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Biology

Sequenzierung des gesamten Genoms zur schnellen Charakterisierung des Tollwutvirus mittels Nanoporentechnologie

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65414
Automatic Translation
1,2, 1,3,4,5, 1,6, 1, 1, 1,6, 7,8, 3,9, 1, 1,6
1School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, 2Research Institute for Tropical Medicine, 3University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, 4Tanzania Industrial Research Development Organization, 5Ifakara Health Institute, 6MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 7Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, 8African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, 9University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

Summary

Hier stellen wir einen schnellen und kostengünstigen Workflow zur Charakterisierung von Tollwutvirusgenomen (RABV) mit Hilfe der Nanoporentechnologie vor. Der Arbeitsablauf soll die genomikgestützte Überwachung auf lokaler Ebene unterstützen und Informationen über zirkulierende RABV-Linien und deren Einordnung in regionale Phylogenien liefern, um Maßnahmen zur Tollwutbekämpfung zu steuern.

Abstract

Genomische Daten können verwendet werden, um die Übertragung und geografische Ausbreitung von Infektionskrankheiten zu verfolgen. Die für die genomische Überwachung erforderliche Sequenzierungskapazität ist jedoch in vielen Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMICs) nach wie vor begrenzt, da die durch Hunde vermittelte Tollwut und/oder die durch Wildtiere wie Vampirfledermäuse übertragene Tollwut große Bedenken für die öffentliche Gesundheit und die Wirtschaft aufwirft. Wir präsentieren hier einen schnellen und kostengünstigen Workflow von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation unter Verwendung der Nanoporentechnologie. Die Protokolle für die Probenentnahme und die Diagnose von Tollwut werden kurz beschrieben, gefolgt von Details des optimierten Arbeitsablaufs bei der Sequenzierung des gesamten Genoms, einschließlich des Primerdesigns und der Optimierung für die Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der Vorbereitung einer modifizierten, kostengünstigen Sequenzierungsbibliothek, der Sequenzierung mit Live- und Offline-Basenaufruf, der Bestimmung genetischer Abstammungslinien und der phylogenetischen Analyse. Die Implementierung des Workflows wird demonstriert und kritische Schritte für den lokalen Einsatz werden hervorgehoben, wie z. B. die Pipeline-Validierung, die Primer-Optimierung, die Einbeziehung von Negativkontrollen und die Verwendung öffentlich zugänglicher Daten und genomischer Tools (GLUE, MADDOG) zur Klassifizierung und Platzierung innerhalb regionaler und globaler Phylogenien. Die Bearbeitungszeit für den Workflow beträgt 2-3 Tage, und die Kosten reichen von 25 USD pro Probe für einen 96-Probenlauf bis zu 80 USD pro Probe für einen 12-Sample-Lauf. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Einrichtung einer genomischen Überwachung von Tollwutviren in LMICs machbar ist und Fortschritte in Richtung des globalen Ziels von null durch Hunde verursachten Tollwuttodesfällen beim Menschen bis 2030 sowie eine verbesserte Überwachung der Ausbreitung von Wildtier-Tollwut unterstützen kann. Darüber hinaus kann die Plattform für andere Krankheitserreger angepasst werden, was zum Aufbau einer vielseitigen genomischen Kapazität beiträgt, die zur Vorbereitung auf Epidemien und Pandemien beiträgt.

Introduction

Das Tollwutvirus (RABV) ist ein Lyssavirus aus der Familie der Rhabdoviridae , das bei Säugetieren eine tödliche neurologische Erkrankung verursacht1. Obwohl Tollwut zu 100 % durch Impfungen vermeidbar ist, bleibt sie in endemischen Ländern ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit und die Wirtschaft. Von den schätzungsweise 60.000 Tollwuttoten beim Menschen pro Jahr entfallen über 95 % auf Afrika und Asien, wo Hunde das wichtigste Reservoir sind2. Im Gegensatz dazu hat die Impfung von Hunden in Westeuropa, Nordamerika und weiten Teilen Lateinamerikas zur Eliminierung der durch Hunde vermittelten Tollwut geführt. In diesen Regionen sind die Tollwutreservoirs heute auf Wildtiere wie Fledermäuse, Waschbären, Stinktiere und wilde Caniden beschränkt3. In ganz Lateinamerika ist die gewöhnliche Vampirfledermaus eine problematische Quelle für Tollwut, da sie während der nächtlichen Blutfütterung regelmäßig von Fledermäusen auf Menschen und Nutztiere übertragenwird 4. Die jährlichen globalen wirtschaftlichen Auswirkungen von Tollwut werden auf 8,6 Milliarden US-Dollar geschätzt, wobei die Verluste an Viehbeständen 6 % ausmachen5.

Sequenzdaten von viralen Krankheitserregern in Kombination mit Metadaten zum Zeitpunkt und zur Quelle von Infektionen können robuste epidemiologische Erkenntnisse liefern6. Für RABV wurde die Sequenzierung verwendet, um den Ursprung von Ausbrüchen zu untersuchen7,8, Wirtsassoziationen mit Wildtieren oder Haushundenzu identifizieren 8,9,10,11,12 und Quellen menschlicher Fälle zu verfolgen 13,14. Ausbruchsuntersuchungen mittels phylogenetischer Analysen haben ergeben, dass die Tollwut in der ehemals tollwutfreien Provinz Bali, Indonesien, durch eine einzige Einschleppung aus den nahe gelegenen Endemiegebieten Kalimantan oder Sulawesi entstandenist 15. In der Zwischenzeit wurde auf den Philippinen nachgewiesen, dass ein Ausbruch auf der Insel Tablas in der Provinz Romblon von der Hauptinsel Luzon16 eingeschleppt wurde. Virale Genomdaten wurden auch verwendet, um die Übertragungsdynamik von Krankheitserregern besser zu verstehen, die für gezielte Bekämpfungsmaßnahmen in der Region erforderlich ist. Zum Beispiel veranschaulicht die genomische Charakterisierung von RABV die geographische Häufung der Kladen 17,18,19, die Kozirkulation von Abstammungslinien 20,21,22, die durch den Menschen vermittelte virale Bewegung 17,23,24 und die Metapopulationsdynamik 25,26.

Die Überwachung von Krankheiten ist eine wichtige Funktion der genomischen Überwachung, die mit der weltweiten Erhöhung der Sequenzierungskapazität als Reaktion auf die SARS-CoV-2-Pandemie verbessert wurde. Die genomische Überwachung hat die Echtzeitverfolgung der besorgniserregenden SARS-COV-2-Varianten27,28 und die damit verbundenen Gegenmaßnahmen unterstützt6. Fortschritte in der zugänglichen Sequenzierungstechnologie, wie z. B. der Nanoporentechnologie, haben zu verbesserten und erschwinglicheren Protokollen für die schnelle Sequenzierung von menschlichen 29,30,31,32 und tierischen33,34,35 Krankheitserregern geführt. In vielen tollwutendemischen Ländern gibt es jedoch immer noch Hindernisse für die Operationalisierung der genomischen Überwachung von Krankheitserregern, wie die globalen Unterschiede in der SARS-CoV-2-Sequenzierungskapazität zeigen36. Einschränkungen in der Laborinfrastruktur, in den Lieferketten und im technischen Wissen machen die Etablierung und Routineisierung der genomischen Überwachung zu einer Herausforderung. In diesem Artikel zeigen wir, wie ein optimierter, schneller und kostengünstiger Arbeitsablauf für die Sequenzierung des gesamten Genoms für die RABV-Überwachung in ressourcenbegrenzten Umgebungen eingesetzt werden kann.

Protocol

Die Studie wurde vom Koordinierungsausschuss für medizinische Forschung des National Institute for Medical Research genehmigt (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), das Ministerium für Regionalverwaltung und Kommunalverwaltung (AB.81/288/01) und das Ifakara Health Institute Institutional Review Board (IHI/IRB/No:22-2014) in Tansania; das Institut für Tropen- und Infektionskrankheiten der Universität Nairobi (P947.11.2019) und das Kenya Medical Research Institute (KEMRI-SERU; Protokoll Nr. 3268) in Kenia; und dem Forschungsinstitut für Tropenmedizin (RITM), Department of Health (2019-023) auf den Philippinen. Die Sequenzierung der aus Nigeria stammenden Proben erfolgte anhand von archiviertem diagnostischem Material, das im Rahmen der nationalen Überwachung gesammelt wurde.

HINWEIS: Die Abschnitte 1-4 sind Voraussetzungen. In den Abschnitten 5-16 wird der Arbeitsablauf von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation für die RABV-Nanoporensequenzierung beschrieben (Abbildung 1). Für nachfolgende Schritte im Protokoll, die eine Pulszentrifugation erfordern, zentrifugieren Sie bei 10-15.000 x g für 5-15 s.

1. Einrichtung der Rechenumgebung für Sequenzierung und Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Website von Oxford Nanopore Technology (ONT)37 und erstellen Sie ein Konto, um auf nanoporenspezifische Ressourcen zuzugreifen.
    1. Melden Sie sich an und installieren Sie die ONT-Sequenzierungs- und Basecalling-Software38.
  2. Öffnen Sie GitHub39 , und erstellen Sie ein Konto.
    1. Gehen Sie zu den Repositories artic-rabv40 und MADDOG41 und folgen Sie den Installationsanweisungen.

2. Entwerfen oder Aktualisieren des Multiplex-Primer-Schemas

HINWEIS: Bestehende RABV-Schemata sind im arkt-rabv-Repository40 verfügbar. Wenn ein neues geografisches Gebiet ausgerichtet ist, sollte ein neues System entworfen oder ein bestehendes System geändert werden, um zusätzliche Vielfalt zu berücksichtigen.

  1. Wählen Sie einen Genomreferenzsatz aus, um die Vielfalt im Untersuchungsgebiet darzustellen. Dabei handelt es sich in der Regel um eine Reihe öffentlich zugänglicher Sequenzen (z. B. von der NCBI GenBank) oder um vorläufige interne Daten. Führen Sie Schritt 2.1.1 aus, um RABV-GLUE42, eine RABV-Sequenzdatenressource, zum Filtern und Herunterladen von NCBI-Sequenzen und zugehörigen Metadaten zu verwenden.
    HINWEIS: Wählen Sie Referenzsequenzen mit vollständigen Genomen (d. h. ohne Lücken und maskierte Basen). Es wird empfohlen, bis zu 10 Sequenzen als Referenzset für das Primerdesign auszuwählen. Wenn die verfügbaren Sequenzdaten unvollständig oder nicht repräsentativ für das Untersuchungsgebiet sind, ist auf die Hinweise43,44,45 in Ergänzungsdatei 1 zu verweisen.
    1. Navigieren Sie zur Seite NCBI RABV-Sequenzen nach Klade über das Dropdown-Menü Sequenzdaten in RABV-GLUE. Klicken Sie auf den Link Tollwutvirus (RABV), um auf alle verfügbaren Daten zuzugreifen, oder wählen Sie eine bestimmte Klade von Interesse aus. Verwenden Sie die Filteroption, um Filter hinzuzufügen, die den gewünschten Kriterien entsprechen (z. B. Herkunftsland, Sequenzlänge). Laden Sie Sequenzen und Metadaten herunter.
  2. Generieren Sie ein Primerschema für die Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gemäß den Anweisungen von PrimalSchema 46. Ein 400-bp-Schema mit einer Überlappung von 50 bp wird empfohlen, um Proben von geringer Qualität zu sequenzieren. Laden Sie alle Ausgaben herunter und speichern Sie sie (bearbeiten Sie nicht die Datei- oder Primernamen).
    HINWEIS: Das Schema wird auf die erste Sequenz in der Eingabe-Fasta indiziert, die im Folgenden als "Indexreferenz" bezeichnet wird (Abbildung 2). Unter Ergänzungsdatei 1 finden Sie Optionen zur Optimierung der Primerleistung.

