmix van pool A en de mastermix van pool B aan de gelabelde PCR-stripbuisjes in het sjabloongebied. Voeg voor elk monster 2,5 μL cDNA (uit stap 3) toe aan elk van de corresponderende gelabelde primer Pool A- en B-reacties. Overtollig cDNA kan worden opgeslagen bij -20 °C.
  3. Meng door zachtjes te tikken en pulscentrifugeer.
  4. Incubeer de monsters onder de in tabel 2 vermelde omstandigheden op een PCR-machine.
    OPMERKING: Het programma bevat geen specifieke uitbreidingsstap vanwege de lange gloeitijd van 5 minuten (vereist vanwege het grote aantal primers) en de korte lengte van de amplicons (400 bp) die voldoende is voor de verlenging.

10. PCR-opschoning en kwantificering (3,5 uur)

  1. Voer vanaf dit punt alle werkzaamheden uit in het post-PCR-gebied.
  2. Aliquot vaste-fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) parels in microcentrifugebuisjes van de hoofdfles. Bewaren bij 4 °C.
  3. Verwarm een SPRI-parel aliquot tot kamertemperatuur (RT; ~20 °C) en draai grondig totdat de korrels volledig in de oplossing zijn geresuspendeerd.
  4. Combineer in buisjes van 1,5 ml de primer Pool A en primer Pool B PCR-producten voor elk monster. Voeg indien nodig water toe om het volume op 25 μL te brengen.
  5. Voeg 25 μL SPRI-korrels toe aan elk monster (1:1 kraal:monsterverhouding). Meng door op en neer te pipetteren of zachtjes op de buis te tikken.
  6. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT, waarbij u af en toe de buizen omkeert of tikt.
  7. Plaats op een magnetisch rek totdat de kralen en de oplossing volledig zijn gescheiden. Verwijder het supernatant en gooi het weg, zorg ervoor dat u de kralenpellet niet verstoort.
  8. Was twee keer met 80% ethanol (opgewarmd tot RT).
    1. Voeg 200 μL ethanol toe aan de pellet. Wacht 30 s om ervoor te zorgen dat de kralen goed worden gewassen.
    2. Verwijder de supernatant voorzichtig en gooi deze weg, waarbij u probeert de kralenpellet niet aan te raken.
    3. Herhaal stap 10.8.1-10.8.2 om de pellet een tweede keer te wassen.
  9. Verwijder alle sporen van ethanol met een tip van 10 μL. Aan de lucht laten drogen totdat het spoor van ethanol is verdampt (met kleine bolletjes gebeurt dit snel, ~30 s); Wanneer dit gebeurt, moet de pellet van glanzend naar mat gaan. Zorg ervoor dat u niet te droog bent (als de pellet barst, is deze te droog), omdat dit het DNA-herstel beïnvloedt.
  10. Resuspendeer de korrels in 15 μL NFW en incubeer gedurende 10 minuten bij RT (off magnetic rack).
  11. Keer terug naar het magnetische rek en breng het supernatans (gereinigd product) over in een verse buis van 1.5 ml.
  12. Bereid een verdunning van 1:10 van elk monster in een apart buisje (2 μL product + 18 μL NFW).
    NOTITIE: Wees in dit stadium zeer voorzichtig om kruisbesmetting te voorkomen. Zorg dat er slechts één ampliconbuis tegelijk open staat. Aliquot 18 μL water eerst in de buizen (in een schoon mastermixgebied).
  13. Meet de DNA-concentratie van elk verdund monster met behulp van een zeer gevoelige en specifieke fluorometer, zoals beschreven in protocols.io54,55.

11. Normalisatie (30 min)

  1. Gebruik het normalisatiesjabloon (aanvullend bestand 3) en de DNA-concentratie (ng/μL) van elk monster om het volume verdund (of zuiver) monster te berekenen dat nodig is voor 200 fmol van elk monster in een totaal volume van 5 μL.
  2. Label nieuwe PCR-buisjes en voeg berekende volumes NFW en monster toe om genormaliseerd DNA te verkrijgen.
  3. Gebruik het berekende volume voor onverdunde (nette) monsters als er meer dan 5 μL van het verdunde monster nodig is om 200 mmol te verkrijgen.
    NOTITIE: Optioneel pauzepunt: Op dit punt kan het gereinigde PCR-product maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard of indien nodig bij -20 °C worden geplaatst voor langdurige opslag.

12. Eindvoorbereiding en barcodering (1,5 uur)

OPMERKING: De volgende stappen gaan uit van het gebruik van specifieke reagentia uit nanoporie-specifieke barcode- en ligatiesequencingkits (zie Tabel met materialen voor details). Het protocol is overdraagbaar tussen verschillende chemische versies, maar gebruikers moeten ervoor zorgen dat ze compatibele kits gebruiken, volgens de instructies van de fabrikant.

  1. Eindreparatie en dA-tailing
    1. Stel de eindreactie in voor elk monster dat in tabel 3 wordt genoemd. Bereid een mastermix voor op basis van het aantal monsters (plus 10% overschot). Wees voorzichtig bij het pipetteren, aangezien de reagentia stroperig zijn.
    2. Voeg 5 μL mastermix toe aan elk buisje genormaliseerd DNA (5 μL). Het totale reactiemengsel moet 10 μL zijn. Vervang de tips elke keer en laat slechts één buis tegelijk open.
    3. Incubeer in een thermische cycler onder de in tabel 3 vermelde omstandigheden.
  2. Streepjescodes
    1. Aliquot de streepjescodes van de barcodekit naar PCR-stripbuisjes bij 1,25 μL/buisje en noteer de streepjescode die aan elk monster is toegewezen.
    2. Voeg 0,75 μl van het eindgeprepareerde monster toe aan het toegewezen streepjescode-aliquot.
    3. Bereid een ligatiemastermix op basis van het aantal monsters (plus 10% overschot) (tabel 4).
    4. Voeg 8 μL ligatiemastermix toe aan het eindgeprepareerde monster + barcodes, waardoor een totale reactie van 10 μL ontstaat.
    5. Incubeer in een thermische cycler onder de in tabel 4 vermelde omstandigheden.
  3. SPRI kralen opruimen en DNA kwantificering
    1. Ontdooi de korte fragmentbuffer (SFB) bij RT, meng door vortexen, pulscentrifugeer en plaats op ijs.
    2. Verzamel alle monsters met streepjescode samen in een lobind microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Om het opruimvolume niet te groot te maken om te gebruiken, bundelt u 12-24 monsters (10 μL/monster), maximaal 48 monsters (5 μL/monster) of maximaal 96 monsters (2,5 μL/monster) van elke native barcodereactie.
    3. Voeg een 0,4x volume SPRI-kralen toe aan de pool met streepjescode. Meng voorzichtig (flikkeren of pipetteren) en incubeer 5 minuten bij RT.
    4. Plaats de monsters op een magneet totdat de kralen zijn gepelleteerd en het supernatans volledig helder is (~2 min). Verwijder het supernatant en gooi het weg. Zorg ervoor dat u de kralen niet verstoort.
    5. Tweemaal wassen met 250 μL SFB.
      1. Verwijder de buis van de magneet en resuspendeer de pellet volledig in 250 μL SFB. Incubeer gedurende 30 s, pulscentrifugeer en keer terug naar de magneet.
      2. Verwijder het supernatans en gooi het weg.
    6. Herhaal stap 12.3.5 om een tweede SFB-wasbeurt uit te voeren.
    7. Pulscentrifugeer en verwijder eventuele resterende SFB.
    8. Voeg 200 μL 80% (RT) ethanol toe om de pellet te wassen. Verwijder de ethanol en gooi deze weg, zorg ervoor dat u de parelkorrel niet verstoort. Laat 30 s aan de lucht drogen of totdat de pellet zijn glans heeft verloren.
    9. Resuspendeer in 22 μL NFW bij RT gedurende 10 min.
    10. Plaats op de magneet, laat ~2 minuten bezinken, verwijder dan voorzichtig de oplossing en breng over naar een schone microcentrifugebuis van 1.5 ml.
    11. Gebruik 1 μL om de DNA-concentratie te verkrijgen, zoals eerder beschreven (stap 10.13).
      OPMERKING: Optioneel pauzepunt: Op dit punt kan de bibliotheek worden opgeslagen bij 4 °C gedurende maximaal 1 week of -20 °C voor opslag op langere termijn, maar het verdient de voorkeur om door te gaan met adapterligatie en sequencing.

13. Sequencing (maximaal 48 uur)

  1. Bereid de computer voor (zie ook de secties Vereisten 1-4).
    1. Controleer of er voldoende ruimte is om nieuwe gegevens op te slaan (min. 150 GB), of er een back-up is gemaakt van de gegevens van oude uitvoeringen/naar een server wordt verplaatst voordat ze worden verwijderd, en of de nieuwste versie van MinKNOW is geïnstalleerd.
  2. Haal de opgeslagen stroomcel uit de koelkast en laat deze RT bereiken.
  3. Adapter ligatie (1 uur)
    1. Pulscentrifugeer het adaptermengsel en ligase en plaats op ijs.
    2. Ontdooi elutiebuffer (EB), SFB en ligatiebuffer bij RT. Meng door vortexen, pulscentrifugeer en plaats op ijs.
    3. Bereid de mastermix voor het afbinden van de adapter (tabel 5) voor, waarbij de reagentia in de aangegeven volgorde worden gecombineerd in een buis met lage binding.
      OPMERKING: Afhankelijk van de beschikbaarheid in het laboratorium kunnen alternatieven voor adapterligatiemastermixreagentia (tabel 5) worden gebruikt. Zie Aanvullend Dossier 3 en Tabel van Materialen voor een lijst van alternatieven. Gebruik berekeningen in het werkblad Aanvullend bestand 3 om het volume van de DNA-bibliotheek gelijk te krijgen aan 200 fmol. Als er minder dan 20 μl wordt berekend, voeg dan NFW toe om tot 20 μl te komen.
    4. Meng door zachtjes te tikken en pulscentrifugeer. Incubeer bij RT gedurende 20 min.
      OPMERKING: Begin tijdens de incubatie met het voorbereiden van de stroomcel (paragraaf 13.5).
  4. Reinig met SPRI-korrels (gebruik geen ethanol zoals bij eerdere schoonmaakbeurten).
    1. Voeg een 0,4x volume SPRI kralen (RT) toe aan de monsters. Incubeer 10 minuten bij RT, tik zachtjes met tussenpozen om het mengen te vergemakkelijken.
    2. Plaats op de magneet totdat de kralen en de oplossing volledig zijn gescheiden (~5 min). Verwijder de supernatant en gooi deze weg; Zorg ervoor dat u de kralenkorrel niet verstoort.
    3. Tweemaal wassen met 125 μL SFB.
    4. Resuspendeer de pellet volledig met 125 μL SFB door te mengen met een pipet. Laat 30 s incuberen.
    5. Pulscentrifuge om vloeistof op te vangen aan de basis van de buis en op de magneet te plaatsen. Verwijder het supernatans en gooi het weg.
    6. Herhaal stap 13.4.4-13.4.5 om de pellet een tweede keer te wassen.
    7. Pulscentrifugeer en verwijder overtollige SFB.
    8. Resuspendeer in 15 μL EB en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
    9. Keer terug naar de magneet gedurende ~2 minuten en breng de oplossing vervolgens voorzichtig over in een schone microcentrifugebuis van 1.5 ml.
    10. Kwantificeer 1 μL van de geëlueerde bibliotheek, zoals eerder beschreven in stap 10.13
      OPMERKING: Ga voor de beste resultaten direct verder met MinION-sequencing; de uiteindelijke bibliotheek kan echter indien nodig maximaal 1 week in EB bij 4 °C worden bewaard.
  5. Voer een kwaliteitscontrole van de stroomcel uit.
    1. Sluit het sequencing-apparaat aan op een laptop en open de sequencing-software.
    2. Selecteer het type stroomcel en klik vervolgens op Stroomcel controleren en test starten.
    3. Eenmaal voltooid, wordt het totale aantal actieve (d.w.z. levensvatbare) poriën weergegeven. Een nieuwe flowcel moet >800 actieve poriën hebben; Als dit niet het geval is, neem dan contact op met de fabrikant voor een vervanging.
  6. Vullen en laden van de flowcel (20 min)
    1. Ontdooi de volgende reagentia bij RT en plaats vervolgens de sequencingbuffer, een spoelketting, spoelbuffer en laadparels op ijs.
    2. Draai de sequentiebuffer en spoelbuffer vortex, pulscentrifugeer en plaats op ijs.
    3. Pulscentrifugeer de spoelketting en meng door te pipetteren; Leg ze vervolgens op ijs.
    4. Bereid de flow cell priming mix voor door 30 μL flush tether rechtstreeks toe te voegen aan de buis van de flush buffer uit een flow cell priming kit en meng door te pipetteren.
    5. Meng de laadparels door direct voor gebruik te pipetteren, omdat ze snel bezinken.
    6. Bereid in een nieuwe tube de laatste bibliotheekverdunning voor sequencing voor, zoals vermeld in tabel 5.
      OPMERKING: Gebruik berekeningen in het werkblad Aanvullend bestand 3 om het volume van de DNA-bibliotheek gelijk aan 50 mmol te krijgen. Als er minder dan 12 μl wordt berekend, voeg dan EB toe om tot 12 μl te komen.
    7. Klap het deksel van het sequencingapparaat terug en schuif het deksel van de aanzuigpoort met de klok mee zodat de aanzuigpoort zichtbaar is (Figuur 3)
    8. Verwijder luchtbellen voorzichtig door een P1000-pipet in te stellen op 200 μL, steek de punt in de aanzuigpoort en draai aan het wiel totdat een klein volume de pipetpunt binnenkomt (max. draaien naar 230 μL).
    9. Laad 800 μL flowcel-primingmix in de flowcel via de priming-poort, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
    10. Laat 5 minuten intrekken.
    11. Til het deksel van de monsterpoort voorzichtig op en laad 200 μL aanzuigmengsel in de stroomcel via de aanzuigpoort met behulp van een P1000-pipet.
    12. Pipeteer de bibliotheekmix op en neer voordat u deze laadt, en zorg ervoor dat de laadparels in de mastermix opnieuw worden gesuspendeerd voordat u deze laadt.
    13. Laad 75 μL bibliotheekmengsel druppelsgewijs in de stroomcel via de monsterpoort. Zorg ervoor dat elke druppel in de poort stroomt voordat u de volgende toevoegt.
    14. Plaats het deksel van de monsterpoort voorzichtig terug en zorg ervoor dat de stop in de monsterpoort komt.
    15. Sluit de ontluchtingspoort en plaats het deksel van het sequencingapparaat terug.
  7. Sequentiereeks (maximaal 48 uur)
    1. Sluit het sequencing-apparaat aan op de laptop en open de sequencing-software.
    2. Klik op start en klik vervolgens op Sequencing starten.
    3. Klik op Nieuw experiment en volg de GUI-werkstroom (Graphical User Interface) van de sequencingsoftware om de parameters voor de uitvoering in te stellen.
    4. Typ de naam van het experiment en de voorbeeld-id (bijvoorbeeld rabv_run1) en kies het type stroomcel in de vervolgkeuzelijst.
    5. Ga verder met het selecteren van de kit en kies de relevante ligatiesequencingkit en native barcodekit(s) die worden gebruikt.
    6. Ga door met opties voor uitvoeren . Behoud de standaardinstellingen, tenzij het gewenst is dat de run automatisch stopt na een bepaald aantal uren (runs kunnen op elk moment handmatig worden gestopt).
    7. Ga verder naar Basecalling. Kies ervoor om Basecalling in of uit te schakelen, afhankelijk van de computerbronnen (zie computerinstellingen). Kies Opties bewerken onder streepjescode en zorg ervoor dat Barcode Both Ends is ingeschakeld. Sla op en ga verder naar het uitvoergedeelte.
    8. Accepteer de standaardinstellingen en ga verder met de laatste beoordeling, controleer de instellingen en noteer de details in het werkblad (aanvullend bestand 3). Klik op Start.
      NOTITIE: Als de stroomcel opnieuw wordt gebruikt, pas dan de startspanning aan (in het geavanceerde gedeelte van de run-opties), zoals aangegeven door het schema in aanvullend bestand 3.
    9. Noteer de eerste actieve kanalen - als dit aanzienlijk lager is dan de kwaliteitscontrole (QC), start u de sequencing-software opnieuw. Als het nog steeds lager is, start u de computer opnieuw op.
    10. Noteer de initiële kanalen in streng versus enkele porie om een geschatte poriebezetting te geven. Dit aantal zal fluctueren, dus geef een benadering.
    11. Houd de uitvoering in de gaten naarmate deze vordert.

