Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Helgenomsekvensering för snabb karakterisering av rabiesvirus med hjälp av nanoporteknik

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65414
Automatic Translation
1,2, 1,3,4,5, 1,6, 1, 1, 1,6, 7,8, 3,9, 1, 1,6
1School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, 2Research Institute for Tropical Medicine, 3University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, 4Tanzania Industrial Research Development Organization, 5Ifakara Health Institute, 6MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 7Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, 8African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, 9University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

Summary

Här presenterar vi ett snabbt och kostnadseffektivt arbetsflöde för att karakterisera rabiesvirus (RABV) genom med hjälp av nanoporteknik. Arbetsflödet är avsett att stödja genomikinformerad övervakning på lokal nivå, genom att ge information om cirkulerande RABV-linjer och deras placering inom regionala fylogenier för att vägleda rabieskontrollåtgärder.

Abstract

Genomdata kan användas för att spåra spridningen och den geografiska spridningen av infektionssjukdomar. Den sekvenseringskapacitet som krävs för genomisk övervakning är dock fortfarande begränsad i många låg- och medelinkomstländer, där hundmedierad rabies och/eller rabies som överförs av vilda djur som vampyrfladdermöss utgör stora folkhälsoproblem och ekonomiska problem. Vi presenterar här ett snabbt och prisvärt arbetsflöde från prov till sekvens till tolkning med hjälp av nanoporteknik. Protokoll för provtagning och diagnos av rabies beskrivs kortfattat, följt av detaljer om det optimerade arbetsflödet för helgenomsekvensering, inklusive primerdesign och optimering för multiplex polymeraskedjereaktion (PCR), en modifierad, billig sekvenseringsbiblioteksförberedelse, sekvensering med live och offline base calling, genetisk härstamningsbeteckning och fylogenetisk analys. Implementering av arbetsflödet demonstreras och kritiska steg lyfts fram för lokal distribution, såsom pipelinevalidering, primeroptimering, inkludering av negativa kontroller och användning av offentligt tillgängliga data och genomiska verktyg (GLUE, MADDOG) för klassificering och placering inom regionala och globala fylogenier. Handläggningstiden för arbetsflödet är 2–3 dagar och kostnaden varierar från 25 USD per prov för en körning med 96 prover till 80 USD per prov för en körning med 12 prov. Vår slutsats är att det är möjligt att inrätta genomisk övervakning av rabiesvirus i låg- och medelinkomstländer och kan stödja framsteg mot det globala målet om noll dödsfall orsakade av rabies hos människor till 2030, samt förbättrad övervakning av spridning av rabies hos vilda djur. Dessutom kan plattformen anpassas för andra patogener, vilket bidrar till att bygga upp en mångsidig genomisk kapacitet som bidrar till epidemi- och pandemiberedskap.

Introduction

Rabiesvirus (RABV) är ett lyssavirus i familjen Rhabdoviridae som orsakar en dödlig neurologisk sjukdomhos däggdjur. Även om rabies kan förebyggas till 100 % genom vaccination, är det fortfarande ett stort folkhälsoproblem och ekonomiskt problem i endemiska länder. Av de 60 000 dödsfall i rabies som beräknas inträffa varje år är över 95 % i Afrika och Asien där hundar är den primära reservoaren. Däremot har hundvaccinering lett till eliminering av hundmedierad rabies i Västeuropa, Nordamerika och stora delar av Latinamerika. I dessa regioner är reservoarer av rabies nu begränsade till vilda djur, såsom fladdermöss, tvättbjörnar, skunkar och vildahunddjur. Över hela Latinamerika är den vanliga vampyrfladdermusen en problematisk källa till rabies på grund av regelbunden överföring från fladdermöss till både människor och boskap under nattlig blodmatning4. Den årliga globala ekonomiska effekten av rabies uppskattas till 8,6 miljarder dollar, varav boskapsförluster står för 6 %5.

Sekvensdata från virala patogener i kombination med metadata om tidpunkt och källa för infektioner kan ge robusta epidemiologiska insikter6. För RABV har sekvensering använts för att undersöka ursprunget till utbrott7,8, identifiera värdassociationer med vilda djur eller tamhundar 8,9,10,11,12 och spåra källor till fall hos människor 13,14. Utbrottsundersökningar med fylogenetisk analys har visat att rabies uppstod i den tidigare rabiesfria provinsen Bali i Indonesien genom en enda introduktion från de närliggande endemiska områdena Kalimantan eller Sulawesi15. Samtidigt, i Filippinerna, har ett utbrott på ön Tablas i Romblonprovinsen visat sig ha införts från huvudön Luzon16. Virala genomiska data har också använts för att bättre förstå den överföringsdynamik som krävs för att rikta kontrollåtgärder geografiskt. Till exempel illustrerar genomisk karakterisering av RABV den geografiska klustringen av kladerna 17,18,19, samcirkulationen av linjer 20,21,22, humanmedierad viral rörelse 17,23,24 och metapopulationsdynamiken 25,26.

Sjukdomsövervakning är en viktig funktion av genomisk övervakning som har förbättrats i och med den globala ökningen av sekvenseringskapaciteten som svar på SARS-CoV-2-pandemin. Genomisk övervakning har bidragit till spårning i realtid av SARS-COV-2-varianter av särskild betydelse27,28 och tillhörande motåtgärder6. Framsteg inom tillgänglig sekvenseringsteknik, såsom nanoporteknik, har lett till förbättrade och mer prisvärda protokoll för snabb sekvensering av både humana 29,30,31,32 ochdjur 33,34,35 patogener. I många rabiesendemiska länder finns det dock fortfarande hinder för att operationalisera genomisk övervakning av patogener, vilket framgår av globala skillnader i SARS-CoV-2-sekvenseringskapacitet36. Begränsningar i laboratorieinfrastruktur, leveranskedjor och teknisk kunskap gör etablering och rutinisering av genomisk övervakning utmanande. I den här artikeln visar vi hur ett optimerat, snabbt och prisvärt arbetsflöde för helgenomsekvensering kan användas för RABV-övervakning i resursbegränsade miljöer.

Protocol

Studien godkändes av Medical Research Coordinating Committee of the National Institute for Medical Research (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), ministeriet för regional förvaltning och lokalt självstyre (AB.81/288/01) och Ifakara Health Institute Institutional Review Board (IHI/IRB/No:22-2014) i Tanzania. University of Nairobi Institute of Tropical and Infectious Diseases (P947/11/2019) och Kenya Medical Research Institute (KEMRI-SERU; protokoll nr 3268) i Kenya; och Research Institute for Tropical Medicine (RITM), Department of Health (2019-023) i Filippinerna. Sekvensering av prover med ursprung i Nigeria utfördes på arkiverat diagnostiskt material som samlats in som en del av den nationella övervakningen.

OBS: Avsnitt 1-4 är förutsättningar. Avsnitt 5-16 beskriver arbetsflödet för prov-till-sekvens-till-tolkning för RABV-nanoporsekvensering (figur 1). För efterföljande steg i protokollet som kräver pulscentrifugering, centrifugera vid 10-15 000 x g i 5-15 s.

1. Beräkningsmiljö för sekvensering och dataanalys

  1. Öppna webbplatsen för Oxford Nanopore Technology (ONT)37 och skapa ett konto för att få tillgång till nanoporspecifika resurser.
    1. Logga in och installera programvaran för ONT-sekvensering och basecalling38.
  2. Öppna GitHub39 och skapa ett konto.
    1. Gå till arkiven artic-rabv40 och MADDOG41 och följ installationsanvisningarna.

2. Designa eller uppdatera multiplexprimerschemat

OBS: Befintliga RABV-scheman finns tillgängliga i artic-rabv-databasen40. När man inriktar sig på ett nytt geografiskt område bör ett nytt system utformas, eller ett befintligt system ändras för att införliva ytterligare mångfald.

  1. Välj en genomreferensuppsättning för att representera mångfalden i studieområdet; Detta är vanligtvis en uppsättning offentligt tillgängliga sekvenser (t.ex. från NCBI GenBank) eller preliminära interna data. Följ steg 2.1.1 för att använda RABV-GLUE42, en RABV-sekvensdataresurs, för att filtrera och ladda ner NCBI-sekvenser och tillhörande metadata.
    OBS: Välj referenssekvenser med fullständiga genom (dvs. utan luckor och maskerade baser). Vi rekommenderar att du väljer upp till 10 sekvenser som referensuppsättning för primerdesign. Om tillgängliga sekvensdata är ofullständiga eller inte representativa för studieområdet, se råd43,44,45 i tilläggsfil 1.
    1. Navigera till sidan NCBI RABV-sekvenser per klad från rullgardinsmenyn Sekvensdata i RABV-GLUE. Klicka på länken Rabies Virus (RABV) för att få tillgång till alla tillgängliga data eller välj en särskild klad av intresse. Använd filteralternativet för att lägga till filter som passar de önskade kriterierna (t.ex. ursprungsland, sekvenslängd). Ladda ner sekvenser och metadata.
  2. Generera ett primerschema för multiplex polymeraskedjereaktion (PCR) enligt instruktionerna i Primal Scheme46. Ett 400 bp-schema med en överlappning på 50 bp rekommenderas för att sekvensera prover av låg kvalitet. Ladda ner och spara alla utdata (redigera inte fil- eller primernamnen).
    ANM.: Schemat kommer att indexeras till den första sekvensen i indatafästet, hädanefter kallad "indexreferens" (figur 2). Se tilläggsfil 1 för alternativ för att optimera primerprestanda.