3. Richten Sie RAMPART- und ARTIC-Bioinformatik-Pipelines ein

  1. In der ergänzenden Datei 2 können Sie eine Verzeichnisstruktur einrichten, um die Eingabe-/Ausgabedateien für RAMPART und die ARTIC-Bioinformatik-Pipeline zu verwalten.

4. Biologische Sicherheit und Laboreinrichtung

  1. Umgang mit potenziell tollwutpositiven Proben unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe (BSL) 2 oder 3.
  2. Stellen Sie sicher, dass das Laborpersonal die Tollwutimpfung vor der Exposition abgeschlossen hat und sich einer Überwachung der Immunität gemäß den Empfehlungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) unterzieht3.
  3. Stellen Sie sicher, dass für das Labor spezielle Standardarbeitsanweisungen und Risikobewertungen gemäß nationalen oder internationalen Richtlinien vorhanden sind.
  4. Erforderlicher Laboraufbau: Minimierung der Kontamination durch Beibehaltung der physischen Trennung zwischen Prä- und Post-PCR-Bereichen. Verwenden Sie in Laboren mit begrenztem Platz oder in Laborumgebungen vor Ort tragbare Handschuhkästen oder provisorische Laborstationen, um die Kontamination zu minimieren.
  5. Stellen Sie sicher, dass in diesem Protokoll getrennte Bereiche ausgewiesen werden für:
    1. Probenextraktion: Richten Sie einen BSL2/3-Schrank/ein Handschuhfach ein, um biologisches Material zu handhaben und Inaktivierung und RNA-Extraktion durchzuführen.
    2. Template-Bereich: Richten Sie einen BSL1-Schrank/eine Handschuhbox für die Zugabe von Template (RNA/cDNA) zum vorbereiteten Reaktions-Mastermix ein.
    3. Master-Mix-Bereich: Richten Sie einen ausgewiesenen Reinbereich (BSL1-Schrank/Handschuhfach) für die Zubereitung von Reagenz-Mastermixen ein. In diesem Bereich sollte es keine Vorlage geben.
    4. Post-PCR-Bereich: Richten Sie einen separaten Bereich für die Arbeit an Amplikons und die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek ein.
      HINWEIS: Alle Bereiche sollten vor und nach dem Gebrauch mit einem Oberflächendekontaminationsmittel gereinigt und ultraviolett (UV) sterilisiert werden.

5. Probenentnahme und Diagnose vor Ort

HINWEIS: Die Proben müssen von geschultem und immunisiertem Personal entnommen werden, das persönliche Schutzausrüstung trägt und die genannten Standardverfahren47,48,49 befolgt.

  1. Entnehmen Sie die Probe über das Foramen magnum (d. h. den Okzipitalweg), wie in Mauti et al.50 ausführlich beschrieben.
  2. Diagnostizieren Sie Tollwut im Feld mit diagnostischen Schnelltests und bestätigen Sie sie im Labor anhand der empfohlenen Verfahren47, wie z. B. dem direkten fluoreszierenden Antikörpertest (DFA), dem direkten immunhistochemischen Schnelltest (DRIT)51,52 oder der Echtzeit-Reverse-Transkription (RT)-PCR53.
  3. Verwenden Sie bestätigte positive Gehirnproben für die RNA-Extraktion oder lagern Sie sie in einem Gefrierschrank bei -20 °C für 2-3 Monate oder -80 °C für längere Zeiträume. Konservieren Sie RNA für die Lagerung und den Transport unter Verwendung eines geeigneten DNA/RNA-Stabilisierungsmediums.

6. Probenvorbereitung und RNA-Extraktion (3 h)

HINWEIS: Verwenden Sie ein Spinsäulen-basiertes virales RNA-Extraktionskit, das für den Probentyp geeignet ist.

  1. Bereiten Sie zwei Keramikperlenröhrchen vor, indem Sie ein 2-ml-PCR-Röhrchen mit ca. 200 μl Röhrchen voller 1,4-mm-Keramikkügelchen füllen und das Röhrchen beschriften.
  2. Geben Sie die empfohlene Menge des im RNA-Extraktionskit enthaltenen Lysepuffers in das markierte PCR-Röhrchen.
  3. Entnehmen Sie einen etwa 3 mm großen Würfel aus der Gehirnprobe, bei der mit einem Holzapplikator eine Tollwutinfektion bestätigt wurde, und geben Sie ihn in ein beschriftetes Röhrchen mit Proben-ID und 100 μl nukleasefreies Wasser in das Röhrchen mit der Beschriftung Negativkontrolle.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Homogenisierung auf Basis geschlossener Röhrchenperlen, um die Probenexposition zu begrenzen. Wenn dies nicht möglich ist, verwenden Sie andere geeignete mechanische Disruptoren (z. B. auf Rotorbasis) oder einen manuellen Mikrostößel. Diese können jedoch weniger effektiv sein als das Schlagen von Kügelchen auf einer harten Oberfläche, um das Gewebe aufzubrechen (Gewebeproben können in bestimmten Speichermedien aushärten).
  4. Zerstören Sie das Hirngewebe manuell mit einem hölzernen Applikatorstäbchen und wirbeln Sie dann mit maximaler Geschwindigkeit vor, bis eine vollständige Homogenisierung des Gewebes erreicht ist.
  5. Zentrifugieren Sie das Lysat gemäß den Anweisungen des Herstellers und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand in ein neu beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Verwenden Sie diesen Überstand nur in den folgenden Schritten.
  6. Befolgen Sie die Anweisungen für die Spin-Säule des RNA-Extraktionskits, um gereinigte RNA zu erhalten.
  7. Fügen Sie hier eine negative Extraktionskontrolle (NEC) hinzu und führen Sie sie bis zur Sequenzierungsphase durch.

7. cDNA-Vorbereitung (20 min)

  1. Bereiten Sie im Mastermix-Bereich einen Mastermix für die Erststrang-cDNA-Synthese entsprechend der Anzahl der zu verarbeitenden Proben und Kontrollen vor (mit einem Übervolumen von 10 %, um ein ausreichendes Reagenz zu gewährleisten; Tabelle 1). In dieser Phase sollte ein Steuerelement ohne Vorlage (NTC) enthalten sein.
  2. Beschriften Sie 0,2 ml PCR-Streifenröhrchen und aliquoten Sie 5 μl des Mastermixes in die Röhrchen.
  3. Bringen Sie die vorbereiteten Röhrchen in den Schablonenbereich. Geben Sie 5 μl RNA in jedes markierte Röhrchen, einschließlich des NEC. Geben Sie 5 μl nukleasefreies Wasser (NFW) in den NTC.
  4. In einem Thermocycler unter den in Tabelle 1 genannten Bedingungen inkubieren.
    HINWEIS: Optionaler Pausenpunkt: cDNA kann bei Bedarf bis zu 1 Monat lang bei -20 °C gelagert werden, es wird jedoch eine PCR bevorzugt.

8. Vorbereitung des Primerpools (1 h)

HINWEIS: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn aus einzelnen Primern neue Materialien hergestellt werden, nach denen vorgefertigte Stofflösungen verwendet werden können.

  1. Bereiten Sie einen Primerpool mit 100 μM Material im Mastermix-Bereich vor.
  2. Resuspendieren Sie die lyophilisierten Primer in 1x Tris-EDTA (TE)-Puffer oder NFW in einer Konzentration von jeweils 100 μM. Gründlich vortexen und runterschleudern.
    HINWEIS: In den folgenden Schritten werden einzelne Primer in zwei Primer-Pools aufgeteilt - ungerade nummeriert (genannt Pool A) und gerade nummeriert (genannt Pool B) -, um Wechselwirkungen zwischen Primern zu vermeiden, die Amplikonüberlappungen flankieren. Diese Primerpools erzeugen überlappende 400 bp-Amplikons, die das Zielgenom umspannen.
  3. Ordnen Sie alle ungeraden Primer in einem Röhrchengestell an. Generieren Sie einen Primer-Pool, indem Sie 5 μl von jedem Primer in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift "Primer scheme name - Pool A (100 μM)" geben.
  4. Wiederholen Sie den Vorgang für alle geraden Primer und kennzeichnen Sie sie als "Name des Primerschemas - Pool B (100 μM)".
  5. Verdünnen Sie jeden Primerpool im Verhältnis 1:10 in Wasser in molekularer Qualität, um 10 μM Primervorräte zu erhalten.
    HINWEIS: Stellen Sie mehrere Aliquoten von 10 μM Primerverdünnungen her und frieren Sie sie im Falle einer Degradation oder Kontamination ein.

9. Multiplex-PCR (5 h)

  1. Bereiten Sie zwei PCR-Mastermixe vor, einen für jeden Primerpool im Mastermix-Bereich.
    1. Verwenden Sie eine Endkonzentration von 0,015 μM pro Primer. Berechnen Sie das erforderliche Primer-Pool-Volumen für die PCR-Reaktion (Tabelle 2) mit der folgenden Formel:
      Primerpoolvolumen = Anzahl der Primer x Reaktionsvolumen x 0,015/Konzentration (μM) des Primermaterials
  2. Aliquotieren Sie jeweils 10 μl Mastermix aus Pool A und Mastermix aus Pool B auf markierte PCR-Streifenröhrchen im Template-Bereich. Geben Sie für jede Probe 2,5 μl cDNA (aus Schritt 3) zu jeder der entsprechenden markierten Primer-Pool-A- und B-Reaktionen. Überschüssige cDNA kann bei -20 °C gelagert werden.
  3. Durch leichtes Schnippen mischen und zentrifugieren.
  4. Inkubieren Sie die Proben unter den in Tabelle 2 genannten Bedingungen auf einem PCR-Gerät.
    HINWEIS: Aufgrund der langen Glühzeit von 5 min (erforderlich aufgrund der hohen Anzahl an Primern) und der kurzen Länge der Amplikons (400 bp), die für die Verlängerung ausreicht, enthält das Programm keinen spezifischen Verlängerungsschritt.

10. PCR-Aufreinigung und Quantifizierung (3,5 h)

  1. Führen Sie ab diesem Zeitpunkt alle Arbeiten im Post-PCR-Bereich durch.
  2. Aliquot Festphasen-reversible Immobilisierung (SPRI) perlt aus der Hauptflasche in Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 4 °C lagern.
  3. Erwärmen Sie ein aliquotes SPRI-Kügelchen auf Raumtemperatur (RT; ~20 °C) und wirbeln Sie es gründlich durch, bis die Kügelchen vollständig in der Lösung resuspendiert sind.
  4. Kombinieren Sie in 1,5-ml-Röhrchen die PCR-Produkte Primer Pool A und Primer Pool B für jede Probe. Falls erforderlich, fügen Sie Wasser hinzu, um das Volumen auf 25 μl zu bringen.
  5. Geben Sie 25 μl SPRI-Kügelchen zu jeder Probe (1:1 Kügelchen-Probe-Verhältnis). Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren oder vorsichtig auf das Röhrchen klopfen.
  6. 10 Minuten bei RT inkubieren, wobei die Röhrchen gelegentlich invertiert oder geschnippt werden.
  7. Auf ein magnetisches Gestell legen, bis sich die Kügelchen und die Lösung vollständig getrennt haben. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, wobei Sie darauf achten müssen, dass das Perlenpellet nicht gestört wird.
  8. Zweimal mit 80%igem Ethanol waschen (erwärmt auf RT).
    1. Fügen Sie dem Pellet 200 μl Ethanol hinzu. Warten Sie 30 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Perlen richtig gewaschen sind.
    2. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und versuchen Sie, das Kügelchen nicht zu berühren.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 10.8.1-10.8.2, um das Pellet ein zweites Mal zu waschen.
  9. Entfernen Sie alle Spuren von Ethanol mit einer 10-μl-Spitze. An der Luft trocknen lassen, bis Spuren von Ethanol verdunstet sind (bei kleinen Kügelchen geschieht dies schnell, ~30 s); Wenn dies geschieht, sollte das Pellet von glänzend zu matt werden. Achten Sie darauf, nicht zu stark zu trocknen (wenn das Pellet reißt, ist es zu trocken), da dies die DNA-Rückgewinnung beeinträchtigt.
  10. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 15 μl NFW und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT (off magnetic rack).
  11. Kehren Sie zum Magnetgestell zurück und füllen Sie den Überstand (gereinigtes Produkt) in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen um.
  12. Bereiten Sie eine 1:10-Verdünnung jeder Probe in einem separaten Röhrchen vor (2 μl Produkt + 18 μl NFW).
    HINWEIS: Seien Sie in dieser Phase sehr vorsichtig, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Halten Sie jeweils nur ein Amplikonröhrchen geöffnet. Aliquotieren Sie zuerst 18 μl Wasser in die Röhrchen (in einem sauberen Mastermix-Bereich).
  13. Die DNA-Konzentration jeder verdünnten Probe wird mit einem hochempfindlichen und spezifischen Fluorometer gemessen, wie in protocols.io54,55 beschrieben.

11. Normalisierung (30 min)

  1. Verwenden Sie die Normalisierungsvorlage (Zusatzdatei 3) und die DNA-Konzentration (ng/μl) jeder Probe, um das Volumen der verdünnten (oder reinen) Probe zu berechnen, das für 200 fmol jeder Probe in einem Gesamtvolumen von 5 μl erforderlich ist.
  2. Beschriften Sie neue PCR-Röhrchen und fügen Sie berechnete Volumina von NFW und Probe hinzu, um normalisierte DNA zu erhalten.
  3. Verwenden Sie das berechnete Volumen für unverdünnte (saubere) Proben, wenn mehr als 5 μl der verdünnten Probe benötigt werden, um 200 fmol zu erhalten.
    HINWEIS: Optionaler Pausenpunkt: Zu diesem Zeitpunkt kann das gereinigte PCR-Produkt bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert oder bei Bedarf bei -20 °C für eine längere Lagerung gelagert werden.

12. Endvorbereitung und Barcode (1,5 h)

HINWEIS: In den nächsten Schritten wird von der Verwendung spezifischer Reagenzien aus nanoporenspezifischen Barcoding- und Ligations-Sequenzierungskits ausgegangen (siehe Materialtabelle für Details). Das Protokoll ist auf verschiedene Chemieversionen übertragbar, aber Benutzer sollten darauf achten, kompatible Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers zu verwenden.

  1. Endreparatur und dA-Tailing
    1. Richten Sie die Endprep-Reaktion für jede in Tabelle 3 erwähnte Probe ein. Bereiten Sie einen Mastermix entsprechend der Anzahl der Proben (plus 10 % Überschuss) vor. Seien Sie vorsichtig beim Pipettieren, da die Reagenzien zähflüssig sind.
    2. Geben Sie 5 μl Mastermix in jedes Röhrchen mit normalisierter DNA (5 μl). Die gesamte Reaktionsmischung sollte 10 μl betragen. Wechseln Sie jedes Mal die Spitzen und lassen Sie jeweils nur ein Röhrchen geöffnet.
    3. In einem Thermocycler unter den in Tabelle 3 genannten Bedingungen inkubieren.
  2. Barcode
    1. Aliquotieren Sie die Barcodes aus dem Barcode-Kit auf PCR-Streifenröhrchen mit 1,25 μl/Röhrchen und zeichnen Sie den Barcode auf, der jeder Probe zugewiesen ist.
    2. Geben Sie 0,75 μl der endpräparierten Probe zu dem zugewiesenen Barcode-Aliquot.
    3. Bereiten Sie eine Ligations-Mastermischung entsprechend der Anzahl der Proben (plus 10 % Überschuss) vor (Tabelle 4).
    4. Fügen Sie 8 μl Ligations-Mastermix zur endpräparierten Probe + Barcodes hinzu, was eine Gesamtreaktion von 10 μl ergibt.
    5. In einem Thermocycler unter den in Tabelle 4 genannten Bedingungen inkubieren.
  3. SPRI-Bead-Clean-up und DNA-Quantifizierung
    1. Kurzfragmentpuffer (SFB) bei RT auftauen, durch Vortexen mischen, pulszentrifugieren und auf Eis legen.
    2. Fassen Sie alle mit Barcodes versehenen Proben in einem 1,5-ml-Lobind-Mikrozentrifugenröhrchen zusammen. Um das Reinigungsvolumen nicht zu groß zu machen, um es zu verwenden, poolen Sie 12-24 Proben (10 μl/Probe), bis zu 48 Proben (5 μl/Probe) oder bis zu 96 Proben (2,5 μl/Probe) aus jeder nativen Barcoding-Reaktion.
    3. Fügen Sie ein 0,4-faches Volumen SPRI-Perlen zum Barcode-Pool hinzu. Vorsichtig mischen (Schnippen oder Pipettieren) und 5 Minuten bei RT inkubieren.
    4. Legen Sie die Proben auf einen Magneten, bis die Kügelchen pelletiert sind und der Überstand vollständig klar ist (~2 min). Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören.
    5. Zweimal mit 250 μl SFB waschen.
      1. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten und resuspendieren Sie das Pellet vollständig in 250 μl SFB. 30 s inkubieren, pulszentrifugieren und zum Magneten zurückkehren.
      2. Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn.
    6. Wiederholen Sie Schritt 12.3.5, um eine zweite SFB-Wäsche durchzuführen.
    7. Zentrifugieren Sie den Impuls und entfernen Sie alle SFB-Reste.
    8. Fügen Sie 200 μl 80%iges (RT) Ethanol hinzu, um das Pellet zu baden. Entfernen und entsorgen Sie das Ethanol und achten Sie darauf, das Kügelchenpellet nicht zu stören. 30 s an der Luft trocknen lassen oder bis das Pellet seinen Glanz verloren hat.
    9. Resuspendieren Sie 10 Minuten lang in 22 μl NFW bei RT.
    10. Auf den Magneten legen, ~2 Minuten einwirken lassen, dann die Lösung vorsichtig entfernen und in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
    11. Verwenden Sie 1 μl, um die DNA-Konzentration zu erhalten, wie zuvor beschrieben (Schritt 10.13).
      HINWEIS: Optionaler Pausenpunkt: Zu diesem Zeitpunkt kann die Bibliothek bis zu 1 Woche lang bei 4 °C oder bei -20 °C für eine längerfristige Lagerung gelagert werden, aber es ist vorzuziehen, mit der Adapterligation und -sequenzierung fortzufahren.

13. Sequenzierung (maximal 48 Stunden)

  1. Bereiten Sie den Computer vor (siehe auch Voraussetzungen Abschnitte 1-4).
    1. Stellen Sie sicher, dass genügend Speicherplatz vorhanden ist, um neue Daten zu speichern (mindestens 150 GB), dass Daten aus alten Läufen vor dem Löschen gesichert/auf einen Server verschoben werden und dass die neueste Version von MinKNOW installiert ist.
  2. Nehmen Sie die aufbewahrte Durchflusszelle aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie RT erreichen.
  3. Adapter-Ligatur (1 h)
    1. Die Adaptermischung und die Ligase pulsieren, zentrifugieren und auf Eis legen.
    2. Elutionspuffer (EB), SFB und Ligationspuffer bei RT auftauen. Durch Vortexen mischen, pulszentrifugieren und auf Eis legen.
    3. Bereiten Sie den Adapter-Ligation-Mastermix (Tabelle 5) vor, indem Sie die Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge in einem Röhrchen mit geringer Bindung kombinieren.
      HINWEIS: Je nach Verfügbarkeit im Labor können Alternativen für Adapter-Ligation-Mastermix-Reagenzien (Tabelle 5) verwendet werden. Siehe Ergänzungsdatei 3 und Materialtabelle für eine Liste der Alternativen. Verwenden Sie die Berechnung im Arbeitsblatt Ergänzungsdatei 3 , um das Volumen der DNA-Bibliothek zu erhalten, das 200 fmol entspricht. Wenn weniger als 20 μl berechnet werden, fügen Sie NFW hinzu, um bis zu 20 μl zu erhalten.
    4. Durch leichtes Schnippen mischen und pulsieren. 20 Minuten bei RT inkubieren.
      ANMERKUNG: Beginnen Sie während der Inkubation mit der Vorbereitung der Durchflusszelle (Abschnitt 13.5).
  4. Reinigen Sie mit SPRI-Kügelchen (verwenden Sie kein Ethanol wie bei früheren Reinigungen).
    1. Geben Sie ein 0,4-faches Volumen SPRI-Kügelchen (RT) zu den Proben. 10 Minuten bei RT inkubieren, zwischendurch vorsichtig schnippen, um das Mischen zu erleichtern.
    2. Auf den Magneten legen, bis sich die Kügelchen und die Lösung vollständig getrennt haben (~5 min). Entfernen und entsorgen Sie den Überstand; Achten Sie darauf, das Kügelchenpellet nicht zu stören.
    3. Zweimal mit 125 μl SFB waschen.
    4. Resuspendieren Sie das Pellet vollständig mit 125 μl SFB, indem Sie es mit einer Pipette mischen. 30 s inkubieren lassen.
    5. Pulszentrifuge, um Flüssigkeit am Röhrchenboden zu sammeln und auf den Magneten zu legen. Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 13.4.4-13.4.5, um das Pellet ein zweites Mal zu waschen.
    7. Pulszentrifugieren und überschüssiges SFB entfernen.
    8. Resuspendieren Sie in 15 μl EB und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
    9. Kehren Sie für ~2 Minuten zum Magneten zurück und geben Sie die Lösung dann vorsichtig in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    10. Quantifizieren Sie 1 μl der eluierten Bibliothek, wie zuvor in Schritt 10.13 beschrieben
      HINWEIS: Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie direkt mit der MinION-Sequenzierung fortfahren. Die endgültige Bibliothek kann jedoch bei Bedarf bis zu 1 Woche in EB bei 4 °C gelagert werden.
  5. Führen Sie eine Qualitätsprüfung der Durchflusszelle durch.
    1. Schließen Sie das Sequenziergerät an einen Laptop an und öffnen Sie die Sequenzierungssoftware.
    2. Wählen Sie den Durchflusszellentyp aus, und klicken Sie dann auf Flusszelle überprüfen und Test starten.
    3. Nach Abschluss des Vorgangs wird die Gesamtzahl der aktiven (d. h. lebensfähigen) Poren angezeigt. Eine neue Durchflusszelle sollte >800 aktive Poren haben; Wenn dies nicht der Fall ist, wenden Sie sich an den Hersteller, um einen Ersatz zu erhalten.
  6. Ansaugen und Beladen der Durchflusszelle (20 min)
    1. Tauen Sie die folgenden Reagenzien bei RT auf und legen Sie dann den Sequenzierungspuffer, einen Spülgurt, einen Spülpuffer und Ladeperlen auf Eis.
    2. Sequenzierpuffer und Spülpuffer vortexen, zentrifugieren und auf Eis legen.
    3. Pulszentrifugieren Sie den Spülgurt und mischen Sie ihn durch Pipettieren. Dann auf Eis legen.
    4. Bereiten Sie die Priming-Mischung für die Durchflusszelle vor, indem Sie 30 μl Flush Tether direkt in das Röhrchen mit dem Spülpuffer aus einem Priming-Kit für die Durchflusszelle geben und durch Pipettieren mischen.
    5. Mischen Sie die Ladeperlen unmittelbar vor dem Gebrauch durch Pipettieren, da sie sich schnell absetzen.
    6. Bereiten Sie in einem frischen Röhrchen die endgültige Bibliotheksverdünnung für die Sequenzierung vor, wie in Tabelle 5 beschrieben.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Berechnung im Arbeitsblatt Ergänzungsdatei 3 , um das Volumen der DNA-Bibliothek zu erhalten, das 50 fmol entspricht. Wenn weniger als 12 μl berechnet werden, fügen Sie EB hinzu, um bis zu 12 μl zu erhalten.
    7. Klappen Sie den Deckel des Sequenziergeräts zurück und schieben Sie die Abdeckung des Ansauganschlusses im Uhrzeigersinn, so dass der Ansauganschluss sichtbar ist (Abbildung 3)
    8. Entfernen Sie Luftblasen vorsichtig, indem Sie eine P1000-Pipette auf 200 μl einstellen, die Spitze in die Ansaugöffnung einführen und das Rad drehen, bis ein kleines Volumen in die Pipettenspitze eintritt (max. Umdrehung auf 230 μl).
    9. Laden Sie 800 μl Priming-Mischung der Durchflusszelle über den Sauganschluss in die Durchflusszelle und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden.
    10. 5 Min. einwirken lassen.
    11. Heben Sie die Abdeckung des Probenanschlusses vorsichtig an und füllen Sie mit einer P1000-Pipette 200 μl Priming-Mischung über den Priming-Port in die Durchflusszelle.
    12. Pitaptieren Sie die Bibliotheksmischung vor dem Laden auf und ab und stellen Sie sicher, dass die Ladeperlen in der Mastermischung vor dem Laden wieder suspendiert werden.
    13. Laden Sie 75 μl Bibliotheksmischung tropfenweise über den Probenanschluss in die Durchflusszelle. Stellen Sie sicher, dass jeder Tropfen in den Anschluss fließt, bevor Sie den nächsten hinzufügen.
    14. Setzen Sie die Abdeckung des Probenanschlusses vorsichtig wieder auf und stellen Sie sicher, dass der Stopfen in den Probenanschluss eindringt.
    15. Schließen Sie den Ansauganschluss und setzen Sie den Deckel des Sequenziergeräts wieder auf.
  7. Sequenzierlauf (maximal 48 Stunden)
    1. Schließen Sie das Sequenziergerät an den Laptop an und öffnen Sie die Sequenzierungssoftware.
    2. Klicken Sie auf Start und dann auf Sequenzierung starten.
    3. Klicken Sie auf Neues Experiment , und befolgen Sie den Workflow der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) der Sequenzierungssoftware, um die Parameter für die Ausführung einzurichten.
    4. Geben Sie den Namen des Experiments und die Proben-ID ein (z. B. rabv_run1) und wählen Sie den Durchflusszellentyp aus dem Dropdown-Menü aus.
    5. Fahren Sie mit der Auswahl des Kits fort und wählen Sie das entsprechende Ligationssequenzierungskit und das verwendete native Barcoding-Kit aus.
    6. Fahren Sie mit den Ausführungsoptionen fort. Behalten Sie die Standardwerte bei, es sei denn, es ist gewünscht, dass der Lauf nach einer bestimmten Anzahl von Stunden automatisch beendet wird (Läufe können jederzeit manuell gestoppt werden).
    7. Fahren Sie mit Basecalling fort. Wählen Sie aus, ob Basecalling je nach Rechenressourcen ein- oder ausgeschaltet werden soll (siehe Computer-Setup). Wählen Sie unter Barcode die Option "Optionen bearbeiten" und stellen Sie sicher, dass "Barcode an beiden Enden" aktiviert ist. Speichern Sie und fahren Sie mit dem Ausgabeabschnitt fort.
    8. Übernehmen Sie die Standardeinstellungen, und fahren Sie mit der abschließenden Überprüfung fort, überprüfen Sie die Einstellungen, und notieren Sie die Details im Arbeitsblatt (Zusatzdatei 3). Klicken Sie auf Start.
      HINWEIS: Wenn die Durchflusszelle wiederverwendet wird, passen Sie die Startspannung (im erweiterten Abschnitt der Laufoptionen) an, wie im Schema in Zusatzdatei 3 angegeben.
    9. Notieren Sie die anfänglich aktiven Kanäle – wenn diese deutlich niedriger sind als die Qualitätskontrolle (QC), starten Sie die Sequenzierungssoftware neu. Wenn immer noch niedriger, starten Sie den Computer neu.
    10. Notieren Sie die anfänglichen Kanäle im Vergleich zu einer einzelnen Pore, um eine ungefähre Porenbelegung zu erhalten. Diese Zahl wird schwanken, also geben Sie eine Annäherung an.
    11. Überwachen Sie den Verlauf der Ausführung.

14. Live- und Offline-Basecalling

HINWEIS: Diese Anweisungen gehen davon aus, dass die bereits vorhandene Verzeichnisstruktur, die im arkt-rabv-Repository bereitgestellt wird, und dass die Voraussetzungen Abschnitte 1 und 3 des Protokolls befolgt wurden.

  1. Erstellen Sie in Ihrem lokalen Dateisystem ein neues Verzeichnis mit dem Namen analysis, in dem Sie alle Analyseausgaben speichern. Um weiter zu organisieren: Erstellen Sie ein Unterverzeichnis mit dem Namen Ihres Projekts und darin ein neues Verzeichnis für die Ausführung, wobei Sie die Beispiel-ID verwenden, die dem MinKNOW als run_name zur Verfügung gestellt wird. Führen Sie dies in einem Befehl wie folgt aus:
    mkdir -p
    Analyse/project_name/run_name
    Navigieren Sie dann zu seinem Speicherort:
    CD
    Pfad/Analyse/project_name/run_name
  2. Live-Basecalling
    HINWEIS: Um Nanoporen-Basecalling in Echtzeit durchführen zu können, benötigen Laptops eine NVIDIA CUDA-kompatible Grafikprozessoreinheit (GPU). Stellen Sie sicher, dass die Anweisungen für das GPU-Basecalling-Setup mit dem Guppy-Protokoll56 ausgeführt wurden.
    1. Aktivieren Sie während des Ausführungssetups das Live-Basecalling.
    2. Verwenden Sie RAMPART, um die Sequenzierungsabdeckung in Echtzeit zu überwachen, wie in der folgenden Anweisung beschrieben.
    3. Aktivieren Sie im Terminal des Computers die Umgebung artic-rabv conda:
      Conda Activate ARTIC-Rabv
    4. Erstellen Sie ein neues Verzeichnis für die Rampart-Ausgabe innerhalb des run_name-Verzeichnisses und navigieren Sie dorthin:
      cd /pfad/analyse/project_name/run_name
      mkdir rampart_output
      CD rampart_output
    5. Erstellen Sie eine barcodes.csv-Datei, um die Barcodes und Beispielnamen zu koppeln. Es sollte eine Zeile pro Barcode haben und nur Barcodes angeben, die in der Bibliothek vorhanden sind, mit den Überschriften "Barcode" und "Muster". Folgen Sie dem Beispiel im Verzeichnis artic-rabv:
      Analyse/example_project/example_run/rampart_output/Barcodes.csv
    6. Starten Sie RAMPART, indem Sie den entsprechenden Protokollordner und den Pfad zum Ordner fastq_pass in der MinKNOW-Ausgabe für die Ausführung angeben:
      rampart --protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol - basecalledPath
    7. Öffnen Sie ein Browserfenster, und navigieren Sie im Feld URL zu localhost:3000. Warten Sie, bis genügend Daten als Basecall angezeigt werden, bevor die Ergebnisse auf dem Bildschirm angezeigt werden.
  3. Offline-Basecalling (wird nach der Ausführung durchgeführt)
    1. Wenn kein Live-Basecalling eingestellt wurde, werden von MinKNOW Rohsignaldaten (fast5-Dateien) ausgegeben. Man wird nicht in der Lage sein, RAMPART während des Laufs zu verwenden. Konvertieren Sie die fast5-Dateien nach dem Start mit guppy in basecalled-Daten (fastq-Dateien) (siehe Setup in Voraussetzungen Schritt 1.1.1.). Führen Sie RAMPART post-hoc für die aufgerufenen Basisdaten aus.
    2. Führe den guppy-basecaller aus:
      guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /Pfad/zum/lesen/fast5_* -s /Pfad/Analyse/project_name/run_name -x auto -r
      -c ist die Konfigurationsdatei zur Angabe des Basecalling-Modells, -i ist der Eingabepfad, -s ist der Speicherpfad, -x gibt Basecalling durch das GPU-Gerät an (ausschließen, wenn die Computerversion von Guppy verwendet wird) und -r gibt an, dass Eingabedateien rekursiv durchsucht werden sollen.
      HINWEIS: Die Konfigurationsdatei (.cfg) kann in einen hochpräzisen Basecaller geändert werden, indem _fast durch _hac ersetzt wird, obwohl dies deutlich länger dauert.

15. Waschen der Durchflusszellen

  1. Die Durchflusszellen können gewaschen und wiederverwendet werden, um neue Bibliotheken zu sequenzieren, wenn die Poren noch lebensfähig sind. Siehe Anweisungen zum Waschen im ONT-Durchflusszellen-Waschprotokoll57.

16. Analyse und Interpretation

  1. Generierung von Konsenssequenzen mit der Bioinformatik-Pipeline von ARTIC
    1. Befolgen Sie die Anweisungen im gitHub-Repository40 von artic-rabv im Ordner rabv_protocols, um Konsenssequenzen aus rohen fast5- oder basecalled-fastq-Dateien zu generieren.
      HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie unter Arktis-Pipeline - Kern-Pipeline58 .
  2. Optional: Analysieren Sie die durchschnittliche Lesetiefe pro Amplicon.
    1. Passen Sie die Skripte an, die im arkt-rabv-Repository verfügbar sind, und beziehen Sie sich dabei auf Ergänzungsdatei 1. Kurz gesagt, detaillierte Statistiken werden mit SAMtools59 erstellt und die Abdeckung pro Nukleotid in R aufgetragen.
  3. Phylogenetische Analyse mit GLUE
    1. Wählen Sie in RABV_GLUE42 die Registerkarte Analyse > Genotypisierung und Interpretation > Dateien hinzufügen und wählen Sie die Fasta-Datei mit Konsenssequenzen aus.
    2. Klicken Sie auf Senden und warten. Sobald die Analysen abgeschlossen sind, kann auf die Schaltfläche "Analyse anzeigen " geklickt werden, um die Kladen- und Subkladenzuweisungen, die Abdeckung pro Gen, die Variation von Referenzsequenzen und den nächsten Verwandten anzuzeigen.
    3. Relevante kontextuelle Sequenzen können auch im Abschnitt Sequenzdaten > NCBI-Sequenzen nach Klade identifiziert werden.
    4. Wählen Sie die identifizierte Klade aus oder klicken Sie auf Tollwutvirus (RABV), um alle verfügbaren Sequenzen anzuzeigen.
    5. Filtern Sie nach relevanten Sequenzen (z. B. Herkunftsland).
    6. Laden Sie diese Sequenzen und die entsprechenden Metadaten zur Analyse und zum Vergleich herunter.
  4. Herkunftszuordnung mit MADDOG41
    1. Rufen Sie das MADDOG-Repository von GitHub ab, um sicherzustellen, dass Sie mit der aktuellsten Version arbeiten.
    2. Erstellen Sie einen Zuweisungsordner innerhalb des lokalen MADDOG-Repositorys (der zuvor im Abschnitt "Voraussetzungen" erstellt wurde) mit dem Namen "Ausführungsname".
    3. Fügen Sie innerhalb des Ordners die Fasta-Datei hinzu, die die Konsensussequenzen enthält.
    4. Fügen Sie dem Ordner eine Metadatendatei hinzu.
      HINWEIS: Bei dieser Datei muss es sich um eine CSV-Datei mit 4 Spalten namens "ID", "Land", "Jahr" und "Zuordnung" handeln, in denen die Sequenz-IDs, das Land der Probenahme und das Jahr der Probenentnahme aufgeführt sind, während die Spalte "Zuweisung" leer sein sollte.
    5. Aktivieren Sie in der Kommandozeilenschnittstelle die conda-Umgebung: conda activate MADDOG.
    6. Navigieren Sie in der Befehlszeilenschnittstelle zum Ordner MADDOG Repository.
    7. Führen Sie zunächst die Herkunftszuweisung für Sequenzen durch, um nach potenziellen Anomalien zu suchen und festzustellen, ob das Ausführen des längeren Schritts zur Herkunftsbezeichnung angemessen wäre. Geben Sie dazu Folgendes in die Befehlszeile ein: sh assignment.sh.
    8. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie Y ein, um anzugeben, dass Sie das Repository abgerufen haben und mit der aktuellsten Version von MADDOG arbeiten.
    9. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie den Namen des Ordners innerhalb des MADDOG-Repository-Ordners ein, der die Fasta-Datei enthält.
    10. Wenn die Herkunftszuweisung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Ausgabedatei in Ihrem Ordner. Wenn die Ausgabe wie erwartet ist und mehrere Sequenzen derselben Herkunft zugewiesen sind, führen Sie die Herkunftsbezeichnung aus.
    11. Wenn Sie die Herkunftsbezeichnung ausführen, löschen Sie die soeben erstellte Zuweisungsausgabedatei.
    12. Führen Sie im Terminal im MADDOG-Repository-Ordner den Befehl sh designation.sh aus.
    13. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie Y ein, um anzugeben, dass Sie das Repository abgerufen haben und mit der aktuellsten Version von MADDOG arbeiten.
    14. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie den Ordnernamen im MADDOG-Repository-Ordner ein, der die Fasta-Datei und die Metadaten enthält. Dies gibt Abstammungsinformationen zu jeder Sequenz, eine Phylogenie der neuen und relevanten früheren Sequenzen (aus 16.3.6), hierarchische Informationen über die Abstammungslinien und Details zu potenziell neu auftretenden Abstammungslinien und Bereichen mit Unterstichproben aus.
      HINWEIS: Ausführliche Informationen zum Protokoll, zur Verwendung und zu den Ausgaben finden Sie in Campbell et al.60.
    15. Wenn die erste Analyse abgeschlossen ist und Sie aufgefordert werden, auch auf neu auftretende und unterbewertete Abstammungslinien zu testen, geben Sie Y ein, falls dies erforderlich ist. Geben Sie andernfalls N ein.
    16. Wenn Sie aufgefordert werden, neu gefundene Herkünfte zu bestätigen, geben Sie Y ein, und befolgen Sie die Anweisungen in der resultierenden NEXT_STEPS.eml-Datei. Geben Sie andernfalls N ein.

Representative Results

Der in diesem Protokoll beschriebene Workflow von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation von RABV wurde unter verschiedenen Laborbedingungen in endemischen Ländern wie Tansania, Kenia, Nigeria und den Philippinen erfolgreich eingesetzt (Abbildung 4). Das Protokoll wurde für verschiedene Probentypen und -bedingungen verwendet (Tabelle 6): frisches und gefrorenes Hirngewebe, cDNA- und RNA-Extrakte aus Hirngewebe, das über längere Zeiträume unter Kühlkette transportiert wurde, und FTA-Karten mit Hirngewebeabstrichen.

Live-Basecalling mit RAMPART (Abbildung 5) zeigt die Generierung von Lesevorgängen und die prozentuale Abdeckung pro Probe. Dies ist besonders nützlich, um zu entscheiden, wann der Lauf gestoppt und die Durchflusszelle zur Wiederverwendung aufbewahrt werden soll. Es wurden Schwankungen in der Laufzeit beobachtet, wobei einige in 2 Stunden fertig waren, während andere mehr als 12 Stunden brauchten, um eine ausreichende Abdeckungstiefe (x100) zu erreichen. Wir können auch Regionen mit schlechter Verstärkung anzeigen; Abbildung 6 zeigt beispielsweise eine Momentaufnahme eines Sequenzierungslaufs, bei dem die Abdeckungsprofile einige Amplikons mit sehr geringer Amplifikation zeigen, was auf potenziell problematische Primer hinweist. Durch die genauere Untersuchung dieser schlecht amplifizierenden Regionen konnten wir Primer-Fehlanpassungen identifizieren, die es uns ermöglichen werden, einzelne Primer neu zu gestalten und zu verbessern. Einige Primer-Schemata haben mehr Diskrepanzen gezeigt als andere. Dies ist im Ostafrika-Primer-Programm im Vergleich zu den Philippinen im Einklang mit der angestrebten Vielfalt zu beobachten, da das Ostafrika-Programm darauf abzielt, eine viel breitere Vielfalt zu erfassen.

RABV-GLUE42, eine universelle Ressource für das RABV-Genomdatenmanagement, und MADDOG60, ein Abstammungsklassifikations- und Nomenklatursystem, wurden verwendet, um die resultierenden RABV-Sequenzen zusammenzustellen und zu interpretieren. Tabelle 7 zeigt die Haupt- und Nebenkladen, die in jedem Land zirkulieren, das mit RABV-GLUE zugeordnet wurde. Gezeigt wird auch eine höher aufgelöste Klassifikation lokaler Abstammungslinien nach der MADDOG-Zuweisung.

Figure 1
Abbildung 1: Sample-to-Sequence-to-Interpretation-Workflow für RABV. Es werden zusammengefasste Schritte für (A) Probenvorbereitung, (B) PCR- und Bibliotheksvorbereitung und (C) Sequenzierung und Bioinformatik bis hin zur Analyse und Interpretation gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Primer-Schemas. Annealing-Positionen entlang des "Index-Referenzgenoms" (dunkelviolett) für Paare von Vorwärts- und Rückwärts-Primern (Halbpfeile), die in zwei getrennten Pools zugewiesen sind: A (rot) und B (grün). Primerpaare erzeugen 400 bp überlappende Amplikons (blau), die entlang des Index-Referenzgenoms im Format "scheme_name_X_DIRECTION" sequenziell nummeriert sind, wobei "X" eine Zahl ist, die sich auf das vom Primer erzeugte Amplikon bezieht, und "DIRECTION" entweder "LEFT" oder "RIGHT" ist, was die Vorwärts- bzw. Rückwärtsbewegung beschreibt. Ungerade oder gerade Werte von 'X' bestimmen den Pool (A bzw. B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Nanoporen-Durchflusszelle48. Blaue Etiketten veranschaulichen die verschiedenen Teile der Durchflusszelle, einschließlich der Abdeckung des Ansauganschlusses, der den Ansauganschluss abdeckt, an dem die Ansauglösung zugegeben wird, der SpotON-Probenanschlussabdeckung, die den Probenanschluss abdeckt, an dem die Probe tropfenweise zugegeben wird, die Abfallanschlüsse 1 und 2 sowie die Durchflusszellen-ID. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Karte mit dem Ort, an dem die RABV-Sequenzierung mit dem optimierten Workflow in den Jahren 2021 und 2022 durchgeführt wurde. Blasengröße und -farbe entsprechen der Anzahl der Sequenzen pro Position, wobei kleiner und dunkler weniger und größer und heller mehr ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Screenshot der RAMPART-Visualisierung im Webbrowser. Barcode-Namen werden entsprechend dem bioinformatischen Aufbau durch Probennamen ersetzt. Die oberen drei Felder zeigen zusammenfassende Diagramme für den gesamten Lauf: Abdeckungstiefe der zugeordneten Reads für jeden Barcode pro Nukleotidposition auf dem Index-Referenzgenom (oben links, gefärbt durch Barcode), summierte gemappte Reads von allen Barcodes im Laufe der Zeit (oben Mitte) und zugeordnete Reads pro Barcode (oben rechts, gefärbt durch Barcode). Die unteren Felder zeigen Reihen von Plots pro Barcode. Von links nach rechts: die Abdeckungstiefe der kartierten Reads pro Nukleotidposition auf dem Index-Referenzgenom (links), die Längenverteilung der kartierten Reads (Mitte) und der Anteil der Nukleotidpositionen auf dem Index-Referenzgenom, die im Laufe der Zeit eine 10-fache, 100-fache und 1.000-fache Abdeckung der kartierten Reads erreicht haben (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Ein Beispiel für die Leseabdeckung des Genoms einer Tollwutvirusprobe von den Philippinen, die mit dem Protokoll sequenziert wurde. Die Leseabdeckung an jeder Nukleotidposition im Genom wird zusammen mit der Position der überlappenden Amplikons (1-41) angezeigt, die zur Generierung der Bibliothek verwendet wurden. Spitzen in der Abdeckungstiefe entsprechen Bereichen mit Amplikonüberlappung. Amplikons mit geringer Bedeckungstiefe entsprechen Bereichen mit Amplikonüberlappung. Amplikons mit geringer Abdeckungstiefe werden rot hervorgehoben, was auf problematische Regionen hinweist, die möglicherweise optimiert werden müssen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Mastermix- und Thermocycler-Bedingungen für die cDNA-Präparation. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Mastermix- und Thermocycler-Bedingungen für die Multiplex-PCR. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Mastermix- und Thermocycler-Bedingungen für die End-Prep-Reaktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Mastermix- und Thermocycler-Bedingungen für Barcoding. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Adapter-Ligations-Mastermix und endgültige Bibliotheksverdünnung für die Sequenzierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6: Die Anzahl der erzeugten Sequenzen des gesamten Genoms des Tollwutvirus und die Art der Proben, die in verschiedenen Ländern unter Verwendung des Workflows von der Probe zur Sequenz und zur Interpretation verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 7: Major- und Minor-Klade-Zuweisungen aus RABV-GLUE und Lineage-Zuweisungen aus MADDOG für Sequenzen, die mit dem Workflow generiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Primer-Schema-Design und -Optimierung sowie Amplikon-Lesetiefenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 2: Rechnerische Einrichtung Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 3: Arbeitsblatt zum RABV-WGS-Protokoll Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Ein zugänglicher RABV-, Nanoporen-basierter Sequenzierungs-Workflow für das gesamte Genom wurde von Brunker et al.61 unter Verwendung von Ressourcen aus dem ARTIC-Netzwerk46 entwickelt. Hier stellen wir einen aktualisierten Workflow mit vollständigen Schritten von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation vor. Der Arbeitsablauf beschreibt die Vorbereitung von Hirngewebeproben für die Sequenzierung des gesamten Genoms, stellt eine Bioinformatik-Pipeline zur Verarbeitung von Lesevorgängen und zur Generierung von Konsensussequenzen vor und hebt zwei tollwutspezifische Werkzeuge hervor, um die Zuordnung von Abstammungslinien zu automatisieren und den phylogenetischen Kontext zu bestimmen. Der aktualisierte Workflow bietet auch umfassende Anweisungen für die Einrichtung geeigneter Computer- und Laborarbeitsbereiche mit Überlegungen zur Implementierung in verschiedenen Kontexten (einschließlich ressourcenarmer Einstellungen). Wir haben die erfolgreiche Implementierung des Workflows sowohl in akademischen als auch in Forschungsinstituten in vier RABV-endemischen LMICs ohne oder mit eingeschränkter genomischer Überwachungskapazität demonstriert. Der Workflow hat sich als widerstandsfähig für die Anwendung in verschiedenen Umgebungen erwiesen und ist für Benutzer mit unterschiedlichem Fachwissen verständlich.

Dieser Workflow für die RABV-Sequenzierung ist das umfassendste öffentlich verfügbare Protokoll (das die Schritte von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation abdeckt) und speziell angepasst wurde, um sowohl die Anlauf- als auch die Betriebskosten zu senken. Der Zeit- und Kostenaufwand für die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung mit der Nanoporentechnologie ist im Vergleich zu anderen Plattformen, wie z. B. Illumina61, stark reduziert, und kontinuierliche Technologieentwicklungen verbessern die Sequenzqualität und -genauigkeit, um mit Illumina62 vergleichbar zu sein.

Dieses Protokoll ist so konzipiert, dass es in verschiedenen ressourcenarmen Kontexten widerstandsfähig ist. Durch die Bezugnahme auf die Anleitungen zur Fehlerbehebung und Änderungen, die neben dem Kernprotokoll bereitgestellt werden, werden Benutzer dabei unterstützt, den Workflow an ihre Bedürfnisse anzupassen. Die Hinzufügung benutzerfreundlicher bioinformatischer Werkzeuge zum Arbeitsablauf stellt eine wichtige Weiterentwicklung des ursprünglichen Protokolls dar und bietet schnelle und standardisierte Methoden, die von Benutzern mit minimaler bioinformatischer Vorerfahrung angewendet werden können, um Sequenzdaten in lokalen Kontexten zu interpretieren. Die Kapazitäten, dies vor Ort zu tun, sind oft durch die Notwendigkeit begrenzt, über spezifische Programmier- und phylogenetische Fähigkeiten zu verfügen, die eine intensive und langfristige Investition in die Ausbildung von Fähigkeiten erfordern. Während diese Fähigkeiten wichtig sind, um Sequenzdaten gründlich zu interpretieren, sind grundlegende und zugängliche Interpretationswerkzeuge ebenso wünschenswert, um lokale "Sequenzierungs-Champions" zu befähigen, deren Kernkompetenz möglicherweise im Nasslabor liegt und die es ihnen ermöglicht, ihre Daten zu interpretieren und die Verantwortung dafür zu übernehmen.

Da das Protokoll seit einigen Jahren in mehreren Ländern praktiziert wird, können wir nun eine Anleitung zur Optimierung von Multiplex-Primer-Schemata geben, um die Abdeckung zu verbessern und mit der angesammelten Vielfalt umzugehen. Es wurden auch Anstrengungen unternommen, um den Anwendern zu helfen, die Kosteneffizienz zu verbessern oder eine einfache Beschaffung in einer bestimmten Region zu ermöglichen, was in der Regel eine Herausforderung für die Nachhaltigkeit molekularer Ansätze darstellt63. In Afrika (Tansania, Kenia und Nigeria) haben wir uns beispielsweise für einen Blunt/TA-Ligase-Mastermix bei der Adapterligation entschieden, der bei lokalen Lieferanten leichter erhältlich und eine günstigere Alternative zu anderen Ligationsreagenzien darstellte.

Erfahrungsgemäß gibt es mehrere Möglichkeiten, die Kosten pro Probe und pro Lauf zu senken. Die Reduzierung der Anzahl der Proben pro Lauf (z. B. von 24 auf 12 Proben) kann die Lebensdauer von Durchflusszellen über mehrere Läufe verlängern, während eine Erhöhung der Anzahl der Proben pro Lauf die Zeit und die Reagenzien maximiert. In unseren Händen waren wir in der Lage, Durchflusszellen für einen von drei Sequenzierläufen zu waschen und wiederzuverwenden, so dass weitere 55 Proben sequenziert werden konnten. Das Waschen der Durchflusszelle unmittelbar nach dem Gebrauch oder, falls dies nicht möglich ist, das Entfernen der Abfallflüssigkeit aus dem Abfallkanal nach jedem Durchlauf schien die Anzahl der Poren zu erhalten, die für einen zweiten Durchlauf zur Verfügung standen. Unter Berücksichtigung der anfänglichen Anzahl der Poren, die in einer Durchflusszelle verfügbar sind, kann ein Lauf auch optimiert werden, um zu planen, wie viele Proben in einer bestimmten Durchflusszelle ausgeführt werden sollen.

Obwohl der Workflow darauf abzielt, so umfassend wie möglich zu sein, mit zusätzlichen detaillierten Anleitungen und ausgeschilderten Ressourcen, ist das Verfahren immer noch komplex und kann für einen neuen Benutzer entmutigend sein. Der Benutzer wird ermutigt, persönliche Schulungen und Unterstützung in Anspruch zu nehmen, idealerweise vor Ort oder alternativ durch externe Mitarbeiter. Auf den Philippinen beispielsweise hat ein Projekt zum Aufbau von Kapazitäten in regionalen Laboren für die genomische Überwachung von SARS-CoV-2 mittels ONT Kernkompetenzen unter Diagnostikern im Gesundheitswesen entwickelt, die leicht auf die RABV-Sequenzierung übertragbar sind. Wichtige Schritte, wie z. B. die SPRI-Bead-Reinigung, können ohne praktisches Training schwer zu meistern sein, und eine ineffektive Reinigung kann die Durchflusszelle beschädigen und den Lauf beeinträchtigen. Die Kontamination von Proben ist bei der Verarbeitung von Amplikons im Labor immer ein großes Problem und kann schwer zu beseitigen sein. Insbesondere Kreuzkontaminationen zwischen Proben sind in der Bioinformatik nach dem Durchlauf äußerst schwer zu erkennen. Gute Labortechniken und -praktiken, wie z. B. die Aufrechterhaltung sauberer Arbeitsflächen, die Trennung von Pre- und Post-PCR-Bereichen und die Einbeziehung von Negativkontrollen, sind unerlässlich, um die Qualitätskontrolle zu gewährleisten. Das hohe Tempo der Entwicklung der Nanoporen-Sequenzierung ist sowohl ein Vor- als auch ein Nachteil für die routinemäßige RABV-Genomüberwachung. Kontinuierliche Verbesserungen der Genauigkeit, Zugänglichkeit und des Protokollrepertoires von Nanopore erweitern und verbessern den Anwendungsbereich. Dieselben Entwicklungen machen es jedoch schwierig, Standardarbeitsanweisungen und bioinformatische Pipelines aufrechtzuerhalten. In diesem Protokoll stellen wir ein Dokument zur Verfügung, das den Übergang von älteren zu aktuellen Nanoporenbibliotheks-Vorbereitungskits (Materialtabelle) unterstützt.

Ein häufiges Hindernis für die Sequenzierung in LMICs ist die Zugänglichkeit, die nicht nur die Kosten, sondern auch die Möglichkeit der zeitnahen Beschaffung von Verbrauchsmaterialien (insbesondere Sequenzierungsreagenzien, die für Beschaffungsteams und Lieferanten relativ neu sind) und Rechenressourcen sowie einfach den Zugang zu stabiler Stromversorgung und dem Internet umfasst. Die Verwendung der tragbaren Nanoporen-Sequenzierungstechnologie als Grundlage dieses Arbeitsablaufs hilft bei vielen dieser Zugänglichkeitsprobleme, und wir haben die Verwendung unseres Protokolls in einer Reihe von Umgebungen demonstriert, indem wir das vollständige Protokoll und die Analyse vor Ort durchgeführt haben. Zugegebenermaßen ist die rechtzeitige Beschaffung von Geräten und Verbrauchsmaterialien für die Sequenzierung nach wie vor eine Herausforderung, und in vielen Fällen waren wir gezwungen, Reagenzien aus dem Vereinigten Königreich zu transportieren oder zu versenden. In einigen Bereichen konnten wir uns jedoch vollständig auf lokale Lieferwege für Reagenzien verlassen und profitierten von Investitionen in die SARS-CoV-2-Sequenzierung (z. B. auf den Philippinen), die die Beschaffungsprozesse rationalisiert und begonnen haben, die Anwendung der Genomik von Krankheitserregern zu normalisieren.

Der Bedarf an einer stabilen Internetverbindung wird durch einmalige Installationen minimiert. Zum Beispiel benötigen GitHub-Repositories, Software-Downloads und die Nanoporen-Sequenzierung selbst nur einen Internetzugang, um den Lauf zu starten (nicht durchgehend) oder können mit Zustimmung des Unternehmens vollständig offline durchgeführt werden. Wenn mobile Daten verfügbar sind, kann ein Telefon als Hotspot für den Laptop verwendet werden, um den Sequenzierungslauf zu starten, bevor die Verbindung für die Ausführungsdauer getrennt wird. Bei der routinemäßigen Verarbeitung von Proben können die Anforderungen an die Datenspeicherung schnell steigen, und im Idealfall werden die Daten auf einem Server gespeichert. Ansonsten sind SSD-Festplatten (Solid State Drives) relativ kostengünstig zu beschaffen.

Wir sind uns zwar bewusst, dass es immer noch Hindernisse für die genomische Überwachung in LMICs gibt, aber steigende Investitionen in den Aufbau von Zugang und Fachwissen zur Genomik (z. B. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa PGI])64 deuten darauf hin, dass sich diese Situation verbessern wird. Die genomische Überwachung ist für die Pandemievorsorge von entscheidender Bedeutung6, und Kapazitäten können durch die Routineisierung der genomischen Überwachung endemischer Krankheitserreger wie RABV aufgebaut werden. Die globalen Ungleichheiten bei den Sequenzierungskapazitäten, die während der SARS-CoV-2-Pandemie zutage getreten sind, sollten ein Motor für einen katalytischen Wandel sein, um diese strukturellen Ungleichheiten anzugehen.

Dieser Workflow von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation für RABV, einschließlich zugänglicher bioinformatischer Werkzeuge, hat das Potenzial, als Richtschnur für Kontrollmaßnahmen verwendet zu werden, die darauf abzielen, bis 2030 keine Todesfälle beim Menschen durch hundevermittelte Tollwut mehr zu erreichen, und letztendlich für die Eliminierung von RABV-Varianten. In Kombination mit relevanten Metadaten ermöglichen die aus diesem Protokoll generierten genomischen Daten eine schnelle RABV-Charakterisierung bei Ausbruchsuntersuchungen und bei der Identifizierung zirkulierender Abstammungslinien in einem Land oder einer Region60,61,65. Wir veranschaulichen unsere Pipeline hauptsächlich anhand von Beispielen aus der durch Hunde vermittelten Tollwut; Der Workflow ist jedoch direkt auf Wildtier-Tollwut anwendbar. Diese Übertragbarkeit und die niedrigen Kosten minimieren die Herausforderungen bei der einfachen Bereitstellung von Routinesequenzierungen, nicht nur für Tollwut, sondern auch für andere Krankheitserreger46,66,67, um das Krankheitsmanagement und die Krankheitskontrolle zu verbessern.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton-Finanzierung durch den Medical Research Council [MR/R025649/1] und das philippinische Ministerium für Wissenschaft und Technologie (DOST), die UK Research and Innovation Global Effort on COVID-19 [MR/V035444/1], den University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], und International Partnership Development Fund, ein Stipendium des DOST British Council-Philippines (CB), ein GemVi-Stipendium des National Institute for Health Research [17/63/82] und Stipendien der University of Glasgow vom MVLS DTP (KC) [125638-06], dem EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] und dem Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. Wir danken den Kollegen und Mitarbeitern, die diese Arbeit unterstützt haben: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana und Anna Czupryna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brand name
Software
Sequencing software
(MinKnow)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/downloads
Bioinformatics tool kit
(Guppy)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
Equipment
Thermal cycler
(miniPCR™ mini16 thermal cycler)		 Cambio MP-QP-1016-01
Homogenizer
(Precellys Evolution Touch Homogenizer)		 Bertin Instruments EQ02520-300
Cold Racks (0.2-0.5mL)
(PCR Mini-cooler with transparent lid)		 BRAND  781260
Pipettor
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) Gilson  SKU: FA10030
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) Gilson  SKU: FA10024
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) Gilson  SKU: FA10020
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) Gilson  SKU: FA10025
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) Gilson  SKU: FA10021
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) Gilson  SKU: FA10026
Fluorometer
(Qubit  4 Fluorometer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q33238
Laptop 
(Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU])
Microcentrifuge
(Refrigerated centrifuge)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 75004081
Vortex mixer
(Basic vortex mixer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 88882011
Magnetic rack
(DynaMag -2 Magnet)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 12321D
Sequencing device
(MinION)		 Oxford Nanopore Technologies MinION Mk1B
RNA Extraction 
RNA extraction kit
(Qiagen RNEasy Mini Kit 250)		 Qiagen 74106
RNA stabilizing reagents 
(RNA later)  Invitrogen AM7020
(DNA/RNA Shield) Zymo Research R1100-50
PCR
Nuclease-free Water
(Nuclease-free Water [not  DEPC-treated])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific AM9937
Master mix for first strand cDNA synthesis
(LunaScript RT SuperMix Kit)		 New England Biolabs E3010S
DNA amplification master mix
(Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])		 New England Biolabs M0494L
Primer (Scheme)
(Custom DNA oligos)		 Invitrogen
SPRI Bead Clean-up
SPRI beads
(Aline Biosciences PCR Clean DX )		 Cambio AL-AC1003-50
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] Merck 818760
Short Fragment buffer
(SFB expansion pack)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-SFB001
DNA Quantification
DNA quantification kit
(Qubit® dsDNA HS Assay Kit)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32854
DNA quantification assay tubes
(Qubit™ Assay Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32856
End Prep and barcoding
(Qubit™ Assay Tubes)
End Prep master mix
(NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)		 New England Biolabs E7546L
Barcoding kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9 
(Native Barcoding Expansion 1-12) EXP-NBD104 
(Native Barcoding Expansion 13-24)  EXP-NBD114 
(Native Barcoding Expansion 96) EXP-NBD196
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
(not compatible)  (not compatible) 
(Native Barcoding Kit 24 V14) SQK-NBD114.24
(Native Barcoding Kit 96 V14) SQK-NBD114.96
Ligation mastermix
(Blunt/TA Ligase Master Mix)		 New England Biolabs M0367S
Adapter Ligation
Adapter ligation master mix
(NEBNext  Quick Ligation Module) New England Biolabs E6056S  
(NEBNext Ultra II Ligation Module)  New England Biolabs E7595S
(Blunt/TA Ligase Master Mix) New England Biolabs M0367S
Adapter mix
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-AMII001
(Adapter Mix II [AMII])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-NBA114
(Native adapter [NA])
Sequencing 
Flowcell priming kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-FLP002
(Flush Buffer [FB])
(Flush Tether [FT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-FLP004
(Flow Cell Flush [FCF])
(Flow Cell Tether [FCT])
Ligation Sequencing Kit 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
SQK-LSK109
Adapter Mix
(Adapter Mix [AMX])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SQB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LB])
Sequencing Tether
(Sequencing Tether [SQT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
SQK-LSK114
Adapter Mix
(Ligation Adapter [LA])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LIB])
Sequencing Tether
(Flow Cell Tether [FCT])
Library solution
(Library solution [LIS])
Flush buffer
(Flow Cell Flush [FCF])
Flow Cell 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
FLO-MIN106D
(Flow Cell  [R9.4.1])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
FLO-MIN114
(Flow Cell  [R10.4.1])
Flow Cell wash 
Flowcell wash kit
(Flow cell wash kit)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-WSH004
Consummables 
Surface decontaminant 
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7010PK
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7002PK
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap
(PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner])		 Greiner 608281
PCR Tube 0.2ml
(PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner])		 Greiner 671201
1000µL Filter Tips (500)
(Stacked 1000µL Filter Tips [500])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11977724
100µL Filter Tips (1000) Thermofisher scientific/Fisher scientific 11947724
10µL Filter Tips (1000)
(Stacked 100µL Filter Tips [1000])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11907724
Reinforced tubes  tubes (2ml)  with screw caps and o-rings
(Fisherbrand™ Bulk tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 15545809
Microcentrifuge tube (1.5ml)
(1.5 ml Eppendorf Tubes [500])		 Eppendorf 1229888
DNA LoBind Tubes  (1.5ml)
(DNA LoBind Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 10051232
Cryobabies labels
Gloves (S/M/L)
Paper towel

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References

  1. Rupprecht, C. E. Rhabdoviruses: rabies virus. Medical Microbiology. , University of Texas Medical Branch. Galveston, TX. (1996).
  2. Rabies. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/rabies (2023).
  3. Health Organization, W. orld WHO Expert Consultation on Rabies: WHO TRS N°1012. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-TRS-1012 (2018).
  4. Benavides, J. A., et al. Defining new pathways to manage the ongoing emergence of bat rabies in Latin America. Viruses. 12 (9), 1002 (2020).
  5. Hampson, K. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), e0003709 (2015).
  6. Global genomic surveillance strategy for pathogens with pandemic and epidemic potential, 2022-2032. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/978924004679 (2022).
  7. Tsai, K. J., et al. Emergence of a sylvatic enzootic formosan ferret badger-associated rabies in Taiwan and the geographical separation of two phylogenetic groups of rabies viruses. Veterinary Microbiology. 182, 28-34 (2016).
  8. Chiou, H. -Y., et al. Molecular characterization of cryptically circulating rabies virus from ferret badgers, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 790-798 (2014).
  9. Sabeta, C. T., Mansfield, K. L., McElhinney, L. M., Fooks, A. R., Nel, L. H. Molecular epidemiology of rabies in bat-eared foxes (Otocyon megalotis) in South Africa. Virus Research. 129 (1), 1-10 (2007).
  10. Scott, T. P. Complete genome and molecular epidemiological data infer the maintenance of rabies among kudu (Tragelaphus strepsiceros) in Namibia. PLoS One. 8 (3), e58739 (2013).
  11. Lembo, T., et al. Exploring reservoir dynamics: a case study of rabies in the Serengeti ecosystem. The Journal of Applied Ecology. 45 (4), 1246-1257 (2008).
  12. Coetzee, P., Nel, L. H. Emerging epidemic dog rabies in coastal South Africa: a molecular epidemiological analysis. Virus Research. 126 (1-2), 186-195 (2007).
  13. Ou de Munnink, B. B. First molecular analysis of rabies virus in Qatar and clinical cases imported into Qatar, a case report. International Journal of Infectious Diseases. 96, 323-326 (2020).
  14. Smith, J., et al. Case report: Rapid ante-mortem diagnosis of a human case of rabies imported into the UK from the Philippines. Journal of Medical Virology. 69, 150-155 (2003).
  15. Mahardika, G. N. K., et al. Phylogenetic analysis and victim contact tracing of rabies virus from humans and dogs in Bali, Indonesia. Epidemiology and Infection. 142 (6), 1146-1154 (2014).
  16. Tohma, K., et al. Molecular and mathematical modeling analyses of inter-island transmission of rabies into a previously rabies-free island in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 38, 22-28 (2016).
  17. Tohma, K., et al. Phylogeographic analysis of rabies viruses in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 23, 86-94 (2014).
  18. Saito, M., et al. Genetic diversity and geographic distribution of genetically distinct rabies viruses in the Philippines. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (4), e2144 (2013).
  19. Biek, R., Henderson, J. C., Waller, L. A., Rupprecht, C. E., Real, L. A. A high-resolution genetic signature of demographic and spatial expansion in epizootic rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 7993-7998 (2007).
  20. Reddy, G. B., et al. Molecular characterization of Indian rabies virus isolates by partial sequencing of nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P) genes. Virus Genes. 43, 13-17 (2011).
  21. David, D., Dveres, N., Yakobson, B. A., Davidson, I. Emergence of dog rabies in the northern region of Israel. Epidemiology and Infection. 137 (4), 544-548 (2009).
  22. Benjathummarak, S. Molecular genetic characterization of rabies virus glycoprotein gene sequences from rabid dogs in Bangkok and neighboring provinces in Thailand, 2013-2014. Archives of Virology. 161 (5), 1261-1271 (2016).
  23. Denduangboripant, J., et al. Transmission dynamics of rabies virus in Thailand: implications for disease control. BMC Infectious Diseases. 5, 52 (2005).
  24. Talbi, C., et al. Phylodynamics and human-mediated dispersal of a zoonotic virus. PLoS Pathogens. 6 (10), e1001166 (2010).
  25. Bourhy, H., et al. Revealing the micro-scale signature of endemic zoonotic disease transmission in an African urban setting. PLoS Pathogens. 12 (4), e1005525 (2016).
  26. Zinsstag, J., et al. Vaccination of dogs in an African city interrupts rabies transmission and reduces human exposure. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  27. Yakovleva, A., et al. Tracking SARS-COV-2 variants using Nanopore sequencing in Ukraine in 2021. Scientific Reports. 12, 15749 (2022).
  28. Mannsverk, S., et al. SARS-CoV-2 variants of concern and spike protein mutational dynamics in a Swedish cohort during 2021, studied by Nanopore sequencing. Virology Journal. 19, 164 (2022).
  29. Soufi, M., et al. Fast and easy nanopore sequencing workflow for rapid genetic testing of familial Hypercholesterolemia. Frontiers in Genetics. 13, 836231 (2022).
  30. Cabibbe, A. M. Application of targeted next-generation sequencing assay on a portable sequencing platform for culture-free detection of drug-resistant tuberculosis from clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 00632 (2020).
  31. Xu, Y., et al. Nanopore metagenomic sequencing of influenza virus directly from respiratory samples: diagnosis, drug resistance and nosocomial transmission, United Kingdom, 2018/19 influenza season. Euro Surveillance. 26 (27), 2000004 (2021).
  32. Stubbs, S. C. B., et al. Assessment of a multiplex PCR and Nanopore-based method for dengue virus sequencing in Indonesia. Virology Journal. 17, 24 (2020).
  33. Croville, G., et al. Rapid whole-genome based typing and surveillance of avipoxviruses using nanopore sequencing. Journal of Virological Methods. 261, 34-39 (2018).
  34. Theuns, S., et al. Nanopore sequencing as a revolutionary diagnostic tool for porcine viral enteric disease complexes identifies porcine kobuvirus as an important enteric virus. Scientific Reports. 8, 9830 (2018).
  35. O'Donnell, V. K., et al. Rapid sequence-based characterization of African swine fever virus by use of the Oxford Nanopore MinION sequence sensing device and a companion analysis software tool. Journal of Clinical Microbiology. 58, 01104-01119 (2019).
  36. Brito, A. F. Global disparities in SARS-CoV-2 genomic surveillance. Nature Communications. 13, 7003 (2022).
  37. ONT login/register. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://nanoporetech.com/login-register (2023).
  38. Software Downloads. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://community.nanoporetech.com/downloads (2023).
  39. GitHub. , Available from: https://github.com/ (2023).
  40. Brunker, K. Artic-rabv. , Available from: https://github.com/kirstyn/artic-rabv (2022).
  41. Campbell, K. MADDOG: Method for Assignment, Definition and Designation of Global Lineages. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  42. Campbell, K. RABV-GLUE. Centre for Virus Research. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  43. Itokawa, K., Sekizuka, T., Hashino, M., Tanaka, R., Kuroda, M. Disentangling primer interactions improves SARS-CoV-2 genome sequencing by multiplex tiling PCR. PLoS ONE. 15 (9), e0239403 (2020).
  44. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 818619 (2022).
  45. Döring, M., Pfeifer, N. openPrimeR: Multiplex PCR primer design and analysis. , (2023).
  46. Quick, J. Multiplex PCR method for MiniON and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
  47. Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization. 1, Available from: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/310836/9789241515153-eng.pdf (2018).
  48. Lembo, T. Partners for Rabies Prevention. The blueprint for rabies prevention and control: a novel operational toolkit for rabies elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (2), e1388 (2012).
  49. Terrestrial Manual Online Access. World Organization for Animal Health. , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2023).
  50. Mauti, S. Field postmortem rabies rapid immunochromatographic diagnostic test for resource-limited settings with further molecular applications. Journal of Visualized Experiments. (160), e60008 (2020).
  51. Patrick, E., et al. Enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test. Journal of Visualized Experiments. (146), e59416 (2019).
  52. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  53. Marston, D. A., et al. Pan-lyssavirus real time RT-PCR for rabies diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (149), e59709 (2019).
  54. Brunker, K. DNA quantification using the Qubit fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-qubit-fluorometer-bc6vize6 (2020).
  55. Quick, J. DNA quantification using the Quantus fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-quantus-fluorometer-7pzhmp6 (2020).
  56. Guppy protocol. Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revaq_14dec2018 (2023).
  57. Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004). Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/flow-cell-wash-kit-exp-wsh004/v/wfc_9120_v1_revh_08dec2020 (2023).
  58. Core Pipeline - arctic pipeline. , Available from: https://artic.readthedocs.io/en/latest/minion/ (2023).
  59. Samtools. , Available from: https://www.htslib.org (2023).
  60. Campbell, K., et al. Making genomic surveillance deliver: A lineage classification and nomenclature system to inform rabies elimination. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010023 (2022).
  61. Brunker, K., et al. Rapid in-country sequencing of whole virus genomes to inform rabies elimination programmes. Wellcome Open Research. 5, 3 (2020).
  62. Bull, R. A., et al. Analytical validity of nanopore sequencing for rapid SARS-CoV-2 genome analysis. Nature Communications. 11, 6272 (2020).
  63. Okeke, I. N., Ihekweazu, C. The importance of molecular diagnostics for infectious diseases in low-resource settings. Nature Reviews. Microbiology. 19 (9), 547-548 (2021).
  64. Inzaule, S. C., Tessema, S. K., Kebede, Y., Ouma, A. E. O., Nkengasong, J. N. Genomic-informed pathogen surveillance in Africa: opportunities and challenges. The Lancet Infectious Diseases. 21 (9), 281-289 (2021).
  65. Kennedy, L. Integrating contact tracing and whole-genome sequencing to track the elimination of dog-mediated rabies: an observational and genomic study. eLife. , (2023).
  66. Pallerla, S. R. Diagnosis of pathogens causing bacterial meningitis using Nanopore sequencing in a resource-limited setting. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 21, 39 (2022).
  67. Quick, J. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).

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Sequenzierung des gesamten Genoms schnelle Charakterisierung Tollwutvirus Nanoporentechnologie genomische Daten Übertragungsverfolgung geografische Verbreitung Infektionskrankheiten Länder mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMICs) Hunde-vermittelte Tollwut Vampirfledermäuse öffentliche Gesundheit wirtschaftliche Bedenken Workflow von der Probe zur Sequenz zur Interpretation Nanoporentechnologie Probenentnahme Tollwutdiagnose Workflow für die Sequenzierung des gesamten Genoms Primer-Design und -Optimierung Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Sequenzierung Bibliotheksvorbereitung Live- und Offline-Basisaufrufe genetische Abstammungsbezeichnung phylogenetische Analyse Workflow-Implementierung Pipeline-Validierung Negativkontrollen genomische Werkzeuge (GLUE MADDOG) regionale und globale Phylogenien
Sequenzierung des gesamten Genoms zur schnellen Charakterisierung des Tollwutvirus mittels Nanoporentechnologie
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Bautista, C., Jaswant, G., French,… More

Bautista, C., Jaswant, G., French, H., Campbell, K., Durrant, R., Gifford, R., Kia, G. S. N., Ogoti, B., Hampson, K., Brunker, K. Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology. J. Vis. Exp. (198), e65414, doi:10.3791/65414 (2023).

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