Summary
מאמר זה מציג מניפולציה לטיפול בדחיסה כרונית של גנגליון השורש הגבי בחולדות באמצעות טיפול טווינא, יחד עם שיטה להערכת יעילותו בהתבסס על התנהגות כאב ותוצאות היסטופתולוגיות.
Abstract
כאב נוירופתי הוא מצב שכיח המשפיע על 6.9%-10% מהאוכלוסייה ונובע מפגיעה עצבית עקב אטיולוגיות שונות, כגון פריצת דיסק מותני, היצרות תעלת עמוד השדרה והיצרות הפתח הבין חולייתי. למרות שטווינה, טיפול ידני סיני מסורתי, הראה השפעות משככות כאבים בפרקטיקה הקלינית לטיפול בכאב נוירופתי, המנגנונים הנוירוביולוגיים הבסיסיים שלו עדיין אינם ברורים. מודלים של בעלי חיים חיוניים להבהרת העקרונות הבסיסיים של טווינה. במחקר זה, אנו מציעים פרוטוקול Tuina סטנדרטי עבור חולדות עם דחיסה של גנגליון שורש גבי (DRG), הכולל גרימת דחיסת DRG על ידי החדרת מוט נירוסטה לתוך הפתח הבין חולייתי, ביצוע מניפולציה Tuina עם פרמטרים ספציפיים של מיקום, עוצמה, ותדירות בסביבה מבוקרת, והערכת התוצאות ההתנהגותיות וההיסטופתולוגיות של טיפול Tuina. מאמר זה דן גם בהשלכות ובמגבלות הקליניות האפשריות של המחקר ומציע כיוונים למחקר עתידי על טווינה.
Introduction
במסגרות קליניות, מקובל לצפות בכאב פתולוגי נוירולוגי הנגרם על ידי דחיסת שורש עצב מסיבות שונות. הצורה האופיינית ביותר של כאב נוירופתי זה היא פריצת דיסק מותני (LDH), שהיא לעתים קרובות מתמשכת, חוזרת וקשה לריפוי. כ-9% מאוכלוסיית העולם מושפעת מ-LDH, מה שמוביל לנטל חברתי וכלכלי משמעותי1. שכיחות סוג זה של כאב נוירופתי עולה מדי שנה, עם מגמה כלפי חולים צעירים יותר, עקב שינויים בייצור האנושי ובאורח החיים2. למרות השימוש במשככי כאבים שאינם סטרואידים, לא ניתן להקל לחלוטין על הסימפטומים של החולים. כתוצאה מכך, טיפולים אלטרנטיביים, כגון Tuina, לטיפול בכאב הנגרם על ידי LDH זכו לתשומת לב גוברת.
טיפול טווינא, סוג של טיפול שמרני ב- LDH, מומלץ באופן נרחב בהנחיות קליניות שונות ברחבי העולם למניעה וטיפול בכאבי גב תחתון 3,4. מחקרים הראו כי Tuina יכול להפחית באופן משמעותי גורמים דלקתיים כגון IL-6 בסרום וגורם נמק הגידול אלפא (TNF-α) בחולי LDH תוך שיפור הכאב של החולים ופגיעה בתפקוד המותני5. עם זאת, המנגנון הספציפי מאחורי ההשפעות משככות הכאב של טיפול Tuina עדיין לא ברור.
מודלים של בעלי חיים הם כלי רב ערך לחקר כאב נוירופתי הנגרם על ידי LDH6. הם מאפשרים מדידות התנהגותיות כדי להעריך את היעילות של טיפול Tuina ולספק דגימות של הפיזיולוגיה הפתולוגית של LDH. לדוגמה, דגימות מגרעיני השורש הגבי בירך ניתן לקחת כדי לאמת שינויים בתאי גנגליון שורש גבי. הדחיסה הכרונית של מודל גנגליון שורש הגב (CCD) משמשת בדרך כלל להערכת הפיזיולוגיה הפתולוגית של LDH, שכן היא גורמת נזק למורפולוגיה של תאי גנגליון שורש גבי התואמים את השינויים הפתולוגיים הנראים במקרים קליניים של דחיסת עצבים הנגרמת על ידי פריצת דיסק7.
חוקרים רבים ערכו מספר ניסויים בבעלי חיים על שיכוך כאבים אקופרסורה 8,9,10. עם זאת, כאשר מיישמים פעולות אקופרסורה על מודלים של בעלי חיים, הם לעתים קרובות מחקים אקופרסורה אנושית. ההשפעה הטיפולית של אקופרסורה מושפעת מגורמים כגון גודל, תדירות וכיוון הכוח המופעל11,12,13. אם הניסוי חסר תקן אקופרסורה אחיד, כגון הכוח, התדירות ומשך הפעולה, הדבר עלול לגרום לסטייה מסוימת בתוצאות הניסוי. מאמר זה מציג סדרה של תוכניות טיפול באקופרסורה המבוססות על המאפיינים של חולדות CCD, ומקדם את הפיתוח של פעולות אקופרסורה סטנדרטיות במודלים של בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבודה זו בוצעה במעבדת הכאב של המכון לנוירוביולוגיה באוניברסיטת פודאן. הניסויים אושרו ונשמרו בקפדנות על ההנחיות להגנה על חיות מעבדה שנקבעו על ידי האגודה הבינלאומית לחקר הכאב (LASP) לכל ההליכים הכירורגיים והטיפול בבעלי חיים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley (SD), שכללו 32 זכרים בגילאי 40-50 יום, במשקל ממוצע של 220 ±-1.38 גרם. חולדות אלה התקבלו ממרכז החיות הניסיוני של האקדמיה למדעי החיים בשנחאי, האקדמיה הסינית למדעים. בעלי החיים טופלו כראוי ושוכנו בחדר ייעודי עם אוורור עצמאי, טמפרטורה מווסתת (22 ± 1 מעלות צלזיוס) ולחות (40%-50%). לחולדות הייתה גישה למזון ומים נאותים בכלובים שלהן. חדר חיות המעבדה פעל במחזור אור-חושך של 12 שעות כדי לשמור על סדירות השעון הביולוגי של החולדות, ואנשי צוות ייעודיים החליפו באופן קבוע את הריפוד. צילום הרנטגן בוצע במחלקת הרדיולוגיה של בית החולים Yueyang לרפואה סינית מסורתית ומערבית משולבת, המסונף לאוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית.
1. משתתפי המחקר והקבצתו
- הקצו 32 חולדות לארבע קבוצות: נאיבית (בקרה), דמה (פעולת דמה), CCD (דחיסת גנגליון שורש גבי כרונית) ו-CCD + Tuina (8 חולדות לקבוצה). לחולדות הייתה גישה חופשית למזון ומים במתקנים לבעלי חיים.
הערה: לחולדות נאיביות לא הייתה התערבות, בעוד שקבוצת הדמה עברה את אותו הליך כירורגי כמו חולדות קבוצת CCD, אך מבלי להשאיר מוט נירוסטה בצורת "L" בפתח הבין חולייתי L4 ו- L5. חולדות בקבוצת CCD עברו ניתוח מלא של מודל דחיסת גנגליון שורש גבי כרוני. חולדות בקבוצת CCD + Tuina קיבלו טיפול בטווינא החל מהיום הרביעי לאחר ניתוח CCD.
2. ביסוס מודל בעלי חיים
- מתן איזופלואורן להרדמת חולדות. ברגע שהחולדות מאבדות את הכרתן (ללא רפלקס תנועת זנב או רפלקס כיפוף רגליים), יש לגלח את השיער באזור הניתוח באמצעות סכין גילוח.
הערה: תרופות משככי כאבים יושמו 15 דקות לפני הניתוח וחולדות הוזרקו תת עורית עם טרמדול 20 מ"ג / ק"ג. - אבטחו את החולדה על לוח קצף (ראו טבלת חומרים) והשתמשו בגומיות כדי לאבטח את הגפיים והחותכות שלה. נגבו את האזור המוכן עם הכנה סטרילית של אלכוהול ויוד לסירוגין במשך 3 מחזורים לפחות.
- הכנס את הבדיקה בצורת "L" (ראה טבלת חומרים).
- השתמשו במספריים כדי לבצע חתך של 2-3 ס"מ דרך העור, הפאשיה השטחית והפאשיה העמוקה שכבה אחר שכבה. ראשית, אתר את עמוד השדרה האיליאק העליון הקדמי, המתאים לעמוד השדרה המותני החמישי. לאחר מכן, אתר ברצף את התהליכים השדרתיים השלישי והרביעי.
- הדקו את התהליך הספינוסי עם מלקחיים עם שיניים והרימו אותו כדי לאפשר למספריים להיות קרובים לצד הימני של התהליך הספינוסי ולחתוך את השריר המחובר לצד הימני של תהליך עמוד השדרה.
- לאחר מכן, לנתח בבוטות את השריר המחובר למשטח החיצוני של לוחית החוליות עד שיש התנגדות לצד ימין. הבליטה היא המפרק הזיגאפופיסיאלי. באופן דומה, לנתח בבוטות את השריר ואת fascia על המפרק zygapophysial.
הערה: התהליך הרוחבי המצביע על כיוון ראשה של החולדה ייגע תחילה בחזית החיצונית התחתונה של מפרק הזיגאפופיסיאל. מתחת לתהליך הרוחבי נמצא הפתח הבין חולייתי, המלא בשורשי עצבים וברקמות רכות שמסביב ובדרך כלל לא קל למצוא אותו. - ראשית, השתמש בבדיקה בצורת "L" כדי לקבוע את מיקום הפתח הבין חולייתי, ולאחר מכן השתמש במוט נירוסטה בצורת "L" (שצריך להיות מיוצר בקוטר של 0.4 מ"מ ובאורך של 4 מ"מ) כדי להחדיר אותו לפתח הבין חולייתי.
- אם גנגליון השורש הגבי נדחס בהצלחה, החולדה תציג תנועת זנב ורפלקס כיפוף רגליים. הכנס את מוט הנירוסטה לפתח הבין חולייתי המותני הרביעי והחמישי. לאחר מכן, תפרו (3-0, ראו טבלת חומרים) את השריר, הפאשיה והעור שכבה אחר שכבה.
- הניחו את החולדה בקופסה תרמוסטטית עד שתתעורר. לאחר התעוררות, שימו לב אם תפקוד הגפה האחורית הימנית של החולדה תקין. אם יש גרירה, זה אומר שהניתוח פגע בעצבים המוטוריים, ויש להשליך את החולדה. אם תפקוד הגפה האחורית הימנית תקין, ניתן להשתמש בחולדה ולהכניס אותה לכלוב להאכלה.
3. טיפול Tuina
- צרו סביבה נוחה: לפני התחלת טיפול בטווינה, הקדישו את החולדה לרסן למשך 30 דקות כדי לאפשר לה להסתגל (איור 1). מכשיר זה יכול לחשוף באופן מלא את הירך של החולדה ולשתק אותה, מה שמקל על תמרוני טווינה (ראו טבלת חומרים).
הערה: הטמפרטורה בחדר הטיפולים צריכה להישמר בין 22-26 מעלות צלזיוס, והלחות צריכה להיות בין 40%-50%. - סטנדרטיזציה של Tuina: ודא שהמטפלים לובשים שרוולי אצבע אלחוטיים שיכולים לנטר את הלחץ והתדירות של Tuina ולספק נתוני משוב בזמן אמת. ראשית, לתרגל Tuina עם נתוני משוב של שרוולי האצבע, התאמת הכוח ל 5 N ואת התדר ל 2 הרץ. לאחר מכן, בצעו את אותם תמרונים על החולדות, ושמרו על כוח ותדירות עקביים לאורך כל התהליך (איור 2).
הערה: בהתבסס על עבודתנו הקודמת, כוח הלחיצה האופטימלי המחושב הוא 5 N (ראה סעיף דיון לפרטים). - זהה את נקודת הדיקור: בחר את שריר הגסטרוקנמיוס של הגפה האחורית הימנית כאזור טווינה של החולדה, בצומת של שני ראשי שריר הגסטרוקנמיוס, בערך במיקום של BL5714.
- בצעו את הטווינה: ודאו שהמטפל פונה לאספקט האחורי של ירך החולדה ומחזיק את הגפה האחורית הימנית של החולדה עם הגפה העליונה הימנית. מקם את האגודל אנכית על נקודת הדיקור BL57, וודא שהאמה והאצבעות מפעילות כוח כדי לבצע תנועה סיבובית קצבית לטווח קטן תוך הפעלת לחץ של 5 N (איור 3).
- במהלך הטיפול, ודא שהכוח והתדירות של משוב המניפולציה תואמים את הערכים שנקבעו מראש. התחל את ההתערבות מהיום הרביעי לאחר הניתוח, עם Tuina מבוצע פעם ביום במשך 15 דקות, ברציפות במשך 18 ימים.
4. בדיקה התנהגותית לכאב
הערה: מבחנים התנהגותיים נערכו לפני מידול, לאחר מידול, ביום התערבות 1, יום התערבות 3, יום התערבות 7, יום התערבות 14, יום התערבות 17, ויום התערבות 21.
- בצע סף תגובה לגירוי מכני (Paw Withdrawal Threshold, PWT) לפי השלבים הבאים (איור 4).
- השתמשו בשיטת פון פריי כדי לבדוק את סף התגובה של גירוי מכני בכפות רגליהן של החולדות. הניחו את החולדות בתא זכוכית מחוסמת שקוף בגודל 20 ס"מ × 10 ס"מ × 20 ס"מ, שהונח על מעמד רשת תיל מתכת עם פתחים של 10 מ"מ × 10 מ"מ בגובה של 40 ס"מ. שמור על טמפרטורת החדר ב 23 ± 2 °C (75 °F), והסביבה שקטה.
- מדדו את סף המשיכה המכנית בעזרת סיבי פון פריי אלקטרוניים (ראו טבלת חומרים). לגרות את מרכז כף הרגל של החולדה עד שהיא נעה באופן ניכר, כגון הרמת הרגל או הימנעות ממנה. ההתקן רושם את ערך הלחץ המרבי (N) באופן אוטומטי.
- המתינו 15 שניות או יותר לפני שתעוררו שוב את אותה חולדה. שמור על כל גירוי מתחת ל -5 שניות כדי למנוע רגישות מישושית בכפות החולדה. חזור על הבדיקה חמש פעמים עד ששלוש המדידות העוקבות שונות בפחות מ- 10 N.
- בצעו חביון למשיכת כפות (PWL) בתגובה לגירוי תרמי (איור 5).
- הערך את PWL באמצעות שיטת Hargreaves15,16. הניחו את החולדות בתא קטן עשוי זכוכית מחוסמת שקופה, בגודל 20 ס"מ x 10 ס"מ x 20 ס"מ, עם מכסה זכוכית שקוף עם חור אוורור. מחממים את האזור המרכזי של מכסה הזכוכית ל-45°C באמצעות פלטת חימום עד שהוא מגיע לטמפרטורה יציבה.
- במהלך שלב הבדיקה ההתנהגותית, יש להרגיל את החולדות למעבדה ההתנהגותית למשך שעתיים לפחות בכל יום כדי למזער את ההשפעה של גורמים סביבתיים על תוצאות הבדיקה.
- לפני הבדיקה הרשמית, הניחו את החולדות במעבדה ההתנהגותית למשך 30 דקות כדי לאפשר להן להסתגל לסביבה ולהפחית הפרעות.
- חממו את פלטת החימום ל-45°C, והניחו את הגפיים האחוריות של החולדה על צלחת החימום.
- חביון נסיגת הכפות (PWL) הוגדר כזמן מתחילת החימום ועד להופעת רפלקס נסיגת הכפות בתגובה לגירוי תרמי. בכל בדיקה, בדוק את אותה גפה אחורית שלוש פעמים ברציפות, ואת הערך הממוצע כדי לקבל את חביון התגובה של אותה גפה אחורית. לאחר הבדיקה, החזירו את החולדות לכלובים שלהן להאכלה.
5. זילוח
- אופן ההכנה: הכינו מראש תמיסת מלח 0.9% ותמיסת פרפורמלדהיד 4%. הכניסו את תמיסת המלח לתנור לטמפרטורה קבועה של 37°C, ואחסנו את תמיסת הפרפורמאלדהיד במקרר בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.
- לבצע הרדמה וליצור גישה.
- התחילו בהזרקת 25% אורתאן (0.6 מ"ל/100 גרם, ראו טבלת חומרים) לחלל הבטן של החולדה כדי לגרום להרדמה עמוקה. המתן עד שלא נצפה שום רפלקס של בוהן, קרנית או סיבוב. תקנו את החולדה על לוח קצף.
- חותכים את עצם החזה במספריים ופותחים את העור ואת הפאשיה שכבה אחר שכבה. חותכים את הסרעפת וחותכים את הצלעות משני הצדדים כדי לחשוף את הלב במלואו. בזהירות להפריד את קרום הלב. להפריד את הריאות מהלב.
- השתמש במלקחיים כדי למשוך ולחשוף את אבי העורקים על ידי משיכת הלב לכיוון עצמך. יישרו את המחט, החדר השמאלי ואבי העורקים בקו ישר ובאותו מישור אופקי. לאחר מכן הכנס את המחט מהחדר השמאלי לתוך אבי העורקים עד שהמחט נראית בתוך אבי העורקים.
- השתמש במלקחיים כדי להדק את אבי העורקים ואת המחט בתוך אבי העורקים, ולאחר מכן לפתוח את אטריום שמאל עם מספריים. בשלב זה, כמות גדולה של דם תזלוג מהאטריום השמאלי. פתח את השסתום לתמיסת המלח וחבר את הזרקת המלח לניקוב תמיסת מלח 37 מעלות צלזיוס, בסך הכל כ 150-200 מ"ל.
- לאחר השלמת זילוח המלח, עברו לתמיסת פרפורמלדהיד 4% ונקבו עם תמיסת פרפורמלדהיד 4% בסך הכל כ-400 מ"ל ב-4°C. כאשר מתחילים את הזלוף paraformaldehyde, להחזיק את השיניים הקדמיות של החולדה עם זוג אחד של מלקחיים ולמשוך אותם קדימה, תוך אחיזת הזנב ביד אחת ומשיכת אותו לאחור, וזה יתרון להארכה מלאה של עמוד השדרה והגדלת הפתח הבין חולייתי כדי להקל על דגימת DRG.
- במהלך הזילוח, הכבד של החולדה, המזנטריה והאומנטום הגדול יותר הופכים בהדרגה מחווירים עד שהכבד נעשה נוקשה. לאחר מכן, האטו את קצב הזרימה והתאימו אותו לכ-2 טיפות לשנייה עד שכל הפרפורמלדהיד מחורר.
6. אוסף גנגליון שורש דורסלי
הערה: לאחר זילוח, חתכו במהירות את החלק המותני בעמוד השדרה של החולדה. אתר את הפתח הבין חולייתי L5 ו- L4 על ידי חיבור הנקודות הגבוהות ביותר של הפסגה האיליאק משני הצדדים לתהליך עמוד השדרה המותני L5 בשיטת מיקום זו, והסר את גנגליון השורש הגבי מהפתח הבין חולייתי. שיטת הגבייה הספציפית היא כדלקמן:
- מפתח תעלת עמוד השדרה (תעלת עמוד השדרה החזי), הכנס את המספריים לתעלת עמוד השדרה וחתך את הלמינה משני הצדדים עד שניתן להסיר לחלוטין את כל הלמינה, תוך חשיפת תעלת עמוד השדרה כולה.
הערה: היזהר שלא לפגוע בחוט השדרה ובשורשי העצבים מחוץ לתעלת עמוד השדרה בעת חיתוך הלמינה. - הסר בזהירות את חוט השדרה ואת הרצועה האורכית האחורית. מפרידים את הדורה מאטר המחוברת לחור הפנימי של הפתח הבין חולייתי.
- השתמש במלקחיים אופתלמיים כדי להדק ולשלוף את גנגליון השורש הגבי, שצורתו כפנינה וצהבהב מעט.
הערה: בשל השבריריות והקשיחות הירודה של רקמת העצבים, יש צורך לתפוס את הכוח ואת כיוון המשיכה בעת משיכת גנגליון שורש הגב ולא להשתמש בכוח הזרוע. - בעת שליפת גנגליון השורש הגבי, הקפד לנקות את הרקמות הרכות שמסביב, כולל דורה מאטר וארכנואיד, מראש כדי להקל על משיכה חלקה של גנגליון שורש הגב.
- מניחים את גנגליון השורש הגבי על נייר סופג, חותכים את האקסון בעזרת להב ומנקים את כלי הדם על פני גנגליון השורש הגבי.
- לאחר החיתוך, שוקלים את גנגליון השורש הגבי וטובלים אותו בתמיסת פרפורמלדהיד 4% עם ריכוז של 4% וטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך זמן מספיק, בדרך כלל כ 2-4 שעות, ולאחר מכן מעבירים את גנגליון השורש הגבי לתמיסת סוכרוז PB של 10%, 20% ו- 30% PB (4 מעלות צלזיוס) שהוכנה מראש להתייבשות הדרגתית.
7. Cryosectioning
- התחל על ידי הצבת גנגליון שורש הגב בתמיסת PBS 0.01 M. נערו אותם במשך 10 דקות ולאחר מכן שטפו את תמיסת הסוכרוז. חותכים בזהירות את סיבי האקסון של שני המקטעים של גרעיני השורש הגבי. נקו את ראש ההקפאה של מכונת ההקפאה והוסיפו לו את תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) (ראו טבלת חומרים).
- מניחים את ראש ההקפאה על פני מעטפת מתכת המכילה חנקן נוזלי, ממתינים עד שהרקמה קפואה, מסירים אותה וחותכים אותה שטוחה. לאחר מכן, מניחים את ראש ההקפאה על בסיס כלי הפריסה. עובי פרוסות גרעיני השורש הגבי צריך להיות 15 מ"מ. סדרו את החלקים הדקים החתוכים בקופסת עץ לפי הסדר ואחסנו אותם במקרר בטמפרטורה של -20°C, הרחק מאור.
8. צביעת Hematoxylin ו Eosin
- מניחים את המקטעים 2 דקות בקסילן, ומייבשים אותם בסדרה של אלכוהולים, כולל 100%, 95%, 80% ו-70%, למשך 2 דקות כל אחד. לאחר מכן מניחים את המקטעים 2 דקות במים מזוקקים, דקה אחת בהמטוקסילין, מבצעים 5 דקות של שטיפת מי ברז, ומבצעים התמיינות בתמיסת אלכוהול מלוחים 1% למשך 30 שניות, ואחריה 30 שניות בליתיום קרבונט רווי.
- לאחר מכן, מניחים את הפרוסות 2 דקות כל אחת במים מזוקקים ומי ברז, 5 דקות בתמיסת אאוזין (0.5%), שטיפה מהירה של דקה אחת במים מזוקקים, שני סיבובים של 2 דקות כל אחד ב-95% ו-100% אלכוהול, 30 שניות ב-100% קסילן בתוספת סודיום ביקרבונט, שלושה סיבובים של 3 דקות כל אחד בקסילן, ולבסוף, חותמים עם בלסם ניטרלי (ראו טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טיפול בטווינה יכול לעזור להפחית את ספי הגירוי המכני והתרמי של חולדות הנגרמים על ידי מידול CCD
לאחר 17 ימים של טיפול בטווינה, נצפה הבדל משמעותי בספי PWT בין חולדות CCD שקיבלו טיפול בטווינה לבין קבוצת ה-CCD שלא טופלה (P = 0.021, <0.05) (איור 6 וטבלה 1).
החולדות בקבוצת ה-CCD שקיבלו טיפול בטווינה הראו שיפור בסף הכאב מתחילת הטיפול, ונמצא הבדל משמעותי בסף הכאב התרמי בין קבוצת ה-CCD לבין הקבוצה שקיבלה טיפול בטווינה מהיום ה-14 לאחר המידול (P = 0.0047, 0.0056, 0.0049, < 0.01) (איור 7 וטבלה 2).
היישום של טיפול Tuina לא שיפר את נמק התא שנגרם על ידי מודל CCD
בהתבסס על צביעת HE של גרעיני השורש הגבי, קבוצת החולדות CCD, שהיו נתונות לדחיסה פיזית עם מוט נירוסטה בצורת "L", גרמה נזק לקרום התא ולאפופטוזיס (איור 8). לעומת זאת, לקבוצת הביקורת של החולדות היו קצוות מוגדרים היטב, קווי מתאר שלמים של תאי עצב וגופי תאים מלאים (איור 9). בקבוצת CCD + Tuina, חלק מקווי המתאר של תאי העצב בגרעיני השורש הגבי של חולדות לא היו שלמים (איור 10).
איור 1: ריסון לחולדות. זהו מכשיר תוצרת בית שיוצר על ידי אוניברסיטת טונג'י, אשר יכול לשתק ביעילות את החולדות ולחשוף באופן מלא את הגפיים האחוריות שלהם. בורג הכסף שולט במבוכה שאוחזת בזנב החולדה ומרסנת אותה. הבורג השחור מתאים את המכשיר לאורך החולדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: לבישת שרוולי אצבע למדידת כוח מישוש אלחוטי. מכשיר המודד ומציג את הכוח והתדירות של לחץ האצבע מספק משוב בזמן אמת על העוצמה והתדירות במהלך מניפולציה של טווינה. (א) חיישן לחץ וציוד שידור. (ב) מדידות לחץ אצבע. (ג) הכוח שנמדד במהלך מניפולציה של טווינא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיקום הגוף ומיקום הדיקור של חולדה טווינה. מרסן החולדות יכול לחשוף לחלוטין את המיקום של BL57. הגפיים, יחד עם האגודל, אוחזות בגפיים התחתונות של החולדה כדי לקבע אותן במקומן כך שהחולדה תוכל לשתף פעולה בשקט במהלך הטיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. מבחן סף משיכה כפות. זהו מבחן למדידת התנהגות כאב אצל חולדות. זה כרוך באופן מכני גירוי הרגליים שלהם ומדידת חביון הנסיגה שלהם כפות. (א) מראה את המנגנון, ו-(ב) מראה כיצד הוא הופעל על העכבר במהלך הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: בדיקת חביון משיכת כפות. מערך זה מודד את סף הכאב של החולדות לפי רגישותן לחום שנוצר על ידי זרקור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים 6: תוצאות מבחן סף הנסיגה של Paw. מדידות מיוצגות באמצעות שגיאת תקן ממוצע פלוס או חיסור (
). תוצאות בדיקת סף רפלקס נסיגה בגפיים האחוריות המושרה על ידי גירוי מכני בשלבים שונים עבור כל קבוצת חולדות. הבדלים משמעותיים (P < 0.05) נצפו בין קבוצות מודל CCD + Tuina לבין קבוצות מודל CCD מהיום ה-17 ואילך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תוצאות בדיקת חביון משיכת כפות. מדידות מיוצגות באמצעות שגיאת תקן ממוצע פלוס או חיסור (). תוצאות בדיקות סף של רפלקס נסיגה מרגליים המושרה על ידי גירוי חום בשלבים שונים של חולדות בכל קבוצה. הבדלים משמעותיים נצפו בין קבוצת CCD + Tuina לבין קבוצת מודל CCD החל מהיום השביעי (P < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: תצפית מיקרוסקופית של נוירוני גנגליון שורש גבי בקבוצת CCD (חתך אורך). תמונה זו התקבלה על ידי סריקת הדגימה המוכתמת HE-של גנגליון השורש הגבי. האליפסה האדומה באיור מצביעה על כך שחלק מהנוירונים עוברים נמק. זה מצביע על כך שמודל CCD גרם נזק לנוירונים בגנגליון השורש הגבי. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9. תצפית מיקרוסקופית של נוירוני גנגליון שורש גבי בקבוצה התמימה (חתך אורך וחתך רוחב). כפי שניתן לראות באיור לעיל, (א) הוא חתך אורך, ו-(ב) הוא חתך רוחבי. אין תופעה של קבוצת CCD פנויה באזור שבו הקבוצה הריקה של גרעיני השורש הגבי של חולדות נאספת. תאי העצב רציפים וקומפקטיים, וגופי התא מלאים. תאי גליית הלוויין ממוקמים בין תאי העצב. סרגל קנה מידה: (a),50 מיקרומטר; (ב), 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: תצפית מיקרוסקופית של נוירוני גנגליון שורש גבי בקבוצת CCD + Tuina (חתך רוחב). תאי העצב רציפים, ויש תופעה של פירוק תאים. זה מצביע על כך שבטווח הקצר, טיפול בעיסוי לא הצליח לשפר את נמק התא (אליפסה אדומה) שנגרם על ידי מודל CCD. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: מבחן לחץ טווינה. חולדות עם ערכי דחיסה מינימליים של רפלקס רחיקה-בריחה משתנות בגודלן, ונעות בין 5 N ל-25 N. האבסיסה מייצגת את מידת הלחץ, ואילו הקואורדינטה מייצגת את מספר החולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: צילומי רנטגן של חולדות CCD. תיקוף ייצור CCD באמצעות הדמיית רנטגן של מודלים של חולדות. (א) מראה את צילום הרנטגן שצולם במישור האנכי, ו-(ב) מראה את צילום הרנטגן שצולם במישור הקשת. שני צילומי הרנטגן השונים מאפשרים תצוגה ברורה יותר של מיקום מוט הנירוסטה בצורת "L". אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| N | לפני הדוגמנות | D1 | ד3 | D7 | D14 | D17 | D21 | |
| נאיבי | 8 | 18.1±1.4 | 16.8+1.5 | 17.8±1.5 | 18.6±1.7 | 17.8±1.5 | 15.6±1.8 | 17.8±1.5 |
| שאם | 8 | 18.0±1.7 | 18.6±1.7 | 16.0±1.3 | 17.6±1.7 | 17.8±1.5 | 30.5±1.7 | 17.8±1.5 |
| CCD | 8 | 17.7±1.1 | 10.7±2.8# | 10.0±1.5 | 4.4±2.2 | 3.8±1.7 | 4.1±2.4 | 3.8±2.5 |
| CCD + Tuina | 8 | 30.5±1.7 | 9.8±2.3# | 8.3±1.4 | 4.8±1.2 | 5.8±2.0 | 7.2±1.8* | 7.5±1.8* |
| #השוואה לפני ומידול D1, עמ' <0.05. | ||||||||
| *השוואה בין קבוצת CCD לקבוצת CCD+Tuina, עמ' <0.05. | ||||||||
טבלה 1: סף משיכת כפות, PWT (, s). השוואה לפני ומידול D1, #p < 0.05. השוואה בין קבוצת CCD לקבוצת CCD + Tuina, *p < 0.05.
| N | לפני הדוגמנות | D1 | ד3 | D7 | D14 | D17 | D21 | |
| נאיבי | 8 | 19.9±1.2 | 12.0±1.6 | 12.2±1.9 | 12.4±1.1 | 12.2±1.9 | 12.0±1.4 | 12.0±1.4 |
| שאם | 8 | 19.9±1.2 | 11.6±1.5 | 12.2±1.9 | 11.6±1.5 | 12.2±0.9 | 11.6±1.5 | 11.6±1.5 |
| CCD | 8 | 10.8±1.1 | 8.9±0.7# | 7.9±0.8 | 7.7±0.5 | 7.8±1.0 | 7.7±0.8 | 7.7±0.8 |
| CCD + Tuina | 8 | 11.3±1.5 | 9.1±0.6# | 8.0±0.7 | 8.3±0.7* | 8.9±0.6* | 9.1±0.7* | 9.2±0.9* |
| #השוואה לפני ומידול D1, p < 0.05. | ||||||||
| השוואה בין קבוצת CCD לקבוצת CCD+Tuina,*p < 0.05. | ||||||||
טבלה 2: חביון משיכת כפות, PWL (, s). השוואה לפני ומידול D1, #p < 0.05. השוואה בין קבוצת CCD לקבוצת CCD + Tuina,*p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קבוצת המחקר שלנו ערכה מחקרים רלוונטיים על הפרמטרים של מניפולציה Tuina בשלב מוקדם. ראשית, חשוב להגדיר את עוצמת הכוח למניפולציה של טווינה. בטווינה הקלינית, המטפלים מתאימים את עוצמת הכוח בהתאם לניסיונם ולתחושותיהם הסובייקטיביות של המטופלים, ומשיגים את אפקט טווינה הטוב ביותר באמצעות תקשורת. עם זאת, זה לא אפשרי בניסויים בבעלי חיים. בניסויים בבעלי חיים, "סף תגובה" משמש להגדרת עוצמת המניפולציה של טווינה. שופטים אלה אם כוח הטוינה המופעל מתאים בהתבסס על התגובה האינסטינקטיבית של החיה. רנדל,בן 17 , השתמש בשיטה זו כדי לחקור התנהגות כאב במודלים של דלקת חולדות. ההבדל הוא שרנדל פעל באזור הדלקת המקומי, בעוד שהניסוי הזה פעל באזור ללא פגיעה. מניפולציה כבדה של טווינה תגרום לחולדות לייצר רפלקסים צורחים ובורחים. קביעת עוצמת הכוח הכבד קובעת כי עוצמת הכוח הפורמלית של טווינה פחותה מעוצמת כוח כבד זו. בהתבסס על התפלגות ערכי הלחיצה המרביים של רפלקס הצעקה והבריחה של 150 חולדות בין 5-25 N, עם ממוצע וסטיית תקן של 9.93 ו-3.018 (איור 11), העבודה הקודמת שלנו חישבה את ערך כוח הלחיצה האופטימלי להיות 5 N. שנית, תדירות ההפעלה של שיטת טווינה מתוארת במדע של טווינה כ-120-160 פעמים לדקה18. לכן, תדר טווינא בניסוי זה נקבע על 2 הרץ.
מודל CCD הוא מודל כירורגי שיכול להיות טראומטי, שכן הוא דורש חשיפה לתהליך המפרקי ולפתח הבין חולייתי. לכן, חולדות זקוקות 1-3 ימים כדי להתאושש לאחר הניתוח. הן על פי הספרות והן על פי נתוני ניסוי ראשוניים, התנהגות הכאב של חולדות נוטה להיות יציבה ביום הרביעי לאחר הניתוח. זה מספק זמן נוח כדי לבחון את ההשפעה משכך כאבים של התערבות Tuina. עם זאת, טווינא ממושכת עשויה שלא להועיל לאפקט משכך הכאבים של חולדות ועלולה להוביל לנזק לרקמות. מחקר זה השווה את ההשפעות משככות הכאבים של טווינה ולישה במשך 5, 15 ו -30 דקות, ובסופו של דבר בחר 15 דקות כמשך הזמן האופטימלי של ההתערבות.
לשיטה זו יש מגבלות, שכן רק חלק מהפעולות הקליניות שימשו לבחירת מניפולציות וחלקי גוף. BL57 (Chengshan) ממוקם ב triceps surae של חולדות, והוא עצבני על ידי גרעיני השורש הגבי של L4 ו L519. מכיוון ששרירי triceps surae עבים ומתאימים לטוינה, עיסוי אזור זה יכול להשפיע ישירות על גרעיני השורש הגבי של L4 ו- L5 בחוליות המותניות של חולדה המשמשות לדגימה ניסיונית.
במהלך תהליך היציקה, יש להבטיח החדרה מדויקת של מוט הנירוסטה בצורת "L" לתוך הפורמינה הבין חולייתית של L4 ו- L5 במודל כאב CCD על ידי ביצוע אימות רנטגן. לפני ביצוע צילום הרנטגן, ביצענו הרדמה תוך-צפקית של 25% (0.6 מ"ל/100 גרם) כדי להרדים את החולדות. צילום הרנטגן אישר את ההחדרה המוצלחת של מוט הנירוסטה בצורת "L" לתוך הפורמינה הבין חולייתית של L4 ו-L5 (איור 12).
בסך הכל, מחקר זה התמקד בהתבוננות בפעולות הטיפול בטווינה ובהערכת ההשפעות הטיפוליות של טווינה על חולדות CCD. הצוות ערך ניסוי בבעלי חיים כדי לבחון כיצד להגדיר פרמטרים של טווינה, לבחור חלקים מתאימים ולקבוע זמני טיפול מתאימים. זה מספק הדגמת התערבות סטנדרטית וניתנת לשחזור של מודל בעלי חיים למחקר עתידי על אפקט משכך הכאבים של טווינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי ShanghaiCritical Clinical Specialties ConstructionProject (מספר מענק: Shslczdzk04001); תוכנית השיט של ועדת המדע והטכנולוגיה של שנגחאי (מספר מענק: 22YF1444300); פרויקטים במסגרת התקציב של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (מספר מענק: 2021LK091).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter) | hand-made | / | For CCD models making |
| ALMEMO admeasuring apparatus | ahlborn | 2450-1 | Mechanical Withdrawal Threshold test |
| Constant temperature slicer CM-1900 | Leica | 1491950C1US | For specimen production |
| Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle | LIRCON/Shandong Lilkang | / | For disinfection |
| Disposable sterile syringe 5 mL | Shanghai Misha Wa Medical Industry | / | For injection |
| Electron microscope CX-31 | Olympus, Japan | BJ002318 | For specimen observation |
| Finger pressure recordings | Suzhou Changxian Optoelectronic Technology | CX1003w | For Tuina manipulation |
| Foam board (35 cm x 20 cm) | hand-made | / | It is our homemade apparatus for fixing rats |
| MERSILK W2512 | Johnson & Johnson | / | For tissue suture |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent | 10004160 | For specimen production |
| paraformaldehyde | China National Chemical Reagent | / | For specimen production |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | For anesthesia of rat |
| Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats | IITC Life Science | / | Paw Withdrawal Latency |
| Precision electronic scale for experiment JY3002 | Shanghai Precision Scientific Instrument | / | Weighing of rat |
| Rat hair clipper | Philips | HP6341/00 | Shaving of rat fur |
| Restrainer for rats | Tongji University (self-made) | / | It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs. |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | For specimen production |
| Uratan | China National Chemical Reagent | / | For anesthesia of rat |
| X-ray detector XR-600 | Dongguan Kaso Electronic Technology | / | Examination of CCD models |
| xylene | Shanghai Sinopharm Group | 100092 | For specimen production |
References
- Vos, T., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Amin, R. M., Andrade, N. S., Neuman, B. J.
- Stochkendahl, M. J., et al. National Clinical Guidelines for non-surgical treatment of patients with recent onset low back pain or lumbar radiculopathy. European Spine Journal. 27 (1), 60-75 (2018).
- Bostelmann, R., Steiger, H. J. Comment on "An evidence-based clinical guideline for the diagnosis and treatment of lumbar disc herniation with radiculopathy". The Spine Journal. 14 (9), 2273 (2014).
- Tang, J., et al. Effect of bone-setting massage combined with acupuncture and moxibustion on simple lumbar disc herniation and its effect on pain and sensory disorder of lower limbs. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 38 (10), 244-247 (2020).
- Lin, X. -Y., Yang, J., Li, H. -M., Hu, S. -J., Xing, J. -L. Dorsal root ganglion compression as an animal model of sciatica and low back pain. Neuroscience Bulletin. 28 (5), 618-630 (2012).
- Shi, C., et al. Animal models for studying the etiology and treatment of low back pain. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 36 (5), 1305-1312 (2018).
- Zhao, X. -y, et al. Effect of Tuina on the expression of TNF-α,IL-6,TGF-β1 and CTGF in the degenerative tissue of rabbits′lumbar intervertebral disc. Journal of Chengdu Medical College. 14 (6), 741-745 (2019).
- Zhang, L., Li, Z. -y, Yu, Z. -y, Yue, X. -y, Fu, R. -y Effect of GABA and GABAAR in analgesic loop of CCI rats by pressing manipulation based on "Taking Tenderness as Acupoints" theory. Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. 28 (3), 50-53 (2014).
- Long, B. -cal, et al. Analgesic effect of massage on rats with neuropathic pain and its mechanism. Guangxi Medical Journal. 44 (17), 2003-2009 (2022).
- Al-Bedah, A., Ali, G., Aboushanab, T., Qureshi, N. Tui Na (or Tuina) massage: A minireview of pertinent literature, 1970-2017. Journal of Complementary and Alternative Medical Research. 3, 1-14 (2017).
- Au, D. W. H., et al. Effects of acupressure on anxiety: a systematic review and meta-analysis. Acupuncture in Medicine: Journal of the British Medical Acupuncture Society. 33 (5), 353-359 (2015).
- Hsiung, W. -T., Chang, Y. -C., Yeh, M. -L., Chang, Y. -H. Acupressure improves the postoperative comfort of gastric cancer patients: A randomised controlled trial. Complementary Therapies in Medicine. 23 (3), 339-346 (2015).
- Wu, S., et al. Neural interconnection between acupoint "Chéngshān (BL57)" and sciatic nerve in the rat. World Journal of Acupuncture - Moxibustion. 31 (2), 129-135 (2021).
- Banik, R. K., Kabadi, R. A. A modified Hargreaves method for assessing threshold temperatures for heat nociception. Journal of neuroscience methods. 219 (1), 41-51 (2013).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal pain sensation in rats and mice using the hargreaves test. Bio-protocol. 7 (16), e2506 (2017).
- Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Archives Internationales De Pharmacodynamie Et De Therapie. 111 (4), 409-419 (1957).
- Yan, J. -t Science of Tuina. , Traditional Chinese Medicine Publishing House. (2003).
- Himes, B. T., Tessler, A. Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats. The Journal of Comparative Neurology. 284 (2), 215-230 (1989).
