Summary
이 논문은 Tuina 요법을 사용하여 쥐의 등쪽 뿌리 신경절의 만성 압박을 치료하기 위한 조작과 통증 행동 및 조직 병리학적 결과를 기반으로 효과를 평가하는 방법을 제시합니다.
Abstract
신경병증성 통증은 인구의 6.9%-10%에 영향을 미치는 흔한 상태이며 요추 추간판 탈출증, 척추관 협착증 및 추간공 협착증과 같은 다양한 원인으로 인한 신경 손상으로 인해 발생합니다. 중국의 전통적인 도수치료인 투이나(Tuina)는 신경병증성 통증 치료를 위한 임상에서 진통 효과를 보였지만 근본적인 신경생물학적 메커니즘은 아직 불분명합니다. 동물 모델은 투이나의 기본 원리를 밝히는 데 필수적이다. 이 연구에서는 등근 신경절(DRG)을 압박한 쥐를 위한 표준화된 Tuina 프로토콜을 제안하며, 여기에는 추간공에 스테인리스 스틸 막대를 삽입하여 DRG 압박을 유도하고, 통제된 환경에서 위치, 강도 및 빈도의 특정 매개변수로 Tuina 조작을 수행하고, Tuina 치료의 행동 및 조직 병리학적 결과를 평가하는 것이 포함됩니다. 이 글은 또한 본 연구의 잠재적인 임상적 의미와 한계에 대해 논의하고 투이나에 대한 향후 연구의 방향을 제시한다.
Introduction
임상 환경에서 다양한 이유로 신경근 압박으로 인한 신경학적 병리학적 통증을 관찰하는 것이 일반적입니다. 이 신경병증성 통증의 가장 전형적인 형태는 요추 추간판 탈출증(LDH)으로, 종종 지속적이고 반복적이며 치료가 어렵습니다. 전 세계 인구의 약 9%가 LDH의 영향을 받고 있으며, 이는 상당한 사회적, 경제적 부담을 초래합니다1. 이러한 유형의 신경병증성 통증의 발생률은 매년 증가하고 있으며, 인체 생산 및 생활 방식의 변화로 인해 젊은 환자로 증가하는 추세이다2. 비스테로이드성 진통제를 사용해도 환자의 증상이 완전히 완화되지는 않습니다. 그 결과, LDH로 인한 통증을 치료하기 위한 투이나(Tuina)와 같은 대체 요법이 점점 더 주목을 받고 있습니다.
LDH에 대한 보존적 치료의 한 형태인 투이나 요법은 요통을 예방하고 치료하기 위해 전 세계의 다양한 임상 진료 지침에서 널리 권장되고있다 3,4. 연구에 따르면 투이나는 LDH 환자의 혈청 IL-6 및 종양괴사인자-알파(TNF-α) 수치와 같은 염증 인자를 현저히 낮추는 동시에 환자의 통증과 요추 기능 장애를 개선할 수 있다5. 그러나 투이나 요법의 통증 완화 효과에 대한 구체적인 메커니즘은 아직 불분명하다.
동물 모델은 LDH6로 인한 신경병증성 통증을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이를 통해 Tuina 요법의 효과를 평가하고 LDH의 병리학적 생리학적 샘플을 제공하기 위한 행동 측정을 할 수 있습니다. 예를 들어, 허벅지의 등근 신경절에서 채취한 샘플을 채취하여 등근 신경절 세포의 변화를 확인할 수 있습니다. 등근신경절(Dorsal Root Ganglion, CCD) 모델의 만성 압박은 LDH의 병리학적 생리학을 평가하는데 일반적으로 사용되는데, 이는 추간판 탈출증으로 인한 신경 압박의 임상적 사례에서 나타나는 병리학적 변화와 일치하는 등쪽 뿌리 신경절 세포의 형태에 손상을 주기 때문이다7.
많은 학자들이 지압 진통제에 대한 몇 가지 동물 실험을 수행했습니다 8,9,10. 그러나 동물 모델에서 지압 작업을 구현할 때 종종 인간 지압을 모방합니다. 지압의 치료 효과는 가해진 힘의 크기, 빈도 및 방향과 같은 요인에 의해 영향을 받는다11,12,13. 실험에 힘, 빈도 및 작동 기간과 같은 통일된 지압 표준이 없는 경우 실험 결과에 약간의 편차가 발생할 수 있습니다. 이 기사에서는 CCD 쥐의 특성을 기반으로 한 일련의 지압 치료 계획을 소개하고 동물 모델에서 표준화된 지압 작업의 개발을 촉진합니다.
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Protocol
이 연구는 푸단 대학의 신경 생물학 연구소의 통증 실험실에서 수행되었습니다. 이 실험은 모든 수술 절차 및 동물 취급에 대해 국제 통증 연구 협회(LASP)에서 제정한 실험 동물 보호 지침을 승인하고 엄격하게 준수했습니다. 본 연구에는 생후 40-50일 사이의 수컷 32마리로 구성된 청정 등급의 Sprague-Dawley(SD) 쥐가 평균 체중 220± 1.38g으로 사용되었습니다. 이 쥐들은 중국과학원 상하이 생명과학원 실험동물센터에서 채취했다. 동물들은 적절한 보살핌을 받았고 독립적인 환기, 조절된 온도(22 ± 1 °C) 및 습도(40%-50%)가 있는 전용 방에 수용되었습니다. 쥐들은 우리에서 적절한 음식과 물을 먹을 수 있었다. 실험동물실은 쥐의 생체 리듬의 규칙성을 유지하기 위해 12시간의 명암 주기를 따랐고, 지정된 인원이 정기적으로 패딩을 교체했다. X-ray는 Shanghai University of Traditional Chinese Medicine 부속 Yueyang Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine의 방사선과에서 수행되었습니다.
1. 연구 참가자 및 그룹화
- 32마리의 쥐를 naive(대조군), sham(가짜 수술), CCD(만성 등쪽 뿌리 신경절 압박) 및 CCD + Tuina(8마리/그룹)의 네 그룹에 할당합니다. 쥐는 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다.
참고: 순진한 쥐는 개입이 없었고, 가짜 그룹은 CCD 그룹 쥐와 동일한 수술 절차를 거쳤지만 L4 및 L5 추간공에 "L"자형 스테인리스 스틸 막대를 남기지 않았습니다. CCD 그룹의 쥐는 완전한 만성 배근 신경절 압박 모델 수술을 받았습니다. CCD + Tuina 그룹의 쥐는 CCD 수술 후 4일째부터 tuina 요법을 받았습니다.
2. 동물모델 확립
- 쥐를 마취하기 위해 이소플루오란을 투여합니다. 쥐가 의식을 잃으면(꼬리 튕기기 반사 또는 다리 굴곡 반사 없음) 면도기를 사용하여 수술 부위의 털을 면도합니다.
참고: 진통제는 수술 15분 전에 적용되었으며 쥐는 트라마돌 20mg/kg을 피하 주사했습니다. - 폼 보드( 재료 표 참조)에 쥐를 고정하고 고무 밴드를 사용하여 팔다리와 앞니를 고정합니다. 알코올과 요오드를 번갈아 가며 멸균한 준비물로 최소 3주기 동안 준비된 부위를 닦습니다.
- "L"자형 프로브를 삽입합니다( 재료 표 참조).
- 가위를 사용하여 피부, 표재성 근막, 심부 근막을 층별로 2-3cm 절개합니다. 먼저 다섯 번째 요추에 해당하는 전방 상장골 척추를 찾습니다. 그런 다음 세 번째와 네 번째 가시돌기를 순차적으로 찾습니다.
- 톱니가 있는 집게로 가시돌기를 고정하고 들어 올려 가위가 가시돌기의 오른쪽에 가까워지도록 하고 가시돌기의 오른쪽에 부착된 근육을 자릅니다.
- 그런 다음 척추판의 바깥쪽 표면에 붙어있는 근육을 오른쪽에 저항이 생길 때까지 뭉툭하게 해부합니다. 돌출부는 접합부 관절입니다. 마찬가지로 접합 관절의 근육과 근막을 무뚝뚝하게 절개합니다.
참고: 쥐의 머리 방향을 가리키는 횡돌기는 접합부 관절의 아래쪽 바깥쪽 전면에서 먼저 터치됩니다. 횡돌기 아래에는 추간공이 있는데, 추간공은 신경근과 주변 연조직으로 채워져 있어 일반적으로 찾기가 쉽지 않습니다. - 먼저 "L"자형 프로브를 사용하여 추간공의 위치를 확인한 다음 "L"자형 스테인리스 막대(직경 0.4mm, 길이 4mm로 만들어야 함)를 사용하여 추간공에 삽입합니다.
- 등뿌리 신경절이 성공적으로 압축되면 쥐는 꼬리 튕기기와 다리 굴곡 반사를 나타냅니다. 스테인리스 스틸 막대를 네 번째 및 다섯 번째 요추 추간공에 삽입합니다. 그런 다음 근육, 근막 및 피부를 층층이 봉합(3-0, 재료 표 참조)합니다.
- 쥐가 깨어날 때까지 온도 조절 상자에 쥐를 넣으십시오. 잠에서 깬 후 쥐의 오른쪽 뒷다리 기능이 정상인지 관찰하십시오. 끌림이 있으면 수술로 인해 운동 신경이 손상되었음을 의미하므로 쥐를 버려야 합니다. 오른쪽 뒷다리의 기능이 정상이면 쥐를 사용하여 케이지에 넣어 먹이를 줄 수 있습니다.
3. 투이나 테라피
- 편안한 환경 조성: Tuina 요법을 시작하기 전에 쥐가 적응할 수 있도록 30분 동안 구속 장치에 쥐를 적응시킵니다(그림 1). 이 장치는 쥐의 허벅지를 완전히 노출시키고 고정시켜 Tuina 기동을 용이하게 할 수 있습니다( 재료 표 참조).
알림: 치료실의 온도는 22-26°C, 습도는 40%-50%로 유지되어야 합니다. - Tuina의 표준화: 치료사가 Tuina의 압력과 주파수를 모니터링하고 실시간 피드백 데이터를 제공할 수 있는 무선 손가락 슬리브를 착용하도록 합니다. 먼저 손가락 소매의 피드백 데이터로 Tuina를 연습하여 힘을 5N으로, 주파수를 2Hz로 조정합니다. 그런 다음 쥐에 대해 동일한 기동을 수행하여 절차 전반에 걸쳐 일관된 힘과 빈도를 유지합니다(그림 2).
참고: 이전 작업을 기반으로 계산된 최적 가압력은 5N입니다(자세한 내용은 토론 섹션 참조). - 경혈 식별 : 오른쪽 뒷다리의 비복근을 비복근의 두 머리가 만나는 지점, 대략 BL5714의 위치에서 쥐의 투이나 영역으로 선택합니다.
- 투이나 수행: 치료사가 쥐의 허벅지 뒤쪽을 향하고 오른쪽 상지와 함께 쥐의 오른쪽 뒷다리를 잡도록 합니다. 엄지손가락을 BL57 경혈에 수직으로 놓고 팔뚝과 손가락이 힘을 가하여 5N 압력을 가하면서 리드미컬한 소범위 회전 운동을 수행하도록 합니다(그림 3).
- 치료하는 동안 조작 피드백의 힘과 주파수가 사전 설정 값과 일치하는지 확인하십시오. 수술 후 4일째부터 중재를 시작하여 Tuina는 하루에 한 번 15분 동안 18일 동안 지속적으로 시행합니다.
4. 통증에 대한 행동 검사
참고: 행동 테스트는 모델링 전, 모델링 후, 개입 1일차, 개입 3일차, 개입 7일차, 개입 14일차, 개입 17일차 및 개입 21일에 수행되었습니다.
- 아래 단계에 따라 기계적 자극 반응 임계값(Paw Withdrawal Threshold, PWT)을 수행합니다(그림 4).
- von Frey 방법을 사용하여 쥐의 발에서 기계적 자극의 반응 역치를 테스트합니다. 쥐를 20cm × 10cm × 20cm 크기의 투명한 강화 유리 구획에 넣고 40cm 높이의 10mm × 10mm 구멍이 있는 금속 와이어 격자 스탠드에 놓습니다. 실내 온도를 23 ± 2 °C로 유지하고 주변 환경을 조용하게 유지하십시오.
- 전자 Von Frey 섬유로 기계적 인출 임계값을 측정합니다( 재료 표 참조). 다리를 올리거나 피하는 등 눈에 띄게 움직일 때까지 쥐의 발 중심을 자극합니다. 기계는 최대 압력 값(N)을 자동으로 기록합니다.
- 같은 쥐를 다시 자극하기 전에 15초 이상 기다리십시오. 쥐의 발에서 촉각 감작을 방지하기 위해 각 자극을 5초 미만으로 유지하십시오. 세 번의 연속 측정값이 10N 미만으로 차이가 날 때까지 테스트를 5회 반복합니다.
- 열 자극에 대한 반응으로 PWL(Paw Withdrawal Latency)을 수행합니다(그림 5).
- Hargreaves 방법15,16을 사용하여 PWL을 평가합니다. 통풍구가 있는 투명한 유리 뚜껑이 있는 20cm x 10cm x 20cm 크기의 투명 강화 유리로 만든 작은 방에 쥐를 넣습니다. 유리 뚜껑의 중앙 영역이 안정적인 온도에 도달할 때까지 가열판을 사용하여 45°C로 가열합니다.
- 행동 테스트 단계에서 실험 결과에 대한 환경적 요인의 영향을 최소화하기 위해 매일 최소 2시간 동안 쥐를 행동 실험실에 적응시킵니다.
- 공식 테스트 전에 쥐를 행동 실험실에 30분 동안 두어 환경에 적응하고 간섭을 줄일 수 있도록 합니다.
- 가열판을 45°C로 가열하고 쥐의 뒷다리를 가열판에 놓습니다.
- 발 철수 잠복기(PWL)는 가열 시작부터 열 자극에 대한 반응으로 발 철수 반사가 나타날 때까지의 시간으로 정의되었습니다. 각 테스트에서 동일한 뒷다리를 연속으로 세 번 테스트하고 평균값을 테스트하여 해당 뒷다리의 응답 대기 시간을 구합니다. 테스트 후 쥐를 우리로 돌려보내 먹이를 줍니다.
5. 관류
- 준비: 0.9% 식염수와 4% 파라포름알데히드 용액을 미리 준비합니다. 식염수를 37°C의 일정한 온도로 설정된 오븐에 넣고 파라포름알데히드 용액을 나중에 사용할 수 있도록 4°C의 냉장고에 보관합니다.
- 마취를 수행하고 접근을 설정합니다.
- 쥐의 복강에 25% 우레탄(0.6mL/100g, 재료 표 참조)을 주입하여 깊은 마취를 유도하는 것으로 시작합니다. 발가락, 각막 또는 회전 반사가 관찰되지 않을 때까지 기다리십시오. 폼 보드에 쥐를 고정하십시오.
- 가슴뼈를 가위로 잘라 피부와 근막을 층층이 벌립니다. 횡격막을 자르고 양쪽 갈비뼈를 잘라 심장을 완전히 노출시킵니다. 심낭을 조심스럽게 분리합니다. 폐와 심장을 분리합니다.
- 집게를 사용하여 심장을 자신 쪽으로 당겨 대동맥을 당기고 노출시킵니다. 바늘, 좌심실, 대동맥을 직선으로 같은 수평면에 맞춥니다. 그런 다음 대동맥 내부에 바늘이 보일 때까지 좌심실의 바늘을 대동맥에 삽입합니다.
- 집게를 사용하여 대동맥과 대동맥 내부의 바늘을 고정한 다음 가위로 왼쪽 심방을 자릅니다. 이때 좌심방에서 많은 양의 혈액이 분출됩니다. 식염수 밸브를 열고 식염수 주입을 관류된 37°C 식염수에 연결하여 총 약 150-200mL를 만듭니다.
- 식염수 관류가 완료된 후 4% 파라포름알데히드 용액으로 전환하고 4% 파라포름알데히드 용액으로 4°C에서 총 약 400mL를 관류합니다. 파라포름알데히드 관류를 시작할 때 한 쌍의 집게로 쥐의 앞니를 잡고 앞으로 당기면서 한 손으로 꼬리를 잡고 뒤로 당기면 척추를 완전히 확장하고 추간공을 늘려 DRG 샘플링을 용이하게 하는 데 유리합니다.
- 관류하는 동안 쥐의 간, 장간막 및 대망막은 간이 뻣뻣해질 때까지 점차 창백해집니다. 그런 다음 유속을 늦추고 모든 파라포름알데히드가 관류될 때까지 초당 약 2방울로 조정합니다.
6. 등쪽 뿌리 신경절 수집
알림: 관류 후 쥐 척추의 요추 부분을 빠르게 잘라냅니다. 이 포지셔닝 방법을 사용하여 양쪽 장골능선의 가장 높은 지점을 L5 요추 가시돌기에 연결하여 L5 및 L4 추간공을 찾고 추간공에서 등근 신경절을 제거합니다. 구체적인 수집 방법은 다음과 같습니다.
- 척추관(흉추관) 입구에서 가위를 척추관에 삽입하고 모든 판판이 완전히 제거될 때까지 양쪽의 라미나를 잘라내어 척추관 전체가 노출됩니다.
알림: 박판을 절단할 때 척수와 척추관 외부의 신경근이 손상되지 않도록 주의하십시오. - 척수와 후방 종인대를 조심스럽게 제거합니다. 추간공의 안쪽 구멍에 부착된 경막을 분리합니다.
- 안과 집게를 사용하여 진주 모양이며 약간 노란색을 띤 등뿌리 신경절을 고정하고 빼냅니다.
알림: 신경 조직의 취약성과 인성이 좋지 않기 때문에 등근 신경절을 뽑을 때 강도와 당기는 방향을 파악하고 무리한 힘을 사용하지 않아야 합니다. - 등근 신경절을 뽑을 때는 경막과 지주막을 포함한 주변의 연조직을 미리 청소하여 등근 신경절이 부드럽게 당겨지도록 합니다.
- 등뿌리 신경절을 흡수성 종이에 놓고 칼날로 축삭을 잘라내고 등뿌리 신경절 표면의 혈관을 청소합니다.
- 트리밍 후, 등뿌리 신경절의 무게를 측정하고 4%의 농도와 4°C의 온도로 4% 파라포름알데히드 용액에 충분한 시간, 보통 약 2-4시간 동안 담근 다음 등뿌리 신경절을 단계적 탈수를 위해 미리 준비된 10%, 20% 및 30% PB 자당 용액(4°C)으로 옮깁니다.
7. 냉동 절제
- 등근 신경절을 0.01M PBS 용액에 넣는 것으로 시작합니다. 10분 동안 흔든 다음 자당 용액을 씻어냅니다. 등뿌리 신경절의 양쪽 부분의 축삭 섬유를 조심스럽게 다듬습니다. 냉동 절편 기계의 냉동 헤드를 청소하고 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 추가합니다( 재료 표 참조).
- 액체 질소가 들어 있는 금속 껍질 표면에 냉동 헤드를 놓고 조직이 얼 때까지 기다렸다가 제거하고 평평하게 다듬습니다. 그런 다음 냉동 헤드를 슬라이서 바닥에 놓습니다. 등뿌리 신경절 조각의 두께는 15mm여야 합니다. 얇게 썬 얇은 부분을 나무 상자에 순서대로 정리하고 빛을 피해 -20°C 냉장고에 보관합니다.
8. Hematoxylin와 Eosin 염색
- 절편을 크실렌에 2분 동안 넣고 각각 100분, 95%, 80%, 70%를 포함한 일련의 알코올로 2분 동안 탈수합니다. 그런 다음 절편을 증류수에 2분, 헤마톡실린에 1분, 수돗물 헹굼 5분을 수행하고 1% 식염수 알코올 용액에서 30초 동안 분화한 다음 포화 탄산 리튬에서 30초를 수행합니다.
- 다음으로, 증류수와 수돗물에 각각 2 분, 에오신 용액 (0.5 %)에 5 분, 증류수에 1 분 빠른 헹굼, 95 % 및 100 % 알코올에 각각 2 분씩 2 회, 중탄산 나트륨이 첨가 된 100 % 크실렌에 30 초, 크실렌에 각각 3 분씩 3 회, 그리고 마지막으로 중성 발삼으로 밀봉하십시오( 재료 표 참조).
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Representative Results
Tuina 요법은 CCD 모델링으로 인한 쥐의 기계적 및 열 자극 역치를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
투이나 요법 17일 후, 투이나 요법을 받은 CCD 쥐와 치료받지 않은 CCD 그룹 간의 PWT 역치에서 유의한 차이가 관찰되었다(P =0.021, <0.05)(그림 6 및 표 1).
투이나요법을 투여받은 CCD군의 랫트는 치료 시작부터 통증역치가 개선되는 것으로 나타났으며, 모델링 후 14일째부터 CCD군과 투이나요법을 투여받은 군에서 열통증역치에 유의한 차이가 확인되었다(P =0.0047, 0.0056, 0.0049, < 0.01)(그림 7 및 표 2).
Tuina 요법의 적용은 CCD 모델로 인한 세포 괴사를 개선하지 못했습니다
등뿌리 신경절의 HE 염색에 기초하여, "L"자형 스테인리스 막대로 물리적 압박을 받은 쥐의 CCD 그룹은 세포막 손상과 세포사멸을 일으켰습니다(그림 8). 대조적으로, 쥐의 대조군은 깔끔하게 정의된 가장자리, 온전한 뉴런 윤곽 및 전체 세포체를 가지고 있었습니다(그림 9). CCD + Tuina 그룹에서는 쥐의 등쪽 뿌리 신경절의 일부 뉴런 윤곽이 불완전했습니다(그림 10).
그림 1: 쥐용 구속 장치. Tongji University에서 제작한 수제 장치로 쥐를 효과적으로 고정시키고 뒷다리를 완전히 노출시킬 수 있습니다. 은색 나사는 쥐의 꼬리를 고정하고 쥐를 구속하는 배플을 제어합니다. 검은색 나사는 쥐의 길이에 맞게 장치를 조정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 무선 촉각력 측정 손가락 슬리브 착용. 손가락 압력의 힘과 주파수를 측정하고 표시하는 장치는 Tuina 조작 중 강도와 주파수에 대한 실시간 피드백을 제공합니다. (a) 압력 센서 및 전송 장비. (b) 손가락 압력 측정. (c) Tuina 조작 중에 측정된 힘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 쥐 Tuina의 신체 위치 및 경혈 위치. 쥐 억제기는 BL57의 위치를 완전히 노출시킬 수 있습니다. 팔다리는 엄지와 함께 쥐의 하반신을 잡아 제자리에 고정시켜 쥐가 치료 중에 조용히 협력할 수 있도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 발 철수 임계값 테스트. 쥐의 통증 행동을 측정하기 위한 테스트입니다. 그것은 기계적으로 발을 자극하고 발 철수 대기 시간을 측정하는 것을 포함합니다. (a)는 장치를 보여주고, (b)는 실험 중에 마우스에서 어떻게 조작되었는지를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 발 철수 대기 시간 테스트. 이 설정은 스포트라이트에 의해 생성된 열에 대한 민감도에 따라 쥐의 통증 역치를 측정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: Paw 인출 임계값 테스트 결과. 측정값은 평균 더하기 또는 빼기 표준 오차()
를 사용하여 표시됩니다. 각 쥐 그룹에 대해 서로 다른 단계에서 기계적 자극 유도 뒷다리 철수 반사 역치 테스트 결과. 17일째부터 CCD + Tuina와 CCD 모델 그룹 간에 유의한 차이(P < 0.05)가 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 발 철수 지연 시간 테스트 결과. 측정값은 평균 더하기 또는 빼기 표준 오차()를 사용하여 표시됩니다. 각 그룹의 여러 단계에서 열 자극으로 인한 다리 철수 반사의 역치 테스트 결과. CCD+Tuina 그룹과 CCD 모델 그룹 간에 7일째부터 유의한 차이가 관찰되었습니다(P < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: CCD 그룹(세로 절편)의 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 현미경 관찰. 이 이미지는 등뿌리 신경절의 HE로 염색된 샘플을 스캔하여 얻은 것입니다. 그림의 빨간색 타원은 일부 뉴런이 괴사를 겪고 있음을 나타냅니다. 이것은 CCD 모델이 등뿌리 신경절의 뉴런에 손상을 입혔음을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9. naive 그룹의 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 현미경 관찰(세로 단면 및 단면). 위의 그림에서 볼 수 있듯이 (a)는 종단면이고 (b)는 횡단면입니다. 쥐의 등뿌리 신경절의 빈 그룹이 모여 있는 영역에는 CCD 그룹 공석 현상이 없습니다. 뉴런은 연속적이고 조밀하며 세포체는 채워져 있습니다. 위성 신경교세포(satellite glial cell)는 뉴런 사이에 위치합니다. 눈금 막대: (a),50 μm; (b), 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: CCD + Tuina 그룹(단면)의 등뿌리 신경절 뉴런의 현미경 관찰. 뉴런은 연속적이며 세포 용해 현상이 있습니다. 이는 단기적으로 마사지 요법이 CCD 모델로 인한 세포 괴사(적색 타원)를 개선할 수 없음을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: Tuina 압력 테스트. 최소 쉿쉿 탈출 반사 압축 값을 가진 쥐는 크기가 5N에서 25N까지 다양합니다. 가로 좌표는 압력의 정도를 나타내고 세로 좌표는 쥐의 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: CCD 쥐의 X선 이미지. 쥐 모델의 X선 이미징을 사용한 CCD 제작 검증. (a)는 수직면에서 촬영한 X-ray를 나타내고, (b)시상면에서 촬영한 X-ray를 나타낸다. 두 개의 서로 다른 단면 X선을 통해 "L"자형 스테인리스강 막대의 위치를 더 명확하게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| N | 모델링 전 | 1일차 | 3일차 | 7일차 | 14일째 | 17일째 | 21일째 | |
| 순진한 | 8 | 18.1±1.4 | 16.8+1.5 | 16.8±1.5 | 18.6±1.7 | 16.8±1.5 | 15.6±1.8 | 16.8±1.5 |
| 가짜 | 8 | 18.0±1.7 | 18.6±1.7 | 16.0±1.3 | 17.6±1.7 | 16.8±1.5 | 18.9±1.7 | 16.8±1.5 |
| 증권 시세 표시기 | 8 | 17.7±1.1 | 10.7±2.8# | 10.0±1.5년 | 4.4±2.2 | 3.8±1.7 | 4.1±2.4 | 3.8±2.5 |
| CCD + 투이나 | 8 | 18.9±1.7 | 9.8±2.3# | 8.3±1.4 | 4.8±1.2 | 5.8±2.0 | 7.2±1.8* | 7.5±1.8* |
| #모델링 전과 D1 모델링 비교, p<0.05. | ||||||||
| *CCD 그룹과 CCD+Tuina 그룹의 비교, p<0.05. | ||||||||
표 1: Paw Withdrawal Threshold, PWT (, s). D1 모델링 전과 비교, #p < 0.05. CCD 그룹과 CCD + Tuina 그룹의 비교, *p < 0.05.
| N | 모델링 전 | 1일차 | 3일차 | 7일차 | 14일째 | 17일째 | 21일째 | |
| 순진한 | 8 | 11.9±1.2년 | 12.0±1.6 | 12.2±1.9 | 12.4±1.1 | 12.2±1.9 | 12.0±1.4 | 12.0±1.4 |
| 가짜 | 8 | 11.9±1.2년 | 11.6±1.5 | 12.2±1.9 | 11.6±1.5 | 12.2±0.9 | 11.6±1.5 | 11.6±1.5 |
| 증권 시세 표시기 | 8 | 10.8±1.1 | 8.9±0.7# | 7.9±0.8 | 7.7±0.5 | 7.8±1.0 | 7.7±0.8 | 7.7±0.8 |
| CCD + 투이나 | 8 | 11.3±1.5 | 9.1±0.6# | 8.0±0.7 | 8.3±0.7* | 8.9±0.6* | 9.1±0.7* | 9.2±0.9* |
| #모델링 전과 D1 모델링 비교, p < 0.05. | ||||||||
| CCD군과 CCD+투이나군을 비교한 결과,*p < 0.05. | ||||||||
표 2: Paw Withdrawal Latency, PWL (, s). D1 모델링 전과 비교, #p < 0.05. CCD 그룹과 CCD + Tuina 그룹의 비교,*p < 0.05.
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Discussion
우리 연구 그룹은 초기 단계에서 Tuina 조작의 매개 변수에 대한 관련 연구를 수행했습니다. 먼저 Tuina 조작을 위한 힘 강도를 설정하는 것이 중요합니다. 임상 Tuina에서 의사는 자신의 경험과 환자의 주관적인 감정에 따라 힘의 강도를 조정하여 의사 소통을 통해 최상의 Tuina 효과를 얻습니다. 그러나 이것은 동물 실험에서 실현 가능하지 않습니다. 동물 실험에서 "반응 역치"는 Tuina 조작의 강도를 정의하는 데 사용됩니다. 이들은 동물의 본능적 반응에 따라 적용된 투이나 힘이 적절한지 여부를 판단합니다. Randall17 은 쥐 염증 모델에서 통증 행동을 연구하기 위해 이 방법을 사용했습니다. 차이점은 Randall은 국소 염증 부위에서 수술한 반면, 이 실험은 부상이 없는 부위에서 수술했다는 것입니다. 무거운 Tuina 조작은 쥐가 비명을 지르고 반사 신경을 탈출하게 만듭니다. 이 무거운 힘 강도의 설정은 공식 Tuina 힘 강도가 이 무거운 힘 강도보다 작다는 것을 결정합니다. 평균 및 표준 편차가 9.93과 3.018인 5-25N 사이의 쥐 150마리의 최대 비명 및 탈출 반사 누름 값의 분포를 기반으로 (그림 11) 이전 연구에서 최적의 가압력 값을 5N으로 계산했습니다. 둘째, 투이나법의 동작 주파수는 투이나의 과학(Science of Tuina)에서 120-160회/분(18)으로 기술되어 있다. 따라서 이 실험에서 Tuina 주파수는 2Hz로 설정되었습니다.
CCD 모델은 관절 돌기와 추간공에 노출되어야 하기 때문에 외상이 될 수 있는 수술 모델입니다. 따라서 쥐는 수술 후 회복하는 데 1-3일이 필요합니다. 문헌과 예비 실험 데이터에 따르면 쥐의 통증 행동은 수술 후 4일째에 안정적인 경향이 있습니다. 이것은 Tuina 개입의 진통 효과를 관찰하기에 유리한 시간을 제공합니다. 그러나 투이나를 장기간 방치하면 쥐의 진통 효과에 도움이 되지 않을 수 있으며 조직 손상으로 이어질 수 있습니다. 이 연구는 5분, 15분, 30분 동안 투이나와 반죽의 진통 효과를 비교한 결과, 최종적으로 최적의 중재 기간으로 15분을 선택했다.
이 방법은 임상 수술의 일부만 조작과 신체 부위를 선택하는 데 사용되었기 때문에 한계가 있습니다. BL57(Chengshan)은 쥐의 삼두근(triceps surae)에 위치하고 있으며, L4와 L519의 등근 신경절(dorsal root ganglia)에 의해 신경이 분포되어 있다. 삼두근은 두껍고 투이나에 적합하기 때문에 이 부위를 마사지하면 실험적 샘플링에 사용되는 쥐 요추의 L4 및 L5 등근 신경절에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다.
성형 과정에서 X선 검증을 수행하여 CCD 통증 모델에서 L4 및 L5의 추간공에 "L"자형 스테인리스 스틸 막대를 정확하게 삽입해야 합니다. X-ray를 촬영하기 전에 쥐를 마취하기 위해 복강내 25% 지속 시간 마취(0.6mL/100g)를 투여했습니다. X-ray는 L4 및 L5의 추간공에 "L"자형 스테인리스강 막대가 성공적으로 삽입된 것을 확인했습니다(그림 12).
전반적으로, 이 연구는 Tuina 치료 작업을 관찰하고 CCD 쥐에 대한 Tuina의 치료 효과를 평가하는 데 중점을 두었습니다. 연구팀은 투이나의 파라미터를 설정하고, 적절한 부위를 선택하고, 적절한 처리 시간을 결정하는 방법을 알아보기 위해 동물 실험을 진행했다. 이것은 Tuina의 진통 효과에 대한 향후 연구를 위해 표준화되고 재현 가능한 동물 모델 중재 시연을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 ShanghaiCritical Clinical Specialties ConstructionProject(보조금 번호: Shslczdzk04001)의 지원을 받았습니다. 상하이 과학 기술위원회의 항해 프로그램 (보조금 번호 : 22YF1444300); Shanghai University of Traditional Chinese Medicine(보조금 번호: 2021LK091)의 예산 범위 내 프로젝트.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter) | hand-made | / | For CCD models making |
| ALMEMO admeasuring apparatus | ahlborn | 2450-1 | Mechanical Withdrawal Threshold test |
| Constant temperature slicer CM-1900 | Leica | 1491950C1US | For specimen production |
| Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle | LIRCON/Shandong Lilkang | / | For disinfection |
| Disposable sterile syringe 5 mL | Shanghai Misha Wa Medical Industry | / | For injection |
| Electron microscope CX-31 | Olympus, Japan | BJ002318 | For specimen observation |
| Finger pressure recordings | Suzhou Changxian Optoelectronic Technology | CX1003w | For Tuina manipulation |
| Foam board (35 cm x 20 cm) | hand-made | / | It is our homemade apparatus for fixing rats |
| MERSILK W2512 | Johnson & Johnson | / | For tissue suture |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent | 10004160 | For specimen production |
| paraformaldehyde | China National Chemical Reagent | / | For specimen production |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | For anesthesia of rat |
| Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats | IITC Life Science | / | Paw Withdrawal Latency |
| Precision electronic scale for experiment JY3002 | Shanghai Precision Scientific Instrument | / | Weighing of rat |
| Rat hair clipper | Philips | HP6341/00 | Shaving of rat fur |
| Restrainer for rats | Tongji University (self-made) | / | It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs. |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | For specimen production |
| Uratan | China National Chemical Reagent | / | For anesthesia of rat |
| X-ray detector XR-600 | Dongguan Kaso Electronic Technology | / | Examination of CCD models |
| xylene | Shanghai Sinopharm Group | 100092 | For specimen production |
References
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