14. Live en offline basecalling

OPMERKING: Deze instructies gaan ervan uit dat de reeds bestaande mappenstructuur in de artic-rabv-repository is opgenomen en dat de secties 1 en 3 van het protocol zijn gevolgd.

  1. Maak op uw lokale bestandssysteem een nieuwe map met de naam analyse, waarin u al uw analyse-uitvoer opslaat. Om verder te organiseren: maak een submap met de naam van uw project en daarbinnen een nieuwe map voor de run, met behulp van de voorbeeld-ID die aan de MinKNOW is verstrekt als de run_name. Doe dit in één commando als volgt:
    mkdir -p
    analyse/project_name/run_name
    Navigeer vervolgens naar de locatie:
    cd
    pad/analyse/project_name/run_name
  2. Live honkbellen
    OPMERKING: Om nanopore basecalling in realtime uit te voeren, hebben laptops een NVIDIA CUDA-compatibele grafische verwerkingseenheid (GPU) nodig. Zorg ervoor dat de instructies voor het instellen van de GPU-basisoproep zijn uitgevoerd met behulp van het guppy-protocol56.
    1. Schakel tijdens het instellen van de run live basecalling in.
    2. Gebruik RAMPART om de sequencingdekking in realtime te volgen, volgens de onderstaande instructie.
    3. Activeer in de terminal van de computer de artic-rabv conda-omgeving:
      Conda activeren Artic-rabv
    4. Maak een nieuwe map voor de waluitvoer in de run_name map en navigeer ernaartoe:
      cd /pad/analyse/project_name/run_name
      MKDIR rampart_output
      cd rampart_output
    5. Maak een bestand .csv streepjescodes om de streepjescodes en voorbeeldnamen te koppelen. Het moet één regel per streepjescode hebben en alleen streepjescodes specificeren die in de bibliotheek aanwezig zijn, met de kopjes "streepjescode" en "voorbeeld". Volg het voorbeeld in de artic-rabv directory:
      analyse/example_project/example_run/rampart_output/barcodes.csv
    6. Start RAMPART door de relevante protocolmap en het pad naar de fastq_pass map in de MinKNOW-uitvoer voor de uitvoering op te geven:
      rampart --protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol - basecalledPath
    7. Open een browservenster en navigeer naar localhost:3000 in het URL-vak. Wacht tot er voldoende gegevens zijn gecalld voordat de resultaten op het scherm verschijnen.
  3. Offline basecalling (uitgevoerd na het hardlopen)
    1. Als live basecalling niet is ingesteld, is de uitvoer van MinKNOW onbewerkte signaalgegevens (fast5-bestanden). Men zal RAMPART niet kunnen gebruiken tijdens de run. Converteer de fast5-bestanden naar basecall-gegevens (fastq-bestanden) na het uitvoeren met behulp van guppy (zie setup in Vereisten stap 1.1.1.). Voer RAMPART post-hoc uit op de basisaangeroepen gegevens.
    2. Voer de guppy basecaller uit:
      guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /path/to/reads/fast5_* -s /path/analysis/project_name/run_name -x auto -r
      -c is het configuratiebestand om het basecall-model te specificeren, -i is het invoerpad, -s is het opslagpad, -x specificeert basecalling door het GPU-apparaat (exclusief als de computerversie van guppy wordt gebruikt) en -r specificeert het recursief zoeken naar invoerbestanden.
      OPMERKING: Het configuratiebestand (.cfg) kan worden gewijzigd in een zeer nauwkeurige basecaller door _fast te vervangen door _hac, hoewel dit aanzienlijk langer zal duren.

15. Wassen van de flowcellen

  1. De flowcellen kunnen worden gewassen en hergebruikt om nieuwe bibliotheken te sequencen als de poriën nog levensvatbaar zijn. Zie instructies voor het wassen bij het ONT-wasprotocol57 voor stroomcellen.