3. Konfigurera RAMPART- och ARTIC-bioinformatikpipelines

  1. Se Supplementary File 2 för att konfigurera en katalogstruktur för att hantera in-/utdatafilerna för RAMPART och ARTIC-bioinformatikpipelinen.

4. Biosäkerhet och laboratorieupplägg

  1. Hantera potentiellt rabiespositiva prover under förhållanden med biosäkerhetsnivå (BSL) 2 eller 3.
  2. Se till att laboratoriepersonalen har slutfört rabiesvaccinationen före exponering och genomgår övervakning av immunitet i enlighet med Världshälsoorganisationens (WHO) rekommendationer3.
  3. Se till att det finns särskilda standardrutiner och riskbedömningar, i enlighet med nationella eller internationella riktlinjer, för laboratoriet.
  4. Nödvändig laboratorieinstallation: Minimera kontaminering genom att upprätthålla fysisk separation mellan områden före och efter PCR. I laboratorier med begränsat utrymme eller laboratoriemiljöer på fältet, använd bärbara handskfack eller provisoriska labbstationer för att minimera kontaminering.
  5. I detta protokoll ska det säkerställas att separata områden avses:
    1. Provextraktion: Sätt upp ett BSL2/3 skåp/handskfack för att hantera biologiskt material och utföra inaktivering och RNA-extraktion.
    2. Mallområde: Ställ in ett BSL1-skåp/handskfack för tillsats av mall (RNA/cDNA) till den förberedda reaktionsmastermixen.
    3. Huvudblandningsområde: Ställ in ett särskilt rent område (BSL1-skåp/handskfack) för beredning av reagensmasterblandningar. Det bör inte finnas någon mall i det här området.
    4. Post-PCR-område: Skapa ett separat område för arbete med amplikoner och förberedelse av sekvenseringsbibliotek.
      OBS: Alla områden bör rengöras med ett ytdekontaminerande och ultraviolett (UV)-steriliserat före och efter användning.

5. Insamling och diagnos av fältprover

OBS: Samples måste samlas in av utbildad och immuniserad personal som bär personlig skyddsutrustning och följer de refererade standardprocedurerna47,48,49.

  1. Samla in provet via foramen magnum (dvs. den occipitala vägen), som beskrivs i detalj i Mauti et al.50.
  2. Diagnostisera rabies i fält med snabba diagnostiska tester och bekräfta i laboratoriet med hjälp av rekommenderade förfaranden47, t.ex. direkt fluorescerande antikroppstest (DFA), direkt immunohistokemiskt snabbtest (DRIT)51,52 eller omvänd transkription i realtid (RT)-PCR 53.
  3. Använd bekräftade positiva hjärnprover för RNA-extraktion eller förvara i frys vid -20 °C i 2-3 månader eller -80 °C under längre perioder. Bevara RNA för lagring och transport med hjälp av ett lämpligt DNA/RNA-stabiliseringsmedium.

6. Provberedning och RNA-extraktion (3 h)

OBS: Använd ett spinnkolonnbaserat viralt RNA-extraktionskit som är lämpligt för provtypen.

  1. Förbered två keramiska pärlrör genom att fylla ett 2 ml PCR-rör med cirka 200 μL rör fullt med 1.4 mm keramiska pärlor och märk röret.
  2. Tillsätt den rekommenderade volymen lysbuffert som finns i RNA-extraktionssatsen till det märkta PCR-röret.
  3. Ta cirka 3 mm kub från hjärnprovet som bekräftats med rabiesinfektion med hjälp av en träapplikator och lägg i ett märkt rör med prov-ID och 100 μL nukleasfritt vatten i röret märkt negativ kontroll.
    OBS: Använd sluten rörpärlbaserad homogenisering för att begränsa sample exponering. Om det inte är möjligt, använd andra lämpliga mekaniska störare (t.ex. rotorbaserade) eller en manuell mikromortelstöt. Dessa kan dock vara mindre effektiva än att slå pärlor på hårda ytor för att störa vävnad (vävnadsprover kan härda i vissa lagringsmedier).
  4. Stör hjärnvävnaden manuellt med hjälp av en applikatorpinne av trä och virvla sedan med maximal hastighet tills fullständig vävnadshomogenisering uppnås.
  5. Centrifugera lysatet enligt tillverkarens anvisningar och använd en pipett för att överföra supernatanten till ett nytt märkt mikrocentrifugrör. Använd endast denna supernatant i de efterföljande stegen.
  6. Följ RNA-extraktionssatsens spinnkolonninstruktioner för att få renat RNA.
  7. Inkludera en negativ extraktionskontroll (NEC) här och ta hela vägen fram till sekvenseringssteget.

7. cDNA-förberedelse (20 min)

  1. I mastermixområdet bereds en mastermix för första strängens cDNA-syntes i enlighet med antalet prover och kontroller som ska bearbetas (med en överskottsvolym på 10 % för att säkerställa adekvat reagens; (se tabell 1). En kontroll utan mall (NTC) bör inkluderas i det här skedet.
  2. Märk 0,2 ml PCR-remsrör och alikvot 5 μL av masterblandningen i rören.
  3. Ta de förberedda rören till mallområdet. Tillsätt 5 μL RNA i varje märkt rör, inklusive NEC. Tillsätt 5 μl nukleasfritt vatten (NFW) till NTC.
  4. Inkubera i en termocykler enligt de betingelser som anges i tabell 1.
    OBS: Valfri pauspunkt: cDNA kan förvaras vid -20 °C i upp till 1 månad vid behov, men att gå vidare till PCR är att föredra.

8. Grundberedning av poolen (1 h)

OBS: Detta steg är endast nödvändigt om du gör nya stammar från enskilda primers, varefter förberedda stamlösningar kan användas.

  1. Förbered en primerpool med 100 μM buljong i masterblandningsområdet.
  2. Återsuspendera de frystorkade primers i 1x tris-EDTA (TE) buffert eller NFW vid en koncentration av 100 μM vardera. Virvla ordentligt och snurra ner.
    OBS: I följande steg separeras enskilda primers i två primerpooler - udda numrerade (benämnda Pool A) och jämna numrerade (benämnda Pool B) - för att undvika interaktioner mellan primers som flankerar amplikonöverlappningar. Dessa pooler av primers genererar överlappande 400 bp-amplikoner som spänner över målgenomet.
  3. Ordna alla udda numrerade primers i ett rörställ. Generera ett primerpoollager genom att tillsätta 5 μL från varje primer till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör märkt "primer scheme name - Pool A (100 μM)".
  4. Upprepa processen för alla jämnt numrerade primers och märk med "primer scheme name - Pool B (100 μM)".
  5. Späd varje primerpool 1:10 i vatten av molekylär kvalitet för att generera 10 μM primermaterial.
    OBS: Gör flera alikvoter av 10 μM primerutspädningar och frys dem i händelse av nedbrytning eller kontaminering.

9. Multiplex PCR (5 timmar)

  1. Förbered två PCR-masterblandningar, en för varje primerpool i masterblandningsområdet.
    1. Använd en slutlig koncentration på 0,015 μM per primer. Beräkna erforderlig primerpoolvolym för PCR-reaktionen (tabell 2) med hjälp av följande formel:
      Primerpoolvolym = antal primers x reaktionsvolym x 0,015/koncentration (μM) primer stock
  2. Alikvot 10 μl vardera av pool A-masterblandningen och pool B-masterblandningen till märkta PCR-remsrör i mallområdet. För varje prov, tillsätt 2,5 μL cDNA (från steg 3) till var och en av de motsvarande märkta primer Pool A- och B-reaktionerna. Överskott av cDNA kan lagras vid -20 °C.
  3. Blanda genom att försiktigt snärta och pulscentrifugera.
  4. Inkubera proverna med de betingelser som anges i tabell 2 på en PCR-maskin.
    OBS: Programmet innehåller inget specifikt förlängningssteg på grund av den långa glödgningstiden på 5 min (krävs på grund av det stora antalet primers) och den korta längden på amplikonerna (400 bp) som är tillräcklig för förlängningen.

10. PCR-sanering och kvantifiering (3,5 timmar)

  1. Utför allt arbete från och med nu i området efter PCR.
  2. Alikvot fastfas-reversibel immobilisering (SPRI) pärlor i mikrocentrifugrör från huvudflaskan. Förvaras vid 4 °C.
  3. Värm en alikvot av en SPRI-sträng till rumstemperatur (RT; ~20 °C) och virvla ordentligt tills pärlorna är helt återsuspenderade i lösningen.
  4. I 1,5 ml rör, kombinera primer Pool A och primer Pool B PCR-produkter för varje prov. Tillsätt vid behov vatten för att få volymen till 25 μL.
  5. Tillsätt 25 μL SPRI till varje prov (1:1 pärla:provförhållande). Blanda genom att pipettera upp och ner eller knacka försiktigt på röret.
  6. Inkubera vid RT i 10 minuter, vänd eller vänd rören då och då.
  7. Placera på ett magnetställ tills pärlorna och lösningen har separerats helt. Ta bort och kassera supernatanten, var noga med att inte störa pärlkulan.
  8. Tvätta två gånger med 80 % etanol (uppvärmd till RT).
    1. Tillsätt 200 μL etanol till pelleten. Vänta i 30 sekunder för att säkerställa att pärlorna tvättas ordentligt.
    2. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten och försök att inte röra pärlpelleten.
    3. Upprepa steg 10.8.1-10.8.2 för att tvätta pelleten en andra gång.
  9. Ta bort alla spår av etanol med en 10 μL spets. Lufttorka tills spåretanol har avdunstat (med små pärlor sker detta snabbt, ~30 s); När detta händer ska pelleten gå från blank till matt. Var noga med att inte torka för mycket (om pelleten spricker är den för torr), eftersom detta kommer att påverka DNA-återhämtningen.
  10. Återsuspendera kulorna i 15 μL NFW och inkubera vid RT (off magnetic rack) i 10 min.
  11. Återgå till magnetstället och överför supernatanten (rengjord produkt) till ett nytt 1,5 ml rör.
  12. Bered en utspädning på 1:10 av varje prov i ett separat rör (2 μl produkt + 18 μl NFW).
    OBS: Var mycket försiktig i detta skede för att undvika korskontaminering. Ha bara ett ampliconrör öppet åt gången. Alikvot 18 μl vatten i rören först (i ett rent masterblandningsområde).
  13. Mät DNA-koncentrationen i varje utspätt prov med hjälp av en mycket känslig och specifik fluorometer, enligt beskrivningen i protocols.io54,55.

11. Normalisering (30 min)

  1. Använd normaliseringsmallen (tilläggsfil 3) och DNA-koncentrationen (ng/μL) för varje prov för att beräkna volymen av utspädd (eller snygg) sample som krävs för 200 fmol av varje sample i en total volym av 5 μL.
  2. Märk nya PCR-rör och lägg till beräknade volymer av NFW och sample för att få normaliserat DNA.
  3. Använd den beräknade volymen för outspädda (rena) prover om det krävs mer än 5 μl av det utspädda provet för att erhålla 200 fmol.
    OBS: Valfri pauspunkt: Vid denna tidpunkt kan den rengjorda PCR-produkten förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka eller placeras vid -20 °C för längre förvaring vid behov.

12. End-prep och streckkodning (1,5 h)

OBS: Nästa steg förutsätter användning av specifika reagenser från nanoporspecifika streckkods- och ligeringssekvenseringssatser (se materialtabell för detaljer). Protokollet kan överföras mellan olika kemiversioner, men användare bör vara noga med att använda kompatibla kit, enligt tillverkarens instruktioner.

  1. Ändreparation och dA-tailing
    1. Ställ in den slutliga förberedelsereaktionen för varje prov som nämns i tabell 3. Förbered en mastermix enligt antalet prover (plus 10 % överskott). Var försiktig när du pipetterar eftersom reagenserna är trögflytande.
    2. Tillsätt 5 μL mastermix i varje rör med normaliserat DNA (5 μL). Den totala reaktionsblandningen bör vara 10 μL. Byt spetsarna varje gång och ha bara ett rör öppet åt gången.
    3. Inkubera i en termocykler under de förhållanden som anges i tabell 3.
  2. Streckkodning
    1. Fördela streckkoderna från streckkodssatsen till PCR-remsrör vid 1,25 μL/rör och registrera streckkoden som tilldelats varje prov.
    2. Tillsätt 0,75 μl av det färdigpreparerade provet till dess tilldelade streckkodsalikvot.
    3. Bered en ligeringsmasterblandning enligt antalet prover (plus 10 % överskott) (tabell 4).
    4. Tillsätt 8 μL ligeringsmastermix till det slutförberedda provet + streckkoder, vilket ger en total reaktion på 10 μL.
    5. Inkubera i en termocykler under de betingelser som anges i tabell 4.
  3. SPRI-pärlrensning och DNA-kvantifiering
    1. Tina kort fragmentbuffert (SFB) vid RT, blanda genom virvling, pulscentrifug och placera på is.
    2. Slå samman alla streckkodade prover i ett 1,5 ml lobind-mikrocentrifugrör. För att inte göra rengöringsvolymen för stor för att använda, poola 12-24 prover (10 μL/prov), upp till 48 prover (5 μL/prov) eller upp till 96 prover (2.5 μL/prov) från varje inbyggd streckkodsreaktion.
    3. Lägg till en 0,4x volym av SPRI i den streckkodade poolen. Blanda försiktigt (snärta eller pipettera) och inkubera vid RT i 5 min.
    4. Placera proverna på en magnet tills kulorna har pelleterat och supernatanten är helt klar (~2 min). Ta bort och kassera supernatanten. Var försiktig så att du inte stör pärlorna.
    5. Tvätta två gånger med 250 μL SFB.
      1. Ta bort röret från magneten och återsuspendera pelleten helt i 250 μL SFB. Inkubera i 30 s, pulscentrifugera och återgå till magneten.
      2. Ta bort supernatanten och kassera den.
    6. Upprepa steg 12.3.5 för att utföra en andra SFB-tvätt.
    7. Pulscentrifugera och ta bort eventuella kvarvarande SFB.
    8. Tillsätt 200 μL 80 % (RT) etanol för att bada pelleten. Ta bort och kassera etanolen, var noga med att inte störa pärlpelleten. Lufttorka i 30 s eller tills pelleten har tappat sin glans.
    9. Återsuspendera i 22 μl NFW vid RT i 10 min.
    10. Placera på magneten, låt sätta sig i ~2 min, ta sedan försiktigt bort lösningen och överför till ett rent 1.5 ml mikrocentrifugrör.
    11. Använd 1 μL för att erhålla DNA-koncentrationen, som beskrivits tidigare (steg 10.13).
      OBS: Valfri pauspunkt: Vid denna tidpunkt kan biblioteket förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka eller -20 °C för längre tids förvaring, men det är att föredra att fortsätta med adapterligering och sekvensering.

13. Sekvensering (max 48 timmar)

  1. Förbered datorn (se även avsnitten 1–4 om förutsättningar).
    1. Kontrollera att det finns tillräckligt med utrymme för att lagra ny data (minst 150 GB), att data från gamla körningar säkerhetskopieras/flyttas till en server innan du tar bort den och att den senaste versionen av MinKNOW är installerad.
  2. Ta ut den lagrade flödescellen ur kylen och låt den nå RT.
  3. Adapterligering (1 h)
    1. Pulscentrifugera adapterblandningen och ligaset och lägg på is.
    2. Upptiningselueringsbuffert (EB), SFB och ligeringsbuffert vid RT. Blanda genom virvning, pulscentrifug och lägg på is.
    3. Bered masterblandningen för adapterligering (tabell 5) och kombinera reagenser i den angivna ordningen i ett lågbindningsrör.
      OBS: Alternativ för masterblandningsreagenser för adapterligering (tabell 5) kan användas beroende på tillgänglighet på labbet. Se tilläggsfil 3 och materialförteckning för en lista över alternativ. Använd beräkning i kalkylbladet Supplementary File 3 för att få volymen av DNA-biblioteket motsvarande 200 fmol. Om mindre än 20 μl beräknas, tillsätt NFW för att bereda 20 μL.
    4. Blanda genom att försiktigt snärta och pulscentrifugera. Inkubera vid RT i 20 min.
      OBS: Under inkubationen, börja förbereda flödescellen (avsnitt 13.5).
  4. Städa upp med SPRI-pärlor (använd inte etanol som vid tidigare saneringar).
    1. Tillsätt en 0,4x volym SPRI-pärlor (RT) till proverna. Inkubera vid RT i 10 minuter, snärta försiktigt med jämna mellanrum för att underlätta blandningen.
    2. Placera på magneten tills pärlorna och lösningen har separerats helt (~5 min). Ta bort och kassera supernatanten; Var försiktig så att du inte stör pärlpelleten.
    3. Tvätta två gånger med 125 μL SFB.
    4. Återsuspendera pelleten helt med 125 μL SFB genom att blanda med en pipett. Låt ruva i 30 s.
    5. Pulscentrifug för att samla upp vätska vid rörbasen och placera på magneten. Ta bort supernatanten och kassera den.
    6. Upprepa steg 13.4.4-13.4.5 för att tvätta pelleten en andra gång.
    7. Pulscentrifugera och ta bort överskott av SFB.
    8. Blanda på nytt i 15 μl EB och inkubera i 10 minuter vid RT.
    9. Återgå till magneten i ~2 minuter och överför sedan försiktigt lösningen till ett rent 1.5 ml mikrocentrifugrör.
    10. Kvantifiera 1 μL av det eluerade biblioteket, som beskrivits tidigare i steg 10.13
      OBS: För bästa resultat, fortsätt direkt till MinION-sekvensering; Det slutliga biblioteket kan dock förvaras i EB vid 4 °C i upp till 1 vecka om det behövs.
  5. Kör en kvalitetskontroll av flödescellen.
    1. Anslut sekvenseringsenheten till en bärbar dator och öppna sekvenseringsprogramvaran.
    2. Välj typ av flödescell och klicka sedan på Kontrollera flödescell och Starta test.
    3. När det är klart kommer det totala antalet aktiva (dvs. livskraftiga) porer att visas. En ny flödescell bör ha > 800 aktiva porer; Om den inte gör det, kontakta tillverkaren för en ersättning.
  6. Fyllning och laddning av flödescellen (20 min)
    1. Tina följande reagenser vid RT och placera sedan sekvenseringsbuffert, en spollina, spolbuffert och laddningspärlor på is.
    2. Virvla sekvenseringsbufferten och spolbufferten, pulscentrifugera och placera på is.
    3. Pulscentrifugera spollinan och blanda genom pipettering. Lägg sedan på is.
    4. Bered blandningen av fyllning av flödesceller genom att tillsätta 30 μl spolförankringslina direkt till röret med spolbuffert från en fyllningssats för flödesceller och blanda genom pipettering.
    5. Blanda laddningspärlorna genom att pipettera omedelbart före användning eftersom de sätter sig snabbt.
    6. I ett nytt rör bereds den slutliga biblioteksspädningen för sekvensering, enligt vad som anges i tabell 5.
      OBS: Använd beräkning i kalkylbladet Supplementary File 3 för att få volymen av DNA-biblioteket motsvarande 50 fmol. Om mindre än 12 μl beräknas, tillsätt EB för att bilda 12 μL.
    7. Fäll tillbaka sekvenseringsenhetens lock och skjut locket till fyllningsporten medurs så att fyllningsporten är synlig (Figur 3)
    8. Ta försiktigt bort luftbubblor genom att ställa in en P1000-pipett på 200 μL, sätt in spetsen i primingporten och vrid hjulet tills en liten volym som kommer in i pipettspetsen syns (max vrid till 230 μL).
    9. Fyll på 800 μL fyllningsblandning från flödescellen via primingporten, var noga med att undvika bubblor.
    10. Låt stå i 5 min.
    11. Lyft försiktigt upp provportens lock och fyll på 200 μL primingblandning i flödescellen via primingporten med hjälp av en P1000-pipett.
    12. Pipettera biblioteksblandningen upp och ner före laddning, se till att laddningspärlorna i masterblandningen återsuspenderas innan de laddas.
    13. Ladda 75 μL biblioteksblandning till flödescellen via provporten på ett droppvis sätt. Se till att varje droppe rinner in i porten innan du lägger till nästa.
    14. Sätt tillbaka sample portkåpan försiktigt, se till att tappen kommer in i sample port.
    15. Stäng primingporten och sätt tillbaka sekvenseringsenhetens lock.
  7. Sekvenseringskörning (max 48 timmar)
    1. Anslut sekvenseringsenheten till den bärbara datorn och öppna sekvenseringsprogramvaran.
    2. Klicka på Start och sedan på Starta sekvensering.
    3. Klicka på Nytt experiment och följ arbetsflödet för sekvenseringsprogramvarans grafiska användargränssnitt (GUI) för att ställa in parametrarna för körningen.
    4. Skriv in experimentnamnet och exempel-ID:t (t.ex. rabv_run1) och välj Flödescelltyp i listrutan.
    5. Fortsätt till val av kit och välj relevant ligeringssekvenseringssats och inbyggda streckkodssatser som används.
    6. Fortsätt till Kör alternativ. Behåll standardvärdena, såvida du inte vill att körningen ska stoppas automatiskt efter ett visst antal timmar (körningar kan stoppas manuellt när som helst).
    7. Fortsätt till Basecalling. Välj om du vill aktivera eller inaktivera Basecalling beroende på datorresurserna (se datorinställningar). Välj Redigeringsalternativ under streckkod och se till att Streckkod i båda ändar är aktiverat. Spara och fortsätt till utdataavsnittet.
    8. Acceptera standardinställningarna och fortsätt till slutlig granskning, kontrollera inställningarna och registrera detaljerna i kalkylbladet (tilläggsfil 3). Klicka på Start.
      OBS: Om flödescellen återanvänds, justera startvolymentage (i det avancerade avsnittet av körningsalternativen), enligt schemat i Supplementary File 3.
    9. Spela in de första aktiva kanalerna - om detta är betydligt lägre än kvalitetskontrollen (QC), starta om sekvenseringsprogramvaran. Om den är ännu lägre, starta om datorn.
    10. Spela in de initiala kanalerna i sträng kontra enkel por för att ge en ungefärlig porbeläggning. Detta antal kommer att fluktuera, så ge en uppskattning.
    11. Övervaka körningen när den fortskrider.

14. Live- och offline-bassamtal

OBS: Dessa instruktioner förutsätter att den befintliga katalogstrukturen som finns i artic-rabv-databasen och att förutsättningarna avsnitt 1 och 3 i protokollet har följts.

  1. I det lokala filsystemet skapar du en ny katalog med namnet analysis, där du lagrar alla dina analysutdata. Så här organiserar du ytterligare: skapa en underkatalog med namnet på projektet och inuti den en ny katalog för körningen med hjälp av exempel-ID:t som tillhandahålls till MinKNOW som run_name. Gör detta i ett kommando enligt följande:
    mkdir -p
    analys/project_name/run_name
    Navigera sedan till dess plats:
    CD
    sökväg/analys/project_name/run_name
  2. Basanrop i direktsändning
    OBS: För att utföra nanopore basecalling i realtid kräver bärbara datorer en NVIDIA CUDA-kompatibel grafikprocessor (GPU). Se till att instruktionerna för GPU-basanropskonfigurationen har utförts med guppy-protokollet56.
    1. Under körningskonfigurationen aktiverar du livebasecalling.
    2. Använd RAMPART för att övervaka sekvenseringstäckningen i realtid, enligt instruktionerna nedan.
    3. I datorns terminal aktiverar du conda-miljön artic-rabv:
      conda aktivera artic-rabv
    4. Skapa en ny katalog för rampart-utdata i run_name-katalogen och navigera till den:
      cd /sökväg/analys/project_name/run_name
      MKDIR rampart_output
      CD-rampart_output
    5. Skapa en streckkods.csv fil för att para ihop streckkoder och exempelnamn. Den ska ha en rad per streckkod och endast ange streckkoder som finns i biblioteket, med rubrikerna "streckkod" och "exempel". Följ exemplet i katalogen artic-rabv:
      analys/example_project/example_run/rampart_output/streckkoder.csv
    6. Starta RAMPART genom att ange relevant protokollmapp och sökväg till mappen fastq_pass i MinKNOW-utdata för körningen:
      rampart --protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol - basecalledPath
    7. Öppna ett webbläsarfönster och gå till localhost:3000 i URL-rutan. Vänta tills tillräckligt med data har basecallats innan resultaten visas på skärmen.
  3. Offlinebasanrop (utförs efter körningen)
    1. Om live-basecalling inte har ställts in kommer utdata från MinKNOW att vara råsignaldata (fast5 files). Man kommer inte att kunna använda RAMPART under körningen. Konvertera fast5-filerna till basecalled data (fastq-filer) efter körning med guppy (se inställningar i Förutsättningar steg 1.1.1.). Kör RAMPART post-hoc på basanropade data.
    2. Kör guppy basecaller:
      guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /sökväg/till/läsningar/fast5_* -s /sökväg/analys/project_name/run_name -x auto -r
      -c är konfigurationsfilen för att ange basecalling-modellen, -i är indatasökvägen, -s är sökvägen för att spara, -x anger basecalling av GPU-enheten (exkludera om du använder datorversionen av guppy) och -r anger att indatafiler ska sökas rekursivt.
      OBS: Konfigurationsfilen (.cfg) kan ändras till en basecaller med hög noggrannhet genom att ersätta _fast med _hac, även om detta tar betydligt längre tid.

15. Tvätta flödescellerna

  1. Flödescellerna kan tvättas och återanvändas för att sekvensera nya bibliotek om porerna fortfarande är livskraftiga. Se instruktioner för tvätt i ONT flödescelltvättprotokoll57.

16. Analys och tolkning

  1. Generering av konsensussekvenser med ARTIC bioinformatikpipeline
    1. Följ instruktionerna som beskrivs i artic-rabv GitHub-lagringsplatsen40 i mappen rabv_protocols för att generera konsensussekvenser från råa fast5- eller basecalled fastq-filer.
      OBS: Se Arktisk pipeline - Kärnledning58 för ytterligare vägledning.
  2. Valfritt: Analysera det genomsnittliga läsdjupet per amplicon.
    1. Anpassa skripten som är tillgängliga från artic-rabv-arkivet, se Tilläggsfil 1. Kortfattat genereras djupgående statistik med hjälp av SAMtools59 och täckning per nukleotid plottad i R.
  3. Fylogenetisk analys med GLUE
    1. Från RABV_GLUE42 väljer du fliken Analys > Genotypning och tolkning > Lägg till filer och väljer den fasta filen med konsensussekvenser.
    2. Klicka på Skicka och vänta. När analyserna är klara kommer knappen Visa analys att vara tillgänglig att klicka på, som visar klad- och underkladtilldelningar, täckning per gen, variation från referenssekvenser och närmaste släkting.
    3. Relevanta kontextuella sekvenser kan också identifieras i avsnittet Sekvensdata > NCBI-sekvenser per klad .
    4. Välj den identifierade kladen eller klicka på Rabies Virus (RABV) för att se alla tillgängliga sekvenser.
    5. Filtrera efter relevanta sekvenser (t.ex. ursprungsland).
    6. Ladda ned dessa sekvenser och motsvarande metadata för analys och jämförelse.
  4. Ursprungstilldelning med MADDOG41
    1. Hämta MADDOG-lagringsplatsen från GitHub för att säkerställa att du arbetar med den senaste versionen.
    2. Skapa en tilldelningsmapp i den lokala MADDOG-lagringsplatsen (skapades tidigare i avsnittet Förutsättningar) med namnet körningsnamn.
    3. I mappen lägger du till fasta-filen som innehåller konsensussekvenserna.
    4. Lägg till en metadatafil i mappen.
      OBS: Den här filen måste vara en csv med 4 kolumner som heter "ID", "land", "år" och "tilldelning", som beskriver sekvens-ID:n, provtagningslandet och året för provtagningen, medan kolumnen "tilldelning" ska vara tom.
    5. I kommandoradsgränssnittet aktiverar du conda-miljön: conda activate MADDOG.
    6. I kommandoradsgränssnittet navigerar du till mappen MADDOG-arkivet.
    7. Börja med att utföra härledningstilldelning på sekvenser för att kontrollera om det finns eventuella avvikelser och för att identifiera om det är lämpligt att köra det längre härledningsdesignsteget. För detta, skriv detta på kommandoraden: sh assignment.sh.
    8. När du uppmanas till det anger du Y för att indikera att du har hämtat databasen och arbetar med den senaste versionen av MADDOG.
    9. När du uppmanas till det anger du namnet på mappen i MADDOG-lagringsplatsens mapp som innehåller fasta-filen.
    10. När ursprungstilldelningen är klar kontrollerar du utdatafilen i mappen. Om utdata är som förväntat och det finns flera sekvenser tilldelade till samma ursprung kör du ursprungsbeteckningen.
    11. Om du kör ursprungsbeteckning tar du bort tilldelningsutdatafilen som nyss skapades.
    12. I terminalen, i mappen MADDOG-lagringsplatsen, kör du kommandot sh designation.sh.
    13. När du uppmanas till det anger du Y för att indikera att du har hämtat databasen och arbetar med den senaste versionen av MADDOG.
    14. När du uppmanas till det anger du mappnamnet i MADDOG-lagringsplatsens mapp som innehåller fasta-filen och metadata. Detta matar ut härstamningsinformation om varje sekvens, en fylogeni av de nya och relevanta tidigare sekvenserna (från 16.3.6), hierarkisk information om härstamningarna och detaljer om potentiellt framväxande linjer och områden med undersampling.
      OBS: Fullständig information om protokoll, användning och utgångar finns i Campbell et al.60.
    15. När den inledande analysen har slutförts anger du Y om du uppmanas att även testa för nya och undersamplade linjer, om det behövs. Annars anger du N.
    16. Om du uppmanas att bekräfta nyligen hittade ursprung anger du Y och följer anvisningarna i den resulterande NEXT_STEPS.eml-filen. Annars anger du N.

Representative Results

Arbetsflödet sample-to-sequence-to-interpretation för RABV som beskrivs i detta protokoll har använts framgångsrikt i olika laboratorieförhållanden i endemiska länder, såsom Tanzania, Kenya, Nigeria och Filippinerna (figur 4). Protokollet användes på olika provtyper och tillstånd (tabell 6): färsk och fryst hjärnvävnad, cDNA- och RNA-extrakt från hjärnvävnad som transporterats under kylkedja under längre perioder och FTA-kort med hjärnvävnadsutstryk.

Live-basecalling med RAMPART (bild 5) visar nästan realtidsgenereringen av läsningar och den procentuella täckningen per exempel. Detta är särskilt användbart när du bestämmer när körningen ska stoppas och flödescellen sparas för återanvändning. Variation i körtid observerades, där vissa avslutades på 2 timmar, medan andra kunde ta mer än 12 timmar för att ett tillräckligt täckningsdjup (x100) skulle uppnås. Vi kan också se regioner med dålig förstärkning; Figur 6 visar till exempel en ögonblicksbild av en sekvenseringskörning där täckningsprofiler visar några amplikoner med mycket låg förstärkning, vilket indikerar potentiellt problematiska primers. Genom att undersöka dessa dåligt förstärkande områden mer noggrant har vi kunnat identifiera primer-missmatchningar, vilket gör det möjligt för oss att omforma och förbättra enskilda primers. Vissa primer-system har visat fler missmatchningar än andra. Detta observeras i Östafrikas grundprogram, jämfört med Filippinernas, i linje med den eftersträvade mångfalden, eftersom det östafrikanska systemet syftar till att fånga upp en mycket bredare mångfald.

RABV-GLUE42, en generell resurs för RABV-genomdatahantering, och MADDOG60, ett härstamningsklassificerings- och nomenklatursystem, användes för att sammanställa och tolka resulterande RABV-sekvenser. Tabell 7 visar de större och mindre klader som cirkulerar i varje land som tilldelats RABV-GLUE. Dessutom visas en klassificering med högre upplösning av lokala linjer efter MADDOG-uppdraget.

Figure 1
Bild 1: Arbetsflöde för sampling-till-sekvens-till-tolkning för RABV. Sammanfattade steg visas för (A) provberedning, (B) PCR- och biblioteksberedning, och (C) sekvensering och bioinformatik fram till analys och tolkning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Grundschema. Glödgningspositioner längs "indexreferensgenomet" (mörklila) för par av framåt- och bakåtprimrar (halvpilar), som tilldelas i två separata pooler: A (röd) och B (grön). Primerpar genererar 400 bp överlappande amplikoner (blå) som numreras sekventiellt längs indexreferensgenomet i formatet "scheme_name_X_DIRECTION", där "X" är ett tal som hänvisar till amplikonen som genereras av primern och "DIRECTION" är antingen "LEFT" eller "RIGHT", som beskriver framåt respektive bakåt. Udda eller jämna värden på "X" bestämmer poolen (A respektive B). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Nanoporflödescell48. Blå etiketter illustrerar de olika delarna av flödescellen, inklusive locket till primingporten som täcker primingporten där priminglösningen tillsätts, SpotON sample portlocket som täcker sample porten där sample läggs till på ett droppvis sätt, avfallsportarna 1 och 2 och flödescellens ID. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Karta som visar platsen där RABV-sekvensering utfördes med det optimerade arbetsflödet 2021 och 2022. Bubblornas storlek och färg motsvarar antalet sekvenser per plats, där mindre och mörkare är färre, medan större och ljusare är mer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: Skärmbild av RAMPART-visualisering i webbläsaren. Streckkodsnamn ersätts med provnamn enligt den bioinformatiska inställningen. De tre översta panelerna visar sammanfattningsdiagram för hela körningen: täckningsdjup för kartlagda läsningar för varje streckkod per nukleotidposition på indexreferensgenomet (överst till vänster, färglagt med streckkod), summerade mappade läsningar från alla streckkoder över tid (överst i mitten) och mappade läsningar per streckkod (överst till höger, färglagt med streckkod). Nedre paneler visar rader med ytor per streckkod. Från vänster till höger: täckningsdjupet för kartlagda avläsningar per nukleotidposition på indexreferensgenomet (vänster), längdfördelningen av kartlagda avläsningar (mitten) och andelen nukleotidpositioner på indexreferensgenomet som har fått en täckning på 10x, 100x och 1 000x för kartlagda avläsningar över tid (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Ett exempel på lästäckning över genomet för ett rabiesvirusprov från Filippinerna som sekvenserats med hjälp av protokollet. Lästäckning vid varje nukleotidposition i genomet visas, tillsammans med positionen för de överlappande amplikonerna (1-41) som används för att generera biblioteket. Spikar i täckningsdjupet motsvarar områden med amplikonöverlappning. Amplikoner med lågt täckningsdjup motsvarar områden med amplikonöverlappning. Amplikoner med lågt täckningsdjup är markerade i rött, vilket indikerar problematiska regioner som kan kräva optimering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Förhållanden för masterblandning och termisk cykler för cDNA-beredning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Förhållanden för masterblandning och termisk cykler för multiplex-PCR. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Masterblandning och termiska cykler betingelser för end-prep-reaktion. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Villkor för masterblandning och termocykler för streckkodning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 5: Mastermix för adapterligering och slutlig biblioteksutspädning för sekvensering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 6: Antalet helgenomsekvenser för rabiesvirus som genererats och vilken typ av prover som använts i olika länder med hjälp av arbetsflödet sample-to-sequence-to-interpretation. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 7: Större och mindre kladtilldelningar från RABV-GLUE och ursprungstilldelningar från MADDOG för sekvenser som genererats med hjälp av arbetsflödet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tilläggsfil 1: Design och optimering av primerschema och analys av ampliconläsdjup. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 2: Beräkningsinställningar Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 3: Arbetsblad för RABV WGS-protokoll Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Ett tillgängligt RABV, nanopore-baserat, arbetsflöde för helgenomsekvensering utvecklades av Brunker et al.61, med hjälp av resurser från ARTIC-nätverket46. Här presenterar vi ett uppdaterat arbetsflöde med kompletta steg från prov till sekvens till tolkning. Arbetsflödet beskriver beredningen av hjärnvävnadsprover för helgenomsekvensering, presenterar en bioinformatisk pipeline för att bearbeta läsningar och generera konsensussekvenser och belyser två rabiesspecifika verktyg för att automatisera härstamningstilldelning och bestämma fylogenetiskt sammanhang. Det uppdaterade arbetsflödet innehåller också omfattande instruktioner för att konfigurera lämpliga beräknings- och laboratoriearbetsytor, med överväganden för implementering i olika sammanhang (inklusive inställningar med låga resurser). Vi har visat den framgångsrika implementeringen av arbetsflödet i både akademiska och forskningsinstitutsmiljöer i fyra RABV-endemiska låginkomstländer med ingen eller begränsad genomisk övervakningskapacitet. Arbetsflödet har visat sig vara motståndskraftigt mot tillämpning i olika miljöer och begripligt för användare med olika expertis.

Detta arbetsflöde för RABV-sekvensering är det mest omfattande offentligt tillgängliga protokollet (som täcker prov-till-sekvens-till-tolkningssteg) och specifikt anpassat för att minska både start- och driftskostnader. Den tid och kostnad som krävs för biblioteksförberedelse och sekvensering med nanoporteknik minskar kraftigt i förhållande till andra plattformar, såsom Illumina61, och kontinuerlig teknikutveckling förbättrar sekvenskvaliteten och noggrannheten för att vara jämförbar med Illumina62.

Det här protokollet är utformat för att vara motståndskraftigt i olika lågresurskontexter. Genom att hänvisa till vägledningen för felsökning och ändringar som tillhandahålls tillsammans med kärnprotokollet får användarna stöd för att anpassa arbetsflödet efter sina behov. Tillägget av användarvänliga bioinformatiska verktyg till arbetsflödet utgör en stor utveckling av det ursprungliga protokollet, vilket ger snabba och standardiserade metoder som kan tillämpas av användare med minimal tidigare bioinformatisk erfarenhet för att tolka sekvensdata i lokala sammanhang. Kapaciteten att göra detta på plats begränsas ofta av behovet av att ha särskilda programmerings- och fylogenetiska färdigheter, vilket kräver en intensiv och långsiktig investering i kompetensutveckling. Även om denna färdighet är viktig för att grundligt tolka sekvensdata, är grundläggande och tillgängliga tolkningsverktyg lika önskvärda för att kapacitera lokala "sekvenseringsmästare", vars kärnkompetens kan vara våtlabbbaserad, vilket gör det möjligt för dem att tolka och ta ägarskap över sina data.

Eftersom protokollet har tillämpats under ett antal år i flera länder kan vi nu ge vägledning om hur man optimerar multiplexprimersystem för att förbättra täckningen och hantera ackumulerad mångfald. Ansträngningar har också gjorts för att hjälpa användarna att förbättra kostnadseffektiviteten eller göra det lättare att göra upphandlingen i en viss region, vilket vanligtvis är en utmaning för hållbarheten hos molekylära metoder63. Till exempel, i Afrika (Tanzania, Kenya och Nigeria), valde vi trubbiga/TA-ligasmastermix vid adapterligeringssteget, vilket var mer lättillgängligt från lokala leverantörer och ett billigare alternativ till andra ligeringsreagenser.

Av erfarenhet finns det flera sätt att minska kostnaden per prov och per körning. Att minska antalet prover per körning (t.ex. från 24 ner till 12 prover) kan förlänga livslängden för flödesceller över flera körningar, medan en ökning av antalet prover per körning maximerar tiden och reagenserna. I våra händer kunde vi tvätta och återanvända flödesceller för var tredje sekvenseringskörning, vilket gjorde det möjligt att sekvensera ytterligare 55 prover. Att tvätta flödescellen omedelbart efter användning, eller om det inte är möjligt, ta bort spillvätskan från avfallskanalen efter varje körning, verkade bevara antalet porer som är tillgängliga för en andra körning. Med hänsyn till det initiala antalet porer som finns tillgängliga i en flödescell kan en körning också optimeras för att planera hur många prover som ska köras i en viss flödescell.

Även om arbetsflödet syftar till att vara så omfattande som möjligt, med tillägg av detaljerad vägledning och vägledande resurser, är proceduren fortfarande komplex och kan vara skrämmande för en ny användare. Användaren uppmuntras att söka personlig utbildning och stöd, helst lokalt eller alternativt genom externa samarbetspartners. I Filippinerna har till exempel ett projekt om kapacitetsuppbyggnad inom regionala laboratorier för genomisk övervakning av SARS-CoV-2 med hjälp av ONT utvecklat kärnkompetenser bland diagnostiker inom hälso- och sjukvården som lätt kan överföras till RABV-sekvensering. Viktiga steg, som att rengöra SPRI-pärlor, kan vara svåra att bemästra utan praktisk utbildning, och ineffektiv rengöring kan skada flödescellen och äventyra körningen. Provkontaminering är alltid ett stort problem när amplikoner bearbetas i laboratoriet och kan vara svåra att eliminera. I synnerhet är korskontaminering mellan prover extremt svår att upptäcka under bioinformatik efter körning. God laboratorieteknik och praxis, t.ex. att hålla arbetsytorna rena, separera områden före och efter PCR och införliva negativa kontroller, är absolut nödvändiga för att säkerställa kvalitetskontroll. Den snabba utvecklingen av nanoporsekvensering är både en fördel och en nackdel för rutinmässig RABV-genomisk övervakning. Kontinuerliga förbättringar av nanoporens noggrannhet, tillgänglighet och protokollrepertoar breddar och förbättrar tillämpningsområdet. Samma utveckling gör det dock svårt att upprätthålla standardrutiner och bioinformatiska pipelines. I detta protokoll tillhandahåller vi ett dokument som hjälper till med övergången från äldre till nuvarande förberedelsesatser för nanoporbibliotek (Table of Materials).

Ett vanligt hinder för sekvensering i låg- och medelinkomstländer är tillgänglighet, som inte bara omfattar kostnaden utan även möjligheten att anskaffa förbrukningsvaror i tid (särskilt sekvenseringsreagenser, som är relativt nya för upphandlingsteam och leverantörer) och beräkningsresurser, samt att helt enkelt ha tillgång till stabil kraft och internet. Att använda bärbar nanoporsekvenseringsteknik som grund för detta arbetsflöde hjälper till med många av dessa tillgänglighetsproblem, och vi har demonstrerat användningen av vårt protokoll i en rad olika miljöer, genom att genomföra hela protokollet och analysen i landet. Visserligen är det fortfarande en utmaning att skaffa utrustning och sekvensera förbrukningsvaror i tid, och i många fall var vi tvungna att transportera eller skicka reagenser från Storbritannien. I vissa områden kunde vi dock helt förlita oss på lokala leveransvägar för reagenser och dra nytta av investeringar i SARS-CoV-2-sekvensering (t.ex. Filippinerna) som har effektiviserat upphandlingsprocesserna och börjat normalisera tillämpningen av patogengenomik.

Behovet av en stabil internetanslutning minimeras av engångsinstallationer; till exempel kräver GitHub-lagringsplatser, nedladdning av programvara och nanoporsekvensering i sig bara internetåtkomst för att starta körningen (inte hela tiden) eller kan utföras helt offline med avtal från företaget. Om mobildata är tillgängligt kan en telefon användas som en hotspot till den bärbara datorn för att påbörja sekvenseringskörningen innan den kopplas bort under körningen. Vid rutinmässig bearbetning av prover kan kraven på datalagring växa snabbt, och helst skulle data lagras på en server. Annars är SSD-hårddiskar (Solid State Drive) relativt billiga att köpa.

Även om vi är medvetna om att det fortfarande finns hinder för genomisk övervakning i låginkomstländer, tyder ökade investeringar i att bygga upp genomikens tillgänglighet och expertis (t.ex. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa SGB])64 på att denna situation kommer att förbättras. Genomisk övervakning är avgörande för pandemiberedskap6, och kapacitet kan etableras genom rutinisering av genomisk övervakning av endemiska patogener som RABV. Globala skillnader i sekvenseringskapacitet som belystes under SARS-CoV-2-pandemin bör vara en drivkraft för katalytiska förändringar för att ta itu med dessa strukturella orättvisor.

Detta arbetsflöde från prov-till-sekvens-till-tolkning för RABV, inklusive tillgängliga bioinformatikverktyg, har potential att användas för att vägleda kontrollåtgärder som syftar till att uppnå målet att noll människor ska dö av hundmedierad rabies senast 2030, och i slutändan för att eliminera RABV-varianter. I kombination med relevanta metadata underlättar genomiska data som genereras från detta protokoll snabb karakterisering av RABV under utbrottsundersökningar och vid identifiering av cirkulerande linjer i ett land eller en region60,61,65. Vi illustrerar vår pipeline främst med hjälp av exempel från hundmedierad rabies; Arbetsflödet är dock direkt tillämpligt på rabies hos vilda djur. Denna överförbarhet och låga kostnad minimerar utmaningarna med att göra rutinsekvensering lättillgänglig, inte bara för rabies utan även för andra patogener46,66,67, för att förbättra sjukdomshantering och kontroll.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton-finansiering från Medical Research Council [MR/R025649/1] och Philippines Department of Science and Technology (DOST), UK Research and Innovation Global Effort on COVID-19 [MR/V035444/1], University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], och International Partnership Development Fund, ett DOST British Council-Philippines studentship (CB), ett National Institute for Health Research [17/63/82] GemVi-stipendium (GJ) och University of Glasgow-studenter från MVLS DTP (KC) [125638-06], EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] och Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. Vi är tacksamma för kollegor och samarbetspartners som har stöttat detta arbete: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana och Anna Czupryna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brand name
Software
Sequencing software
(MinKnow)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/downloads
Bioinformatics tool kit
(Guppy)		 Oxford Nanopore Technologies https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
Equipment
Thermal cycler
(miniPCR™ mini16 thermal cycler)		 Cambio MP-QP-1016-01
Homogenizer
(Precellys Evolution Touch Homogenizer)		 Bertin Instruments EQ02520-300
Cold Racks (0.2-0.5mL)
(PCR Mini-cooler with transparent lid)		 BRAND  781260
Pipettor
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) Gilson  SKU: FA10030
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) Gilson  SKU: FA10024
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) Gilson  SKU: FA10020
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) Gilson  SKU: FA10025
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) Gilson  SKU: FA10021
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) Gilson  SKU: FA10026
Fluorometer
(Qubit  4 Fluorometer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q33238
Laptop 
(Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU])
Microcentrifuge
(Refrigerated centrifuge)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 75004081
Vortex mixer
(Basic vortex mixer) 		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 88882011
Magnetic rack
(DynaMag -2 Magnet)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 12321D
Sequencing device
(MinION)		 Oxford Nanopore Technologies MinION Mk1B
RNA Extraction 
RNA extraction kit
(Qiagen RNEasy Mini Kit 250)		 Qiagen 74106
RNA stabilizing reagents 
(RNA later)  Invitrogen AM7020
(DNA/RNA Shield) Zymo Research R1100-50
PCR
Nuclease-free Water
(Nuclease-free Water [not  DEPC-treated])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific AM9937
Master mix for first strand cDNA synthesis
(LunaScript RT SuperMix Kit)		 New England Biolabs E3010S
DNA amplification master mix
(Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])		 New England Biolabs M0494L
Primer (Scheme)
(Custom DNA oligos)		 Invitrogen
SPRI Bead Clean-up
SPRI beads
(Aline Biosciences PCR Clean DX )		 Cambio AL-AC1003-50
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] Merck 818760
Short Fragment buffer
(SFB expansion pack)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-SFB001
DNA Quantification
DNA quantification kit
(Qubit® dsDNA HS Assay Kit)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32854
DNA quantification assay tubes
(Qubit™ Assay Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific Q32856
End Prep and barcoding
(Qubit™ Assay Tubes)
End Prep master mix
(NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)		 New England Biolabs E7546L
Barcoding kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9 
(Native Barcoding Expansion 1-12) EXP-NBD104 
(Native Barcoding Expansion 13-24)  EXP-NBD114 
(Native Barcoding Expansion 96) EXP-NBD196
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
(not compatible)  (not compatible) 
(Native Barcoding Kit 24 V14) SQK-NBD114.24
(Native Barcoding Kit 96 V14) SQK-NBD114.96
Ligation mastermix
(Blunt/TA Ligase Master Mix)		 New England Biolabs M0367S
Adapter Ligation
Adapter ligation master mix
(NEBNext  Quick Ligation Module) New England Biolabs E6056S  
(NEBNext Ultra II Ligation Module)  New England Biolabs E7595S
(Blunt/TA Ligase Master Mix) New England Biolabs M0367S
Adapter mix
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-AMII001
(Adapter Mix II [AMII])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-NBA114
(Native adapter [NA])
Sequencing 
Flowcell priming kit
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
EXP-FLP002
(Flush Buffer [FB])
(Flush Tether [FT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
EXP-FLP004
(Flow Cell Flush [FCF])
(Flow Cell Tether [FCT])
Ligation Sequencing Kit 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
SQK-LSK109
Adapter Mix
(Adapter Mix [AMX])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SQB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LB])
Sequencing Tether
(Sequencing Tether [SQT])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
SQK-LSK114
Adapter Mix
(Ligation Adapter [LA])
Ligation Buffer
(Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer
(Sequencing Buffer [SB])
Elution Buffer
(Elution buffer [EB])
Loading Beads
(Loading Beads [LIB])
Sequencing Tether
(Flow Cell Tether [FCT])
Library solution
(Library solution [LIS])
Flush buffer
(Flow Cell Flush [FCF])
Flow Cell 
*Chemistry 9  Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 9
FLO-MIN106D
(Flow Cell  [R9.4.1])
*Chemistry 14 Oxford Nanopore Technologies *Chemistry 14
FLO-MIN114
(Flow Cell  [R10.4.1])
Flow Cell wash 
Flowcell wash kit
(Flow cell wash kit)		 Oxford Nanopore Technologies EXP-WSH004
Consummables 
Surface decontaminant 
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7010PK
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) Thermofisher scientific/Fisher scientific 7002PK
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap
(PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner])		 Greiner 608281
PCR Tube 0.2ml
(PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner])		 Greiner 671201
1000µL Filter Tips (500)
(Stacked 1000µL Filter Tips [500])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11977724
100µL Filter Tips (1000) Thermofisher scientific/Fisher scientific 11947724
10µL Filter Tips (1000)
(Stacked 100µL Filter Tips [1000])		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 11907724
Reinforced tubes  tubes (2ml)  with screw caps and o-rings
(Fisherbrand™ Bulk tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 15545809
Microcentrifuge tube (1.5ml)
(1.5 ml Eppendorf Tubes [500])		 Eppendorf 1229888
DNA LoBind Tubes  (1.5ml)
(DNA LoBind Tubes)		 Thermofisher scientific/Fisher scientific 10051232
Cryobabies labels
Gloves (S/M/L)
Paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupprecht, C. E. Rhabdoviruses: rabies virus. Medical Microbiology. , University of Texas Medical Branch. Galveston, TX. (1996).
  2. Rabies. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/rabies (2023).
  3. Health Organization, W. orld WHO Expert Consultation on Rabies: WHO TRS N°1012. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-TRS-1012 (2018).
  4. Benavides, J. A., et al. Defining new pathways to manage the ongoing emergence of bat rabies in Latin America. Viruses. 12 (9), 1002 (2020).
  5. Hampson, K. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), e0003709 (2015).
  6. Global genomic surveillance strategy for pathogens with pandemic and epidemic potential, 2022-2032. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/978924004679 (2022).
  7. Tsai, K. J., et al. Emergence of a sylvatic enzootic formosan ferret badger-associated rabies in Taiwan and the geographical separation of two phylogenetic groups of rabies viruses. Veterinary Microbiology. 182, 28-34 (2016).
  8. Chiou, H. -Y., et al. Molecular characterization of cryptically circulating rabies virus from ferret badgers, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 790-798 (2014).
  9. Sabeta, C. T., Mansfield, K. L., McElhinney, L. M., Fooks, A. R., Nel, L. H. Molecular epidemiology of rabies in bat-eared foxes (Otocyon megalotis) in South Africa. Virus Research. 129 (1), 1-10 (2007).
  10. Scott, T. P. Complete genome and molecular epidemiological data infer the maintenance of rabies among kudu (Tragelaphus strepsiceros) in Namibia. PLoS One. 8 (3), e58739 (2013).
  11. Lembo, T., et al. Exploring reservoir dynamics: a case study of rabies in the Serengeti ecosystem. The Journal of Applied Ecology. 45 (4), 1246-1257 (2008).
  12. Coetzee, P., Nel, L. H. Emerging epidemic dog rabies in coastal South Africa: a molecular epidemiological analysis. Virus Research. 126 (1-2), 186-195 (2007).
  13. Ou de Munnink, B. B. First molecular analysis of rabies virus in Qatar and clinical cases imported into Qatar, a case report. International Journal of Infectious Diseases. 96, 323-326 (2020).
  14. Smith, J., et al. Case report: Rapid ante-mortem diagnosis of a human case of rabies imported into the UK from the Philippines. Journal of Medical Virology. 69, 150-155 (2003).
  15. Mahardika, G. N. K., et al. Phylogenetic analysis and victim contact tracing of rabies virus from humans and dogs in Bali, Indonesia. Epidemiology and Infection. 142 (6), 1146-1154 (2014).
  16. Tohma, K., et al. Molecular and mathematical modeling analyses of inter-island transmission of rabies into a previously rabies-free island in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 38, 22-28 (2016).
  17. Tohma, K., et al. Phylogeographic analysis of rabies viruses in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 23, 86-94 (2014).
  18. Saito, M., et al. Genetic diversity and geographic distribution of genetically distinct rabies viruses in the Philippines. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (4), e2144 (2013).
  19. Biek, R., Henderson, J. C., Waller, L. A., Rupprecht, C. E., Real, L. A. A high-resolution genetic signature of demographic and spatial expansion in epizootic rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 7993-7998 (2007).
  20. Reddy, G. B., et al. Molecular characterization of Indian rabies virus isolates by partial sequencing of nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P) genes. Virus Genes. 43, 13-17 (2011).
  21. David, D., Dveres, N., Yakobson, B. A., Davidson, I. Emergence of dog rabies in the northern region of Israel. Epidemiology and Infection. 137 (4), 544-548 (2009).
  22. Benjathummarak, S. Molecular genetic characterization of rabies virus glycoprotein gene sequences from rabid dogs in Bangkok and neighboring provinces in Thailand, 2013-2014. Archives of Virology. 161 (5), 1261-1271 (2016).
  23. Denduangboripant, J., et al. Transmission dynamics of rabies virus in Thailand: implications for disease control. BMC Infectious Diseases. 5, 52 (2005).
  24. Talbi, C., et al. Phylodynamics and human-mediated dispersal of a zoonotic virus. PLoS Pathogens. 6 (10), e1001166 (2010).
  25. Bourhy, H., et al. Revealing the micro-scale signature of endemic zoonotic disease transmission in an African urban setting. PLoS Pathogens. 12 (4), e1005525 (2016).
  26. Zinsstag, J., et al. Vaccination of dogs in an African city interrupts rabies transmission and reduces human exposure. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  27. Yakovleva, A., et al. Tracking SARS-COV-2 variants using Nanopore sequencing in Ukraine in 2021. Scientific Reports. 12, 15749 (2022).
  28. Mannsverk, S., et al. SARS-CoV-2 variants of concern and spike protein mutational dynamics in a Swedish cohort during 2021, studied by Nanopore sequencing. Virology Journal. 19, 164 (2022).
  29. Soufi, M., et al. Fast and easy nanopore sequencing workflow for rapid genetic testing of familial Hypercholesterolemia. Frontiers in Genetics. 13, 836231 (2022).
  30. Cabibbe, A. M. Application of targeted next-generation sequencing assay on a portable sequencing platform for culture-free detection of drug-resistant tuberculosis from clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 00632 (2020).
  31. Xu, Y., et al. Nanopore metagenomic sequencing of influenza virus directly from respiratory samples: diagnosis, drug resistance and nosocomial transmission, United Kingdom, 2018/19 influenza season. Euro Surveillance. 26 (27), 2000004 (2021).
  32. Stubbs, S. C. B., et al. Assessment of a multiplex PCR and Nanopore-based method for dengue virus sequencing in Indonesia. Virology Journal. 17, 24 (2020).
  33. Croville, G., et al. Rapid whole-genome based typing and surveillance of avipoxviruses using nanopore sequencing. Journal of Virological Methods. 261, 34-39 (2018).
  34. Theuns, S., et al. Nanopore sequencing as a revolutionary diagnostic tool for porcine viral enteric disease complexes identifies porcine kobuvirus as an important enteric virus. Scientific Reports. 8, 9830 (2018).
  35. O'Donnell, V. K., et al. Rapid sequence-based characterization of African swine fever virus by use of the Oxford Nanopore MinION sequence sensing device and a companion analysis software tool. Journal of Clinical Microbiology. 58, 01104-01119 (2019).
  36. Brito, A. F. Global disparities in SARS-CoV-2 genomic surveillance. Nature Communications. 13, 7003 (2022).
  37. ONT login/register. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://nanoporetech.com/login-register (2023).
  38. Software Downloads. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://community.nanoporetech.com/downloads (2023).
  39. GitHub. , Available from: https://github.com/ (2023).
  40. Brunker, K. Artic-rabv. , Available from: https://github.com/kirstyn/artic-rabv (2022).
  41. Campbell, K. MADDOG: Method for Assignment, Definition and Designation of Global Lineages. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  42. Campbell, K. RABV-GLUE. Centre for Virus Research. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  43. Itokawa, K., Sekizuka, T., Hashino, M., Tanaka, R., Kuroda, M. Disentangling primer interactions improves SARS-CoV-2 genome sequencing by multiplex tiling PCR. PLoS ONE. 15 (9), e0239403 (2020).
  44. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 818619 (2022).
  45. Döring, M., Pfeifer, N. openPrimeR: Multiplex PCR primer design and analysis. , (2023).
  46. Quick, J. Multiplex PCR method for MiniON and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
  47. Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization. 1, Available from: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/310836/9789241515153-eng.pdf (2018).
  48. Lembo, T. Partners for Rabies Prevention. The blueprint for rabies prevention and control: a novel operational toolkit for rabies elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (2), e1388 (2012).
  49. Terrestrial Manual Online Access. World Organization for Animal Health. , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2023).
  50. Mauti, S. Field postmortem rabies rapid immunochromatographic diagnostic test for resource-limited settings with further molecular applications. Journal of Visualized Experiments. (160), e60008 (2020).
  51. Patrick, E., et al. Enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test. Journal of Visualized Experiments. (146), e59416 (2019).
  52. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  53. Marston, D. A., et al. Pan-lyssavirus real time RT-PCR for rabies diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (149), e59709 (2019).
  54. Brunker, K. DNA quantification using the Qubit fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-qubit-fluorometer-bc6vize6 (2020).
  55. Quick, J. DNA quantification using the Quantus fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-quantus-fluorometer-7pzhmp6 (2020).
  56. Guppy protocol. Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revaq_14dec2018 (2023).
  57. Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004). Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/flow-cell-wash-kit-exp-wsh004/v/wfc_9120_v1_revh_08dec2020 (2023).
  58. Core Pipeline - arctic pipeline. , Available from: https://artic.readthedocs.io/en/latest/minion/ (2023).
  59. Samtools. , Available from: https://www.htslib.org (2023).
  60. Campbell, K., et al. Making genomic surveillance deliver: A lineage classification and nomenclature system to inform rabies elimination. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010023 (2022).
  61. Brunker, K., et al. Rapid in-country sequencing of whole virus genomes to inform rabies elimination programmes. Wellcome Open Research. 5, 3 (2020).
  62. Bull, R. A., et al. Analytical validity of nanopore sequencing for rapid SARS-CoV-2 genome analysis. Nature Communications. 11, 6272 (2020).
  63. Okeke, I. N., Ihekweazu, C. The importance of molecular diagnostics for infectious diseases in low-resource settings. Nature Reviews. Microbiology. 19 (9), 547-548 (2021).
  64. Inzaule, S. C., Tessema, S. K., Kebede, Y., Ouma, A. E. O., Nkengasong, J. N. Genomic-informed pathogen surveillance in Africa: opportunities and challenges. The Lancet Infectious Diseases. 21 (9), 281-289 (2021).
  65. Kennedy, L. Integrating contact tracing and whole-genome sequencing to track the elimination of dog-mediated rabies: an observational and genomic study. eLife. , (2023).
  66. Pallerla, S. R. Diagnosis of pathogens causing bacterial meningitis using Nanopore sequencing in a resource-limited setting. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 21, 39 (2022).
  67. Quick, J. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).

Tags

Helgenomsekvensering snabb karakterisering rabiesvirus nanoporteknik genomiska data överföringsspårning geografisk spridning infektionssjukdomar låg- och medelinkomstländer (LMIC) hundmedierade rabies vampyrfladdermöss folkhälsa ekonomiska problem prov-till-sekvens-till-tolkning-arbetsflöde nanoporteknik provinsamling rabiesdiagnos helgenomsekvenseringsarbetsflöde primerdesign och optimering multiplexpolymeraskedjereaktion (PCR) sekvensering Biblioteksförberedelse live och offline basanrop genetisk härstamningsbeteckning fylogenetisk analys arbetsflödesimplementering pipelinevalidering negativa kontroller genomiska verktyg (GLUE MADDOG) regionala och globala fylogenier
Helgenomsekvensering för snabb karakterisering av rabiesvirus med hjälp av nanoporteknik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bautista, C., Jaswant, G., French,… More

Bautista, C., Jaswant, G., French, H., Campbell, K., Durrant, R., Gifford, R., Kia, G. S. N., Ogoti, B., Hampson, K., Brunker, K. Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology. J. Vis. Exp. (198), e65414, doi:10.3791/65414 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter