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Secuenciación del genoma completo para la caracterización rápida del virus de la rabia mediante tecnología de nanoporos

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65414
Automatic Translation
1,2, 1,3,4,5, 1,6, 1, 1, 1,6, 7,8, 3,9, 1, 1,6
1School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, 2Research Institute for Tropical Medicine, 3University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, 4Tanzania Industrial Research Development Organization, 5Ifakara Health Institute, 6MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 7Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, 8African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, 9University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

Summary

Aquí, presentamos un flujo de trabajo rápido y rentable para caracterizar los genomas del virus de la rabia (RABV) utilizando tecnología de nanoporos. El flujo de trabajo está destinado a apoyar la vigilancia genómica a nivel local, proporcionando información sobre los linajes circulantes del RABV y su ubicación dentro de las filogenias regionales para guiar las medidas de control de la rabia.

Abstract

Los datos genómicos se pueden utilizar para rastrear la transmisión y la propagación geográfica de enfermedades infecciosas. Sin embargo, la capacidad de secuenciación necesaria para la vigilancia genómica sigue siendo limitada en muchos países de ingresos bajos y medianos, donde la rabia transmitida por perros y/o la rabia transmitida por animales silvestres, como los murciélagos vampiros, plantea importantes problemas económicos y de salud pública. Presentamos aquí un flujo de trabajo rápido y asequible de muestra, secuencia e interpretación utilizando la tecnología de nanoporos. Se describen brevemente los protocolos para la recolección de muestras y el diagnóstico de la rabia, seguidos de detalles del flujo de trabajo optimizado de secuenciación del genoma completo, incluido el diseño del cebador y la optimización para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex, una preparación de biblioteca de secuenciación modificada y de bajo costo, secuenciación con llamada de base en vivo y fuera de línea, designación de linaje genético y análisis filogenético. Se demuestra la implementación del flujo de trabajo y se destacan los pasos críticos para la implementación local, como la validación de la canalización, la optimización del cebador, la inclusión de controles negativos y el uso de datos disponibles públicamente y herramientas genómicas (GLUE, MADDOG) para la clasificación y ubicación dentro de las filogenias regionales y globales. El tiempo de respuesta para el flujo de trabajo es de 2 a 3 días y el costo oscila entre $25 por muestra para una tirada de 96 muestras y $80 por muestra para una tirada de 12 muestras. Llegamos a la conclusión de que el establecimiento de la vigilancia genómica del virus de la rabia en los países de ingresos bajos y medianos es factible y puede respaldar el progreso hacia el objetivo mundial de cero muertes humanas por rabia transmitidas por perros para 2030, así como un mejor monitoreo de la propagación de la rabia en la vida silvestre. Además, la plataforma se puede adaptar a otros patógenos, lo que ayuda a desarrollar una capacidad genómica versátil que contribuye a la preparación para epidemias y pandemias.

Introduction

El virus de la rabia (RABV) es un lyssavirus de la familia Rhabdoviridae que causa una enfermedad neurológica mortalen los mamíferos. Aunque la rabia es 100% prevenible mediante la vacunación, sigue siendo un importante problema económico y de salud pública en los países endémicos. De las 60.000 muertes humanas por rabia que se estima que ocurren cada año, más del 95% se producen en África y Asia, donde los perros son el principal reservorio. Por el contrario, la vacunación canina ha llevado a la eliminación de la rabia transmitida por perros en Europa Occidental, América del Norte y gran parte de América Latina. En estas regiones, los reservorios de rabia ahora están restringidos a la vida silvestre, como murciélagos, mapaches, zorrillos y cánidossalvajes. En toda América Latina, el murciélago vampiro común es una fuente problemática de rabia debido a la transmisión regular de los murciélagos a los humanos y al ganado durante la alimentación nocturnacon sangre. Se estima que el impacto económico mundial anual de la rabia es de 8.600 millones de dólares, y que las pérdidas de ganado representan el 6%5.

Los datos de secuencia de patógenos virales combinados con metadatos sobre el momento y la fuente de las infecciones pueden proporcionar información epidemiológica sólida6. En el caso del RABV, la secuenciación se ha utilizado para investigar el origen de los brotes7,8, identificar las asociaciones de huéspedes con la fauna silvestre o los perros domésticos8,9,10,11,12 y rastrear las fuentes de los casos humanos 13,14. Las investigaciones de brotes mediante análisis filogenéticos han indicado que la rabia surgió en la provincia de Bali, Indonesia, anteriormente libre de rabia, a través de una sola introducción desde las áreas endémicas cercanas de Kalimantan o Sulawesi15. Mientras tanto, en Filipinas, se comprobó que un brote en la isla de Tablas, provincia de Romblon, se introdujo desde la isla principal de Luzón16. Los datos genómicos virales también se han utilizado para comprender mejor la dinámica de transmisión de patógenos necesaria para orientar geográficamente las medidas de control. Por ejemplo, la caracterización genómica del RABV ilustra la agrupación geográfica de los clados 17,18,19, la cocirculación de linajes 20,21,22, el movimiento viral mediado por humanos 17,23,24 y la dinámica de metapoblaciones 25,26.

La monitorización de enfermedades es una función importante de la vigilancia genómica que se ha mejorado con el aumento mundial de la capacidad de secuenciación en respuesta a la pandemia de SARS-CoV-2. La vigilancia genómica ha respaldado el seguimiento en tiempo real de las variantes preocupantes del SARS-COV-227,28 y las contramedidas asociadas 6. Los avances en la tecnología de secuenciación accesible, como la tecnología de nanoporos, han dado lugar a protocolos mejorados y más asequibles para la secuenciación rápida de patógenoshumanos 29,30,31,32 y animales33,34,35. Sin embargo, en muchos países donde la rabia es endémica, todavía existen barreras para poner en práctica la vigilancia genómica de patógenos, como lo demuestran las disparidades mundiales en la capacidad de secuenciación del SARS-CoV-236. Las limitaciones en la infraestructura de laboratorio, las cadenas de suministro y los conocimientos técnicos dificultan el establecimiento y la rutinización de la vigilancia genómica. En este artículo, demostramos cómo se puede implementar un flujo de trabajo de secuenciación del genoma completo optimizado, rápido y asequible para la vigilancia del RABV en entornos con recursos limitados.

Protocol

El estudio fue aprobado por el Comité de Coordinación de Investigación Médica del Instituto Nacional de Investigación Médica (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), el Ministerio de Administración Regional y Gobierno Local (AB.81/288/01) y la Junta de Revisión Institucional del Instituto de Salud de Ifakara (IHI/IRB/No:22-2014) en Tanzanía; el Instituto de Enfermedades Tropicales e Infecciosas de la Universidad de Nairobi (P947/11/2019) y el Instituto de Investigación Médica de Kenia (KEMRI-SERU; protocolo n.º 3268) en Kenia; y el Instituto de Investigación de Medicina Tropical (RITM), Departamento de Salud (2019-023) en Filipinas. La secuenciación de las muestras procedentes de Nigeria se llevó a cabo a partir de material de diagnóstico archivado recogido como parte de la vigilancia nacional.

NOTA: Las secciones 1-4 son requisitos previos. En la sección 5-16 se describe el flujo de trabajo de muestra, secuencia e interpretación para la secuenciación de nanoporos de RABV (Figura 1). Para los pasos posteriores del protocolo que necesiten centrifugación por impulsos, centrifugar a 10-15.000 x g durante 5-15 s.

1. Configuración del entorno computacional para la secuenciación y el análisis de datos

  1. Abra el sitio web de Oxford Nanopore Technology (ONT)37 y cree una cuenta para acceder a recursos específicos de nanoporos.
    1. Inicie sesión e instale el software de secuenciación y llamada base de la ONT38.
  2. Abre GitHub39 y crea una cuenta.
    1. Vaya a los repositorios artic-rabv40 y MADDOG41 y siga las instrucciones de instalación.

2. Diseñar o actualizar el esquema de imprimación múltiplex

NOTA: Los esquemas RABV existentes están disponibles en el repositorio artic-rabv40. Cuando se trata de una nueva zona geográfica, se debe diseñar un nuevo plan o modificar un plan existente para incorporar una diversidad adicional.

  1. Elegir un conjunto de referencia genómica que represente la diversidad en el área de estudio; por lo general, se trata de un conjunto de secuencias disponibles públicamente (por ejemplo, de NCBI GenBank) o datos internos preliminares. Siga el paso 2.1.1 para utilizar RABV-GLUE42, un recurso de datos de secuencia RABV, para filtrar y descargar secuencias NCBI y metadatos asociados.
    NOTA: Elija secuencias de referencia con genomas completos (es decir, sin huecos y bases enmascaradas). Se recomienda elegir hasta 10 secuencias como conjunto de referencia para el diseño de imprimación. Si los datos de secuencia disponibles son incompletos o no son representativos del área de estudio, refiérase al consejo43,44,45 en el Archivo Suplementario 1.
    1. Navegue a la página NCBI RABV Sequences by Clade desde el menú desplegable Datos de secuencia en RABV-GLUE. Haga clic en el enlace Virus de la rabia (RABV) para acceder a todos los datos disponibles o seleccionar un clado particular de interés. Utilice la opción de filtro para agregar filtros que se ajusten a los criterios deseados (por ejemplo, país de origen, longitud de la secuencia). Descarga secuencias y metadatos.
  2. Genere un esquema de cebador para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex siguiendo las instrucciones proporcionadas por el EsquemaPrimario 46. Se recomienda un esquema de 400 pb con una superposición de 50 pb para secuenciar muestras de baja calidad. Descargue y guarde todos los resultados (no edite los nombres de los archivos o de los cebadores).
    NOTA: El esquema se indexará a la primera secuencia de la entrada fasta, en lo sucesivo denominada "referencia de índice" (Figura 2). Consulte el Archivo Suplementario 1 para ver las opciones para optimizar el rendimiento de la imprimación.

3. Configurar los pipelines de bioinformática RAMPART y ARTIC

  1. Consulte el Archivo Suplementario 2 para configurar una estructura de directorios para administrar los archivos de entrada/salida para RAMPART y la canalización de bioinformática ARTIC.

4. Bioseguridad y configuración del laboratorio

  1. Manipule muestras potencialmente positivas para la rabia en condiciones de nivel de bioseguridad (BSL) 2 o 3.
  2. Asegurarse de que el personal del laboratorio haya completado la vacunación previa a la exposición contra la rabia y se someta a un control de la inmunidad de acuerdo con las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS)3.
  3. Asegúrese de que el laboratorio cuente con procedimientos operativos estándar específicos y evaluaciones de riesgos, siguiendo las directrices nacionales o internacionales.
  4. Configuración de laboratorio requerida: Minimice la contaminación manteniendo la separación física entre las áreas previas y posteriores a la PCR. En laboratorios con espacio limitado o en entornos de laboratorio en el campo, use guanteras portátiles o estaciones de laboratorio improvisadas para minimizar la contaminación.
  5. En este protocolo, asegúrese de designar áreas separadas para:
    1. Extracción de muestras: Configure un gabinete/guantera BSL2/3 para manipular material biológico y realizar la inactivación y la extracción de ARN.
    2. Área de plantilla: Configure una caja de armario/guantera BSL1 para la adición de una plantilla (ARN/ADNc) a la mezcla maestra de reacción preparada previamente.
    3. Área de mezcla maestra: Configure un área limpia designada (gabinete BSL1/guantera) para la preparación de mezclas maestras de reactivos. No debería haber ninguna plantilla en esta área.
    4. Área posterior a la PCR: Establezca un área separada para trabajar en amplicones y preparación de bibliotecas de secuenciación.
      NOTA: Todas las áreas deben limpiarse con un descontaminante de superficies y esterilizarse con rayos ultravioleta (UV) antes y después de su uso.

5. Toma de muestras de campo y diagnóstico

NOTA: Las muestras deben ser recolectadas por personal capacitado e inmunizado que use equipo de protección personal y siga los procedimientos estándar de referencia47,48,49.

  1. Recoger la muestra a través del foramen magnum (es decir, la vía occipital), como se describe en detalle en Mauti et al.50.
  2. Diagnosticar la rabia en el campo con pruebas diagnósticas rápidas y confirmarla en el laboratorio mediante los procedimientos recomendados47, como la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA), la prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT)51,52 o la transcripción inversa (RT)-PCR en tiempo real 53.
  3. Utilice muestras cerebrales positivas confirmadas para la extracción de ARN o guárdelas en un congelador a -20 °C durante 2-3 meses o a -80 °C durante períodos más largos. Conservar el ARN para su almacenamiento y transporte utilizando un medio de estabilización adecuado/ARN.

6. Preparación de la muestra y extracción de ARN (3 h)

NOTA: Utilice un kit de extracción de ARN viral basado en columna de centrifugación adecuado para el tipo de muestra.

  1. Prepare dos tubos de perlas de cerámica llenando un tubo de PCR de 2 ml con un tubo de aproximadamente 200 μl lleno de perlas de cerámica de 1,4 mm y etiquete el tubo.
  2. Agregue el volumen recomendado de tampón de lisis proporcionado en el kit de extracción de ARN al tubo de PCR etiquetado.
  3. Obtenga un cubo de aproximadamente 3 mm de la muestra de cerebro confirmada con infección por rabia usando un aplicador de madera y colóquelo en un tubo etiquetado con la identificación de la muestra y 100 μL de agua libre de nucleasa en el tubo etiquetado como control negativo.
    NOTA: Utilice la homogeneización basada en perlas de tubo cerrado para limitar la exposición de la muestra. Si no es posible, utilice otros disruptores mecánicos adecuados (por ejemplo, basados en rotor) o un micromortero manual. Sin embargo, estos pueden ser menos efectivos que golpear las perlas en una superficie dura para romper el tejido (las muestras de tejido pueden endurecerse en ciertos medios de almacenamiento).
  4. Altere el tejido cerebral manualmente con un palo aplicador de madera y luego haga un vórtice a máxima velocidad hasta lograr la homogeneización completa del tejido.
  5. Centrifugue el lisado según las instrucciones del fabricante y use una pipeta para transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga etiquetado. Utilice este sobrenadante únicamente en los pasos siguientes.
  6. Siga las instrucciones de la columna de centrifugación del kit de extracción de ARN para obtener ARN purificado.
  7. Incluya aquí un control de extracción negativo (NEC) y continúe hasta la etapa de secuenciación.

7. Preparación del ADNc (20 min)

  1. En el área de mezcla maestra, prepare una mezcla maestra para la síntesis de ADNc de primera cadena de acuerdo con el número de muestras y controles a procesar (con un volumen excedente del 10% para garantizar un reactivo adecuado; Tabla 1). En esta etapa se debe incluir un control sin plantilla (NTC).
  2. Etiquete los tubos de tiras de PCR de 0,2 ml y alícuota de 5 μl de la mezcla maestra en los tubos.
  3. Lleve los tubos preparados al área de la plantilla. Agregue 5 μL de ARN en cada tubo marcado, incluido el NEC. Agregue 5 μL de agua libre de nucleasas (NFW) al NTC.
  4. Incubar en un termociclador siguiendo las condiciones mencionadas en la Tabla 1.
    NOTA: Punto de pausa opcional: el ADNc se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de 1 mes si es necesario, pero se prefiere proceder a la PCR.

8. Preparación de la imprimación del pool (1 h)

NOTA: Este paso solo es necesario si se fabrican nuevos materiales a partir de cebadores individuales, después de lo cual se pueden usar soluciones madre preparadas.

  1. Prepare un depósito de imprimación de 100 μM de caldo en el área de mezcla maestra.
  2. Vuelva a suspender los cebadores liofilizados en 1x tampón tris-EDTA (TE) o NFW a una concentración de 100 μM cada uno. Vórtice a fondo y gire hacia abajo.
    NOTA: En los siguientes pasos, los cebadores individuales se separan en dos grupos de cebadores, con números impares (denominados Grupo A) y pares (denominados Grupos B), para evitar interacciones entre los cebadores que flanquean las superposiciones de amplicones. Estos grupos de cebadores generan amplicones superpuestos de 400 pb que abarcan el genoma objetivo.
  3. Coloque todos los cebadores impares en una rejilla para tubos. Genere un stock de cebador agregando 5 μL de cada cebador a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con la etiqueta "nombre del esquema de cebador - Grupo A (100 μM)".
  4. Repita el proceso para todos los cebadores pares y etiquételos como "nombre del esquema de cebador - Grupo B (100 μM)".
  5. Diluya cada baño de imprimación 1:10 en agua de grado molecular para generar 10 μM de material de imprimación.
    NOTA: Realizar múltiples alícuotas de diluciones de imprimación de 10 μM y congelarlas en caso de degradación o contaminación.

9. PCR multiplex (5 h)

  1. Prepare dos mezclas maestras de PCR, una para cada grupo de cebadores en el área de mezcla maestra.
    1. Utilice una concentración final de 0,015 μM por imprimación. Calcule el volumen requerido del grupo de cebadores para la reacción de PCR (Tabla 2) utilizando la siguiente fórmula:
      Volumen de la piscina de cebadores = número de cebadores x volumen de reacción x 0,015/concentración (μM) de material de cebado
  2. Alícuota de 10 μL de cada mezcla maestra del Grupo A y mezcla maestra del Grupo B a tubos de tiras de PCR etiquetados en el área de la plantilla. Para cada muestra, agregue 2,5 μL de ADNc (del paso 3) a cada una de las reacciones correspondientes del grupo A y B del cebador marcado. El exceso de ADNc puede almacenarse a -20 °C.
  3. Mezcle agitando suavemente y centrifugando por pulsos.
  4. Incubar las muestras con las condiciones mencionadas en la Tabla 2 en una máquina de PCR.
    NOTA: El programa no incluye un paso de extensión específico debido al largo tiempo de recocido de 5 min (requerido debido al alto número de cebadores) y la corta longitud de los amplicones (400 pb) que es suficiente para la extensión.

10. Limpieza y cuantificación por PCR (3,5 h)

  1. Realice todo el trabajo a partir de este momento en el área posterior a la PCR.
  2. Bolas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) alícuotas en tubos de microcentrífuga desde el frasco principal. Conservar a 4 °C.
  3. Calentar una alícuota de SPRI a temperatura ambiente (RT; ~20 °C) y vórtice completamente hasta que las perlas se resuspendan completamente en la solución.
  4. En tubos de 1,5 ml, combine los productos de PCR del primer grupo A y del cebador del grupo B para cada muestra. Si es necesario, agregue agua para llevar el volumen a 25 μL.
  5. Agregue 25 μL de perlas SPRI a cada muestra (proporción 1:1 perla:muestra). Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo o golpeando suavemente el tubo.
  6. Incubar a RT durante 10 minutos, invirtiendo o moviendo ocasionalmente los tubos.
  7. Coloque en una rejilla magnética hasta que las perlas y la solución se hayan separado por completo. Retire y deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar el gránulo de perlas.
  8. Lavar dos veces con etanol al 80% (calentado a RT).
    1. Agregue 200 μL de etanol al pellet. Espere 30 segundos para asegurarse de que las cuentas se laven correctamente.
    2. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante, tratando de no tocar la bolita de perlas.
    3. Repita los pasos 10.8.1-10.8.2 para lavar el gránulo por segunda vez.
  9. Elimine todos los restos de etanol con una boquilla de 10 μL. Secar al aire hasta que el etanol traza se haya evaporado (con pequeñas perlas esto sucede rápidamente, ~ 30 s); Cuando esto sucede, el gránulo debe pasar de brillante a mate. Tenga cuidado de no secar demasiado (si el gránulo se está agrietando, está demasiado seco), ya que esto afectará la recuperación del ADN.
  10. Vuelva a suspender las perlas en 15 μL de NFW e incube a RT (fuera de la rejilla magnética) durante 10 min.
  11. Regrese a la rejilla magnética y transfiera el sobrenadante (producto limpio) a un tubo nuevo de 1,5 ml.
  12. Preparar una dilución 1:10 de cada muestra en un tubo separado (2 μL de producto + 18 μL de NFW).
    NOTA: Tenga mucho cuidado en esta etapa para evitar la contaminación cruzada. Solo tenga un tubo de amplicón abierto a la vez. Alícuota 18 μL de agua en los tubos primero (en un área de mezcla maestra limpia).
  13. Mida la concentración de ADN de cada muestra diluida utilizando un fluorómetro altamente sensible y específico, como se describe en protocols.io54,55.

11. Normalización (30 min)

  1. Utilice la plantilla de normalización (Archivo suplementario 3) y la concentración de ADN (ng/μL) de cada muestra para calcular el volumen de muestra diluida (o limpia) necesaria para 200 fmol de cada muestra en un volumen total de 5 μL.
  2. Etiquete los nuevos tubos de PCR y agregue volúmenes calculados de NFW y muestra para obtener ADN normalizado.
  3. Utilice el volumen calculado para muestras sin diluir (limpias) si se requieren más de 5 μl de la muestra diluida para obtener 200 fmol.
    NOTA: Punto de pausa opcional: En este punto, el producto de PCR limpio puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 semana o colocarse a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo si es necesario.

12. Preparación final y código de barras (1,5 h)

NOTA: Los siguientes pasos asumen el uso de reactivos específicos de los kits de secuenciación de ligadura y códigos de barras específicos de nanoporos (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). El protocolo es transferible a diferentes versiones químicas, pero los usuarios deben tener cuidado de usar kits compatibles, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

  1. Reparación de extremos y dA-tailing
    1. Configure la reacción de preparación final para cada muestra mencionada en la Tabla 3. Prepare una mezcla maestra de acuerdo con el número de muestras (más un 10% de exceso). Tenga cuidado al pipetear, ya que los reactivos son viscosos.
    2. Agregue 5 μL de mezcla maestra en cada tubo de ADN normalizado (5 μL). La mezcla total de reacción debe ser de 10 μL. Cambie las puntas cada vez y solo tenga un tubo abierto a la vez.
    3. Incubar en un termociclador en las condiciones mencionadas en la Tabla 3.
  2. Código de barras
    1. Alicuone los códigos de barras del kit de códigos de barras a los tubos de tiras de PCR a 1,25 μL/tubo y registre el código de barras asignado a cada muestra.
    2. Añada 0,75 μL de la muestra preparada al final a su alícuota de código de barras asignada.
    3. Preparar una mezcla maestra de ligadura según el número de muestras (más un 10% de exceso) (Tabla 4).
    4. Agregue 8 μL de mezcla maestra de ligadura a la muestra preparada al final + códigos de barras, dando una reacción total de 10 μL.
    5. Incubar en un termociclador utilizando las condiciones mencionadas en la Tabla 4.
  3. Limpieza de perlas SPRI y cuantificación de ADN
    1. Descongele el tampón de fragmentos cortos (SFB) en RT, mezcle por vórtice, centrifuga por pulso y colóquelo en hielo.
    2. Agrupe todas las muestras con código de barras en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para no hacer que el volumen de limpieza sea demasiado grande para su uso, agrupe de 12 a 24 muestras (10 μL/muestra), hasta 48 muestras (5 μL/muestra) o hasta 96 muestras (2,5 μL/muestra) de cada reacción nativa de código de barras.
    3. Agregue un volumen de 0,4 veces más de cuentas SPRI al grupo con código de barras. Mezclar suavemente (agitando o pipeteando) e incubar a temperatura media durante 5 min.
    4. Coloque las muestras en un imán hasta que las perlas se hayan granulado y el sobrenadante esté completamente claro (~2 min). Retire y deseche el sobrenadante. Tenga cuidado de no alterar las cuentas.
    5. Lavar dos veces con 250 μL de SFB.
      1. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender completamente el gránulo en 250 μL de SFB. Incubar durante 30 s, centrífuga de pulsos y volver al imán.
      2. Retire el sobrenadante y deséchelo.
    6. Repita el paso 12.3.5 para realizar un segundo lavado de SFB.
    7. Centrifugar por pulsos y eliminar cualquier SFB residual.
    8. Agregue 200 μL de etanol al 80% (RT) para bañar el pellet. Retire y deseche el etanol, teniendo cuidado de no alterar la bolita de perlas. Secar al aire durante 30 s o hasta que el pellet haya perdido su brillo.
    9. Vuelva a suspender 22 μL de NFW a RT durante 10 min.
    10. Coloque en el imán, deje reposar durante ~ 2 minutos, luego retire con cuidado la solución y transfiérala a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
    11. Utilice 1 μL para obtener la concentración de ADN, como se describió anteriormente (paso 10.13).
      NOTA: Punto de pausa opcional: En este punto, la biblioteca se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana o a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo, pero es preferible continuar con la ligadura y secuenciación del adaptador.

13. Secuenciación (máximo 48 h)

  1. Prepare el equipo (consulte también las secciones 1 a 4 de Requisitos previos).
    1. Compruebe que haya suficiente espacio para almacenar datos nuevos (mínimo 150 GB), que se haga una copia de seguridad de los datos de las ejecuciones anteriores o que se muevan a un servidor antes de eliminarlos y que se haya instalado la última versión de MinKNOW.
  2. Retire la celda de flujo almacenada del refrigerador y deje que alcance RT.
  3. Ligadura con adaptador (1 h)
    1. Centrifugar por pulsos la mezcla adaptadora y la ligasa y colocar en hielo.
    2. Descongele el tampón de elución (EB), el SFB y el tampón de ligadura en RT. Mezcle por vórtice, centrífugo de pulso y colóquelo en hielo.
    3. Prepare la mezcla maestra de ligadura del adaptador (Tabla 5), combinando los reactivos en el orden especificado en un tubo de unión baja.
      NOTA: Se pueden utilizar alternativas para los reactivos de mezcla maestra de ligadura adaptadora (Tabla 5) según la disponibilidad en el laboratorio. Consulte el Archivo Suplementario 3 y la Tabla de Materiales para obtener una lista de alternativas. Utilice el cálculo en la hoja de cálculo del Archivo Suplementario 3 para obtener el volumen de la biblioteca de ADN equivalente a 200 fmol. Si se calcula menos de 20 μL, agregue NFW para obtener hasta 20 μL.
    4. Mezcle con un movimiento suave y una centrífuga de pulsos. Incubar en RT durante 20 min.
      NOTA: Durante la incubación, comience a preparar la celda de flujo (sección 13.5).
  4. Limpie con perlas SPRI (no use etanol como en limpiezas anteriores).
    1. Agregue un volumen de 0.4x de perlas SPRI (RT) a las muestras. Incubar a temperatura media durante 10 minutos, agitar suavemente de forma intermitente para ayudar a mezclar.
    2. Coloque en el imán hasta que las perlas y la solución se hayan separado por completo (~ 5 min). Retire y deseche el sobrenadante; Tenga cuidado de no alterar el gránulo de cuentas.
    3. Lavar dos veces con 125 μL de SFB.
    4. Vuelva a suspender el gránulo completamente con 125 μL de SFB mezclando con una pipeta. Dejar incubar durante 30 s.
    5. Centrífuga de pulsos para recoger el líquido en la base del tubo y colocarlo en el imán. Retire el sobrenadante y deséchelo.
    6. Repita los pasos 13.4.4-13.4.5 para lavar el gránulo por segunda vez.
    7. Centrifugar por pulsos y eliminar el exceso de SFB.
    8. Volver a suspender en 15 μL de EB e incubar durante 10 min a RT.
    9. Regrese al imán durante ~ 2 minutos y luego transfiera con cuidado la solución a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
    10. Cuantifique 1 μL de la biblioteca eluida, como se describió anteriormente en el paso 10.13
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, proceda directamente a la secuenciación MinION; sin embargo, la biblioteca final se puede almacenar en EB a 4 °C durante un máximo de 1 semana si es necesario.
  5. Ejecute una comprobación de la calidad de la celda de flujo.
    1. Conecte el dispositivo de secuenciación a una computadora portátil y abra el software de secuenciación.
    2. Seleccione el tipo de celda de flujo y, a continuación, haga clic en Comprobar celda de flujo e Iniciar prueba.
    3. Una vez completado, se mostrará el número total de poros activos (es decir, viables). Una nueva celda de flujo debe tener >800 poros activos; Si no es así, póngase en contacto con el fabricante para obtener un reemplazo.
  6. Cebado y carga de la celda de flujo (20 min)
    1. Descongele los siguientes reactivos en RT y, a continuación, coloque el tampón de secuenciación, una correa de lavado, un tampón de lavado y perlas de carga en hielo.
    2. Agite el tampón de secuenciación y el tampón de lavado, centrifuga de pulsos y colóquelo en hielo.
    3. Centrifugar por pulsos la correa de descarga y mezclar mediante pipeteo; luego colóquelo en hielo.
    4. Prepare la mezcla de cebado de celda de flujo agregando 30 μL de correa de lavado directamente al tubo de tampón de lavado de un kit de cebado de celda de flujo y mezcle mediante pipeteo.
    5. Mezcle las perlas de carga pipeteándolas inmediatamente antes de usarlas, ya que se asientan rápidamente.
    6. En un tubo nuevo, prepare la dilución final de la biblioteca para la secuenciación, como se menciona en la Tabla 5.
      NOTA: Utilice el cálculo en la hoja de trabajo del Archivo Suplementario 3 para obtener el volumen de la biblioteca de ADN equivalente a 50 fmol. Si se calcula menos de 12 μL, agregue EB para obtener hasta 12 μL.
    7. Voltee hacia atrás la tapa del dispositivo de secuenciación y deslice la cubierta del puerto de cebado en el sentido de las agujas del reloj para que el puerto de cebado sea visible (Figura 3)
    8. Elimine las burbujas de aire con cuidado ajustando una pipeta P1000 a 200 μL, inserte la punta en el puerto de cebado y gire la rueda hasta que se vea un pequeño volumen que entra en la punta de la pipeta (giro máximo a 230 μL).
    9. Cargue 800 μL de mezcla de cebado de celda de flujo en la celda de flujo a través del puerto de cebado, teniendo cuidado de evitar burbujas.
    10. Dejar actuar durante 5 min.
    11. Levante suavemente la tapa del puerto de muestra y cargue 200 μl de mezcla de cebado en la celda de flujo a través del puerto de cebado con una pipeta P1000.
    12. Pipetee la mezcla de la biblioteca hacia arriba y hacia abajo antes de cargarla, asegurándose de que las perlas de carga en la mezcla maestra se vuelvan a suspender antes de cargar.
    13. Cargue 75 μL de mezcla de biblioteca en la celda de flujo a través del puerto de muestra gota a gota. Asegúrese de que cada goteo fluya hacia el puerto antes de agregar el siguiente.
    14. Vuelva a colocar la tapa del puerto de muestra con cuidado, asegurándose de que el tapón entre en el puerto de muestra.
    15. Cierre el puerto de cebado y vuelva a colocar la tapa del dispositivo de secuenciación.
  7. Ciclo de secuenciación (máximo 48 h)
    1. Conecte el dispositivo de secuenciación a la computadora portátil y abra el software de secuenciación.
    2. Haga clic en Inicio y, a continuación, haga clic en Iniciar secuenciación.
    3. Haga clic en Nuevo experimento y siga el flujo de trabajo de la interfaz gráfica de usuario (GUI) del software de secuenciación para configurar los parámetros de la ejecución.
    4. Escriba el nombre del experimento y el ID de muestra (por ejemplo, rabv_run1) y elija el tipo de celda de flujo en el menú desplegable.
    5. Continúe con la selección del kit y elija el kit de secuenciación de ligadura correspondiente y los kits de códigos de barras nativos utilizados.
    6. Continúe con las opciones de ejecución . Mantenga los valores predeterminados, a menos que se desee que la ejecución se detenga automáticamente después de un cierto número de horas (las ejecuciones se pueden detener manualmente en cualquier momento).
    7. Continúe con Basecalling. Elija activar o desactivar las llamadas base de acuerdo con los recursos informáticos (consulte configuración de la computadora). Elija Editar opciones en código de barras y asegúrese de que el código de barras de ambos extremos esté activado. Guarde y continúe con la sección de salida.
    8. Acepte los valores predeterminados y continúe con la revisión final, verifique la configuración y registre los detalles en la hoja de trabajo (Archivo complementario 3). Haga clic en Inicio.
      NOTA: Si se está reutilizando la celda de flujo, ajuste el voltaje de arranque (en la sección avanzada de las opciones de funcionamiento), como se indica en el esquema del Archivo Suplementario 3.
    9. Registre los canales activos iniciales: si esto es significativamente menor que la verificación de control de calidad (QC), reinicie el software de secuenciación. Si aún es más bajo, reinicie la computadora.
    10. Registre los canales iniciales en la hebra frente a un solo poro para obtener una ocupación aproximada de los poros. Este número fluctuará, así que da una aproximación.
    11. Supervise la ejecución a medida que avanza.

14. Llamadas base en vivo y fuera de línea

NOTA: Estas instrucciones asumen que se ha seguido la estructura de directorios preexistente proporcionada en el repositorio artic-rabv y que se han seguido las secciones 1 y 3 de los requisitos previos del protocolo.

  1. En el sistema de archivos local, cree un nuevo directorio llamado análisis, donde almacenará todos los resultados del análisis. Para organizarse aún más: cree un subdirectorio con el nombre de su proyecto y, dentro de él, un nuevo directorio para la ejecución, utilizando el ID de muestra proporcionado al MinKNOW como run_name. Haga esto en un comando de la siguiente manera:
    mkdir -p
    análisis/project_name/run_name
    A continuación, navegue hasta su ubicación:
    CD
    ruta/análisis/project_name/run_name
  2. Llamadas base en vivo
    NOTA: Para realizar llamadas base de nanoporos en tiempo real, las computadoras portátiles requieren una unidad de procesamiento de gráficos (GPU) compatible con NVIDIA CUDA. Asegúrese de que las instrucciones para la configuración de llamada base de GPU se hayan realizado mediante el protocolo guppy56.
    1. Durante la configuración de la ejecución, active las llamadas base en vivo.
    2. Utilice RAMPART para supervisar la cobertura de secuenciación en tiempo real, según las instrucciones que se indican a continuación.
    3. En el terminal del ordenador, active el entorno artic-rabv conda:
      Conda Activar ARTIC-RABb
    4. Cree un nuevo directorio para la salida de la muralla dentro del directorio run_name y navegue hasta él:
      cd /ruta/análisis/project_name/run_name
      mkdir rampart_output
      CD rampart_output
    5. Cree un archivo de códigos de barras.csv para emparejar los códigos de barras y los nombres de muestra. Debe tener una línea por código de barras y solo especificar los códigos de barras que están presentes en la biblioteca, con los encabezados "código de barras" y "muestra". Siga el ejemplo en el directorio artic-rabv:
      análisis/example_project/example_run/rampart_output/códigos de barras.csv
    6. Inicie RAMPART proporcionando la carpeta de protocolo relevante y la ruta de acceso a la carpeta fastq_pass en la salida de MinKNOW para la ejecución:
      rampart --protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol - basecalledPath
    7. Abra una ventana del navegador y navegue hasta localhost:3000 en el cuadro de URL. Espere a que se llamen a base suficientes datos antes de que los resultados aparezcan en la pantalla.
  3. Llamada base sin conexión (realizada después de la ejecución)
    1. Si no se configuró la llamada base en vivo, la salida de MinKNOW serán datos de señal sin procesar (archivos fast5). No se podrá usar RAMPART durante la ejecución. Convierta los archivos fast5 en datos denominados base (archivos fastq) después de la ejecución usando guppy (consulte la configuración en el paso 1.1.1 de los requisitos previos). Ejecute RAMPART post-hoc en la base llamada data.
    2. Ejecute el guppy basecaller:
      guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /ruta/a/lecturas/fast5_* -s /ruta/análisis/project_name/run_name -x auto -r
      -c es el archivo de configuración para especificar el modelo de llamada base, -i es la ruta de entrada, -s es la ruta de guardado, -x especifica la llamada base por parte del dispositivo GPU (excluir si se usa la versión de computadora de guppy) y -r especifica buscar archivos de entrada de forma recursiva.
      NOTA: El archivo de configuración (.cfg) se puede cambiar a un llamador base de alta precisión reemplazando _fast por _hac, aunque esto llevará mucho más tiempo.

15. Lavado de las celdas de flujo

  1. Las celdas de flujo se pueden lavar y reutilizar para secuenciar nuevas bibliotecas si los poros aún son viables. Consulte las instrucciones para el lavado en el protocolo de lavado de celdas de flujo ONT57.

16. Análisis e interpretación

  1. Generación de secuencias de consenso con el pipeline de bioinformática de ARTIC
    1. Siga las instrucciones detalladas en el repositorio de GitHub artic-rabv40 en la carpeta rabv_protocols para generar secuencias de consenso a partir de archivos raw, fast5 o basecalled fastq.
      NOTA: Consulte Tubería ártica - Tuberíaprincipal 58 para obtener más orientación.
  2. Opcional: Analice la profundidad de lectura media por amplicón.
    1. Adaptar los scripts disponibles en el repositorio artic-rabv, haciendo referencia al Fichero Suplementario 1. Brevemente, se generan estadísticas detalladas utilizando SAMtools59 y la cobertura por nucleótido se representa en R.
  3. Análisis filogenético mediante GLUE
    1. A partir de RABV_GLUE42, seleccione la pestaña Análisis > genotipado e interpretación > Agregar archivos, seleccionando el archivo fasta de secuencias de consenso.
    2. Haga clic en Enviar y espere. Una vez que se completen los análisis, el botón Mostrar análisis estará disponible para hacer clic, mostrando las asignaciones de clados y subclados, la cobertura por gen, la variación de las secuencias de referencia y el pariente más cercano.
    3. Las secuencias contextuales relevantes también se pueden identificar en la sección Datos de secuencia > secuencias NCBI por clado .
    4. Seleccione el clado identificado o haga clic en Virus de la rabia (RABV) para ver todas las secuencias disponibles.
    5. Filtre por secuencias relevantes (por ejemplo, país de origen).
    6. Descargue estas secuencias y los metadatos correspondientes para su análisis y comparación.
  4. Asignación de linaje con MADDOG41
    1. Extrae el repositorio de MADDOG de GitHub para asegurarte de que estás trabajando con la versión más actualizada.
    2. Cree una carpeta de asignación dentro del repositorio local de MADDOG (creado anteriormente en la sección Requisitos previos) llamada nombre de ejecución.
    3. Dentro de la carpeta, agregue el archivo fasta que contiene las secuencias de consenso.
    4. Agregue un archivo de metadatos a la carpeta.
      NOTA: Este archivo debe ser un csv con 4 columnas llamadas 'ID', 'país', 'año' y 'asignación', detallando los ID de secuencia, el país de muestreo y el año de recolección de la muestra, mientras que la columna 'asignación' debe estar en blanco.
    5. En la interfaz de línea de comandos, active el entorno de conda: conda activate MADDOG.
    6. En la interfaz de línea de comandos, navegue hasta la carpeta del repositorio MADDOG.
    7. Inicialmente, realice la asignación de linaje en las secuencias para verificar si hay posibles anomalías e identificar si sería apropiado ejecutar el paso de designación de linaje más largo. Para ello, escriba esto en la línea de comandos: sh assignment.sh.
    8. Cuando se le solicite, escriba Y para indicar que ha extraído el repositorio y está trabajando con la versión más actualizada de MADDOG.
    9. Cuando se le solicite, introduzca el nombre de la carpeta dentro de la carpeta del repositorio de MADDOG que contiene el archivo fasta.
    10. Cuando se complete la asignación de linaje, compruebe el archivo de salida en la carpeta. Si el resultado es el esperado y hay varias secuencias asignadas al mismo linaje, ejecute la designación de linaje.
    11. Si ejecuta la designación de linaje, elimine el archivo de salida de asignación que se acaba de crear.
    12. En el terminal, dentro de la carpeta del repositorio MADDOG, ejecute el comando sh designation.sh.
    13. Cuando se le solicite, escriba Y para indicar que ha extraído el repositorio y está trabajando con la versión más actualizada de MADDOG.
    14. Cuando se le solicite, introduzca el nombre de la carpeta dentro de la carpeta del repositorio de MADDOG que contiene el archivo fasta y los metadatos. Esto genera información de linaje sobre cada secuencia, una filogenia de las secuencias anteriores nuevas y relevantes (de 16.3.6), información jerárquica sobre los linajes y detalles de linajes potencialmente emergentes y áreas de submuestreo.
      NOTA: Los detalles completos del protocolo, el uso y los resultados se pueden encontrar en Campbell et al.60.
    15. Cuando se haya completado el análisis inicial, si se le pide que también pruebe los linajes emergentes y submuestreados, escriba Y, si es necesario. De lo contrario, escriba N.
    16. Si se le pide que confirme los linajes recién encontrados, escriba Y y siga las instrucciones del archivo NEXT_STEPS.eml resultante. De lo contrario, escriba N.

Representative Results

El flujo de trabajo de muestra, secuencia e interpretación para el RABV descrito en este protocolo se ha utilizado con éxito en diferentes condiciones de laboratorio en países endémicos, como Tanzania, Kenia, Nigeria y Filipinas (Figura 4). El protocolo se utilizó en diferentes tipos de muestras y condiciones (Tabla 6): tejido cerebral fresco y congelado, extractos de ADNc y ARN de tejido cerebral transportados bajo cadena de frío durante períodos prolongados, y tarjetas FTA con frotis de tejido cerebral.

Las llamadas base en vivo mediante RAMPART (Figura 5) muestran la generación de lecturas casi en tiempo real y el porcentaje de cobertura por muestra. Esto es particularmente útil para decidir cuándo detener la ejecución y guardar la celda de flujo para su reutilización. Se observó variación en el tiempo de ejecución, con algunos terminados en 2 h, mientras que otros podían tardar más de 12 h en alcanzar una profundidad de cobertura adecuada (x100). También podemos ver regiones con poca amplificación; por ejemplo, la Figura 6 muestra una instantánea de una serie de secuenciación en la que los perfiles de cobertura muestran algunos amplicones con amplificación muy baja, lo que indica cebadores potencialmente problemáticos. Al investigar más a fondo estas regiones de amplificación deficiente, hemos podido identificar desajustes de cebadores, lo que nos permitirá rediseñar y mejorar los cebadores individuales. Algunos esquemas de imprimación han mostrado más desajustes que otros. Esto se observa en el plan de cartilla de África Oriental, en comparación con Filipinas, en consonancia con la diversidad objetivo, ya que el plan de África Oriental tiene como objetivo captar una diversidad mucho más amplia.

RABV-GLUE42, un recurso de propósito general para la gestión de datos del genoma del RABV, y MADDOG60, un sistema de clasificación y nomenclatura de linajes, se utilizaron para compilar e interpretar las secuencias de RABV resultantes. En el Cuadro 7 se muestran los clados mayores y menores que circulan en cada país asignado utilizando RABV-GLUE. También se muestra una clasificación de mayor resolución de los linajes locales después de la asignación de MADDOG.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo de muestra, secuencia e interpretación para RABV. Se muestran los pasos resumidos para (A) preparación de muestras, (B) preparación de PCR y biblioteca, y (C) secuenciación y bioinformática hasta el análisis e interpretación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema del esquema de cebadores. Posiciones de recocido a lo largo del "genoma de referencia índice" (púrpura oscuro) para pares de cebadores hacia adelante y hacia atrás (medias flechas), que se asignan en dos grupos separados: A (rojo) y B (verde). Los pares de cebadores generan amplicones superpuestos de 400 pb (azul) que se numeran secuencialmente a lo largo del genoma de referencia índice en el formato 'scheme_name_X_DIRECTION', donde 'X' es un número que se refiere al amplicón generado por el cebador y 'DIRECCIÓN' es 'IZQUIERDA' o 'DERECHA', describiendo el avance o retroceso respectivamente. Los valores pares o impares de 'X' determinan el grupo (A o B, respectivamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Celda de flujo de nanoporos48. Las etiquetas azules ilustran las diferentes partes de la celda de flujo, incluida la cubierta del puerto de cebado que cubre el puerto de cebado donde se agrega la solución de cebado, la cubierta del puerto de muestra SpotON que cubre el puerto de muestra donde se agrega la muestra gota a gota, los puertos de desagüe 1 y 2 y el ID de la celda de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Mapa que muestra la ubicación donde se realizó la secuenciación de RABV utilizando el flujo de trabajo optimizado en 2021 y 2022. El tamaño y el color de la burbuja corresponden al número de secuencias por ubicación, donde más pequeño y oscuro es menos, mientras que más grande y más claro es más. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Captura de pantalla de la visualización de RAMPART en el navegador web. Los nombres de los códigos de barras se sustituyen por nombres de muestra de acuerdo con la configuración bioinformática. Los tres paneles superiores muestran gráficos de resumen para toda la tirada: profundidad de cobertura de las lecturas asignadas para cada código de barras por posición de nucleótido en el genoma de referencia índice (arriba a la izquierda, coloreadas por código de barras), lecturas mapeadas sumadas de todos los códigos de barras a lo largo del tiempo (arriba en el medio) y lecturas asignadas por código de barras (arriba a la derecha, coloreadas por código de barras). Los paneles inferiores muestran filas de gráficos por código de barras. De izquierda a derecha: la profundidad de la cobertura de las lecturas mapeadas por posición de nucleótido en el genoma de referencia índice (izquierda), la distribución de longitud de las lecturas mapeadas (centro) y la proporción de posiciones de nucleótidos en el genoma de referencia índice que han obtenido una cobertura de 10x, 100x y 1.000x de lecturas mapeadas a lo largo del tiempo (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Un ejemplo de cobertura de lectura en todo el genoma de una muestra de virus de la rabia de Filipinas secuenciada utilizando el protocolo. Se muestra la cobertura de lectura en cada posición de nucleótido en el genoma, junto con la posición de los amplicones superpuestos (1-41) utilizados para generar la biblioteca. Los picos en la profundidad de cobertura corresponden a áreas de superposición de amplicones. Los amplicones con una profundidad de cobertura baja corresponden a áreas de superposición de amplicones. Los amplicones con una profundidad de cobertura baja se resaltan en rojo, lo que indica regiones problemáticas que pueden requerir optimización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Condiciones de la mezcla maestra y del termociclador para la preparación del ADNc. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Condiciones de la mezcla maestra y del termociclador para PCR multiplex. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Condiciones de la mezcla maestra y del termociclador para la reacción de preparación final. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Condiciones de la mezcla maestra y del termociclador para el código de barras. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Mezcla maestra de ligadura del adaptador y dilución final de la biblioteca para la secuenciación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 6: Número de secuencias del genoma completo del virus de la rabia generadas y el tipo de muestras utilizadas en diferentes países que utilizan el flujo de trabajo de muestra-secuencia-interpretación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 7: Asignaciones de clados mayores y menores de RABV-GLUE y asignaciones de linaje de MADDOG para secuencias generadas utilizando el flujo de trabajo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Diseño y optimización del esquema de cebadores, y análisis de profundidad de lectura de amplicones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Configuración computacional Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Hoja de trabajo del protocolo RABV WGS Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Brunker et al.61 desarrollaron un flujo de trabajo accesible de secuenciación del genoma completo basado en nanoporos, utilizando recursos de la red ARTIC46. Aquí, presentamos un flujo de trabajo actualizado, con pasos completos de muestra, secuencia e interpretación. El flujo de trabajo detalla la preparación de muestras de tejido cerebral para la secuenciación del genoma completo, presenta una línea bioinformática para procesar lecturas y generar secuencias de consenso, y destaca dos herramientas específicas de la rabia para automatizar la asignación de linajes y determinar el contexto filogenético. El flujo de trabajo actualizado también proporciona instrucciones completas para la configuración de espacios de trabajo computacionales y de laboratorio adecuados, con consideraciones para la implementación en diferentes contextos (incluidos los entornos de bajos recursos). Hemos demostrado la implementación exitosa del flujo de trabajo tanto en entornos académicos como de institutos de investigación en cuatro países de ingresos bajos y medianos endémicos de RABV con una capacidad de vigilancia genómica nula o limitada. El flujo de trabajo ha demostrado ser resistente a la aplicación en diversos entornos y comprensible para usuarios con diferentes conocimientos.

Este flujo de trabajo para la secuenciación de RABV es el protocolo más completo disponible públicamente (que cubre los pasos de muestra, secuencia e interpretación) y está específicamente adaptado para reducir los costos de inicio y funcionamiento. El tiempo y el costo necesarios para la preparación y secuenciación de bibliotecas con tecnología de nanoporos se reducen considerablemente en relación con otras plataformas, como Illumina61, y los continuos desarrollos tecnológicos están mejorando la calidad y la precisión de la secuencia para que sean comparables con Illumina62.

Este protocolo está diseñado para ser resistente en diversos contextos de bajos recursos. Al consultar la guía de solución de problemas y modificaciones proporcionada junto con el protocolo principal, los usuarios pueden adaptar el flujo de trabajo a sus necesidades. La adición de herramientas bioinformáticas fáciles de usar al flujo de trabajo constituye un avance importante para el protocolo original, proporcionando métodos rápidos y estandarizados que pueden ser aplicados por usuarios con una experiencia bioinformática previa mínima para interpretar datos de secuencia en contextos locales. La capacidad de hacer esto in situ a menudo está limitada por la necesidad de tener habilidades específicas de programación y filogenética, que requieren una inversión intensiva y a largo plazo en la formación de habilidades. Si bien este conjunto de habilidades es importante para interpretar a fondo los datos de secuencia, las herramientas de interpretación básicas y accesibles son igualmente deseables para capacitar a los "campeones de la secuenciación" locales, cuya experiencia principal puede estar basada en el laboratorio húmedo, lo que les permite interpretar y apropiarse de sus datos.

Dado que el protocolo se ha llevado a cabo durante varios años en varios países, ahora podemos proporcionar orientación sobre cómo optimizar los esquemas de cebadores de multiplex para mejorar la cobertura y hacer frente a la diversidad acumulada. También se han realizado esfuerzos para ayudar a los usuarios a mejorar la eficacia en función de los costos o para facilitar la adquisición en una región determinada, lo que suele ser un desafío para la sostenibilidad de los enfoques moleculares63. Por ejemplo, en África (Tanzania, Kenia y Nigeria), optamos por una mezcla maestra de ligasa roma/TA en la etapa de ligadura del adaptador, que estaba más disponible en los proveedores locales y era una alternativa más barata a otros reactivos de ligadura.

Según la experiencia, hay varias formas de reducir el coste por muestra y por tirada. Reducir el número de muestras por ciclo (por ejemplo, de 24 a 12 muestras) puede prolongar la vida útil de las celdas de flujo en varios ciclos, mientras que aumentar el número de muestras por ciclo maximiza el tiempo y los reactivos. En nuestras manos, pudimos lavar y reutilizar celdas de flujo para una de cada tres secuenciaciones, lo que permitió secuenciar 55 muestras adicionales. Lavar la celda de flujo inmediatamente después de su uso, o si no es posible, eliminar el fluido residual del canal de desechos después de cada ejecución, parecía preservar el número de poros disponibles para una segunda ejecución. Teniendo en cuenta el número inicial de poros disponibles en una celda de flujo, también se puede optimizar una ejecución para planificar cuántas muestras se ejecutarán en una celda de flujo en particular.

Aunque el flujo de trabajo pretende ser lo más completo posible, con la adición de orientación detallada y recursos señalizados, el procedimiento sigue siendo complejo y puede ser desalentador para un nuevo usuario. Se anima al usuario a buscar formación y apoyo en persona, idealmente a nivel local, o alternativamente a través de colaboradores externos. En Filipinas, por ejemplo, un proyecto sobre el desarrollo de capacidades dentro de los laboratorios regionales para la vigilancia genómica del SARS-CoV-2 mediante ONT ha desarrollado competencias básicas entre los diagnosticadores de atención de la salud que son fácilmente transferibles a la secuenciación del RABV. Los pasos importantes, como la limpieza del cordón SPRI, pueden ser difíciles de dominar sin capacitación práctica, y una limpieza ineficaz puede dañar la celda de flujo y comprometer el funcionamiento. La contaminación de las muestras es siempre una preocupación importante cuando los amplicones se procesan en el laboratorio y puede ser difícil de eliminar. En particular, la contaminación cruzada entre muestras es extremadamente difícil de detectar durante la bioinformática posterior a la ejecución. Las buenas técnicas y prácticas de laboratorio, como mantener limpias las superficies de trabajo, separar las áreas pre y post PCR e incorporar controles negativos, son imprescindibles para garantizar el control de calidad. El rápido ritmo de desarrollo de la secuenciación de nanoporos es tanto una ventaja como una desventaja para la vigilancia genómica rutinaria del RABV. Las continuas mejoras en la precisión, la accesibilidad y el repertorio de protocolos de los nanoporos amplían y mejoran el alcance de su aplicación. Sin embargo, los mismos desarrollos dificultan el mantenimiento de los procedimientos operativos estándar y las tuberías bioinformáticas. En este protocolo, proporcionamos un documento que ayuda a la transición de los kits de preparación de bibliotecas de nanoporos más antiguos a los actuales (Tabla de materiales).

Un obstáculo común para la secuenciación en los países de ingresos bajos y medianos es la accesibilidad, que incluye no solo el costo, sino también la capacidad de adquirir consumibles de manera oportuna (en particular, los reactivos de secuenciación, que son relativamente nuevos para los equipos de adquisiciones y los proveedores) y los recursos computacionales, así como simplemente tener acceso a energía estable e Internet. El uso de la tecnología de secuenciación de nanoporos portátil como base de este flujo de trabajo ayuda con muchos de estos problemas de accesibilidad, y hemos demostrado el uso de nuestro protocolo en una variedad de entornos, realizando el protocolo completo y el análisis en el país. Es cierto que la adquisición de equipos y consumibles de secuenciación de manera oportuna sigue siendo un desafío y, en muchos casos, nos vimos obligados a transportar o enviar reactivos desde el Reino Unido. Sin embargo, en algunas zonas, pudimos depender totalmente de las rutas de suministro locales de reactivos, beneficiándonos de la inversión en secuenciación del SARS-CoV-2 (por ejemplo, Filipinas) que ha agilizado los procesos de adquisición y ha comenzado a normalizar la aplicación de la genómica de patógenos.

La necesidad de una conexión a Internet estable se minimiza con instalaciones únicas; por ejemplo, los repositorios de GitHub, la descarga de software y la secuenciación de nanoporos en sí solo requieren acceso a Internet para iniciar la ejecución (no en todo momento) o se pueden realizar completamente fuera de línea con el acuerdo de la empresa. Si los datos móviles están disponibles, se puede usar un teléfono como punto de acceso a la computadora portátil para comenzar la ejecución de secuenciación, antes de desconectarse durante la ejecución. Cuando se procesan muestras de forma rutinaria, los requisitos de almacenamiento de datos pueden crecer rápidamente y, lo ideal sería que los datos se almacenaran en un servidor. De lo contrario, los discos duros de unidades de estado sólido (SSD) son relativamente baratos de obtener.

Si bien reconocemos que todavía existen barreras para la vigilancia genómica en los países de ingresos bajos y medianos, el aumento de la inversión en el desarrollo de la accesibilidad y los conocimientos especializados en genómica (por ejemplo, la Iniciativa de Genómica de Patógenos de África [PGI de África])64 sugiere que esta situación mejorará. La vigilancia genómica es fundamental para la preparación ante pandemias6, y la capacidad puede establecerse mediante la rutinización de la vigilancia genómica de patógenos endémicos como el RABV. Las disparidades mundiales en las capacidades de secuenciación puestas de manifiesto durante la pandemia de SARS-CoV-2 deberían ser un motor de cambio catalizador para abordar estas desigualdades estructurales.

Este flujo de trabajo de muestra, secuencia e interpretación para el RABV, que incluye herramientas bioinformáticas accesibles, tiene el potencial de utilizarse para guiar las medidas de control dirigidas al objetivo de cero muertes humanas por rabia transmitida por perros para 2030 y, en última instancia, para la eliminación de las variantes del RABV. En combinación con los metadatos relevantes, los datos genómicos generados a partir de este protocolo facilitan la caracterización rápida del RABV durante las investigaciones de brotes y en la identificación de linajes circulantes en un país o región60,61,65. Ilustramos nuestra cartera de productos principalmente con ejemplos de la rabia transmitida por perros; sin embargo, el flujo de trabajo es directamente aplicable a la rabia de la fauna silvestre. Esta transferibilidad y bajo costo minimizan los desafíos para hacer que la secuenciación de rutina esté fácilmente disponible, no solo para la rabia sino también para otros patógenos46,66,67, para mejorar el manejo y control de la enfermedad.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo de Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], la financiación de Newton del Consejo de Investigación Médica [MR/R025649/1] y el Departamento de Ciencia y Tecnología de Filipinas (DOST), el esfuerzo mundial de investigación e innovación del Reino Unido sobre la COVID-19 [MR/V035444/1], el Fondo de Apoyo Estratégico Institucional de la Universidad de Glasgow [204820], el Premio al Nuevo Investigador del Consejo de Investigación Médica (KB) [MR/X002047/1], y el Fondo para el Desarrollo de la Asociación Internacional, una beca DOST British Council-Filipinas (CB), una beca GemVi del Instituto Nacional de Investigación en Salud [17/63/82] y becas de la Universidad de Glasgow del MVLS DTP (KC) [125638-06], el EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] y el Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. Agradecemos a los colegas y colaboradores que han apoyado este trabajo: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana y Anna Czupryna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brand name
Software
Sequencing software
(MinKnow)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/downloads
Bioinformatics tool kit
(Guppy)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
Equipment
Thermal cycler
(miniPCR™ mini16 thermal cycler)		 Cambio MP-QP-1016-01
Homogenizer
(Precellys Evolution Touch Homogenizer)		 Bertin Instruments EQ02520-300
Cold Racks (0.2-0.5mL)
(PCR Mini-cooler with transparent lid)		 BRAND  781260
Pipettor
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) Gilson  SKU: FA10030
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) Gilson  SKU: FA10024
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) Gilson  SKU: FA10020
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) Gilson  SKU: FA10025
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) Gilson  SKU: FA10021
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) Gilson  SKU: FA10026
Fluorometer
(Qubit  4 Fluorometer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q33238
Laptop 
(Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU])
Microcentrifuge
(Refrigerated centrifuge)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 75004081
Vortex mixer
(Basic vortex mixer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 88882011
Magnetic rack
(DynaMag -2 Magnet)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 12321D
Sequencing device
(MinION)		 Oxford Nanopore Technologies MinION Mk1B
RNA Extraction 
RNA extraction kit
(Qiagen RNEasy Mini Kit 250)		 Qiagen 74106
RNA stabilizing reagents 
(RNA later)  Invitrogen AM7020
(DNA/RNA Shield) Zymo Research R1100-50
PCR
Nuclease-free Water
(Nuclease-free Water [not  DEPC-treated])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific AM9937
Master mix for first strand cDNA synthesis
(LunaScript RT SuperMix Kit)		 New England Biolabs E3010S
DNA amplification master mix
(Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])		 New England Biolabs M0494L
Primer (Scheme)
(Custom DNA oligos)		 Invitrogen
SPRI Bead Clean-up
SPRI beads
(Aline Biosciences PCR Clean DX )		 Cambio AL-AC1003-50
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] Merck 818760
Short Fragment buffer
(SFB expansion pack)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-SFB001
DNA Quantification
DNA quantification kit
(Qubit® dsDNA HS Assay Kit)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32854
DNA quantification assay tubes
(Qubit™ Assay Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32856
End Prep and barcoding
(Qubit™ Assay Tubes)
End Prep master mix
(NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)		 New England Biolabs E7546L
Barcoding kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9 
(Native Barcoding Expansion 1-12) EXP-NBD104 
(Native Barcoding Expansion 13-24)  EXP-NBD114 
(Native Barcoding Expansion 96) EXP-NBD196
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
(not compatible)  (not compatible) 
(Native Barcoding Kit 24 V14) SQK-NBD114.24
(Native Barcoding Kit 96 V14) SQK-NBD114.96
Ligation mastermix
(Blunt/TA Ligase Master Mix)		 New England Biolabs M0367S
Adapter Ligation
Adapter ligation master mix
(NEBNext  Quick Ligation Module) New England Biolabs E6056S  
(NEBNext Ultra II Ligation Module)  New England Biolabs E7595S
(Blunt/TA Ligase Master Mix) New England Biolabs M0367S
Adapter mix
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-AMII001
(Adapter Mix II [AMII])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-NBA114
(Native adapter [NA])
Sequencing 
Flowcell priming kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-FLP002
(Flush Buffer [FB])
(Flush Tether [FT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-FLP004
(Flow Cell Flush [FCF])
(Flow Cell Tether [FCT])
Ligation Sequencing Kit 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
SQK-LSK109
Adapter Mix
(Adapter Mix [AMX])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SQB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LB])
Sequencing Tether
(Sequencing Tether [SQT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
SQK-LSK114
Adapter Mix
(Ligation Adapter [LA])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LIB])
Sequencing Tether
(Flow Cell Tether [FCT])
Library solution
(Library solution [LIS])
Flush buffer
(Flow Cell Flush [FCF])
Flow Cell 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
FLO-MIN106D
(Flow Cell  [R9.4.1])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
FLO-MIN114
(Flow Cell  [R10.4.1])
Flow Cell wash 
Flowcell wash kit
(Flow cell wash kit)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-WSH004
Consummables 
Surface decontaminant 
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7010PK
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7002PK
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap
(PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner])		 Greiner 608281
PCR Tube 0.2ml
(PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner])		 Greiner 671201
1000µL Filter Tips (500)
(Stacked 1000µL Filter Tips [500])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11977724
100µL Filter Tips (1000) Thermofisher scientific/Fisher scientific 11947724
10µL Filter Tips (1000)
(Stacked 100µL Filter Tips [1000])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11907724
Reinforced tubes  tubes (2ml)  with screw caps and o-rings
(Fisherbrand™ Bulk tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 15545809
Microcentrifuge tube (1.5ml)
(1.5 ml Eppendorf Tubes [500])		 Eppendorf 1229888
DNA LoBind Tubes  (1.5ml)
(DNA LoBind Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 10051232
Cryobabies labels
Gloves (S/M/L)
Paper towel

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References

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Secuenciación del genoma completo caracterización rápida virus de la rabia tecnología de nanoporos datos genómicos seguimiento de la transmisión propagación geográfica enfermedades infecciosas países de ingresos bajos y medianos rabia mediada por perros murciélagos vampiros salud pública preocupaciones económicas flujo de trabajo de muestra secuencia e interpretación tecnología de nanoporos recolección de muestras diagnóstico de rabia flujo de trabajo de secuenciación del genoma completo diseño y optimización de cebadores reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) secuenciación Preparación de bibliotecas llamadas de bases en vivo y fuera de línea designación de linaje genético análisis filogenético implementación de flujos de trabajo validación de tuberías controles negativos herramientas genómicas (GLUE MADDOG) filogenias regionales y globales
Secuenciación del genoma completo para la caracterización rápida del virus de la rabia mediante tecnología de nanoporos
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Bautista, C., Jaswant, G., French,… More

Bautista, C., Jaswant, G., French, H., Campbell, K., Durrant, R., Gifford, R., Kia, G. S. N., Ogoti, B., Hampson, K., Brunker, K. Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology. J. Vis. Exp. (198), e65414, doi:10.3791/65414 (2023).

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