16. Analyse en interpretatie

  1. Consensussequentiegeneratie met ARTIC-bioinformaticapijplijn
    1. Volg de instructies in de artic-rabv GitHub repository40 in de map rabv_protocols om consensussequenties te genereren van raw fast5 of basecalled fastq bestanden.
      OPMERKING: Raadpleeg Artic pipeline - Core pipeline58 voor meer informatie.
  2. Optioneel: Analyseer de gemiddelde leesdiepte per amplicon.
    1. Pas de scripts aan die beschikbaar zijn in de artic-rabv-repository, verwijzend naar aanvullend bestand 1. In het kort worden diepgaande statistieken gegenereerd met behulp van SAMtools59 en dekking per nucleotide uitgezet in R.
  3. Fylogenetische analyse met behulp van GLUE
    1. Selecteer in RABV_GLUE42 het tabblad Analyse > het tabblad Genotypering en interpretatie > Bestanden toevoegen en selecteer het fasta-bestand met consensussequenties.
    2. Klik op Verzenden en wacht. Zodra de analyses zijn voltooid, is de knop Analyse weergeven beschikbaar om op te klikken, met klade- en subcladetoewijzingen, dekking per gen, variatie ten opzichte van referentiesequenties en naaste verwant.
    3. Relevante contextuele sequenties kunnen ook worden geïdentificeerd in de sectie Sequentiegegevens > NCBI-sequenties per clade .
    4. Selecteer de geïdentificeerde clade of klik op Rabiësvirus (RABV) om alle beschikbare sequenties te zien.
    5. Filter op relevante sequenties (bijv. land van herkomst).
    6. Download deze sequenties en bijbehorende metadata voor analyse en vergelijking.
  4. Afstammingstoewijzing met behulp van MADDOG41
    1. Haal de MADDOG-repository uit GitHub om er zeker van te zijn dat u met de meest up-to-date versie werkt.
    2. Maak een toewijzingsmap in de lokale MADDOG-opslagplaats (eerder gemaakt in de sectie Vereisten) met de naam van de uitvoering.
    3. Voeg in de map het fasta-bestand toe met de consensussequenties.
    4. Voeg een metadatabestand toe aan de map.
      OPMERKING: Dit bestand moet een csv zijn met 4 kolommen met de naam 'ID', 'land', 'jaar' en 'toewijzing', met details over de sequentie-ID's, het land van bemonstering en het jaar van monsterverzameling, terwijl de kolom 'toewijzing' leeg moet zijn.
    5. Activeer in de opdrachtregelinterface de conda-omgeving: conda activeer MADDOG.
    6. Navigeer in de opdrachtregelinterface naar de map MADDOG-opslagplaats.
    7. Voer in eerste instantie de afstammingstoewijzing uit op sequenties om te controleren op mogelijke afwijkingen en om te bepalen of het uitvoeren van de langere afstammingsaanduidingsstap geschikt zou zijn. Typ hiervoor dit in de opdrachtregel: sh assignment.sh.
    8. Wanneer daarom wordt gevraagd, voer je Y in om aan te geven dat je de repository hebt opgehaald en werkt met de meest up-to-date versie van MADDOG.
    9. Voer desgevraagd de naam in van de map in de MADDOG-opslagplaatsmap die het fasta-bestand bevat.
    10. Wanneer de herkomsttoewijzing is voltooid, controleert u het uitvoerbestand in uw map. Als de uitvoer is zoals verwacht en er meerdere sequenties zijn toegewezen aan dezelfde herkomst, voert u de herkomstaanduiding uit.
    11. Als u de herkomstaanduiding uitvoert, verwijdert u het zojuist gemaakte uitvoerbestand van de opdracht.
    12. Voer in de terminal, in de map van de MADDOG-repository, het commando sh designation.sh uit.
    13. Wanneer daarom wordt gevraagd, voert u Y in om aan te geven dat u de repository hebt opgehaald en met de meest up-to-date versie van MADDOG werkt.
    14. Voer desgevraagd de mapnaam in de MADDOG-repositorymap in met het fasta-bestand en de metadata. Dit levert afstammingsinformatie op over elke sequentie, een fylogenie van de nieuwe en relevante eerdere sequenties (vanaf 16.3.6), hiërarchische informatie over de afstammingslijnen en details van mogelijk opkomende afstammingslijnen en gebieden van onderbemonstering.
      OPMERKING: Volledige details van het protocol, het gebruik en de uitvoer zijn te vinden in Campbell et al.60.
    15. Wanneer de eerste analyse is voltooid, voert u Y in als u wordt gevraagd om ook te testen op opkomende en onderbemonsterde afstammingslijnen, indien dit vereist is. Voer anders N in.
    16. Als u wordt gevraagd om nieuw gevonden afstammingslijnen te bevestigen, voert u Y in en volgt u de instructies in het resulterende NEXT_STEPS.eml-bestand. Voer anders N in.

Representative Results

De sample-to-sequence-to-interpretation workflow voor RABV die in dit protocol wordt beschreven, is met succes gebruikt in verschillende laboratoriumomstandigheden in endemische landen, zoals Tanzania, Kenia, Nigeria en de Filippijnen (Figuur 4). Het protocol werd gebruikt voor verschillende soorten monsters en omstandigheden (tabel 6): vers en ingevroren hersenweefsel, cDNA- en RNA-extracten van hersenweefsel dat gedurende langere perioden onder de koudeketen werd getransporteerd, en FTA-kaarten met uitstrijkjes van hersenweefsel.

Live basecalling met behulp van RAMPART (Figuur 5) toont de bijna real-time generatie van reads en de procentuele dekking per sample. Dit is vooral handig om te beslissen wanneer de run moet worden gestopt en de flowcel moet worden bewaard voor hergebruik. Er werd variatie in looptijd waargenomen, waarbij sommige binnen 2 uur klaar waren, terwijl andere meer dan 12 uur nodig hadden om een voldoende dekkingsdiepte (x100) te bereiken. We kunnen ook regio's bekijken met een slechte versterking; Figuur 6 toont bijvoorbeeld een momentopname van één sequencing-run waarbij dekkingsprofielen enkele amplicons vertonen met een zeer lage versterking, wat wijst op mogelijk problematische primers. Door deze slecht versterkende regio's grondiger te onderzoeken, hebben we primer-mismatches kunnen identificeren, waardoor we individuele primers opnieuw kunnen ontwerpen en verbeteren. Sommige primerschema's hebben meer mismatches laten zien dan andere. Dit wordt waargenomen in het Oost-Afrikaanse primerschema, in vergelijking met de Filippijnen, in overeenstemming met de beoogde diversiteit, aangezien het Oost-Afrika-schema tot doel heeft een veel bredere diversiteit vast te leggen.

RABV-GLUE42, een algemene bron voor het beheer van RABV-genoomgegevens, en MADDOG60, een afstammingsclassificatie- en nomenclatuursysteem, werden gebruikt om de resulterende RABV-sequenties samen te stellen en te interpreteren. Tabel 7 geeft een overzicht van de grote en kleine clades die circuleren in elk land dat met behulp van RABV-GRUE is toegewezen. Ook wordt een hogere resolutie classificatie van lokale afstammingslijnen getoond na de MADDOG-opdracht.

Figure 1
Figuur 1: Sample-to-sequence-to-interpretation workflow voor RABV. Samengevatte stappen worden getoond voor (A) monstervoorbereiding, (B) PCR- en bibliotheekvoorbereiding, en (C) sequencing en bio-informatica tot analyse en interpretatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schema van het primerschema. Gloeiposities langs het 'indexreferentiegenoom' (donkerpaars) voor paren voorwaartse en achterwaartse primers (halve pijlen), die in twee afzonderlijke pools zijn ingedeeld: A (rood) en B (groen). Primerparen genereren overlappende amplicons van 400 bp (blauw) die opeenvolgend zijn genummerd langs het indexreferentiegenoom in het formaat 'scheme_name_X_DIRECTION', waarbij 'X' een getal is dat verwijst naar het amplicon dat door de primer wordt gegenereerd en 'DIRECTION' 'LINKS' of 'RECHTS' is, dat respectievelijk de vooruit of achteruit beschrijft. Oneven of even waarden van 'X' bepalen de pool (respectievelijk A of B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Nanopore flow cel48. Blauwe labels illustreren de verschillende onderdelen van de flowcel, waaronder het deksel van de primingpoort dat de primingpoort bedekt waar de primingoplossing wordt toegevoegd, het deksel van de SpotON-monsterpoort dat de monsterpoort bedekt waar het monster druppelsgewijs wordt toegevoegd, de afvalpoorten 1 en 2 en de flowcel-ID. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Kaart met de locatie waar RABV-sequencing werd uitgevoerd met behulp van de geoptimaliseerde workflow in 2021 en 2022. De grootte en kleur van de bellen komen overeen met het aantal sequenties per locatie, waarbij kleiner en donkerder minder is, terwijl groter en lichter meer is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Afbeelding 5: Screenshot van RAMPART-visualisatie in webbrowser. Barcodenamen worden vervangen door voorbeeldnamen volgens de bio-informatica-opstelling. De bovenste drie panelen tonen samenvattende plots voor de hele run: dekkingsdiepte van in kaart gebrachte reads voor elke streepjescode per nucleotidepositie op het indexreferentiegenoom (linksboven, gekleurd door streepjescode), opgetelde in kaart gebrachte lezingen van alle streepjescodes in de loop van de tijd (midden boven) en in kaart gebrachte lezingen per streepjescode (rechtsboven, gekleurd door streepjescode). Onderste panelen tonen rijen plots per streepjescode. Van links naar rechts: de dekkingsdiepte van in kaart gebrachte reads per nucleotidepositie op het indexreferentiegenoom (links), lengteverdeling van in kaart gebrachte reads (midden) en het aandeel nucleotideposities op het indexreferentiegenoom die in de loop van de tijd een dekking van 10x, 100x en 1.000x van in kaart gebrachte reads hebben verkregen (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Een voorbeeld van een leesdekking over het genoom voor een rabiësvirusmonster uit de Filippijnen waarvan de sequentie is bepaald met behulp van het protocol. De leesdekking op elke nucleotidepositie in het genoom wordt weergegeven, naast de positie van de overlappende amplicons (1-41) die worden gebruikt om de bibliotheek te genereren. Pieken in de dekkingsdiepte komen overeen met overlappingsgebieden met ampliconen. Amplicons met een lage dekkingsdiepte komen overeen met overlappende gebieden met amplicon. Amplicons met een lage dekkingsdiepte worden rood gemarkeerd om problematische regio's aan te geven die mogelijk moeten worden geoptimaliseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Condities voor mastermix en thermische cycler voor cDNA-preparaat. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Mastermix- en thermische cyclercondities voor multiplex-PCR. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Condities van het mastermengsel en de thermische cycler voor de eindvoorbereidingsreactie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Condities voor het mastermengsel en de thermische cycler voor barcodering. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Adapter ligation master mix en final library dilution for sequencing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: Het aantal gegenereerde sequenties van het hele genoom van het rabiësvirus en het type monsters dat in verschillende landen is gebruikt met behulp van de workflow van monster naar sequentie naar interpretatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 7: Grote en kleine clade-toewijzingen van RABV-GLUE en afstammingstoewijzingen van MADDOG voor sequenties die zijn gegenereerd met behulp van de workflow. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Ontwerp en optimalisatie van het inleidingsschema, en analyse van de ampliconleesdiepte. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Computationele setup Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: RABV WGS-protocol werkblad Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Brunker et al.61 ontwikkelden een toegankelijke RABV, op nanoporiën gebaseerde, volledige genoomsequencing-workflow met behulp van bronnen van het ARTIC-netwerk46. Hier presenteren we een bijgewerkte workflow, met volledige stappen van monster naar sequentie naar interpretatie. De workflow beschrijft de voorbereiding van hersenweefselmonsters voor sequencing van het hele genoom, presenteert een bio-informaticapijplijn om lezingen te verwerken en consensussequenties te genereren, en belicht twee rabiës-specifieke tools om de toewijzing van afstammingslijnen te automatiseren en de fylogenetische context te bepalen. De bijgewerkte werkstroom biedt ook uitgebreide instructies voor het instellen van geschikte reken- en laboratoriumwerkruimten, met overwegingen voor implementatie in verschillende contexten (inclusief instellingen met weinig middelen). We hebben de succesvolle implementatie van de workflow aangetoond in zowel academische als onderzoeksinstellingen in vier RABV endemische LMIC's met geen of beperkte genomische surveillancecapaciteit. De workflow is veerkrachtig gebleken voor toepassing in verschillende omgevingen en begrijpelijk voor gebruikers met verschillende expertises.

Deze workflow voor RABV-sequencing is het meest uitgebreide openbaar beschikbare protocol (dat stappen van monster naar sequentie naar interpretatie omvat) en specifiek is aangepast om zowel de opstart- als de bedrijfskosten te verlagen. De tijd en kosten die nodig zijn voor de voorbereiding en sequencing van bibliotheken met nanoporietechnologie worden aanzienlijk verminderd in vergelijking met andere platforms, zoals Illumina61, en voortdurende technologische ontwikkelingen verbeteren de kwaliteit en nauwkeurigheid van de sequentie om vergelijkbaar te zijn met Illumina62.

Dit protocol is ontworpen om veerkrachtig te zijn in diverse contexten met weinig middelen. Door te verwijzen naar de richtlijnen voor probleemoplossing en wijzigingen die naast het kernprotocol worden gegeven, worden gebruikers ondersteund om de workflow aan hun behoeften aan te passen. De toevoeging van gebruiksvriendelijke bio-informaticatools aan de workflow vormt een belangrijke ontwikkeling ten opzichte van het oorspronkelijke protocol, omdat het snelle en gestandaardiseerde methoden biedt die kunnen worden toegepast door gebruikers met minimale eerdere bio-informatica-ervaring om sequentiegegevens in lokale contexten te interpreteren. De capaciteit om dit in situ te doen wordt vaak beperkt door de noodzaak om over specifieke programmeer- en fylogenetische vaardigheden te beschikken, die een intensieve en langdurige investering in vaardigheidstraining vereisen. Hoewel deze vaardigheden belangrijk zijn om sequentiegegevens grondig te interpreteren, zijn eenvoudige en toegankelijke interpretatietools even wenselijk om lokale "sequencing-kampioenen" te capaciteren, wier kernexpertise mogelijk op natte laboratoria is gebaseerd, waardoor ze hun gegevens kunnen interpreteren en er eigenaar van kunnen worden.

Aangezien het protocol al een aantal jaren in verschillende landen wordt toegepast, kunnen we nu richtlijnen geven voor het optimaliseren van multiplex-primerschema's om de dekking te verbeteren en om te gaan met geaccumuleerde diversiteit. Er zijn ook inspanningen geleverd om gebruikers te helpen de kosteneffectiviteit te verbeteren of om de aanschaf in een bepaalde regio te vergemakkelijken, wat doorgaans een uitdaging is voor de duurzaamheid van moleculaire benaderingen63. In Afrika (Tanzania, Kenia en Nigeria) hebben we bijvoorbeeld gekozen voor blunt/TA-ligase-mastermix bij de adapterligatiestap, die gemakkelijker verkrijgbaar was bij lokale leveranciers en een goedkoper alternatief was voor andere ligatiereagentia.

Uit ervaring blijkt dat er verschillende manieren zijn om de kosten per monster en per run te verlagen. Het verminderen van het aantal monsters per run (bijv. van 24 naar 12 samples) kan de levensduur van flowcellen over meerdere runs verlengen, terwijl het verhogen van het aantal monsters per run de tijd en reagentia maximaliseert. In onze handen waren we in staat om flowcellen te wassen en te hergebruiken voor één op de drie sequencing-runs, waardoor nog eens 55 monsters konden worden gesequenced. Door de flowcel direct na gebruik te wassen, of indien niet mogelijk, de afvalvloeistof na elke run uit het afvalkanaal te verwijderen, leek het aantal beschikbare poriën voor een tweede run te behouden. Rekening houdend met het aanvankelijke aantal poriën dat beschikbaar is in een stroomcel, kan één run ook worden geoptimaliseerd om te plannen hoeveel monsters in een bepaalde stroomcel moeten worden uitgevoerd.

Hoewel de workflow ernaar streeft zo uitgebreid mogelijk te zijn, met de toevoeging van gedetailleerde richtlijnen en bewegwijzerde bronnen, is de procedure nog steeds complex en kan het ontmoedigend zijn voor een nieuwe gebruiker. De gebruiker wordt aangemoedigd om persoonlijke training en ondersteuning te zoeken, idealiter lokaal, of anders via externe medewerkers. In de Filippijnen bijvoorbeeld heeft een project over capaciteitsopbouw binnen regionale laboratoria voor SARS-CoV-2-genomische surveillance met behulp van ONT kerncompetenties ontwikkeld onder diagnostici in de gezondheidszorg die gemakkelijk kunnen worden overgedragen op RABV-sequencing. Belangrijke stappen, zoals het opruimen van SPRI-parels, kunnen moeilijk onder de knie te krijgen zijn zonder praktische training, en ineffectief opruimen kan de stroomcel beschadigen en de run in gevaar brengen. Monsterbesmetting is altijd een groot probleem wanneer amplicons in het laboratorium worden verwerkt en kan moeilijk te elimineren zijn. Met name kruisbesmetting tussen monsters is uiterst moeilijk te detecteren tijdens bio-informatica na het uitvoeren van gegevens. Goede laboratoriumtechnieken en -praktijken, zoals het handhaven van schone werkoppervlakken, het scheiden van pre- en post-PCR-gebieden en het opnemen van negatieve controles, zijn absoluut noodzakelijk om kwaliteitscontrole te garanderen. Het snelle tempo van de ontwikkelingen op het gebied van nanoporiesequencing is zowel een voordeel als een nadeel voor routinematige RABV-genomische surveillance. De voortdurende verbeteringen aan de nauwkeurigheid, de toegankelijkheid, en het protocolrepertoire van nanopore verbreden en verbeteren het werkingsgebied voor zijn toepassing. Dezelfde ontwikkelingen maken het echter een uitdaging om standaard operationele procedures en bio-informaticapijplijnen te onderhouden. In dit protocol bieden we een document dat helpt bij de overgang van oudere naar huidige voorbereidingskits voor nanoporiebibliotheken (Tabel met materialen).

Een veel voorkomende hindernis voor sequencing in LMIC's is toegankelijkheid, waaronder niet alleen de kosten, maar ook de mogelijkheid om tijdig verbruiksartikelen aan te schaffen (met name sequencing-reagentia, die relatief nieuw zijn voor inkoopteams en leveranciers) en rekenkracht, evenals simpelweg toegang hebben tot stabiele stroom en internet. Het gebruik van draagbare nanoporie-sequencingtechnologie als basis van deze workflow helpt bij veel van deze toegankelijkheidsproblemen, en we hebben het gebruik van ons protocol in een reeks instellingen gedemonstreerd, waarbij we het volledige protocol en de analyse in het land hebben uitgevoerd. Toegegeven, het tijdig aanschaffen van apparatuur en het rangschikken van verbruiksartikelen blijft een uitdaging en in veel gevallen waren we genoodzaakt om reagentia uit het VK te vervoeren of te verzenden. In sommige gebieden konden we echter volledig vertrouwen op lokale aanvoerroutes voor reagentia, waarbij we profiteerden van investeringen in SARS-CoV-2-sequencing (bijv. de Filippijnen) die de inkoopprocessen hebben gestroomlijnd en een begin hebben gemaakt met het normaliseren van de toepassing van pathogene genomica.

De behoefte aan een stabiele internetverbinding wordt geminimaliseerd door eenmalige installaties; GitHub-repositories, softwaredownload en nanopore-sequencing zelf hebben bijvoorbeeld alleen internettoegang nodig om de run te starten (niet overal) of kunnen volledig offline worden uitgevoerd met toestemming van het bedrijf. Als er mobiele data beschikbaar is, kan een telefoon worden gebruikt als hotspot voor de laptop om de sequencing-run te starten, voordat de verbinding wordt verbroken voor de duur van de run. Bij het routinematig verwerken van monsters kunnen de vereisten voor gegevensopslag snel toenemen en idealiter worden gegevens op een server opgeslagen. Anders zijn solid state drive (SSD) harde schijven relatief goedkoop te verkrijgen.

Hoewel we erkennen dat er nog steeds belemmeringen zijn voor genomische surveillance in LMIC's, suggereert de toenemende investering in het opbouwen van toegankelijkheid en expertise op het gebied van genomica (bijv. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa BGA])64 dat deze situatie zal verbeteren. Genomische surveillance is van cruciaal belang voor pandemische paraatheid6, en capaciteit kan worden vastgesteld door de genomische surveillance van endemische pathogenen zoals RABV routinematig te maken. De wereldwijde verschillen in sequentiecapaciteit die tijdens de SARS-CoV-2-pandemie aan het licht zijn gekomen, zouden een katalysator moeten zijn voor katalytische verandering om deze structurele ongelijkheden aan te pakken.

Deze workflow van steekproef naar sequentie naar interpretatie voor RABV, inclusief toegankelijke bio-informaticatools, heeft het potentieel om te worden gebruikt als leidraad voor controlemaatregelen die gericht zijn op het doel van nul menselijke sterfgevallen door hondsgemedieerde hondsdolheid tegen 2030, en uiteindelijk voor de eliminatie van RABV-varianten. In combinatie met relevante metadata, maken genomische gegevens die uit dit protocol worden gegenereerd een snelle RABV-karakterisering mogelijk tijdens uitbraakonderzoeken en bij de identificatie van circulerende afstammingslijnen in een land of regio60,61,65. We illustreren onze pijplijn voornamelijk aan de hand van voorbeelden van hond-gemedieerde hondsdolheid; De workflow is echter direct toepasbaar op rabiës in het wild. Deze overdraagbaarheid en lage kosten minimaliseren de uitdagingen bij het gemakkelijk beschikbaar maken van routinematige sequencing, niet alleen voor hondsdolheid maar ook voor andere ziekteverwekkers46,66,67, om het ziektebeheer en de bestrijding te verbeteren.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton-financiering van de Medical Research Council [MR/R025649/1] en het Filippijnse ministerie van Wetenschap en Technologie (DOST), de UK Research and Innovation Global effort on COVID-19 [MR/V035444/1], het University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], en International Partnership Development Fund, een DOST British Council-Philippines studentship (CB), een National Institute for Health Research [17/63/82] GemVi scholarship (GJ), en University of Glasgow studentships van de MVLS DTP (KC) [125638-06], de EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1], en de Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. We zijn de collega's en medewerkers die dit werk hebben gesteund dankbaar: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana en Anna Czupryna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brand name
Software
Sequencing software
(MinKnow)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/downloads
Bioinformatics tool kit
(Guppy)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
Equipment
Thermal cycler
(miniPCR™ mini16 thermal cycler)		 Cambio MP-QP-1016-01
Homogenizer
(Precellys Evolution Touch Homogenizer)		 Bertin Instruments EQ02520-300
Cold Racks (0.2-0.5mL)
(PCR Mini-cooler with transparent lid)		 BRAND  781260
Pipettor
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) Gilson  SKU: FA10030
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) Gilson  SKU: FA10024
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) Gilson  SKU: FA10020
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) Gilson  SKU: FA10025
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) Gilson  SKU: FA10021
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) Gilson  SKU: FA10026
Fluorometer
(Qubit  4 Fluorometer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q33238
Laptop 
(Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU])
Microcentrifuge
(Refrigerated centrifuge)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 75004081
Vortex mixer
(Basic vortex mixer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 88882011
Magnetic rack
(DynaMag -2 Magnet)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 12321D
Sequencing device
(MinION)		 Oxford Nanopore Technologies MinION Mk1B
RNA Extraction 
RNA extraction kit
(Qiagen RNEasy Mini Kit 250)		 Qiagen 74106
RNA stabilizing reagents 
(RNA later)  Invitrogen AM7020
(DNA/RNA Shield) Zymo Research R1100-50
PCR
Nuclease-free Water
(Nuclease-free Water [not  DEPC-treated])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific AM9937
Master mix for first strand cDNA synthesis
(LunaScript RT SuperMix Kit)		 New England Biolabs E3010S
DNA amplification master mix
(Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])		 New England Biolabs M0494L
Primer (Scheme)
(Custom DNA oligos)		 Invitrogen
SPRI Bead Clean-up
SPRI beads
(Aline Biosciences PCR Clean DX )		 Cambio AL-AC1003-50
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] Merck 818760
Short Fragment buffer
(SFB expansion pack)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-SFB001
DNA Quantification
DNA quantification kit
(Qubit® dsDNA HS Assay Kit)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32854
DNA quantification assay tubes
(Qubit™ Assay Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32856
End Prep and barcoding
(Qubit™ Assay Tubes)
End Prep master mix
(NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)		 New England Biolabs E7546L
Barcoding kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9 
(Native Barcoding Expansion 1-12) EXP-NBD104 
(Native Barcoding Expansion 13-24)  EXP-NBD114 
(Native Barcoding Expansion 96) EXP-NBD196
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
(not compatible)  (not compatible) 
(Native Barcoding Kit 24 V14) SQK-NBD114.24
(Native Barcoding Kit 96 V14) SQK-NBD114.96
Ligation mastermix
(Blunt/TA Ligase Master Mix)		 New England Biolabs M0367S
Adapter Ligation
Adapter ligation master mix
(NEBNext  Quick Ligation Module) New England Biolabs E6056S  
(NEBNext Ultra II Ligation Module)  New England Biolabs E7595S
(Blunt/TA Ligase Master Mix) New England Biolabs M0367S
Adapter mix
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-AMII001
(Adapter Mix II [AMII])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-NBA114
(Native adapter [NA])
Sequencing 
Flowcell priming kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-FLP002
(Flush Buffer [FB])
(Flush Tether [FT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-FLP004
(Flow Cell Flush [FCF])
(Flow Cell Tether [FCT])
Ligation Sequencing Kit 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
SQK-LSK109
Adapter Mix
(Adapter Mix [AMX])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SQB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LB])
Sequencing Tether
(Sequencing Tether [SQT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
SQK-LSK114
Adapter Mix
(Ligation Adapter [LA])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LIB])
Sequencing Tether
(Flow Cell Tether [FCT])
Library solution
(Library solution [LIS])
Flush buffer
(Flow Cell Flush [FCF])
Flow Cell 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
FLO-MIN106D
(Flow Cell  [R9.4.1])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
FLO-MIN114
(Flow Cell  [R10.4.1])
Flow Cell wash 
Flowcell wash kit
(Flow cell wash kit)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-WSH004
Consummables 
Surface decontaminant 
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7010PK
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7002PK
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap
(PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner])		 Greiner 608281
PCR Tube 0.2ml
(PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner])		 Greiner 671201
1000µL Filter Tips (500)
(Stacked 1000µL Filter Tips [500])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11977724
100µL Filter Tips (1000) Thermofisher scientific/Fisher scientific 11947724
10µL Filter Tips (1000)
(Stacked 100µL Filter Tips [1000])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11907724
Reinforced tubes  tubes (2ml)  with screw caps and o-rings
(Fisherbrand™ Bulk tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 15545809
Microcentrifuge tube (1.5ml)
(1.5 ml Eppendorf Tubes [500])		 Eppendorf 1229888
DNA LoBind Tubes  (1.5ml)
(DNA LoBind Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 10051232
Cryobabies labels
Gloves (S/M/L)
Paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupprecht, C. E. Rhabdoviruses: rabies virus. Medical Microbiology. , University of Texas Medical Branch. Galveston, TX. (1996).
  2. Rabies. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/rabies (2023).
  3. Health Organization, W. orld WHO Expert Consultation on Rabies: WHO TRS N°1012. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-TRS-1012 (2018).
  4. Benavides, J. A., et al. Defining new pathways to manage the ongoing emergence of bat rabies in Latin America. Viruses. 12 (9), 1002 (2020).
  5. Hampson, K. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), e0003709 (2015).
  6. Global genomic surveillance strategy for pathogens with pandemic and epidemic potential, 2022-2032. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/978924004679 (2022).
  7. Tsai, K. J., et al. Emergence of a sylvatic enzootic formosan ferret badger-associated rabies in Taiwan and the geographical separation of two phylogenetic groups of rabies viruses. Veterinary Microbiology. 182, 28-34 (2016).
  8. Chiou, H. -Y., et al. Molecular characterization of cryptically circulating rabies virus from ferret badgers, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 790-798 (2014).
  9. Sabeta, C. T., Mansfield, K. L., McElhinney, L. M., Fooks, A. R., Nel, L. H. Molecular epidemiology of rabies in bat-eared foxes (Otocyon megalotis) in South Africa. Virus Research. 129 (1), 1-10 (2007).
  10. Scott, T. P. Complete genome and molecular epidemiological data infer the maintenance of rabies among kudu (Tragelaphus strepsiceros) in Namibia. PLoS One. 8 (3), e58739 (2013).
  11. Lembo, T., et al. Exploring reservoir dynamics: a case study of rabies in the Serengeti ecosystem. The Journal of Applied Ecology. 45 (4), 1246-1257 (2008).
  12. Coetzee, P., Nel, L. H. Emerging epidemic dog rabies in coastal South Africa: a molecular epidemiological analysis. Virus Research. 126 (1-2), 186-195 (2007).
  13. Ou de Munnink, B. B. First molecular analysis of rabies virus in Qatar and clinical cases imported into Qatar, a case report. International Journal of Infectious Diseases. 96, 323-326 (2020).
  14. Smith, J., et al. Case report: Rapid ante-mortem diagnosis of a human case of rabies imported into the UK from the Philippines. Journal of Medical Virology. 69, 150-155 (2003).
  15. Mahardika, G. N. K., et al. Phylogenetic analysis and victim contact tracing of rabies virus from humans and dogs in Bali, Indonesia. Epidemiology and Infection. 142 (6), 1146-1154 (2014).
  16. Tohma, K., et al. Molecular and mathematical modeling analyses of inter-island transmission of rabies into a previously rabies-free island in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 38, 22-28 (2016).
  17. Tohma, K., et al. Phylogeographic analysis of rabies viruses in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 23, 86-94 (2014).
  18. Saito, M., et al. Genetic diversity and geographic distribution of genetically distinct rabies viruses in the Philippines. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (4), e2144 (2013).
  19. Biek, R., Henderson, J. C., Waller, L. A., Rupprecht, C. E., Real, L. A. A high-resolution genetic signature of demographic and spatial expansion in epizootic rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 7993-7998 (2007).
  20. Reddy, G. B., et al. Molecular characterization of Indian rabies virus isolates by partial sequencing of nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P) genes. Virus Genes. 43, 13-17 (2011).
  21. David, D., Dveres, N., Yakobson, B. A., Davidson, I. Emergence of dog rabies in the northern region of Israel. Epidemiology and Infection. 137 (4), 544-548 (2009).
  22. Benjathummarak, S. Molecular genetic characterization of rabies virus glycoprotein gene sequences from rabid dogs in Bangkok and neighboring provinces in Thailand, 2013-2014. Archives of Virology. 161 (5), 1261-1271 (2016).
  23. Denduangboripant, J., et al. Transmission dynamics of rabies virus in Thailand: implications for disease control. BMC Infectious Diseases. 5, 52 (2005).
  24. Talbi, C., et al. Phylodynamics and human-mediated dispersal of a zoonotic virus. PLoS Pathogens. 6 (10), e1001166 (2010).
  25. Bourhy, H., et al. Revealing the micro-scale signature of endemic zoonotic disease transmission in an African urban setting. PLoS Pathogens. 12 (4), e1005525 (2016).
  26. Zinsstag, J., et al. Vaccination of dogs in an African city interrupts rabies transmission and reduces human exposure. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  27. Yakovleva, A., et al. Tracking SARS-COV-2 variants using Nanopore sequencing in Ukraine in 2021. Scientific Reports. 12, 15749 (2022).
  28. Mannsverk, S., et al. SARS-CoV-2 variants of concern and spike protein mutational dynamics in a Swedish cohort during 2021, studied by Nanopore sequencing. Virology Journal. 19, 164 (2022).
  29. Soufi, M., et al. Fast and easy nanopore sequencing workflow for rapid genetic testing of familial Hypercholesterolemia. Frontiers in Genetics. 13, 836231 (2022).
  30. Cabibbe, A. M. Application of targeted next-generation sequencing assay on a portable sequencing platform for culture-free detection of drug-resistant tuberculosis from clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 00632 (2020).
  31. Xu, Y., et al. Nanopore metagenomic sequencing of influenza virus directly from respiratory samples: diagnosis, drug resistance and nosocomial transmission, United Kingdom, 2018/19 influenza season. Euro Surveillance. 26 (27), 2000004 (2021).
  32. Stubbs, S. C. B., et al. Assessment of a multiplex PCR and Nanopore-based method for dengue virus sequencing in Indonesia. Virology Journal. 17, 24 (2020).
  33. Croville, G., et al. Rapid whole-genome based typing and surveillance of avipoxviruses using nanopore sequencing. Journal of Virological Methods. 261, 34-39 (2018).
  34. Theuns, S., et al. Nanopore sequencing as a revolutionary diagnostic tool for porcine viral enteric disease complexes identifies porcine kobuvirus as an important enteric virus. Scientific Reports. 8, 9830 (2018).
  35. O'Donnell, V. K., et al. Rapid sequence-based characterization of African swine fever virus by use of the Oxford Nanopore MinION sequence sensing device and a companion analysis software tool. Journal of Clinical Microbiology. 58, 01104-01119 (2019).
  36. Brito, A. F. Global disparities in SARS-CoV-2 genomic surveillance. Nature Communications. 13, 7003 (2022).
  37. ONT login/register. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://nanoporetech.com/login-register (2023).
  38. Software Downloads. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://community.nanoporetech.com/downloads (2023).
  39. GitHub. , Available from: https://github.com/ (2023).
  40. Brunker, K. Artic-rabv. , Available from: https://github.com/kirstyn/artic-rabv (2022).
  41. Campbell, K. MADDOG: Method for Assignment, Definition and Designation of Global Lineages. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  42. Campbell, K. RABV-GLUE. Centre for Virus Research. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  43. Itokawa, K., Sekizuka, T., Hashino, M., Tanaka, R., Kuroda, M. Disentangling primer interactions improves SARS-CoV-2 genome sequencing by multiplex tiling PCR. PLoS ONE. 15 (9), e0239403 (2020).
  44. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 818619 (2022).
  45. Döring, M., Pfeifer, N. openPrimeR: Multiplex PCR primer design and analysis. , (2023).
  46. Quick, J. Multiplex PCR method for MiniON and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
  47. Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization. 1, Available from: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/310836/9789241515153-eng.pdf (2018).
  48. Lembo, T. Partners for Rabies Prevention. The blueprint for rabies prevention and control: a novel operational toolkit for rabies elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (2), e1388 (2012).
  49. Terrestrial Manual Online Access. World Organization for Animal Health. , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2023).
  50. Mauti, S. Field postmortem rabies rapid immunochromatographic diagnostic test for resource-limited settings with further molecular applications. Journal of Visualized Experiments. (160), e60008 (2020).
  51. Patrick, E., et al. Enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test. Journal of Visualized Experiments. (146), e59416 (2019).
  52. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  53. Marston, D. A., et al. Pan-lyssavirus real time RT-PCR for rabies diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (149), e59709 (2019).
  54. Brunker, K. DNA quantification using the Qubit fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-qubit-fluorometer-bc6vize6 (2020).
  55. Quick, J. DNA quantification using the Quantus fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-quantus-fluorometer-7pzhmp6 (2020).
  56. Guppy protocol. Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revaq_14dec2018 (2023).
  57. Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004). Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/flow-cell-wash-kit-exp-wsh004/v/wfc_9120_v1_revh_08dec2020 (2023).
  58. Core Pipeline - arctic pipeline. , Available from: https://artic.readthedocs.io/en/latest/minion/ (2023).
  59. Samtools. , Available from: https://www.htslib.org (2023).
  60. Campbell, K., et al. Making genomic surveillance deliver: A lineage classification and nomenclature system to inform rabies elimination. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010023 (2022).
  61. Brunker, K., et al. Rapid in-country sequencing of whole virus genomes to inform rabies elimination programmes. Wellcome Open Research. 5, 3 (2020).
  62. Bull, R. A., et al. Analytical validity of nanopore sequencing for rapid SARS-CoV-2 genome analysis. Nature Communications. 11, 6272 (2020).
  63. Okeke, I. N., Ihekweazu, C. The importance of molecular diagnostics for infectious diseases in low-resource settings. Nature Reviews. Microbiology. 19 (9), 547-548 (2021).
  64. Inzaule, S. C., Tessema, S. K., Kebede, Y., Ouma, A. E. O., Nkengasong, J. N. Genomic-informed pathogen surveillance in Africa: opportunities and challenges. The Lancet Infectious Diseases. 21 (9), 281-289 (2021).
  65. Kennedy, L. Integrating contact tracing and whole-genome sequencing to track the elimination of dog-mediated rabies: an observational and genomic study. eLife. , (2023).
  66. Pallerla, S. R. Diagnosis of pathogens causing bacterial meningitis using Nanopore sequencing in a resource-limited setting. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 21, 39 (2022).
  67. Quick, J. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).

Tags

Sequencing van het hele genoom Snelle karakterisering Rabiësvirus Nanopore-technologie Genomische gegevens Transmissie volgen Geografische verspreiding Infectieziekten Lage- en middeninkomenslanden (LMIC's) Hond-gemedieerde hondsdolheid Vampiervleermuizen Volksgezondheid Economische zorgen Sample-to-sequence-to-interpretation Workflow Nanopore Technologie Monsterverzameling Rabiës Diagnose Whole Genome Sequencing Workflow Primer Design And Optimization Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) Sequencing Bibliotheekvoorbereiding Live en offline basisoproepen Genetische afstammingsaanduiding Fylogenetische analyse Workflow-implementatie Pijplijnvalidatie Negatieve controles Genomische tools (GLUE MADDOG) Regionale en wereldwijde fylogenieën
Sequencing van het hele genoom voor snelle karakterisering van het rabiësvirus met behulp van nanoporietechnologie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bautista, C., Jaswant, G., French,… More

Bautista, C., Jaswant, G., French, H., Campbell, K., Durrant, R., Gifford, R., Kia, G. S. N., Ogoti, B., Hampson, K., Brunker, K. Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology. J. Vis. Exp. (198), e65414, doi:10.3791/65414 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter