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Biology

नैनोपोर प्रौद्योगिकी का उपयोग करके रेबीज वायरस के तेजी से लक्षण वर्णन के लिए संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65414
Automatic Translation
1,2, 1,3,4,5, 1,6, 1, 1, 1,6, 7,8, 3,9, 1, 1,6
1School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, 2Research Institute for Tropical Medicine, 3University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, 4Tanzania Industrial Research Development Organization, 5Ifakara Health Institute, 6MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 7Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, 8African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, 9University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

Summary

यहां, हम नैनोपोर तकनीक का उपयोग करके रेबीज वायरस (आरएबीवी) जीनोम को चिह्नित करने के लिए एक तेज़ और लागत प्रभावी वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं। वर्कफ़्लो का उद्देश्य स्थानीय स्तर पर जीनोमिक्स-सूचित निगरानी का समर्थन करना है, जो रेबीज नियंत्रण उपायों का मार्गदर्शन करने के लिए आरएबीवी वंशावली और क्षेत्रीय फ़ाइलोजिनिस के भीतर उनके प्लेसमेंट के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

Abstract

जीनोमिक डेटा का उपयोग संक्रामक रोगों के संचरण और भौगोलिक प्रसार को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, जीनोमिक निगरानी के लिए आवश्यक अनुक्रमण क्षमता कई निम्न और मध्यम आय वाले देशों (LMICs) में सीमित है, जहां कुत्ते-मध्यस्थता रेबीज और / या पिशाच चमगादड़ जैसे वन्यजीवों द्वारा प्रेषित रेबीज प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य और आर्थिक चिंताएं पैदा करते हैं। हम यहां नैनोपोर तकनीक का उपयोग करके एक तेज़ और सस्ती नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं। नमूना संग्रह और रेबीज के निदान के लिए प्रोटोकॉल संक्षेप में वर्णित हैं, इसके बाद अनुकूलित संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण वर्कफ़्लो का विवरण दिया गया है, जिसमें मल्टीप्लेक्स पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए प्राइमर डिज़ाइन और अनुकूलन, एक संशोधित, कम लागत वाली अनुक्रमण लाइब्रेरी तैयारी, लाइव और ऑफलाइन बेस कॉलिंग के साथ अनुक्रमण, आनुवंशिक वंश पदनाम और फाइटोलैनेटिक विश्लेषण शामिल हैं। वर्कफ़्लो के कार्यान्वयन का प्रदर्शन किया जाता है, और स्थानीय तैनाती के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डाला जाता है, जैसे कि पाइपलाइन सत्यापन, प्राइमर अनुकूलन, नकारात्मक नियंत्रणों को शामिल करना, और क्षेत्रीय और वैश्विक फ़ाइलोजिनिस के भीतर वर्गीकरण और प्लेसमेंट के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटा और जीनोमिक टूल (गोंद, मैडडॉग) का उपयोग। वर्कफ़्लो के लिए टर्नअराउंड समय 2-3 दिन है, और लागत 96 नमूना रन के लिए $ 25 प्रति नमूना से लेकर 12 नमूना रन के लिए $ 80 प्रति नमूना तक होती है। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि एलएमआईसी में रेबीज वायरस जीनोमिक निगरानी स्थापित करना संभव है और 2030 तक शून्य कुत्ते-मध्यस्थता वाले मानव रेबीज मौतों के वैश्विक लक्ष्य की दिशा में प्रगति का समर्थन कर सकता है, साथ ही वन्यजीव रेबीज प्रसार की बढ़ी हुई निगरानी भी कर सकता है। इसके अलावा, मंच को अन्य रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे एक बहुमुखी जीनोमिक क्षमता बनाने में मदद मिलती है जो महामारी और महामारी की तैयारी में योगदान देती है।

Introduction

रेबीज वायरस (आरएबीवी) रैब्डोविरिडे परिवार में एक लाइसावायरस है जो स्तनधारियों में एक घातक न्यूरोलॉजिकल बीमारी का कारण बनताहै। यद्यपि रेबीज टीकाकरण द्वारा 100% रोकथाम योग्य है, यह स्थानिक देशों में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य और आर्थिक चिंता का विषय बना हुआ है। हर साल होने वाली 60,000 मानव रेबीज मौतों में से, 95% से अधिक अफ्रीका और एशिया में हैं जहां कुत्ते प्राथमिक जलाशयहैं। इसके विपरीत, कुत्ते के टीकाकरण ने पश्चिमी यूरोप, उत्तरी अमेरिका और लैटिन अमेरिका के अधिकांश हिस्सों में कुत्ते-मध्यस्थता रेबीज के उन्मूलन को जन्म दिया है। इन क्षेत्रों में, रेबीज के जलाशय अब वन्यजीवों तक ही सीमित हैं, जैसे चमगादड़, रैकून, स्कंक और जंगली कैनिड्स3। लैटिन अमेरिका में, आम पिशाच चमगादड़ रेबीज का एक समस्याग्रस्त स्रोत है क्योंकि रात मेंरक्त पिलाने के दौरान चमगादड़ से मनुष्यों और पशुधन दोनों में नियमित रूप से स्पिलओवर संचरण होता है। रेबीज का वार्षिक वैश्विक आर्थिक प्रभाव $ 8.6 बिलियन होने का अनुमान है, जिसमें पशुधन का नुकसान 6% 5% है।

संक्रमण के समय और स्रोत पर मेटाडेटा के साथ संयुक्त वायरल रोगजनकों से अनुक्रम डेटा मजबूत महामारी विज्ञान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकताहै। आरएबीवी के लिए, अनुक्रमण का उपयोग प्रकोप 7,8 की उत्पत्ति की जांच करने, वन्यजीवों या घरेलू कुत्तों के साथ मेजबान संघों की पहचान करने और मानव मामलों के स्रोतों का पता लगानेके लिए किया गयाहै। फाइटोलैनेटिक विश्लेषण का उपयोग करके प्रकोप की जांच ने संकेत दिया है कि रेबीज पूर्व में रेबीज-मुक्त प्रांत बाली, इंडोनेशिया में उभरा, कालीमंतन या सुलावेसी15 के पास के स्थानिक क्षेत्रों से एक परिचय के माध्यम से। इस बीच, फिलीपींस में, तबलास द्वीप, रोम्बलॉन प्रांत पर एक प्रकोप लुज़ोन16 के मुख्य द्वीप से पेश किया गया था। भौगोलिक रूप से नियंत्रण उपायों को लक्षित करने के लिए आवश्यक रोगज़नक़ संचरण गतिशीलता को बेहतर ढंग से समझने के लिए वायरल जीनोमिक डेटा का भी उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, आरएबीवी का जीनोमिक लक्षण वर्णन क्लेड 17,18,19 के भौगोलिक क्लस्टरिंग, वंशावली20,21,22 के सह-परिसंचरण, मानव-मध्यस्थता वायरल आंदोलन 17,23,24 और मेटापॉपुलेशन डायनामिक्स 25,26 को दर्शाता है।

रोग निगरानी जीनोमिक निगरानी का एक महत्वपूर्ण कार्य है जिसे सार्स-सीओवी-2 महामारी के जवाब में अनुक्रमण क्षमता में वैश्विक वृद्धि के साथ बढ़ाया गया है। जीनोमिक निगरानी ने सार्स-सीओवी-2 वेरिएंट ्स की रियल-टाइम ट्रैकिंग का समर्थन किया है। नैनोपोर तकनीक जैसी सुलभ अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में प्रगति ने मानव 29,30,31,32 और पशु33,34,35 रोगजनकों दोनों के तेजी से अनुक्रमण के लिए बेहतर और अधिक किफायती प्रोटोकॉल का नेतृत्व किया है। हालांकि, कई रेबीज स्थानिक देशों में, रोगज़नक़ जीनोमिक निगरानी को संचालित करने में अभी भी बाधाएं हैं, जैसा कि सार्स-सीओवी-2 अनुक्रमण क्षमता36 में वैश्विक असमानताओं से पता चलता है। प्रयोगशाला के बुनियादी ढांचे, आपूर्ति श्रृंखला और तकनीकी ज्ञान में सीमाएं जीनोमिक निगरानी की स्थापना और पुनरावृत्ति को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। इस पेपर में, हम प्रदर्शित करते हैं कि संसाधन-सीमित सेटिंग्स में आरएबीवी निगरानी के लिए एक अनुकूलित, तेज और सस्ती संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण वर्कफ़्लो कैसे तैनात किया जा सकता है।

Protocol

इस अध्ययन को राष्ट्रीय आयुर्विज्ञान अनुसंधान संस्थान (एनआईएमआर/मुख्यालय/आर.8ए/वॉल्यूम) की चिकित्सा अनुसंधान समन्वय समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। IX/2788, क्षेत्रीय प्रशासन और स्थानीय सरकार मंत्रालय (AB.81/288/01), और तंजानिया में इफकारा स्वास्थ्य संस्थान संस्थागत समीक्षा बोर्ड (IHI / IRB / No: 22-2014); नैरोबी इंस्टीट्यूट ऑफ ट्रॉपिकल एंड इन्फेक्शियस डिजीज विश्वविद्यालय (पी 947/11/2019) और केन्या मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट (केईएमआरआई-एसईआरयू; प्रोटोकॉल नंबर 3268) केन्या में; और फिलीपींस में रिसर्च इंस्टीट्यूट फॉर ट्रॉपिकल मेडिसिन (आरआईटीएम), स्वास्थ्य विभाग (2019-023)। नाइजीरिया से उत्पन्न नमूनों का अनुक्रमण राष्ट्रीय निगरानी के एक भाग के रूप में एकत्र की गई संग्रहीत नैदानिक सामग्री पर किया गया था।

नोट: धारा 1-4 आवश्यक शर्तें हैं। खंड 5-16 आरएबीवी नैनोपोर अनुक्रमण के लिए नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या वर्कफ़्लो का वर्णन करता है (चित्रा 1)। प्रोटोकॉल में बाद के चरणों के लिए जिन्हें पल्स सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता होती है, 5-15 सेकंड के लिए 10-15,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।

1. अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण के लिए कम्प्यूटेशनल वातावरण सेटअप

  1. ऑक्सफोर्ड नैनोपोर टेक्नोलॉजी (ओएनटी) वेबसाइट37 खोलें और नैनोपोर-विशिष्ट संसाधनों तक पहुंचने के लिए एक खाता बनाएं।
    1. लॉग इन करें और ONT अनुक्रमण और बेसकॉलिंग सॉफ़्टवेयर स्थापित करें38.
  2. GitHub39 खोलें और एक खाता बनाएँ।
    1. आर्टिक-rabv40 और MADDOG रिपॉजिटरी41 पर जाएँ और स्थापना निर्देशों का पालन करें।

2. मल्टीप्लेक्स प्राइमर योजना को डिजाइन या अपडेट करें

नोट: मौजूदा आरएबीवी योजनाएं आर्टिक-आरएबीवी रिपॉजिटरी40 में उपलब्ध हैं। एक नए भौगोलिक क्षेत्र को लक्षित करते समय, एक नई योजना तैयार की जानी चाहिए, या अतिरिक्त विविधता को शामिल करने के लिए एक मौजूदा योजना को संशोधित किया जाना चाहिए।

  1. अध्ययन क्षेत्र में विविधता का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक जीनोम संदर्भ सेट चुनें; यह आम तौर पर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध अनुक्रमों (जैसे, एनसीबीआई जेनबैंक से) या प्रारंभिक इन-हाउस डेटा का एक सेट है। NCBI अनुक्रम और संबद्ध मेटाडेटा को फ़िल्टर और डाउनलोड करने के लिए RABV-GLUE42, एक RABV अनुक्रम डेटा संसाधन का उपयोग करने के लिए चरण 2.1.1 का पालन करें।
    नोट: पूर्ण जीनोम के साथ संदर्भ अनुक्रम चुनें (यानी, अंतराल और नकाबपोश आधार के बिना)। प्राइमर डिज़ाइन के लिए संदर्भ सेट के रूप में 10 अनुक्रमों को चुनने की सिफारिश की जाती है। यदि उपलब्ध अनुक्रम डेटा अपूर्ण है या अध्ययन क्षेत्र का प्रतिनिधि नहीं है, तो पूरक फ़ाइल 1 में सलाह43,44,45 देखें।
    1. RABV-GLUE में अनुक्रम डेटा ड्रॉप-डाउन मेनू से क्लेड पृष्ठ द्वारा NCBI RABV अनुक्रम पर नेविगेट करें। सभी उपलब्ध डेटा तक पहुंचने के लिए रेबीज वायरस (आरएबीवी) लिंक पर क्लिक करें या रुचि के एक विशेष क्लैड का चयन करें। वांछित मापदंड (जैसे, उत्पत्ति का देश, अनुक्रम लंबाई) को फिट करने वाले फ़िल्टर जोड़ने के लिए फ़िल्टर विकल्प का उपयोग करें। अनुक्रम और मेटाडेटा डाउनलोड करें.
  2. प्राइमल स्कीम46 द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए मल्टीप्लेक्स पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए एक प्राइमर स्कीम तैयार करें। कम गुणवत्ता वाले नमूनों को अनुक्रमित करने के लिए 50 बीपी ओवरलैप के साथ 400 बीपी योजना की सिफारिश की जाती है। सभी आउटपुट डाउनलोड करें और सहेजें (फ़ाइल या प्राइमर नामों को संपादित न करें)।
    नोट: योजना को इनपुट फास्टा में पहले अनुक्रम में अनुक्रमित किया जाएगा, जिसे अब से 'इंडेक्स संदर्भ' (चित्रा 2) के रूप में जाना जाता है। प्राइमर प्रदर्शन ऑप्टिमाइज़ करने के विकल्पों के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें।

3. रैमपार्ट और आर्टिक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन स्थापित करें

  1. रैमपार्ट और आर्टिक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन के लिए इनपुट/आउटपुट फ़ाइलों को प्रबंधित करने के लिए एक निर्देशिका संरचना स्थापित करने के लिए पूरक फ़ाइल 2 देखें।

4. जैव सुरक्षा और प्रयोगशाला सेटअप

  1. जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) 2 या 3 स्थितियों में संभावित रेबीज पॉजिटिव नमूनों को संभालें।
  2. सुनिश्चित करें कि प्रयोगशाला के कर्मचारियों ने रेबीज प्री-एक्सपोजर टीकाकरण पूरा कर लिया है और विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) की सिफारिशों के अनुसार प्रतिरक्षा की निगरानी से गुजरनाहै।
  3. सुनिश्चित करें कि प्रयोगशाला के लिए राष्ट्रीय या अंतर्राष्ट्रीय दिशानिर्देशों का पालन करते हुए समर्पित मानक संचालन प्रक्रियाएं और जोखिम मूल्यांकन हों।
  4. आवश्यक प्रयोगशाला सेटअप: पूर्व और बाद के पीसीआर क्षेत्रों के बीच भौतिक अलगाव को बनाए रखते हुए संदूषण को कम करें। सीमित स्थान या इन-फील्ड लैब सेटिंग्स वाली प्रयोगशालाओं में, संदूषण को कम करने के लिए पोर्टेबल दस्ताने बॉक्स या अस्थायी लैब स्टेशनों का उपयोग करें।
  5. इस प्रोटोकॉल में, निम्नलिखित के लिए अलग-अलग क्षेत्रों को नामित करना सुनिश्चित करें:
    1. नमूना निष्कर्षण: जैविक सामग्री को संभालने और निष्क्रियता और आरएनए निष्कर्षण करने के लिए बीएसएल 2/3 कैबिनेट / दस्ताने बॉक्स स्थापित करें।
    2. टेम्पलेट क्षेत्र: पहले से तैयार प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण में टेम्पलेट (आरएनए / सीडीएनए) को जोड़ने के लिए एक बीएसएल 1 कैबिनेट / दस्ताने बॉक्स सेट करें।
    3. मास्टर मिक्स क्षेत्र: अभिकर्मक मास्टर मिक्स की तैयारी के लिए एक निर्दिष्ट स्वच्छ क्षेत्र (बीएसएल 1 कैबिनेट / दस्ताने बॉक्स) स्थापित करें। इस क्षेत्र में कोई टेम्पलेट नहीं होना चाहिए.
    4. पोस्ट-पीसीआर क्षेत्र: एम्प्लिकॉन और अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी पर काम के लिए एक अलग क्षेत्र स्थापित करें।
      नोट: सभी क्षेत्रों को उपयोग से पहले और बाद में सतह विसंदूषक और पराबैंगनी (यूवी) -निष्फल के साथ साफ किया जाना चाहिए।

5. क्षेत्र नमूना संग्रह और निदान

नोट: नमूने व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने और संदर्भित मानक प्रक्रियाओं47,48,49 का पालन करने वाले प्रशिक्षित और प्रतिरक्षित कर्मियों द्वारा एकत्र किए जाने चाहिए।

  1. फोरमेन मैग्नम (यानी, ओसीसीपिटल मार्ग) के माध्यम से नमूना एकत्र करें, जैसा कि मौती एट अल .50 में विस्तार से वर्णित है।
  2. तेजी से नैदानिक परीक्षणों के साथ क्षेत्र में रेबीज का निदान करें और अनुशंसित प्रक्रियाओं47 का उपयोग करके प्रयोगशाला में पुष्टि करें, जैसे कि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण (डीएफए), प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट (डीआरआईटी) 51,52, या वास्तविक समय रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी)-पीसीआर 53।
  3. आरएनए निष्कर्षण के लिए पुष्टि किए गए सकारात्मक मस्तिष्क के नमूनों का उपयोग करें या 2-3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या लंबी अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में स्टोर करें। आरएनए स्थिरीकरण माध्यम का उपयोग करके भंडारण और परिवहन के लिए आरएनए को संरक्षित करें।

6. नमूना तैयारी और आरएनए निष्कर्षण (3 घंटे)

नोट: नमूना प्रकार के लिए उपयुक्त स्पिन कॉलम-आधारित वायरल आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें।

  1. 1.4 मिमी सिरेमिक मोतियों से भरे लगभग 200 μL ट्यूब के साथ 2 एमएल पीसीआर ट्यूब भरकर दो सिरेमिक बीड ट्यूब तैयार करें और ट्यूब को लेबल करें।
  2. आरएनए निष्कर्षण किट में प्रदान किए गए लाइसिस बफर की अनुशंसित मात्रा को लेबल पीसीआर ट्यूब में जोड़ें।
  3. लकड़ी के एप्लिकेटर का उपयोग करके रेबीज संक्रमण के साथ पुष्टि किए गए मस्तिष्क के नमूने से लगभग 3 मिमी क्यूब प्राप्त करें और नमूना आईडी के साथ एक लेबल ट्यूब में डालें और नकारात्मक नियंत्रण लेबल वाली ट्यूब में 100 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी डालें।
    नोट: नमूना जोखिम को सीमित करने के लिए बंद ट्यूब मोती-आधारित होमोजेनाइजेशन का उपयोग करें। यदि संभव नहीं है, तो अन्य उपयुक्त यांत्रिक विघटनकर्ताओं (जैसे, रोटर-आधारित) या मैनुअल माइक्रो पेस्टल का उपयोग करें। हालांकि, ये ऊतक को बाधित करने के लिए कठोर सतह पर मोती की पिटाई की तुलना में कम प्रभावी हो सकते हैं (ऊतक के नमूने कुछ भंडारण मीडिया में कठोर हो सकते हैं)।
  4. लकड़ी के एप्लिकेटर स्टिक का उपयोग करके मस्तिष्क के ऊतकों को मैन्युअल रूप से बाधित करें और फिर अधिकतम गति से भंवर करें जब तक कि पूर्ण ऊतक समरूपीकरण प्राप्त न हो जाए।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को एक नए लेबल वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। केवल बाद के चरणों में इस सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करें।
  6. शुद्ध आरएनए प्राप्त करने के लिए आरएनए निष्कर्षण किट के स्पिन कॉलम निर्देशों का पालन करें।
  7. यहां एक नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रण (एनईसी) शामिल करें और अनुक्रमण चरण के माध्यम से सभी तरह से ले जाएं।

7. सीडीएनए तैयारी (20 मिनट)

  1. मास्टर मिक्स क्षेत्र में, संसाधित किए जाने वाले नमूनों और नियंत्रणों की संख्या के अनुसार पहले स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें (पर्याप्त अभिकर्मक सुनिश्चित करने के लिए 10% की अतिरिक्त मात्रा के साथ; तालिका 1)। इस स्तर पर एक नो-टेम्पलेट नियंत्रण (NTC) शामिल किया जाना चाहिए।
  2. 0.2 एमएल पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब और ट्यूब ों में मास्टर मिश्रण के एलिकोट 5 μL लेबल करें।
  3. तैयार ट्यूबों को टेम्पलेट क्षेत्र में ले जाएं। एनईसी सहित प्रत्येक लेबल ट्यूब में आरएनए के 5 μL जोड़ें। एनटीसी में न्यूक्लियस-मुक्त पानी (एनएफडब्ल्यू) के 5 μL जोड़ें।
  4. तालिका 1 में उल्लिखित शर्तों का पालन करते हुए थर्मल साइकलर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: यदि आवश्यक हो तो सीडीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन पीसीआर के लिए आगे बढ़ना पसंद किया जाता है।

8. प्राइमर पूल स्टॉक तैयारी (1 घंटे)

नोट: यह कदम केवल तभी आवश्यक है जब व्यक्तिगत प्राइमरों से नए स्टॉक बनाते हैं, जिसके बाद पूर्व-तैयार स्टॉक समाधान का उपयोग किया जा सकता है।

  1. मास्टर मिक्स क्षेत्र में 100 μM स्टॉक का एक प्राइमर पूल तैयार करें।
  2. 1x tris-EDTA (TE) बफर या NFW में लियोफिलाइज्ड प्राइमरों को 100 μM की एकाग्रता पर पुन: निलंबित करें। भंवर अच्छी तरह से और नीचे घूमता है।
    नोट: निम्नलिखित चरणों में, अलग-अलग प्राइमरों को दो प्राइमर पूल-विषम क्रमांकित (पूल ए नाम) और सम क्रमांकित (पूल बी नाम) में विभाजित किया जाता है - ताकि एम्प्लिकॉन ओवरलैप वाले प्राइमरों के बीच बातचीत से बचा जा सके। प्राइमरों के ये पूल लक्ष्य जीनोम में फैले अतिव्यापी 400 बीपी एम्प्लिकॉन उत्पन्न करते हैं।
  3. एक ट्यूब रैक में सभी विषम क्रमांकित प्राइमरों को व्यवस्थित करें। प्रत्येक प्राइमर से 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5 μL जोड़कर एक प्राइमर पूल स्टॉक उत्पन्न करें, जिसे "प्राइमर स्कीम नाम - पूल ए (100 μM)" लेबल किया गया है।
  4. सभी सम क्रमांकित प्राइमरों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं और "प्राइमर स्कीम नाम - पूल बी (100 μM)" के रूप में लेबल करें।
  5. 10 μM प्राइमर स्टॉक उत्पन्न करने के लिए आणविक ग्रेड पानी में प्रत्येक प्राइमर पूल 1: 10 को पतला करें।
    नोट: 10 μM प्राइमर कमजोर पड़ने के कई एलिकोट बनाएं और गिरावट या संदूषण के मामले में उन्हें फ्रीज करें।

9. मल्टीप्लेक्स पीसीआर (5 घंटे)

  1. मास्टर मिक्स क्षेत्र में प्रत्येक प्राइमर पूल के लिए दो पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें।
    1. 0.015 μM प्रति प्राइमर की अंतिम एकाग्रता का उपयोग करें। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया (तालिका 2) के लिए आवश्यक प्राइमर पूल मात्रा की गणना करें:
      प्राइमर पूल वॉल्यूम = प्राइमर स्टॉक के प्राइमर एक्स रिएक्शन वॉल्यूम x 0.015/एकाग्रता (μM) की संख्या।
  2. टेम्पलेट क्षेत्र में पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों को लेबल करने के लिए पूल ए मास्टर मिक्स और पूल बी मास्टर मिक्स के एलिकोट 10 μL। प्रत्येक नमूने के लिए, संबंधित लेबल प्राइमर पूल ए और बी प्रतिक्रियाओं में से प्रत्येक में सीडीएनए (चरण 3 से) के 2.5 μL जोड़ें। अतिरिक्त सीडीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. धीरे से फ्लिक और पल्स सेंट्रीफ्यूज द्वारा मिलाएं।
  4. पीसीआर मशीन पर तालिका 2 में उल्लिखित शर्तों के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें।
    नोट: कार्यक्रम में 5 मिनट के लंबे एनीलिंग समय (प्राइमरों की उच्च संख्या के कारण आवश्यक) और एम्प्लिकॉन (400 बीपी) की छोटी लंबाई के कारण एक विशिष्ट विस्तार चरण शामिल नहीं है जो विस्तार के लिए पर्याप्त है।

10. पीसीआर सफाई और परिमाणीकरण (3.5 घंटे)

  1. पोस्ट-पीसीआर क्षेत्र में इस बिंदु से सभी काम करें।
  2. एलिकोट ठोस-चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (एसपीआरआई) मोती मुख्य बोतल से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बदल जाता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. एक एसपीआरआई मोती को कमरे के तापमान (आरटी; ~ 20 डिग्री सेल्सियस) और अच्छी तरह से भंवर में गर्म करें जब तक कि मोती घोल में पूरी तरह से फिर से निलंबित न हो जाएं।
  4. 1.5 एमएल ट्यूबों में, प्रत्येक नमूने के लिए प्राइमर पूल ए और प्राइमर पूल बी पीसीआर उत्पादों को मिलाएं। यदि आवश्यक हो, तो मात्रा को 25 μL तक लाने के लिए पानी जोड़ें।
  5. प्रत्येक नमूने में 25 μL SPRI मोती जोड़ें (1: 1 मोती: नमूना अनुपात)। ऊपर और नीचे पाइप करके या धीरे से ट्यूब टैप करके मिलाएं।
  6. 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें, कभी-कभी ट्यूबों को इनवर्ट या फ्लिक करें।
  7. एक चुंबकीय रैक पर रखें जब तक कि मोती और घोल पूरी तरह से अलग न हो जाएं। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और फेंक दें, इस बात का ध्यान रखें कि मोती की गोली को परेशान न करें।
  8. 80% इथेनॉल (आरटी के लिए गर्म) के साथ दो बार धोएं।
    1. गोली में इथेनॉल के 200 μL जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए 30 सेकंड तक प्रतीक्षा करें कि मोती ठीक से धोए गए हैं।
    2. सतह पर तैरने वाले को सावधानी से निकालें और फेंक दें, मोती गोली को छूने की कोशिश न करें।
    3. गोली को दूसरी बार धोने के लिए चरण 10.8.1-10.8.2 दोहराएं।
  9. 10 μL टिप का उपयोग करके इथेनॉल के सभी निशान हटा दें। जब तक ट्रेस इथेनॉल वाष्पित नहीं हो जाता तब तक हवा सूख जाती है (छोटे मोतियों के साथ यह जल्दी से होता है, ~ 30 एस); जब ऐसा होता है, तो गोली को चमकदार से मैट तक जाना चाहिए। ध्यान रखें कि अधिक सूखा न हो (यदि गोली टूट रही है, तो यह बहुत सूखी है), क्योंकि यह डीएनए वसूली को प्रभावित करेगा।
  10. एनएफडब्ल्यू के 15 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें और 10 मिनट के लिए RT (चुंबकीय रैक से बाहर) पर इनक्यूबेट करें।
  11. चुंबकीय रैक पर लौटें और सतह पर तैरने वाला (साफ उत्पाद) को एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  12. एक अलग ट्यूब में प्रत्येक नमूने का 1: 10 पतला पड़ने की तैयारी करें (उत्पाद का 2 μL + NFW का 18 μL)।
    नोट: क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए इस स्तर पर बहुत सावधान रहें। एक समय में केवल एक एम्पलीकॉन ट्यूब खुली है। पहले ट्यूबों में 18 μL पानी का एलिकोट (एक साफ मास्टर मिश्रण क्षेत्र में)।
  13. एक अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट फ्लोरोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक पतला नमूने की डीएनए एकाग्रता को मापें, जैसा कि protocols.io54,55 में वर्णित है।

11. सामान्यीकरण (30 मिनट)

  1. 5 μL की कुल मात्रा में प्रत्येक नमूने के 200 fmol के लिए आवश्यक पतला (या साफ) नमूने की मात्रा की गणना करने के लिए प्रत्येक नमूने के सामान्यीकरण टेम्पलेट (पूरक फ़ाइल 3) और डीएनए एकाग्रता (ng / μL) का उपयोग करें।
  2. नए पीसीआर ट्यूबों को लेबल करें और सामान्यीकृत डीएनए प्राप्त करने के लिए एनएफडब्ल्यू और नमूने की गणना मात्रा जोड़ें।
  3. यदि 200 एफएमओएल प्राप्त करने के लिए पतला नमूने के 5 μL से अधिक की आवश्यकता होती है, तो अघुलनशील (साफ) नमूनों के लिए गणना मात्रा का उपयोग करें।
    नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: इस बिंदु पर, क्लीन-अप पीसीआर उत्पाद को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या यदि आवश्यक हो तो दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।

12. एंड-प्रेप और बारकोडिंग (1.5 घंटे)

नोट: अगले चरण नैनोपोर-विशिष्ट बारकोडिंग और लिगेशन अनुक्रमण किट से विशिष्ट अभिकर्मकों का उपयोग मानते हैं (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। प्रोटोकॉल विभिन्न रसायन विज्ञान संस्करणों में हस्तांतरणीय है, लेकिन निर्माता के निर्देशों के अनुसार, उपयोगकर्ताओं को संगत किट का उपयोग करने का ध्यान रखना चाहिए।

  1. अंत मरम्मत और डीए-टेलिंग
    1. तालिका 3 में उल्लिखित प्रत्येक नमूने के लिए अंत-तैयारी प्रतिक्रिया सेट करें। नमूने की संख्या (प्लस 10% अधिक) के अनुसार एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। पाइपिंग करते समय ध्यान रखें क्योंकि अभिकर्मक चिपचिपे होते हैं।
    2. सामान्यीकृत डीएनए (5 μL) की प्रत्येक ट्यूब में मास्टर मिश्रण के 5 μL जोड़ें। कुल प्रतिक्रिया मिश्रण 10 μL होना चाहिए। हर बार युक्तियों को बदलें और एक समय में केवल एक ट्यूब खोलें।
    3. तालिका 3 में उल्लिखित शर्तों के तहत थर्मल साइकलर में इनक्यूबेट करें।
  2. बारकोडिंग
    1. बारकोडिंग किट से बारकोड को 1.25 μL / ट्यूब पर पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों में लिखें, और प्रत्येक नमूने को सौंपे गए बारकोड रिकॉर्ड करें।
    2. अपने असाइन किए गए बारकोड एलिकोट में अंत-तैयार नमूने के 0.75 μL जोड़ें।
    3. नमूनों की संख्या (प्लस 10% अधिक) के अनुसार एक लिगेशन मास्टर मिश्रण तैयार करें (तालिका 4)।
    4. अंत-तैयार नमूना + बारकोड में 8 μL लिगेशन मास्टर मिश्रण जोड़ें, जिससे कुल प्रतिक्रिया 10 μL हो जाए।
    5. तालिका 4 में उल्लिखित शर्तों का उपयोग करके थर्मल साइकलर में इनक्यूबेट करें।
  3. एसपीआरआई मोती की सफाई और डीएनए परिमाणीकरण
    1. आरटी पर शॉर्ट फ्रैगमेंट बफर (एसएफबी) पिघलाएं, भंवर, पल्स सेंट्रीफ्यूज द्वारा मिश्रण, और बर्फ पर रखें।
    2. सभी बारकोडेड नमूनों को 1.5 एमएल लोबिंड माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक साथ पूल करें। ताकि क्लीन अप वॉल्यूम को उपयोग करने के लिए बहुत बड़ा न बनाया जा सके, प्रत्येक देशी बारकोडिंग प्रतिक्रिया से 12-24 नमूने (10 μL / नमूना), 48 नमूने (5 μL / नमूना), या 96 नमूने (2.5 μL / नमूना) तक पूल करें।
    3. बारकोडेड पूल में एसपीआरआई मोतियों की 0.4x मात्रा जोड़ें। धीरे से मिलाएं (फ्लिक िंग या पाइपटिंग) और 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    4. नमूनों को एक चुंबक पर रखें जब तक कि मोती गोली न हो जाएं और सतह पर तैरने वाला पूरी तरह से स्पष्ट न हो जाए (~ 2 मिनट)। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और फेंक दें। ध्यान रखें कि मोतियों को परेशान न करें।
    5. एसएफबी के 250 μL के साथ दो बार धो लें।
      1. चुंबक से ट्यूब निकालें और एसएफबी के 250 μL में गोली को पूरी तरह से निलंबित करें। 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें, पल्स सेंट्रीफ्यूज करें, और चुंबक पर वापस आ जाएं।
      2. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और फेंक दें।
    6. दूसरा एसएफबी वॉश करने के लिए चरण 12.3.5 दोहराएं।
    7. पल्स सेंट्रीफ्यूज करें और किसी भी अवशिष्ट एसएफबी को हटा दें।
    8. गोली को स्नान करने के लिए 80% (आरटी) इथेनॉल के 200 μL जोड़ें। इथेनॉल को निकालें और फेंक दें, सावधान रहें कि मोती गोली को परेशान न करें। 30 सेकंड के लिए हवा में सूखने या जब तक गोली अपनी चमक खो न दे।
    9. 10 मिनट के लिए आरटी पर एनएफडब्ल्यू के 22 μL में पुन: निलंबित करें।
    10. चुंबक पर रखें, ~ 2 मिनट के लिए बसने के लिए छोड़ दें, फिर घोल को सावधानीपूर्वक हटा दें और एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    11. डीएनए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 1 μL का उपयोग करें, जैसा कि पहले वर्णित है (चरण 10.13)।
      नोट: वैकल्पिक विराम बिंदु: इस बिंदु पर, पुस्तकालय को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन एडाप्टर लिगेशन और अनुक्रमण के साथ जारी रखना बेहतर है।

13. अनुक्रमण (अधिकतम 48 घंटे)

  1. कंप्यूटर तैयार करें (पूर्वापेक्षाएँ अनुभाग 1-4 भी देखें)।
    1. जांचें कि नए डेटा (न्यूनतम 150 जीबी) को संग्रहीत करने के लिए पर्याप्त स्थान है, पुराने रन से डेटा का बैकअप लिया जाता है / हटाने से पहले सर्वर पर ले जाया जाता है, और MinNOW का नवीनतम संस्करण स्थापित किया जाता है।
  2. फ्रिज से संग्रहीत प्रवाह सेल को हटा दें और इसे आरटी तक पहुंचने दें।
  3. एडाप्टर बंधाव (1 घंटे)
    1. पल्स सेंट्रीफ्यूज एडाप्टर मिश्रण और लिगेज और बर्फ पर रखें।
    2. आरटी पर पिघलाव क्षालन बफर (ईबी), एसएफबी, और लिगेशन बफर। भंवर, पल्स सेंट्रीफ्यूज और बर्फ पर रखें।
    3. एडेप्टर लिगेशन मास्टर मिक्स (तालिका 5) तैयार करें, कम बाइंड ट्यूब में निर्दिष्ट क्रम में अभिकर्मकों का संयोजन करें।
      नोट: एडाप्टर लिगेशन मास्टर मिक्स अभिकर्मकों (तालिका 5) के लिए विकल्प प्रयोगशाला में उपलब्धता के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है। विकल्पों की सूची के लिए पूरक फ़ाइल 3 और सामग्री तालिका देखें। 200 fmol के बराबर DNA लायब्रेरी की मात्रा प्राप्त करने के लिए पूरक फ़ाइल 3 कार्यपत्रक में गणना का उपयोग करें। यदि 20 μL से कम की गणना की जाती है, तो 20 μL तक बनाने के लिए NFW जोड़ें।
    4. सौम्य फ्लिकिंग और पल्स सेंट्रीफ्यूज द्वारा मिलाएं। 20 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इनक्यूबेशन के दौरान, प्रवाह कक्ष (अनुभाग 13.5) तैयार करना प्रारंभ करें।
  4. एसपीआरआई मोतियों का उपयोग करके सफाई करें (पहले की सफाई के रूप में इथेनॉल का उपयोग न करें)।
    1. नमूने में एसपीआरआई मोतियों (आरटी) की 0.4 x मात्रा जोड़ें। 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें, मिश्रण में सहायता के लिए धीरे से रुक-रुक कर फ्लिक करें।
    2. चुंबक पर तब तक रखें जब तक मोती और घोल पूरी तरह से अलग न हो जाएं (~ 5 मिनट)। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और छोड़ दें; ध्यान रखें कि मोती की गोली को परेशान न करें।
    3. एसएफबी के 125 μL के साथ दो बार धो लें।
    4. एक पिपेट के साथ मिलाकर 125 μL SFB के साथ गोली को पूरी तरह से निलंबित करें। 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दें।
    5. ट्यूब बेस पर तरल इकट्ठा करने और चुंबक पर रखने के लिए पल्स सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और फेंक दें।
    6. गोली को दूसरी बार धोने के लिए चरण 13.4.4-13.4.5 दोहराएं।
    7. पल्स सेंट्रीफ्यूज करें और अतिरिक्त एसएफबी को हटा दें।
    8. ईबी के 15 μL में पुन: निलंबित करें और आरटी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. ~ 2 मिनट के लिए चुंबक पर लौटें और फिर घोल को एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
    10. चरण 10.13 में पहले वर्णित के रूप में इल्यूटेड लाइब्रेरी के 1 μL की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सीधे MinION अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ें; हालांकि, यदि आवश्यक हो तो अंतिम पुस्तकालय को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह तक ईबी में संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. प्रवाह कक्ष गुणवत्ता जाँच चलाएँ.
    1. अनुक्रमण डिवाइस को लैपटॉप से कनेक्ट करें और अनुक्रमण सॉफ़्टवेयर खोलें।
    2. प्रवाह कक्ष प्रकार का चयन करें, और उसके बाद प्रवाह कक्ष और प्रारंभ परीक्षण जाँचें क्लिक करें।
    3. एक बार पूरा होने के बाद, सक्रिय (यानी, व्यवहार्य) छिद्रों की कुल संख्या प्रदर्शित की जाएगी। एक नए प्रवाह सेल में >800 सक्रिय छिद्र होने चाहिए; यदि ऐसा नहीं होता है, तो प्रतिस्थापन के लिए निर्माता से संपर्क करें।
  6. प्रवाह सेल को प्राइमिंग और लोड करना (20 मिनट)
    1. आरटी पर निम्नलिखित अभिकर्मकों को पिघलाएं और फिर अनुक्रमण बफर, एक फ्लश टीथर, फ्लश बफर और बर्फ पर लोडिंग मोती रखें।
    2. भंवर अनुक्रमण बफर और फ्लश बफर, पल्स सेंट्रीफ्यूज, और बर्फ पर स्थान।
    3. फ्लश टीथर को पल्स सेंट्रीफ्यूज करें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं; फिर बर्फ पर रखें।
    4. फ्लो सेल प्राइमिंग किट से फ्लश बफर की ट्यूब में सीधे 30 μL फ्लश टीथर जोड़कर फ्लो सेल प्राइमिंग मिक्स तैयार करें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
    5. लोडिंग मोतियों को उपयोग से तुरंत पहले पाइपिंग करके मिलाएं क्योंकि वे जल्दी से व्यवस्थित हो जाते हैं।
    6. एक ताजा ट्यूब में, अनुक्रमण के लिए अंतिम पुस्तकालय कमजोर पड़ने की तैयारी करें, जैसा कि तालिका 5 में बताया गया है।
      नोट: 50 fmol के बराबर डीएनए लाइब्रेरी की मात्रा प्राप्त करने के लिए पूरक फ़ाइल 3 कार्यपत्रक में गणना का उपयोग करें। यदि 12 μL से कम की गणना की जाती है, तो 12 μL तक बनाने के लिए EB जोड़ें।
    7. अनुक्रमण डिवाइस ढक्कन को वापस फ्लिप करें और प्राइमिंग पोर्ट कवर को घड़ी के अनुसार स्लाइड करें ताकि प्राइमिंग पोर्ट दिखाई दे (चित्रा 3)।
    8. P1000 पिपेट को 200 μL पर सेट करके हवा के बुलबुले को सावधानी से निकालें, टिप को प्राइमिंग पोर्ट में डालें, और पहिया को तब तक घुमाएं जब तक कि पिपेट टिप में प्रवेश करने वाली एक छोटी मात्रा दिखाई न दे (अधिकतम मोड़ 230 μL हो)।
    9. बुलबुले से बचने का ध्यान रखते हुए, प्राइमिंग पोर्ट के माध्यम से प्रवाह सेल में 800 μL फ्लो सेल प्राइमिंग मिश्रण लोड करें।
    10. 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
    11. नमूना पोर्ट कवर को धीरे से उठाएं और पी 1000 पिपेट का उपयोग करके प्राइमिंग पोर्ट के माध्यम से फ्लो सेल में 200 μL प्राइमिंग मिश्रण लोड करें।
    12. लोडिंग से पहले लाइब्रेरी मिश्रण को ऊपर और नीचे पिपेट करें, यह सुनिश्चित करें कि लोड करने से पहले मास्टर मिक्स में लोडिंग मोतियों को फिर से निलंबित कर दिया जाए।
    13. ड्रॉपवाइज फैशन में नमूना पोर्ट के माध्यम से प्रवाह सेल में 75 μL लाइब्रेरी मिश्रण लोड करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ड्रिप अगले को जोड़ने से पहले बंदरगाह में बहती है।
    14. नमूना पोर्ट कवर को धीरे से बदलें, सुनिश्चित करें कि बुंग नमूना पोर्ट में प्रवेश करता है।
    15. प्राइमिंग पोर्ट बंद करें और अनुक्रमण डिवाइस ढक्कन को बदलें।
  7. अनुक्रमण रन (अधिकतम 48 घंटे)
    1. अनुक्रमण डिवाइस को लैपटॉप से कनेक्ट करें और अनुक्रमण सॉफ्टवेयर खोलें।
    2. प्रारंभ क्लिक करें , और तब अनुक्रमण प्रारंभ करें क्लिक करें.
    3. नया प्रयोग क्लिक करें और रन के लिए पैरामीटर सेट करने के लिए अनुक्रमण सॉफ़्टवेयर ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) वर्कफ़्लो का पालन करें।
    4. प्रयोग नाम और नमूना ID (उदाहरण के लिए, rabv_run1) लिखें, और ड्रॉप-डाउन मेनू से फ्लो सेल प्रकार चुनें.
    5. किट चयन जारी रखें और उपयोग किए जाने वाले प्रासंगिक लिगेशन अनुक्रमण किट और देशी बारकोडिंग किट का चयन करें।
    6. विकल्प चलाना जारी रखें. डिफ़ॉल्ट रखें, जब तक कि रन के लिए एक निश्चित संख्या में घंटों के बाद स्वचालित रूप से बंद होना वांछित न हो (रन को किसी भी समय मैन्युअल रूप से रोका जा सकता है)।
    7. बेसकॉलिंग जारी रखें। कंप्यूटिंग संसाधनों के अनुसार बेसकॉलिंग चालू या बंद करना चुनें (कंप्यूटर सेटअप देखें)। बारकोडिंग के तहत विकल्प संपादित करें चुनें और सुनिश्चित करें कि बारकोड दोनों छोर चालू हैं। सहेजें और आउटपुट अनुभाग में जारी रखें।
    8. डिफ़ॉल्ट स्वीकार करें और अंतिम समीक्षा जारी रखें, सेटिंग्स की जाँच करें, और कार्यपत्रक (पूरक फ़ाइल 3) में विवरण रिकॉर्ड करें। प्रारंभ क्लिक करें.
      नोट: यदि प्रवाह सेल का पुन: उपयोग किया जा रहा है, तो प्रारंभिक वोल्टेज (रन विकल्पों के उन्नत अनुभाग में) को समायोजित करें, जैसा कि पूरक फ़ाइल 3 में योजना द्वारा इंगित किया गया है।
    9. प्रारंभिक सक्रिय चैनल रिकॉर्ड करें-यदि यह गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) जांच से काफी कम है, तो अनुक्रमण सॉफ़्टवेयर को पुनरारंभ करें। यदि अभी भी कम है, तो कंप्यूटर को रीबूट करें।
    10. अनुमानित छिद्र अधिभोग देने के लिए स्ट्रैंड बनाम एकल छिद्र में प्रारंभिक चैनलों को रिकॉर्ड करें। इस संख्या में उतार-चढ़ाव होगा, इसलिए अनुमान लगाएं।
    11. जैसे-जैसे रन आगे बढ़ता है, उसकी निगरानी करें।

14. लाइव और ऑफलाइन बेसकॉलिंग

नोट: ये निर्देश मानते हैं कि आर्टिक-रैबव रिपॉजिटरी में प्रदान की गई पूर्व-मौजूदा निर्देशिका संरचना और प्रोटोकॉल के अनुभाग 1 और 3 का पालन किया गया है।

  1. अपने स्थानीय फ़ाइल सिस्टम पर, विश्लेषण नामक एक नई निर्देशिका बनाएं, जहां आप अपने सभी विश्लेषण आउटपुट संग्रहीत करेंगे। आगे व्यवस्थित करने के लिए: अपने प्रोजेक्ट के नाम के साथ एक उप-निर्देशिका बनाएं और उसके अंदर run_name के रूप में MinNOW को प्रदान की गई नमूना आईडी का उपयोग करके रन के लिए एक नई निर्देशिका बनाएं। इसे एक कमांड में निम्नानुसार करें:
    mkdir-p
    विश्लेषण/project_name/run_name
    फिर इसके स्थान पर नेविगेट करें:
    कॉम्‍पैक्‍ट डिस्‍क
    पथ/विश्लेषण/project_name/run_name
  2. लाइव बेसकॉलिंग
    नोट: वास्तविक समय में नैनोपोर बेसकॉलिंग करने के लिए, लैपटॉप को एनवीडिया क्यूडीए-संगत ग्राफिक्स प्रोसेसिंग यूनिट (जीपीयू) की आवश्यकता होती है। सुनिश्चित करें कि GPU बेसकॉलिंग सेटअप के लिए निर्देश Guppy प्रोटोकॉल56 का उपयोग करके किए गए हैं।
    1. रन सेटअप के दौरान, लाइव बेसकॉलिंग चालू करें।
    2. नीचे दिए गए निर्देश के अनुसार, वास्तविक समय में अनुक्रमण कवरेज की निगरानी के लिए रैमपार्ट का उपयोग करें।
    3. कंप्यूटर के टर्मिनल में, आर्टिक-rabv conda वातावरण को सक्रिय करें:
      Conda सक्रिय आर्टिक-RABV
    4. run_name निर्देशिका के अंदर प्राचीर आउटपुट के लिए एक नई निर्देशिका बनाएँ और उसमें नेविगेट करें:
      सीडी/पथ/विश्लेषण/project_name/run_name
      एमकेडीआईआर rampart_output
      सीडी rampart_output
    5. बारकोड और नमूना नामों को युग्मित करने के लिए बारकोड.csv फ़ाइल बनाएँ. इसमें प्रति बारकोड एक पंक्ति होनी चाहिए और केवल "बारकोड" और "नमूना" शीर्षकों के साथ लाइब्रेरी में मौजूद बारकोड निर्दिष्ट करना चाहिए। आर्टिक-rabv निर्देशिका में उदाहरण का पालन करें:
      विश्लेषण/example_project/example_run/rampart_output/बारकोड.csv
    6. चलाने के लिए MinNOW आउटपुट में संबंधित प्रोटोकॉल फ़ोल्डर और fastq_pass फ़ोल्डर के लिए पथ प्रदान करके RAMPART प्रारंभ करें:
      प्राचीर -- प्रोटोकॉल / पथ / प्रांपार्ट / scheme_name_V1_protocol - बेसकॉल्ड पाथ <इंसर्टपाथ टू फास्टक्पासफोल्डर>
    7. एक ब्राउज़र विंडो खोलें और URL बॉक्स में localhost:3000 पर नेविगेट करें। स्क्रीन पर परिणाम दिखाई देने से पहले पर्याप्त डेटा के बेसकॉल होने की प्रतीक्षा करें।
  3. ऑफ़लाइन बेसकॉलिंग (पोस्ट-रन किया गया)
    1. यदि लाइव बेसकॉलिंग सेट नहीं की गई थी, तो MinKNOW से आउटपुट कच्चे सिग्नल डेटा (fast5 फाइलें) होगा। रन के दौरान कोई भी रैमपार्ट का उपयोग नहीं कर पाएगा। Fast5 फ़ाइलों को Guipy का उपयोग करके बेसकॉल डेटा (fastq फ़ाइलें) पोस्ट-रन में कनवर्ट करें (पूर्वापेक्षाएँ चरण 1.1.1 में सेटअप देखें।). बेसकॉल्ड डेटा पर रैमपार्ट पोस्ट-हॉक चलाएं।
    2. Gupp बेसकॉलर चलाएँ:
      guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i/path/to/reads/fast5_* -s/path/analysis/project_name/run_name-x auto-r
      -सी बेसकॉलिंग मॉडल निर्दिष्ट करने के लिए कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल है, -i इनपुट पथ है, -s सहेजने का पथ है, -x GPU डिवाइस द्वारा बेसकॉलिंग निर्दिष्ट करता है (Guppy के कंप्यूटर संस्करण का उपयोग करने पर छोड़ दें), और -r इनपुट फ़ाइलों को पुनरावर्ती रूप से खोजने के लिए निर्दिष्ट करता है।
      नोट: कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल (.cfg) को _hac के साथ बदलकर _fast उच्च-सटीकता बेसकॉलर में बदला जा सकता है, हालांकि इसमें काफी अधिक समय लगेगा।

15. प्रवाह कोशिकाओं को धोना

  1. प्रवाह कोशिकाओं को धोया जा सकता है और नए पुस्तकालयों को अनुक्रमित करने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है यदि छिद्र अभी भी व्यवहार्य हैं। ओएनटी फ्लो सेल वॉश प्रोटोकॉल57 पर धोने के निर्देश देखें।

16. विश्लेषण और व्याख्या

  1. आर्टिक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन के साथ आम सहमति अनुक्रम उत्पादन।
    1. कच्चे fast5 या बेसकॉल्ड Fastq फ़ाइलों से आम सहमति अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए rabv_protocols फ़ोल्डर में आर्टिक-rabv GitHub रिपॉजिटरी40 में विस्तृत निर्देशों का पालन करें।
      नोट: आगे मार्गदर्शन के लिए आर्टिक पाइपलाइन - कोर पाइपलाइन58 देखें।
  2. वैकल्पिक: प्रति एम्प्लिकॉन औसत पढ़ने की गहराई का विश्लेषण करें।
    1. पूरक फ़ाइल 1 का उल्लेख करते हुए, आर्टिक-रब्व रिपॉजिटरी से उपलब्ध स्क्रिप्ट को अनुकूलित करें। संक्षेप में, एसएएमटूल्स59 और आर में प्लॉट किए गए प्रति न्यूक्लियोटाइड कवरेज का उपयोग करके गहराई से आंकड़े उत्पन्न किए जाते हैं।
  3. गोंद का उपयोग करके फाइटोलैनेटिक विश्लेषण।
    1. RABV_GLUE 42 से, विश्लेषण > जीनोटाइपिंग और व्याख्या टैब का चयन करें > फ़ाइलें जोड़ें, आम सहमति अनुक्रमों की फास्टा फ़ाइल का चयन करें।
    2. सबमिट करें पर क्लिक करें और प्रतीक्षा करें. एक बार विश्लेषण पूरा हो जाने के बाद, विश्लेषण दिखाएँ बटन क्लिक करने के लिए उपलब्ध होगा, जिसमें क्लेड और सबक्लेड असाइनमेंट, प्रति जीन कवरेज, संदर्भ अनुक्रमों से भिन्नता और निकटतम रिश्तेदार दिखाए जाएंगे।
    3. क्लेड अनुभाग द्वारा एनसीबीआई अनुक्रमों के अनुक्रम डेटा > प्रासंगिक प्रासंगिक अनुक्रमों की भी पहचान की जा सकती है।
    4. पहचाने गए क्लेड का चयन करें या सभी उपलब्ध अनुक्रमों को देखने के लिए रेबीज वायरस (आरएबीवी) पर क्लिक करें।
    5. प्रासंगिक अनुक्रमों के लिए फ़िल्टर करें (उदाहरण के लिए, मूल देश).
    6. विश्लेषण और तुलना के लिए इन अनुक्रमों और संबंधित मेटाडेटा को डाउनलोड करें।
  4. मैडॉग41 का उपयोग करते हुए वंशावली असाइनमेंट
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए GitHub से MADDOG रिपॉजिटरी खींचें कि आप सबसे अद्यतित संस्करण के साथ काम कर रहे हैं।
    2. स्थानीय MADDOG रिपॉजिटरी (पहले पूर्वापेक्षाएँ अनुभाग में बनाया गया) के भीतर एक असाइनमेंट फ़ोल्डर बनाएँ जिसे रन नाम कहा जाता है।
    3. फ़ोल्डर के अंदर, आम सहमति अनुक्रमों वाली फास्टा फ़ाइल जोड़ें।
    4. फ़ोल्डर में कोई मेटाडेटा फ़ाइल जोड़ें.
      नोट: यह फ़ाइल 'ID,' 'देश', 'वर्ष', और 'असाइनमेंट' नामक 4 कॉलम के साथ एक csv होना चाहिए, जिसमें अनुक्रम आईडी, नमूनाकरण का देश और नमूना संग्रह का वर्ष का विवरण होना चाहिए, जबकि 'असाइनमेंट' कॉलम रिक्त होना चाहिए।
    5. कमांड लाइन इंटरफ़ेस में, कोंडा वातावरण को सक्रिय करें: कोंडा MADDOG को सक्रिय करता है।
    6. कमांड लाइन इंटरफ़ेस में, MADDOG रिपॉजिटरी फ़ोल्डर पर नेविगेट करें।
    7. प्रारंभ में, किसी भी संभावित असामान्यताओं की जांच करने के लिए अनुक्रमों पर वंशावली असाइनमेंट करें और यह पहचानने के लिए कि क्या लंबे वंश पदनाम चरण को चलाना उचित होगा। इसके लिए, कमांड लाइन में यह टाइप करें: sh assignment.sh।
    8. संकेत दिए जाने पर, यह इंगित करने के लिए वाई दर्ज करें कि आपने रिपॉजिटरी खींच ली है और मैडडॉग के सबसे अद्यतित संस्करण के साथ काम कर रहे हैं।
    9. संकेत दिए जाने पर, MADDOG रिपॉजिटरी फ़ोल्डर में फ़ोल्डर का नाम दर्ज करें जिसमें Fasta फ़ाइल है।
    10. जब वंशावली असाइनमेंट पूरा हो जाए, तो अपने फ़ोल्डर में आउटपुट फ़ाइल की जाँच करें। यदि आउटपुट अपेक्षा के अनुसार है और एक ही वंश को कई अनुक्रम सौंपे गए हैं, तो वंश पदनाम चलाएं।
    11. यदि वंशावली पदनाम चल रहा है, तो अभी बनाई गई असाइनमेंट आउटपुट फ़ाइल को हटा दें।
    12. टर्मिनल में, MADDOG रिपॉजिटरी फ़ोल्डर के अंदर, कमांड sh designation.sh चलाएँ।
    13. संकेत दिए जाने पर, यह इंगित करने के लिए वाई दर्ज करें कि आपने रिपॉजिटरी खींच ली है और मैडडॉग के सबसे अद्यतित संस्करण के साथ काम कर रहे हैं।
    14. संकेत दिए जाने पर, MADDOG रिपॉजिटरी फ़ोल्डर में फ़ोल्डर का नाम दर्ज करें जिसमें Fasta फ़ाइल और मेटाडेटा होता है। यह प्रत्येक अनुक्रम के बारे में वंश जानकारी, नए और प्रासंगिक पिछले अनुक्रमों (16.3.6 से) की एक फ़ाइलोजेनी, वंशों के बारे में पदानुक्रमित जानकारी, और संभावित उभरते वंशों और अंडरसैंपलिंग के क्षेत्रों का विवरण आउटपुट करता है।
      नोट: प्रोटोकॉल, उपयोग और आउटपुट का पूरा विवरण कैंपबेल एट अल .60 में पाया जा सकता है।
    15. जब प्रारंभिक विश्लेषण पूरा हो जाता है, तो यदि उभरते और कम नमूने वाले वंशों के लिए भी परीक्षण करने के लिए संकेत दिया जाता है, तो यदि आवश्यक हो तो वाई दर्ज करें। अन्यथा, N दर्ज करें।
    16. यदि नए पाए गए वंशों की पुष्टि करने के लिए संकेत दिया जाता है, तो Y दर्ज करें और परिणामी NEXT_STEPS.eml फ़ाइल में दिए गए निर्देशों का पालन करें। अन्यथा, N दर्ज करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित आरएबीवी के लिए नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या वर्कफ़्लो का उपयोग स्थानिक देशों, जैसे तंजानिया, केन्या, नाइजीरिया और फिलीपींस (चित्रा 4) में विभिन्न प्रयोगशाला स्थितियों में सफलतापूर्वक किया गया है। प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न नमूना प्रकारों और स्थितियों पर किया गया था (तालिका 6): ताजा और जमे हुए मस्तिष्क ऊतक, विस्तारित अवधि के लिए कोल्ड चेन के तहत ले जाए गए मस्तिष्क के ऊतकों से सीडीएनए और आरएनए अर्क, और मस्तिष्क ऊतक स्मीयर के साथ एफटीए कार्ड।

रैमपार्ट (चित्रा 5) का उपयोग करके लाइव बेसकॉलिंग पढ़ने की लगभग वास्तविक समय पीढ़ी और प्रति नमूना प्रतिशत कवरेज को दर्शाता है। यह विशेष रूप से यह तय करने में उपयोगी है कि रन को कब रोकना है और पुन: उपयोग के लिए प्रवाह सेल को कब सहेजना है। रन टाइम में भिन्नता देखी गई, कुछ 2 घंटे में समाप्त हो गए, जबकि अन्य को कवरेज की पर्याप्त गहराई (एक्स 100) तक पहुंचने में 12 घंटे से अधिक समय लग सकता है। हम खराब प्रवर्धन वाले क्षेत्रों को भी देख सकते हैं; उदाहरण के लिए, चित्रा 6 एक अनुक्रमण रन का एक स्नैपशॉट दिखाता है जहां कवरेज प्रोफाइल बहुत कम प्रवर्धन के साथ कुछ एम्प्लिकॉन दिखाते हैं, जो संभावित समस्याग्रस्त प्राइमरों का संकेत देते हैं। इन खराब विस्तारक क्षेत्रों की अधिक अच्छी तरह से जांच करके, हम प्राइमर बेमेल की पहचान करने में सक्षम हैं, जो हमें व्यक्तिगत प्राइमरों को फिर से डिजाइन करने और सुधारने में सक्षम करेगा। कुछ प्राइमर योजनाओं ने दूसरों की तुलना में अधिक बेमेल दिखाया है। यह फिलीपींस की तुलना में पूर्वी अफ्रीका प्राइमर योजना में लक्षित विविधता के अनुरूप देखा जाता है, क्योंकि पूर्वी अफ्रीका योजना का उद्देश्य बहुत व्यापक विविधता पर कब्जा करना है।

आरएबीवी-गोंद42, आरएबीवी जीनोम डेटा प्रबंधन के लिए एक सामान्य-उद्देश्य संसाधन, और मैडॉग60, एक वंश वर्गीकरण और नामकरण प्रणाली, का उपयोग परिणामी आरएबीवी अनुक्रमों को संकलित करने और व्याख्या करने के लिए किया गया था। तालिका 7 आरएबीवी-गोंद का उपयोग करके सौंपे गए प्रत्येक देश में घूम रहे प्रमुख और छोटे क्लेड को दर्शाती है। यह भी दिखाया गया है कि मैडडॉग असाइनमेंट के बाद स्थानीय वंशों का एक उच्च रिज़ॉल्यूशन वर्गीकरण है।

Figure 1
चित्र 1: आरएबीवी के लिए नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या वर्कफ़्लो। संक्षेप में (ए) नमूना तैयारी, (बी) पीसीआर और पुस्तकालय तैयारी, और (सी) अनुक्रमण और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण और व्याख्या के लिए दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्राइमर योजना योजनाबद्ध। आगे और रिवर्स प्राइमरों (आधे तीर) के जोड़े के लिए 'इंडेक्स रेफरेंस जीनोम' (गहरे बैंगनी) के साथ एनीलिंग स्थिति, जिन्हें दो अलग-अलग पूलमें सौंपा गया है: ए (लाल) और बी (हरा)। प्राइमर जोड़े 400 बीपी ओवरलैपिंग एम्प्लिकॉन (नीला) उत्पन्न करते हैं, जिन्हें प्रारूप 'scheme_name_X_DIRECTION' में इंडेक्स संदर्भ जीनोम के साथ क्रमिक रूप से क्रमांकित किया जाता है, जहां 'एक्स' प्राइमर द्वारा उत्पन्न एम्प्लिकॉन को संदर्भित करने वाली संख्या है और 'दिशा' या तो 'बाएं' या 'दाएं' है, जो क्रमशः आगे या पीछे का वर्णन करती है। 'X' के विषम या सम मान पूल (क्रमशः A या B) का निर्धारण करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: नैनोपोर प्रवाह सेल48। ब्लू लेबल फ्लो सेल के विभिन्न हिस्सों को चित्रित करते हैं, जिसमें प्राइमिंग पोर्ट कवर शामिल है जो प्राइमिंग पोर्ट को कवर करता है जहां प्राइमिंग समाधान जोड़ा जाता है, स्पॉटऑन नमूना पोर्ट कवर जहां नमूना ड्रॉपवाइज फैशन में जोड़ा जाता है, अपशिष्ट पोर्ट 1 और 2, और फ्लो सेल आईडी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: मानचित्र उस स्थान को दर्शाता है जहां 2021 और 2022 में अनुकूलित वर्कफ़्लो का उपयोग करके आरएबीवी अनुक्रमण आयोजित किया गया था। बुलबुला आकार और रंग प्रति स्थान अनुक्रमों की संख्या के अनुरूप है, जहां छोटा और गहरा कम है, जबकि बड़ा और हल्का अधिक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: वेब ब्राउज़र में RAMPART विज़ुअलाइज़ेशन का स्क्रीनशॉट। जैव सूचना विज्ञान सेटअप के अनुसार बारकोड नामों को नमूना नामों से बदल दिया जाता है। शीर्ष तीन पैनल पूरे रन के लिए सारांश प्लॉट दिखाते हैं: इंडेक्स संदर्भ जीनोम (ऊपर बाएं, बारकोड द्वारा रंगीन) पर प्रति न्यूक्लियोटाइड स्थिति में प्रत्येक बारकोड के लिए मैप किए गए रीड के कवरेज की गहराई, समय के साथ सभी बारकोड से मैप किए गए रीड (शीर्ष मध्य), और मैप किए गए प्रति बारकोड (ऊपर दाएं, बारकोड द्वारा रंगीन)। निचले पैनल प्रति बारकोड किए गए भूखंडों की पंक्तियों को दिखाते हैं। बाएं से दाएं: इंडेक्स संदर्भ जीनोम (बाएं) पर प्रति न्यूक्लियोटाइड स्थिति में मैप किए गए रीड के कवरेज की गहराई, मैप किए गए रीड (मध्य) की लंबाई वितरण, और इंडेक्स संदर्भ जीनोम पर न्यूक्लियोटाइड स्थितियों का अनुपात जो समय के साथ मैप किए गए रीड का 10x, 100x और 1,000x कवरेज प्राप्त कर चुके हैं (दाएं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्रोटोकॉल का उपयोग करके अनुक्रमित फिलीपींस से रेबीज वायरस के नमूने के लिए जीनोम में एक उदाहरण पढ़ा गया कवरेज। जीनोम में प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड स्थिति पर पठन कवरेज दिखाया गया है, साथ ही लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अतिव्यापी एम्प्लिकॉन (1-41) की स्थिति के साथ। कवरेज की गहराई में स्पाइक्स एम्प्लिकॉन ओवरलैप के क्षेत्रों के अनुरूप हैं। कवरेज की कम गहराई वाले एम्प्लिकॉन एम्प्लिकॉन ओवरलैप के क्षेत्रों के अनुरूप हैं। कवरेज की कम गहराई वाले एम्प्लिकॉन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है जो समस्याग्रस्त क्षेत्रों को दर्शाता है जिन्हें अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: सीडीएनए तैयारी के लिए मास्टर मिक्स और थर्मल साइकलर की स्थिति। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: मल्टीप्लेक्स पीसीआर के लिए मास्टर मिक्स और थर्मल साइकलर की स्थिति। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: अंत-तैयारी प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण और थर्मल साइक्लर की स्थिति। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 4: बारकोडिंग के लिए मास्टर मिक्स और थर्मल साइकलर की स्थिति। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 5: अनुक्रमण के लिए एडेप्टर लिगेशन मास्टर मिक्स और अंतिम लाइब्रेरी कमजोर पड़ना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 6: रेबीज वायरस पूरे जीनोम अनुक्रमों की संख्या उत्पन्न होती है और नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या वर्कफ़्लो का उपयोग करके विभिन्न देशों में उपयोग किए जाने वाले नमूनों का प्रकार। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 7: वर्कफ़्लो का उपयोग करके उत्पन्न अनुक्रमों के लिए आरएबीवी-ग्लू से प्रमुख और मामूली क्लेड असाइनमेंट और मैडडॉग से वंशावली असाइनमेंट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: प्राइमर योजना डिजाइन और अनुकूलन, और एम्प्लिकॉन पढ़ने की गहराई विश्लेषण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: कम्प्यूटेशनल सेटअप कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: RABV WGS प्रोटोकॉल कार्यपत्रक कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एक सुलभ आरएबीवी, नैनोपोर-आधारित, संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण वर्कफ़्लो को ब्रुंकर एट अल.61 द्वारा विकसित किया गया था, जिसमें आर्टिक नेटवर्क46 के संसाधनों का उपयोग किया गया था। यहां, हम पूर्ण नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या चरणों के साथ एक अद्यतन वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं। वर्कफ़्लो पूरे जीनोम अनुक्रमण के लिए मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों की तैयारी का विवरण देता है, आम सहमति अनुक्रमों को संसाधित करने और उत्पन्न करने के लिए एक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन प्रस्तुत करता है, और वंश असाइनमेंट को स्वचालित करने और फाइटोलैनेटिक संदर्भ निर्धारित करने के लिए दो रेबीज-विशिष्ट उपकरणों पर प्रकाश डालता है। अद्यतन वर्कफ़्लो विभिन्न संदर्भों (कम-संसाधन सेटिंग्स सहित) में कार्यान्वयन के लिए विचारों के साथ उपयुक्त कम्प्यूटेशनल और प्रयोगशाला कार्यस्थानों के सेटअप के लिए व्यापक निर्देश भी प्रदान करता है। हमने बिना या सीमित जीनोमिक निगरानी क्षमता के साथ चार आरएबीवी स्थानिक एलएमआईसी में अकादमिक और अनुसंधान संस्थान सेटिंग्स दोनों में वर्कफ़्लो के सफल कार्यान्वयन का प्रदर्शन किया है। वर्कफ़्लो विभिन्न सेटिंग्स में अनुप्रयोग के लिए लचीला साबित हुआ है, और अलग-अलग विशेषज्ञता वाले उपयोगकर्ताओं द्वारा समझने योग्य है।

RABV अनुक्रमण के लिए यह वर्कफ़्लो सबसे व्यापक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल है (नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या चरणों को कवर करता है) और विशेष रूप से स्टार्टअप और रनिंग लागत दोनों को कम करने के लिए अनुकूलित है। नैनोपोर तकनीक के साथ पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए आवश्यक समय और लागत अन्य प्लेटफार्मों के सापेक्ष बहुत कम हो जाती है, जैसे कि इलुमिना61, और निरंतर प्रौद्योगिकी विकास अनुक्रम गुणवत्ता और सटीकता में सुधार कर रहे हैं जो इलुमिना62 के साथ तुलनीय है।

यह प्रोटोकॉल विविध कम-संसाधन संदर्भों में लचीला होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कोर प्रोटोकॉल के साथ प्रदान किए गए समस्या निवारण और संशोधन मार्गदर्शन का उल्लेख करके, उपयोगकर्ताओं को वर्कफ़्लो को उनकी आवश्यकताओं के अनुकूल बनाने के लिए समर्थित किया जाता है। वर्कफ़्लो में उपयोगकर्ता के अनुकूल जैव सूचना विज्ञान उपकरणों को जोड़ना मूल प्रोटोकॉल के लिए एक प्रमुख विकास का गठन करता है, जो तेजी से और मानकीकृत तरीके प्रदान करता है जिन्हें स्थानीय संदर्भों में अनुक्रम डेटा की व्याख्या करने के लिए न्यूनतम पूर्व जैव सूचना विज्ञान अनुभव वाले उपयोगकर्ताओं द्वारा लागू किया जा सकता है। सीटू में ऐसा करने की क्षमता अक्सर विशिष्ट प्रोग्रामिंग और फाइटोलैनेटिक कौशल की आवश्यकता से सीमित होती है, जिसके लिए गहन और दीर्घकालिक कौशल प्रशिक्षण निवेश की आवश्यकता होती है। जबकि यह कौशल अनुक्रम डेटा की पूरी तरह से व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है, स्थानीय "अनुक्रमण चैंपियन" को कैपेसिट करने के लिए बुनियादी और सुलभ व्याख्या उपकरण समान रूप से वांछनीय हैं, जिनकी मुख्य विशेषज्ञता गीली प्रयोगशाला आधारित हो सकती है, जिससे उन्हें अपने डेटा की व्याख्या करने और स्वामित्व लेने में सक्षम बनाया जा सके।

जैसा कि प्रोटोकॉल कई देशों में कई वर्षों से किया गया है, अब हम कवरेज में सुधार और संचित विविधता से निपटने के लिए मल्टीप्लेक्स प्राइमर योजनाओं को अनुकूलित करने के तरीके पर मार्गदर्शन प्रदान कर सकते हैं। उपयोगकर्ताओं को लागत-प्रभावशीलता में सुधार करने या किसी दिए गए क्षेत्र में खरीद में आसानी की अनुमति देने में मदद करने के प्रयास भी किए गए हैं, जो आमतौर पर आणविक दृष्टिकोणकी स्थिरता के लिए एक चुनौती है। उदाहरण के लिए, अफ्रीका (तंजानिया, केन्या और नाइजीरिया) में, हमने एडेप्टर लिगेशन चरण में ब्लंट / टीए लिगेज मास्टर मिश्रण का विकल्प चुना, जो स्थानीय आपूर्तिकर्ताओं से अधिक आसानी से उपलब्ध था और अन्य लिगेशन अभिकर्मकों के लिए एक सस्ता विकल्प था।

अनुभव से, प्रति नमूना और प्रति रन लागत को कम करने के कई तरीके हैं। प्रति रन नमूनों की संख्या को कम करना (उदाहरण के लिए, 24 से 12 नमूने तक) प्रवाह कोशिकाओं के जीवन को कई रन पर बढ़ा सकता है, जबकि प्रति रन नमूनों की संख्या बढ़ाने से समय और अभिकर्मकों को अधिकतम किया जा सकता है। हमारे हाथों में, हम हर तीन अनुक्रमण रन में से एक के लिए प्रवाह कोशिकाओं को धोने और पुन: उपयोग करने में सक्षम थे, जिससे अतिरिक्त 55 नमूनों को अनुक्रमित किया जा सके। उपयोग के तुरंत बाद प्रवाह सेल को धोना, या यदि संभव नहीं है, तो हर रन के बाद अपशिष्ट चैनल से अपशिष्ट तरल पदार्थ को हटाना, दूसरे रन के लिए उपलब्ध छिद्रों की संख्या को संरक्षित करना प्रतीत होता है। एक प्रवाह सेल में उपलब्ध छिद्रों की प्रारंभिक संख्या को ध्यान में रखते हुए, एक रन को यह योजना बनाने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है कि किसी विशेष प्रवाह सेल में कितने नमूने चलाने हैं।

यद्यपि वर्कफ़्लो का उद्देश्य विस्तृत मार्गदर्शन और साइनपोस्ट किए गए संसाधनों को जोड़ने के साथ यथासंभव व्यापक होना है, प्रक्रिया अभी भी जटिल है और एक नए उपयोगकर्ता के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है। उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत रूप से प्रशिक्षण और समर्थन प्राप्त करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, आदर्श रूप से स्थानीय रूप से, या वैकल्पिक रूप से बाहरी सहयोगियों के माध्यम से। उदाहरण के लिए, फिलीपींस में, ओएनटी का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 जीनोमिक निगरानी के लिए क्षेत्रीय प्रयोगशालाओं के भीतर क्षमता निर्माण पर एक परियोजना ने स्वास्थ्य देखभाल निदानकर्ताओं के बीच मुख्य दक्षताओं को विकसित किया है जो आरएबीवी अनुक्रमण के लिए आसानी से हस्तांतरणीय हैं। एसपीआरआई बीड क्लीन अप जैसे महत्वपूर्ण कदम, हाथों पर प्रशिक्षण के बिना मास्टर करना मुश्किल हो सकता है, और अप्रभावी सफाई प्रवाह सेल को नुकसान पहुंचा सकती है और रन से समझौता कर सकती है। नमूना संदूषण हमेशा एक प्रमुख चिंता का विषय होता है जब प्रयोगशाला में एम्प्लिकॉन संसाधित किए जा रहे होते हैं और इसे खत्म करना मुश्किल हो सकता है। विशेष रूप से, पोस्ट-रन जैव सूचना विज्ञान के दौरान नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण का पता लगाना बेहद मुश्किल है। अच्छी प्रयोगशाला तकनीक और प्रथाएं, जैसे कि साफ काम की सतहों को बनाए रखना, पूर्व और बाद के पीसीआर क्षेत्रों को अलग करना, और नकारात्मक नियंत्रण को शामिल करना, गुणवत्ता नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए अनिवार्य हैं। नैनोपोर अनुक्रमण विकास की तेज गति नियमित आरएबीवी जीनोमिक निगरानी के लिए एक लाभ और नुकसान दोनों है। नैनोपोर की सटीकता, पहुंच और प्रोटोकॉल प्रदर्शनों की सूची में निरंतर सुधार इसके आवेदन के दायरे को चौड़ा और बेहतर बनाता है। हालांकि, वही विकास मानक संचालन प्रक्रियाओं और जैव सूचना त्मक पाइपलाइनों को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम पुराने से वर्तमान नैनोपोर लाइब्रेरी तैयारी किट (सामग्री की तालिका) में संक्रमण की सहायता करने वाला एक दस्तावेज प्रदान करते हैं।

एलएमआईसी में अनुक्रमण के लिए एक आम बाधा पहुंच है, जिसमें न केवल लागत शामिल है, बल्कि समय पर तरीके से उपभोग्य सामग्रियों की खरीद करने की क्षमता भी शामिल है (विशेष रूप से अनुक्रमण अभिकर्मकों, जो खरीद टीमों और आपूर्तिकर्ताओं के लिए अपेक्षाकृत नए हैं) और कम्प्यूटेशनल संसाधन, साथ ही साथ स्थिर शक्ति और इंटरनेट तक पहुंच होना। इस वर्कफ़्लो की नींव के रूप में पोर्टेबल नैनोपोर अनुक्रमण तकनीक का उपयोग करने से इनमें से कई पहुंच समस्याओं में मदद मिलती है, और हमने देश में पूर्ण प्रोटोकॉल और विश्लेषण का संचालन करते हुए सेटिंग्स की एक श्रृंखला में हमारे प्रोटोकॉल के उपयोग का प्रदर्शन किया है। बेशक, समय पर उपकरण और अनुक्रमण उपभोग्य सामग्रियों की खरीद एक चुनौती बनी हुई है और, कई उदाहरणों में, हमें यूके से अभिकर्मकों को ले जाने या जहाज करने के लिए मजबूर किया गया था। हालांकि, कुछ क्षेत्रों में, हम अभिकर्मकों के लिए पूरी तरह से स्थानीय आपूर्ति मार्गों पर भरोसा करने में सक्षम थे, सार्स-सीओवी-2 अनुक्रमण (जैसे, फिलीपींस) में निवेश से लाभान्वित हुए, जिसने खरीद प्रक्रियाओं को सुव्यवस्थित किया है और रोगज़नक़ जीनोमिक्स के आवेदन को सामान्य करना शुरू कर दिया है।

एक स्थिर इंटरनेट कनेक्शन की आवश्यकता को एक-बार-केवल इंस्टॉल द्वारा कम किया जाता है; उदाहरण के लिए, गिटहब रिपॉजिटरी, सॉफ्टवेयर डाउनलोड और नैनोपोर अनुक्रमण को केवल रन शुरू करने के लिए इंटरनेट एक्सेस की आवश्यकता होती है (पूरे नहीं) या कंपनी से समझौते के साथ पूरी तरह से ऑफ़लाइन प्रदर्शन किया जा सकता है। यदि मोबाइल डेटा उपलब्ध है, तो रन अवधि के लिए डिस्कनेक्ट करने से पहले, अनुक्रमण रन शुरू करने के लिए लैपटॉप के हॉटस्पॉट के रूप में एक फोन का उपयोग किया जा सकता है। नियमित रूप से नमूने संसाधित करते समय, डेटा भंडारण आवश्यकताएं तेजी से बढ़ सकती हैं, और आदर्श रूप से डेटा को सर्वर पर संग्रहीत किया जाएगा। अन्यथा, सॉलिड स्टेट ड्राइव (एसएसडी) हार्ड ड्राइव स्रोत के लिए अपेक्षाकृत सस्ते हैं।

जबकि हम मानते हैं कि एलएमआईसी में जीनोमिक निगरानी के लिए अभी भी बाधाएं हैं, जीनोमिक्स पहुंच और विशेषज्ञता (जैसे, अफ्रीका पैथोजन जीनोमिक्स इनिशिएटिव [अफ्रीका पीजीआई]) के निर्माण में बढ़ते निवेश से पता चलता है कि इस स्थिति में सुधार होगा। महामारीकी तैयारी के लिए जीनोमिक निगरानी महत्वपूर्ण है, और आरएबीवी जैसे स्थानिक रोगजनकों की जीनोमिक निगरानी के माध्यम से क्षमता स्थापित की जा सकती है। सार्स-सीओवी-2 महामारी के दौरान उजागर की गई अनुक्रमण क्षमताओं में वैश्विक असमानताओं को इन संरचनात्मक असमानताओं को दूर करने के लिए उत्प्रेरक परिवर्तन का एक चालक होना चाहिए।

आरएबीवी के लिए यह नमूना-से-अनुक्रम-से-व्याख्या वर्कफ़्लो, जिसमें सुलभ जैव सूचना विज्ञान उपकरण शामिल हैं, का उपयोग 2030 तक कुत्ते-मध्यस्थता रेबीज से शून्य मानव मौतों के लक्ष्य को लक्षित करने वाले नियंत्रण उपायों को निर्देशित करने और अंततः आरएबीवी वेरिएंट के उन्मूलन के लिए किया जा सकता है। प्रासंगिक मेटाडेटा के साथ संयुक्त, इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न जीनोमिक डेटा प्रकोप की जांच के दौरान और किसी देश या क्षेत्रमें परिसंचारी वंशावली की पहचान में तेजी से आरएबीवी लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करता है। हम अपनी पाइपलाइन को ज्यादातर कुत्ते-मध्यस्थता रेबीज के उदाहरणों का उपयोग करके चित्रित करते हैं; हालांकि, वर्कफ़्लो सीधे वन्यजीव रेबीज पर लागू होता है। यह हस्तांतरणीयता और कम लागत नियमित अनुक्रमण को आसानी से उपलब्ध कराने में चुनौतियों को कम करती है, न केवल रेबीज के लिए बल्कि अन्य रोगजनकों के लिए भीरोग प्रबंधन और नियंत्रण में सुधार के लिए।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को वेलकम [207569/जेड/17/जेड, 224670/जेड/21/जेड], मेडिकल रिसर्च काउंसिल [एमआर/R025649/1] और फिलीपींस डिपार्टमेंट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (डीओएसटी), यूके रिसर्च एंड इनोवेशन ग्लोबल इफरमेंट ऑन कोविड-19 [एमआर/V035444/1], यूनिवर्सिटी ऑफ ग्लासगो इंस्टीट्यूशनल स्ट्रेटेजिक सपोर्ट फंड [204820], मेडिकल रिसर्च काउंसिल न्यू इन्वेस्टिगेटर अवार्ड (केबी) [एमआर/X002047] से फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। और इंटरनेशनल पार्टनरशिप डेवलपमेंट फंड, एक डीओएसटी ब्रिटिश काउंसिल-फिलीपींस स्टूडेंट्सशिप (सीबी), एक नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च [17/63/82] जेमवी छात्रवृत्ति (जीजे), और ग्लासगो विश्वविद्यालय के छात्र एमवीएलएस डीटीपी (केसी) [125638-06], ईपीएसआरसी डीटीपी (आरडी) [ईपी / 218518 T517896 / हम उन सहयोगियों और सहयोगियों के आभारी हैं जिन्होंने इस काम का समर्थन किया है: डैनियल स्ट्रेकर, एलिस ब्रोस, एलिजाबेथ मिरांडा, डीवीएम, डारिया मनालो, डीवीएम, थुम्बी मवांगी, कैनेडी लुशासी, चार्ल्स कायुकी, जूड कार्लो बोलिवर, जेरोमिर बॉन्डोक, एस्टेवन बाल्बिन, रोनेल टोंगोहान, अगाथा उकांडे, डेविस कुचाका, मुम्बुआ मुतुंगा, लुटिको सिकाना, और अन्ना क्ज़ुप्रिना।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brand name
Software
Sequencing software
(MinKnow)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/downloads
Bioinformatics tool kit
(Guppy)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
Equipment
Thermal cycler
(miniPCR™ mini16 thermal cycler)		 Cambio MP-QP-1016-01
Homogenizer
(Precellys Evolution Touch Homogenizer)		 Bertin Instruments EQ02520-300
Cold Racks (0.2-0.5mL)
(PCR Mini-cooler with transparent lid)		 BRAND  781260
Pipettor
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) Gilson  SKU: FA10030
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) Gilson  SKU: FA10024
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) Gilson  SKU: FA10020
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) Gilson  SKU: FA10025
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) Gilson  SKU: FA10021
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) Gilson  SKU: FA10026
Fluorometer
(Qubit  4 Fluorometer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q33238
Laptop 
(Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU])
Microcentrifuge
(Refrigerated centrifuge)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 75004081
Vortex mixer
(Basic vortex mixer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 88882011
Magnetic rack
(DynaMag -2 Magnet)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 12321D
Sequencing device
(MinION)		 Oxford Nanopore Technologies MinION Mk1B
RNA Extraction 
RNA extraction kit
(Qiagen RNEasy Mini Kit 250)		 Qiagen 74106
RNA stabilizing reagents 
(RNA later)  Invitrogen AM7020
(DNA/RNA Shield) Zymo Research R1100-50
PCR
Nuclease-free Water
(Nuclease-free Water [not  DEPC-treated])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific AM9937
Master mix for first strand cDNA synthesis
(LunaScript RT SuperMix Kit)		 New England Biolabs E3010S
DNA amplification master mix
(Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])		 New England Biolabs M0494L
Primer (Scheme)
(Custom DNA oligos)		 Invitrogen
SPRI Bead Clean-up
SPRI beads
(Aline Biosciences PCR Clean DX )		 Cambio AL-AC1003-50
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] Merck 818760
Short Fragment buffer
(SFB expansion pack)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-SFB001
DNA Quantification
DNA quantification kit
(Qubit® dsDNA HS Assay Kit)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32854
DNA quantification assay tubes
(Qubit™ Assay Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32856
End Prep and barcoding
(Qubit™ Assay Tubes)
End Prep master mix
(NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)		 New England Biolabs E7546L
Barcoding kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9 
(Native Barcoding Expansion 1-12) EXP-NBD104 
(Native Barcoding Expansion 13-24)  EXP-NBD114 
(Native Barcoding Expansion 96) EXP-NBD196
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
(not compatible)  (not compatible) 
(Native Barcoding Kit 24 V14) SQK-NBD114.24
(Native Barcoding Kit 96 V14) SQK-NBD114.96
Ligation mastermix
(Blunt/TA Ligase Master Mix)		 New England Biolabs M0367S
Adapter Ligation
Adapter ligation master mix
(NEBNext  Quick Ligation Module) New England Biolabs E6056S  
(NEBNext Ultra II Ligation Module)  New England Biolabs E7595S
(Blunt/TA Ligase Master Mix) New England Biolabs M0367S
Adapter mix
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-AMII001
(Adapter Mix II [AMII])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-NBA114
(Native adapter [NA])
Sequencing 
Flowcell priming kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-FLP002
(Flush Buffer [FB])
(Flush Tether [FT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-FLP004
(Flow Cell Flush [FCF])
(Flow Cell Tether [FCT])
Ligation Sequencing Kit 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
SQK-LSK109
Adapter Mix
(Adapter Mix [AMX])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SQB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LB])
Sequencing Tether
(Sequencing Tether [SQT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
SQK-LSK114
Adapter Mix
(Ligation Adapter [LA])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LIB])
Sequencing Tether
(Flow Cell Tether [FCT])
Library solution
(Library solution [LIS])
Flush buffer
(Flow Cell Flush [FCF])
Flow Cell 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
FLO-MIN106D
(Flow Cell  [R9.4.1])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
FLO-MIN114
(Flow Cell  [R10.4.1])
Flow Cell wash 
Flowcell wash kit
(Flow cell wash kit)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-WSH004
Consummables 
Surface decontaminant 
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7010PK
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7002PK
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap
(PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner])		 Greiner 608281
PCR Tube 0.2ml
(PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner])		 Greiner 671201
1000µL Filter Tips (500)
(Stacked 1000µL Filter Tips [500])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11977724
100µL Filter Tips (1000) Thermofisher scientific/Fisher scientific 11947724
10µL Filter Tips (1000)
(Stacked 100µL Filter Tips [1000])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11907724
Reinforced tubes  tubes (2ml)  with screw caps and o-rings
(Fisherbrand™ Bulk tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 15545809
Microcentrifuge tube (1.5ml)
(1.5 ml Eppendorf Tubes [500])		 Eppendorf 1229888
DNA LoBind Tubes  (1.5ml)
(DNA LoBind Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 10051232
Cryobabies labels
Gloves (S/M/L)
Paper towel

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References

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Bautista, C., Jaswant, G., French, H., Campbell, K., Durrant, R., Gifford, R., Kia, G. S. N., Ogoti, B., Hampson, K., Brunker, K. Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology. J. Vis. Exp. (198), e65414, doi:10.3791/65414 (2023).

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