Summary
Dit artikel presenteert een manipulatie voor de behandeling van chronische compressie van het dorsale wortelganglion bij ratten met behulp van Tuina-therapie, samen met een methode voor het evalueren van de effectiviteit ervan op basis van pijngedrag en histopathologische resultaten.
Abstract
Neuropathische pijn is een veel voorkomende aandoening die 6,9%-10% van de bevolking treft en het gevolg is van zenuwbeschadiging als gevolg van verschillende etiologieën, zoals lumbale hernia, stenose van het wervelkanaal en stenose van het foramen tussen de wervels. Hoewel Tuina, een traditionele Chinese manuele therapie, in de klinische praktijk pijnstillende effecten heeft aangetoond voor de behandeling van neuropathische pijn, blijven de onderliggende neurobiologische mechanismen onduidelijk. Diermodellen zijn essentieel voor het ophelderen van de basisprincipes van Tuina. In deze studie stellen we een gestandaardiseerd Tuina-protocol voor ratten voor met compressie van het dorsale wortelganglion (DRG), waarbij DRG-compressie wordt geïnduceerd door een roestvrijstalen staaf in het intervertebrale foramen te steken, Tuina-manipulatie uit te voeren met specifieke parameters van locatie, intensiteit en frequentie in een gecontroleerde omgeving, en de gedrags- en histopathologische resultaten van Tuina-behandeling te beoordelen. Dit artikel bespreekt ook de mogelijke klinische implicaties en beperkingen van de studie en geeft aanwijzingen voor toekomstig onderzoek naar Tuina.
Introduction
In klinische omgevingen is het gebruikelijk om neurologische pathologische pijn te observeren die wordt veroorzaakt door compressie van de zenuwwortel om verschillende redenen. De meest typische vorm van deze neuropathische pijn is lumbale hernia (LDH), die vaak aanhoudend, terugkerend en moeilijk te genezen is. Ongeveer 9% van de wereldbevolking wordt getroffen door LDH, wat leidt tot aanzienlijke sociale en economische lasten1. De incidentie van dit type neuropathische pijn neemt jaarlijks toe, met een trend naar jongere patiënten, als gevolg van veranderingen in de menselijke productie en levensstijl. Ondanks het gebruik van niet-steroïde pijnstillers kunnen de symptomen van patiënten niet volledig worden verlicht. Als gevolg hiervan hebben alternatieve therapieën, zoals Tuina, voor de behandeling van pijn veroorzaakt door LDH steeds meer aandacht gekregen.
Tuina-therapie, een vorm van conservatieve behandeling voor LDH, wordt wereldwijd algemeen aanbevolen in verschillende klinische praktijkrichtlijnen voor het voorkomen en behandelen van lage rugpijn 3,4. Onderzoek heeft aangetoond dat Tuina ontstekingsfactoren zoals serum IL-6 en tumornecrosefactor-alfa (TNF-α)-spiegels bij LDH-patiënten aanzienlijk kan verlagen, terwijl de pijn en lumbale functiestoornissen van patiënten worden verbeterd. Het specifieke mechanisme achter de pijnstillende effecten van de Tuina-therapie blijft echter onduidelijk.
Diermodellen zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van neuropathische pijn veroorzaakt door LDH6. Ze maken gedragsmetingen mogelijk om de effectiviteit van Tuina-therapie te evalueren en leveren monsters van de pathologische fysiologie van LDH. Er kunnen bijvoorbeeld monsters worden genomen van de ganglia van de dorsale wortel in de dij om veranderingen in de ganglioncellen van de dorsale wortel te verifiëren. De chronische compressie van het Dorsal Root Ganglion (CCD)-model wordt vaak gebruikt om de pathologische fysiologie van LDH te evalueren, omdat het schade veroorzaakt aan de morfologie van dorsale wortelganglioncellen die consistent zijn met de pathologische veranderingen die worden waargenomen in klinische gevallen van zenuwcompressie veroorzaakt door discushernia.
Veel geleerden hebben verschillende dierproeven uitgevoerd op acupressuuranalgesie 8,9,10. Bij het uitvoeren van acupressuuroperaties op diermodellen imiteren ze echter vaak menselijke acupressuur. Het therapeutische effect van acupressuur wordt beïnvloed door factoren zoals de grootte, frequentie en de richting van de uitgeoefende kracht11,12,13. Als het experiment geen uniforme acupressuurstandaard heeft, zoals de kracht, frequentie en duur van de operatie, kan dit enige afwijking in de experimentele resultaten veroorzaken. Dit artikel introduceert een reeks behandelplannen voor acupressuur op basis van de kenmerken van CCD-ratten en bevordert de ontwikkeling van gestandaardiseerde acupressuuroperaties in diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit werk werd uitgevoerd in het Pain Lab van het Neurobiology Institute van de Fudan University. De experimenten werden goedgekeurd en strikt nageleefd de richtlijnen voor de bescherming van proefdieren die zijn opgesteld door de International Association for the Study of Pain (LASP) voor alle chirurgische ingrepen en het hanteren van dieren. Voor het huidige onderzoek werden Sprague-Dawley (SD)-ratten van schone kwaliteit gebruikt, bestaande uit 32 mannetjes tussen 40-50 dagen oud, met een gemiddeld gewicht van 220 ± 1,38 g. Deze ratten zijn verkregen van het Experimental Animal Center van de Shanghai Academy of Life Sciences, Chinese Academy of Sciences. De dieren werden goed verzorgd en gehuisvest in een speciale ruimte met onafhankelijke ventilatie, gereguleerde temperatuur (22 ± 1 °C) en vochtigheid (40%-50%). De ratten hadden toegang tot voldoende voedsel en water in hun kooien. De proefdierenkamer volgde een licht-donkercyclus van 12 uur om de regelmaat van het circadiane ritme van de ratten te behouden, en aangewezen personeel verving regelmatig de vulling. De röntgenfoto werd uitgevoerd op de afdeling Radiologie van het Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, verbonden aan de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine.
1. Studiedeelnemers en groepering
- Wijs 32 ratten toe aan vier groepen: naïef (controle), schijnvertoning (schijnoperatie), CCD (chronische compressie van het ganglion van de dorsale wortel) en CCD + Tuina (8 ratten/groep). Ratten hadden vrije toegang tot voedsel en water in dierenverblijven.
OPMERKING: Naïeve ratten hadden geen interventie, terwijl de schijngroep dezelfde chirurgische ingreep onderging als de ratten uit de CCD-groep, maar zonder een "L"-vormige roestvrijstalen staaf achter te laten in het L4- en L5-intervertebrale foramen. Ratten in de CCD-groep ondergingen een volledige chronische compressiemodeloperatie met dorsale wortelganglion. Ratten in de CCD + Tuina-groep kregen tuina-therapie vanaf de vierde dag na de CCD-operatie.
2. Vaststelling van een diermodel
- Dien isofluoraan toe om ratten te verdoven. Zodra de ratten het bewustzijn verliezen (geen staartreflex of beenflexiereflex), scheert u het haar in het operatiegebied met een scheermes.
OPMERKING: Pijnstillers werden 15 minuten voor de operatie aangebracht en ratten werden subcutaan geïnjecteerd met tramadol 20 mg/kg. - Zet de rat vast op een foamboard (zie Materiaaltabel) en gebruik elastiekjes om zijn ledematen en snijtanden vast te zetten. Veeg het voorbereide gebied af met een steriele bereiding van afwisseling van alcohol en jodium gedurende minimaal 3 cycli.
- Plaats de "L"-vormige sonde (zie Tabel met materialen).
- Gebruik een schaar om laag voor laag een incisie van 2-3 cm door de huid, oppervlakkige fascia en diepe fascia te maken. Lokaliseer eerst de voorste superieure iliacale wervelkolom, die overeenkomt met de vijfde lumbale wervelkolom. Lokaliseer vervolgens achtereenvolgens de derde en vierde processus spinosus.
- Klem de processus spinosus vast met een getande pincet en til deze op zodat de schaar dicht bij de rechterkant van de processus spinosus is en knip de spier af die aan de rechterkant van de processus spinosus is bevestigd.
- Ontleed vervolgens botweg de spier die aan het buitenoppervlak van de wervelplaat is bevestigd totdat er weerstand is aan de rechterkant. Het uitsteeksel is het zygapophysiale gewricht. Ontleed op dezelfde manier botweg de spier en fascia op het zygapophysiaalgewricht.
OPMERKING: De transversale processus die in de richting van de kop van de rat wijst, wordt eerst aangeraakt in de onderste buitenste voorkant van het zygapophysiale gewricht. Onder de processus transversaal bevindt zich het intervertebrale foramen, dat gevuld is met zenuwwortels en omliggende zachte weefsels en meestal niet gemakkelijk te vinden is. - Gebruik eerst een "L"-vormige sonde om de positie van het tussenwervelforamen te bepalen en gebruik vervolgens een "L"-vormige roestvrijstalen staaf (die moet worden gemaakt met een diameter van 0,4 mm en een lengte van 4 mm) om deze in het tussenwervelforamen te steken.
- Als het ganglion van de dorsale wortel met succes wordt samengedrukt, zal de rat een staartbeweging en beenflexiereflex vertonen. Steek de roestvrijstalen staaf in het vierde en vijfde lumbale intervertebrale foramen. Hecht vervolgens (3-0, zie Materiaaltabel) de spier, fascia en huid laag voor laag.
- Plaats de rat in een thermostatische doos totdat hij wakker wordt. Observeer na het ontwaken of de functie van de rechter achterpoot van de rat normaal is. Als er sprake is van slepen, betekent dit dat de operatie de motorische zenuwen heeft verwond en dat de rat moet worden weggegooid. Als de functie van de rechter achterpoot normaal is, kan de rat worden gebruikt en in een kooi worden geplaatst om te eten.
3. Tuina therapie
- Zorg voor een comfortabele omgeving: voordat u met de Tuina-therapie begint, moet u de rat 30 minuten in de restrainer laten acclimatiseren om hem de kans te geven zich aan te passen (Figuur 1). Dit apparaat kan de dij van de rat volledig blootleggen en immobiliseren, waardoor Tuina-manoeuvres worden vergemakkelijkt (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: De temperatuur in de behandelkamer moet tussen de 22-26 °C worden gehouden en de luchtvochtigheid moet tussen de 40%-50% liggen. - Standaardisatie van Tuina: zorg ervoor dat de therapeuten draadloze vingerhulzen dragen die de druk en frequentie van Tuina kunnen monitoren en real-time feedbackgegevens kunnen geven. Oefen eerst Tuina met de feedbackgegevens van de vingerhulzen, waarbij je de kracht instelt op 5 N en de frequentie op 2 Hz. Voer vervolgens dezelfde manoeuvres uit op de ratten, waarbij u gedurende de hele procedure een consistente kracht en frequentie aanhoudt (Figuur 2).
OPMERKING: Op basis van ons eerdere werk is de berekende optimale perskracht 5 N (zie het gedeelte Discussie voor details). - Identificeer het acupunt: selecteer de gastrocnemius-spier van de rechter achterpoot als het Tuina-gebied van de rat, op de kruising van de twee koppen van de gastrocnemius-spier, ongeveer op de locatie van BL5714.
- Voer de Tuina uit: zorg ervoor dat de therapeut naar het achterste deel van de dij van de rat kijkt en de rechter achterpoot van de rat vasthoudt met zijn rechter bovenste ledemaat. Plaats de duim verticaal op het BL57-acupunt en zorg ervoor dat de onderarm en vingers kracht uitoefenen om ritmische roterende bewegingen op kleine afstand uit te voeren terwijl ze een druk van 5 N uitoefenen (Figuur 3).
- Zorg er tijdens de behandeling voor dat de kracht en frequentie van de manipulatiefeedback overeenkomen met de vooraf ingestelde waarden. Start de ingreep vanaf de vierde dag na de operatie, waarbij Tuina eenmaal per dag gedurende 15 minuten wordt uitgevoerd, continu gedurende 18 dagen.
4. Gedragstesten op pijn
OPMERKING: Gedragstests werden uitgevoerd vóór het modelleren, na het modelleren, op interventiedag 1, interventiedag 3, interventiedag 7, interventiedag 14, interventiedag 17 en interventiedag 21.
- Voer de Mechanical Stimulation Response Threshold (Paw Withdrawal Threshold, PWT) uit door de onderstaande stappen te volgen (Figuur 4).
- Gebruik de von Frey-methode om de reactiedrempel van mechanische stimulatie in de poten van de ratten te testen. Plaats de ratten in een transparant compartiment van gehard glas van 20 cm × 10 cm × 20 cm, dat op een metalen roosterstandaard met openingen van 10 mm × 10 mm op een hoogte van 40 cm is geplaatst. Houd de kamertemperatuur op 23 ± 2 °C en de omgeving rustig.
- Meet de mechanische onttrekkingsdrempel met elektronische Von Frey-vezels (zie Tabel met materialen). Stimuleer het voetcentrum van de rat totdat deze merkbaar beweegt, zoals het optillen van de poot of het ontwijken. De machine registreert automatisch de maximale drukwaarde (N).
- Wacht 15 s of langer voordat je dezelfde rat opnieuw stimuleert. Houd elke stimulatie onder de 5 s om tactiele overgevoeligheid in de poten van de rat te voorkomen. Herhaal de test vijf keer totdat de drie opeenvolgende metingen minder dan 10 N verschillen.
- Voer Paw Withdrawal Latency (PWL) uit als reactie op thermische stimulatie (Figuur 5).
- Beoordeel de PWL met behulp van de Hargreaves-methode15,16. Plaats de ratten in een kleine kamer van transparant gehard glas van 20 cm x 10 cm x 20 cm, met een transparant glazen deksel met een ventilatiegat. Verwarm het centrale gedeelte van het glazen deksel met behulp van een verwarmingsplaat tot 45 °C tot het een stabiele temperatuur heeft bereikt.
- Laat de ratten tijdens de gedragstestfase elke dag minstens 2 uur acclimatiseren in het gedragslaboratorium om de impact van omgevingsfactoren op de testresultaten te minimaliseren.
- Plaats de ratten vóór de formele test 30 minuten in het gedragslaboratorium om ze in staat te stellen zich aan te passen aan de omgeving en interferentie te verminderen.
- Verwarm de verwarmingsplaat tot 45 °C en plaats de achterpoten van de rat op de verwarmingsplaat.
- De latentie van het terugtrekken van de poot (PWL) werd gedefinieerd als de tijd vanaf het begin van de verwarming tot het verschijnen van de terugtrekkingsreflex van de poot als reactie op thermische stimulatie. Test bij elke test drie keer achter elkaar dezelfde achterpoot en de gemiddelde waarde om de responslatentie van die achterpoot te verkrijgen. Breng de ratten na het testen terug naar hun kooien om te eten.
5. Perfusie
- Bereiding: bereid vooraf een 0,9% zoutoplossing en een 4% paraformaldehyde-oplossing. Plaats de zoutoplossing in een oven met een constante temperatuur van 37 °C en bewaar de paraformaldehydeoplossing in de koelkast bij 4 °C voor later gebruik.
- Voer anesthesie uit en zorg voor toegang.
- Begin met het injecteren van 25% urethaan (0,6 ml/100 g, zie materiaaltabel) in de buikholte van de rat om diepe anesthesie te induceren. Wacht tot er geen teen-, hoornvlies- of draaireflex wordt waargenomen. Bevestig de rat op een foamboard.
- Knip het borstbeen af met een schaar en open de huid en fascia laag voor laag. Snijd het middenrif door en snijd de ribben aan beide kanten af om het hart volledig bloot te leggen. Scheid het hartzakje voorzichtig. Scheid de longen van het hart.
- Gebruik een tang om aan de aorta te trekken en bloot te leggen door het hart naar zich toe te trekken. Lijn de naald, linkerventrikel en aorta uit in een rechte lijn en op hetzelfde horizontale vlak. Steek vervolgens de naald vanuit de linker hartkamer in de aorta totdat de naald zichtbaar is in de aorta.
- Gebruik een pincet om de aorta en de naald in de aorta vast te klemmen en knip vervolgens het linker atrium open met een schaar. Op dit moment zal een grote hoeveelheid bloed uit het linker atrium spuiten. Open de klep voor de zoutoplossing en sluit de zoutoplossing aan om 37 °C zoutoplossing te doordringen, voor een totaal van ongeveer 150-200 ml.
- Nadat de zoutoplossing is voltooid, schakelt u over op de 4% paraformaldehyde-oplossing en perfuseert u met 4% paraformaldehyde-oplossing voor een totaal van ongeveer 400 ml bij 4 °C. Houd bij het starten van de paraformaldehyde-perfusie de voortanden van de rat vast met één pincet en trek ze naar voren, terwijl u de staart met één hand vasthoudt en naar achteren trekt, wat voordelig is voor het volledig strekken van de wervelkolom en het vergroten van het foramen tussen de wervels om DRG-bemonstering te vergemakkelijken.
- Tijdens de perfusie worden de lever, het mesenterium en het grotere omentum van de rat geleidelijk bleek totdat de lever stijf wordt. Vertraag vervolgens het debiet en pas het aan tot ongeveer 2 druppels per seconde totdat alle paraformaldehyde is geperfuseerd.
6. Verzameling van ganglion met dorsale wortel
OPMERKING: Snijd na perfusie snel het lumbale gedeelte van de wervelkolom van de rat af. Lokaliseer het L5 en L4 foramen van de tussenwervels door de hoogste punten van de iliacale kam aan beide zijden te verbinden met de processus lumbale doornosus L5 met behulp van deze positioneringsmethode, en verwijder het ganglion van de dorsale wortel van het tussenwervelforamen. De specifieke verzamelmethode is als volgt:
- Steek vanaf de ingang van het wervelkanaal (thoracaal wervelkanaal) de schaar in het wervelkanaal en knip de lamina aan beide zijden af totdat alle laminae volledig kunnen worden verwijderd, waardoor het hele wervelkanaal bloot komt te liggen.
NOTITIE: Pas op dat u het ruggenmerg en de zenuwwortels buiten het wervelkanaal niet beschadigt bij het doorsnijden van de laminae. - Verwijder voorzichtig het ruggenmerg en het achterste longitudinale ligament. Scheid de dura mater die aan het binnenste gat van het tussenwervelforamen is bevestigd.
- Gebruik een oogheelkundige pincet om het ganglion van de dorsale wortel, dat de vorm heeft van een parel en enigszins gelig is, vast te klemmen en eruit te trekken.
OPMERKING: Vanwege de kwetsbaarheid en slechte taaiheid van zenuwweefsel, is het noodzakelijk om de kracht en trekrichting vast te pakken bij het uittrekken van het ganglion van de dorsale wortel en geen brute kracht te gebruiken. - Zorg er bij het uittrekken van het ganglion van de dorsale wortel voor dat u de omliggende zachte weefsels, inclusief de dura mater en de arachnoïde, van tevoren reinigt om het soepel trekken van het ganglion van de dorsale wortel te vergemakkelijken.
- Plaats het ganglion van de dorsale wortel op absorberend papier, snijd het axon af met een mes en reinig de bloedvaten op het oppervlak van het ganglion van de dorsale wortel.
- Weeg na het trimmen het ganglion van de dorsale wortel en dompel het gedurende voldoende tijd, meestal ongeveer 2-4 uur, onder in een 4% paraformaldehyde-oplossing met een concentratie van 4% en een temperatuur van 4 °C, en breng vervolgens het dorsale wortelganglion over in 10%, 20% en 30% PB sucrose-oplossing (4 °C) die van tevoren is bereid voor stapsgewijze uitdroging.
7. Cryosectie
- Begin met het plaatsen van het ganglion van de dorsale wortel in een PBS-oplossing van 0,01 M. Schud ze gedurende 10 minuten en spoel dan de sucrose-oplossing weg. Snijd voorzichtig de axonvezels van beide segmenten van de dorsale wortelganglia. Reinig de vrieskop van de cryosectiemachine en voeg de optimale snijtemperatuur (OCT) toe (zie Materiaaltabel).
- Plaats de vrieskop op het oppervlak van een metalen omhulsel met vloeibare stikstof, wacht tot het weefsel is bevroren, verwijder het en snijd het plat. Plaats daarna de vrieskop op de basis van de snijmachine. De dikte van de plakjes van de ganglia van de dorsale wortel moet 15 mm zijn. Schik de gesneden dunne secties in een houten kist op volgorde en bewaar ze in een koelkast van -20 °C, uit de buurt van licht.
8. Hematoxyline- en eosinekleuring
- Plaats de secties 2 minuten in xyleen en dehydrateer ze in een reeks alcoholen, waaronder 100%, 95%, 80% en 70%, elk gedurende 2 minuten. Plaats vervolgens de secties 2 minuten in gedestilleerd water, 1 minuut in hematoxyline, spoel 5 minuten met kraanwater en voer differentiatie uit in 1% zoutoplossing gedurende 30 s, gevolgd door 30 s in verzadigd lithiumcarbonaat.
- Leg vervolgens de plakjes 2 minuten elk in gedestilleerd water en kraanwater, 5 minuten in eosine-oplossing (0,5%), 1 minuut snel spoelen in gedestilleerd water, twee rondes van elk 2 minuten in 95% en 100% alcohol, 30 s in 100% xyleen met toegevoegd natriumbicarbonaat, drie rondes van elk 3 minuten in xyleen, en tot slot, afdichten met neutraal balsem (zie Materiaaltabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tuina-therapie kan helpen de mechanische en thermische stimulatiedrempels van ratten te verlagen die worden veroorzaakt door CCD-modellering
Na 17 dagen Tuina-therapie werd een significant verschil waargenomen in PWT-drempels tussen de CCD-ratten die Tuina-therapie kregen en de onbehandelde CCD-groep (P = 0,021, <0,05) (Figuur 6 en Tabel 1).
De ratten in de CCD-groep die Tuina-therapie kregen, vertoonden vanaf het begin van de behandeling een verbetering van de pijndrempel en er werd een significant verschil in thermische pijndrempel gevonden tussen de CCD-groep en de groep die Tuina-therapie kreeg vanaf dag 14 na modellering (P = 0,0047, 0,0056, 0,0049, < 0,01) (Figuur 7 en Tabel 2).
De toepassing van Tuina-therapie verbeterde de celnecrose veroorzaakt door het CCD-model niet
Op basis van de HE-kleuring van de dorsale wortelganglia had de CCD-groep ratten, die werden onderworpen aan fysieke compressie met een "L"-vormige roestvrijstalen staaf, celmembraanbeschadiging en apoptose opgelopen (Figuur 8). Daarentegen had de controlegroep van ratten netjes gedefinieerde randen, intacte neuronencontouren en volledige cellichamen (Figuur 9). In de CCD + Tuina-groep waren sommige neuronencontouren in de dorsale wortelganglia van ratten onvolledig (Figuur 10).
Figuur 1: Restrainer voor ratten. Het is een zelfgemaakt apparaat vervaardigd door de Tongji University, dat de ratten effectief kan immobiliseren en hun achterpoten volledig kan blootleggen. De zilveren schroef bestuurt het schot dat de staart van de rat vasthoudt en de rat in bedwang houdt. De zwarte schroef past het apparaat aan de lengte van de rat aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Het dragen van draadloze vingerhulzen voor tactiele krachtmeting. Een apparaat dat de kracht en frequentie van vingerdruk meet en weergeeft, geeft real-time feedback over de intensiteit en frequentie tijdens Tuina-manipulatie. a) Druksensor en transmissieapparatuur. b) Metingen van de vingerdruk. (c) De kracht gemeten tijdens de manipulatie van Tuina. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Lichaamshouding en acupuntlocatie voor rat Tuina. De rattenbeschermer kan de positie van BL57 volledig blootleggen. De ledematen grijpen samen met de duim de onderste ledematen van de rat vast om deze op zijn plaats te fixeren, zodat de rat rustig kan meewerken tijdens de behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Drempeltest voor het terugtrekken van de poten. Dit is een test om pijngedrag bij ratten te meten. Het gaat om het mechanisch stimuleren van hun voeten en het meten van de latentie van hun pootterugtrekking. (a) toont het apparaat, en (b) laat zien hoe het tijdens het experiment op de muis werd gemanipuleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Latentietest voor het terugtrekken van de poten. Deze opstelling meet de pijngrens van de ratten aan de hand van hun gevoeligheid voor de warmte die door een schijnwerper wordt gegenereerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Resultaten van de Paw terugtrekkingsdrempeltest. Metingen worden weergegeven met behulp van de gemiddelde plus- of min-standaardfout (
). Resultaten van de mechanische stimulus-geïnduceerde terugtrekkingsreflextest van de achterpoten in verschillende stadia voor elke groep ratten. Significante verschillen (P < 0,05) werden waargenomen tussen de CCD + Tuina en de CCD-modelgroepen vanaf dag 17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Resultaten van de latentietest voor het terugtrekken van de poten. Metingen worden weergegeven met behulp van de gemiddelde plus- of min-standaardfout (). Resultaten van drempeltesten van door warmtestimulatie geïnduceerde terugtrekkingsreflex van de poten in verschillende stadia van ratten in elke groep. Er werden significante verschillen waargenomen tussen de CCD + Tuina-groep en de CCD-modelgroep vanaf de zevende dag (P < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Microscopische waarneming van dorsale ganglionneuronen in de CCD-groep (longitudinale doorsnede). Dit beeld werd verkregen door het HE-gekleurde monster van het ganglion van de dorsale wortel te scannen. De rode ellips in de figuur geeft aan dat sommige neuronen necrose ondergaan. Dit geeft aan dat het CCD-model schade heeft veroorzaakt aan de neuronen in het ganglion van de dorsale wortel. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. Microscopische observatie van dorsale ganglionneuronen in de naïeve groep (longitudinale doorsnede en dwarsdoorsnede). Zoals te zien is in de bovenstaande figuur, is (a) een langsdoorsnede en (b) een dwarsdoorsnede. Er is geen CCD-groepsleegstandsfenomeen in het gebied waar de dorsale wortelganglia van de lege groep ratten zijn verzameld. De neuronen zijn continu en compact, en de cellichamen zijn gevuld. De satellietgliacellen bevinden zich tussen de neuronen. Schaalbalk: (a),50 μm; (b), 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Microscopische waarneming van dorsale ganglionneuronen in de CCD + Tuina-groep (dwarsdoorsnede). De neuronen zijn continu en er is een celoplossingsfenomeen. Dit geeft aan dat massagetherapie op korte termijn niet in staat was om de celnecrose (rode ellips) veroorzaakt door het CCD-model te verbeteren. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Tuina druktest. Ratten met minimale compressiewaarden voor sissende ontsnappingsreflexen variëren in grootte, variërend van 5 N tot 25 N. De abscis staat voor de mate van druk, terwijl de ordinaat staat voor het aantal ratten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Röntgenfoto's van CCD-ratten. Validatie van CCD-fabricage met behulp van röntgenbeeldvorming van rattenmodellen. a) toont de röntgenfoto die in het verticale vlak is gemaakt, en b) toont de röntgenfoto die in het sagittale vlak is gemaakt. De twee verschillende röntgenfoto's met dwarsdoorsnede zorgen voor een duidelijker beeld van de positie van de "L"-vormige roestvrijstalen staaf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| N | Voor het modelleren | D1 | D3 | D7 | D14 | D17 | D21 | |
| Naïef | 8 | 18.1±1.4 | 16.8+1.5 | 16,8±1,5 | 18.6±1.7 | 16,8±1,5 | 15.6±1.8 | 16,8±1,5 |
| Voorwenden | 8 | 18.0±1.7 | 18.6±1.7 | 16.0±1.3 | 17.6±1.7 | 16,8±1,5 | 18.9±1.7 | 16,8±1,5 |
| CCD | 8 | 17.7±1.1 | 10.7±2.8# | 10.0±1.5 | 4.4±2.2 | 3.8±1.7 | 4.1±2.4 | 3.8±2.5 |
| CCD + Tuina | 8 | 18.9±1.7 | 9.8±2.3# | 8.3±1.4 | 4.8±1.2 | 5.8±2.0 | 7,2±1,8* | 7,5±1,8* |
| #Vergelijking voor en D1 modellering, p<0.05. | ||||||||
| *Vergelijking tussen CCD-groep en CCD+Tuina-groep, p<0.05. | ||||||||
Tabel 1: Paw Withdrawal Threshold, PWT (, s). Vergelijking voor en D1 modellering, #p < 0,05. Vergelijking tussen de CCD-groep en de CCD + Tuina-groep, *p < 0,05.
| N | Voor het modelleren | D1 | D3 | D7 | D14 | D17 | D21 | |
| Naïef | 8 | 11.9±1.2 | 12.0±1.6 | 12.2±1.9 | 12.4±1.1 | 12.2±1.9 | 12.0±1.4 | 12.0±1.4 |
| Voorwenden | 8 | 11.9±1.2 | 11,6±1,5 | 12.2±1.9 | 11,6±1,5 | 12,2±0,9 | 11,6±1,5 | 11,6±1,5 |
| CCD | 8 | 10.8±1.1 | 8.9±0.7# | 7,9±0,8 | 7,7±0,5 | 7.8±1.0 | 7,7±0,8 | 7,7±0,8 |
| CCD + Tuina | 8 | 11.3±1.5 | 9.1±0.6# | 8,0±0,7 | 8,3±0,7* | 8,9±0,6* | 9,1±0,7* | 9,2±0,9* |
| #Vergelijking voor en D1 modellering, p < 0,05. | ||||||||
| Vergelijking tussen CCD-groep en CCD+Tuina-groep,*p < 0,05. | ||||||||
Tabel 2: Paw Withdrawal Latency, PWL (, s). Vergelijking voor en D1 modellering, #p < 0,05. Vergelijking tussen de CCD-groep en de CCD + Tuina-groep,*p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze onderzoeksgroep heeft in een vroeg stadium relevante studies uitgevoerd naar de parameters van Tuina-manipulatie. Ten eerste is het belangrijk om de krachtintensiteit voor Tuina-manipulatie in te stellen. In klinische Tuina passen behandelaars de krachtintensiteit aan op basis van hun ervaring en de subjectieve gevoelens van de patiënt, waardoor het beste Tuina-effect wordt bereikt door middel van communicatie. Bij dierproeven is dit echter niet haalbaar. In dierproeven wordt een "responsdrempel" gebruikt om de intensiteit van Tuina-manipulatie te bepalen. Deze beoordeelt of de toegepaste Tuina-kracht geschikt is op basis van de instinctieve reactie van het dier. Randall17 gebruikte deze methode om pijngedrag te bestuderen in ontstekingsmodellen bij ratten. Het verschil is dat Randall opereerde in het lokale ontstekingsgebied, terwijl dit experiment opereerde in het niet-verwondingsgebied. Zware Tuina-manipulatie zorgt ervoor dat ratten schreeuwen en ontsnappen. De instelling van deze zware krachtintensiteit bepaalt dat de formele Tuina-krachtintensiteit lager is dan deze zware krachtintensiteit. Op basis van de verdeling van de maximale schreeuw- en ontsnappingsreflexdrukwaarden van 150 ratten tussen 5-25 N, met een gemiddelde en standaarddeviatie van 9,93 en 3,018 (Figuur 11), berekende ons eerdere werk de optimale perskrachtwaarde op 5 N. Ten tweede wordt de werkfrequentie van de Tuina-methode in de Science of Tuina beschreven als 120-160 keer/min18. Daarom werd de Tuina-frequentie in dit experiment ingesteld op 2 Hz.
Het CCD-model is een chirurgisch model dat traumatisch kan zijn, omdat het blootstelling aan het gewrichtsproces en intervertebrale foramen vereist. Daarom hebben ratten 1-3 dagen nodig om te herstellen na de operatie. Volgens zowel de literatuur als voorlopige experimentele gegevens is het pijngedrag van ratten meestal stabiel op de vierde dag na de operatie. Dit biedt een gunstig moment om het pijnstillende effect van Tuina-interventie te observeren. Langdurige Tuina is echter mogelijk niet gunstig voor het pijnstillende effect van ratten en kan leiden tot weefselbeschadiging. Deze studie vergeleek de pijnstillende effecten van Tuina en kneden gedurende 5, 15 en 30 minuten, en koos uiteindelijk 15 minuten als de optimale duur van de interventie.
Deze methode heeft beperkingen, aangezien slechts een deel van de klinische operaties werd gebruikt om manipulaties en lichaamsdelen te selecteren. BL57 (Chengshan) bevindt zich in de triceps surae van ratten en wordt geïnnerveerd door de dorsale ganglia van L4 en L519. Omdat de triceps surae-spieren dik zijn en geschikt voor Tuina, kan het masseren van dit gebied een directe invloed hebben op de dorsale wortelganglia van L4 en L5 in de lendenwervels van ratten die worden gebruikt voor experimentele bemonstering.
Tijdens het vormproces moet men zorgen voor een nauwkeurige inbrenging van de "L"-vormige roestvrijstalen staaf in de tussenwervelforamina van L4 en L5 in het CCD-pijnmodel door röntgenverificatie uit te voeren. Voordat de röntgenfoto werd gemaakt, dienden we intraperitoneale anesthesie van 25% (0,6 ml/100 g) toe om de ratten te verdoven. De röntgenfoto bevestigde de succesvolle inbrenging van de "L"-vormige roestvrijstalen staaf in de tussenwervelforamina van L4 en L5 (figuur 12).
Over het algemeen concentreerde deze studie zich op het observeren van Tuina-behandelingsoperaties en het evalueren van de therapeutische effecten van Tuina op CCD-ratten. Het team voerde een dierproef uit om te onderzoeken hoe Tuina-parameters konden worden ingesteld, geschikte onderdelen konden worden geselecteerd en geschikte behandelingstijden konden worden bepaald. Dit levert een gestandaardiseerde en reproduceerbare diermodelinterventiedemonstratie op voor toekomstig onderzoek naar de pijnstillende werking van Tuina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door ShanghaiCritical Clinical Specialties ConstructionProject (subsidienummer: Shslczdzk04001); het zeilprogramma van de Shanghai Science and Technology Commission (subsidienummer: 22YF1444300); Projecten binnen het budget vanShanghai University of Traditional ChineseMedicine(Subsidienummer: 2021LK091).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter) | hand-made | / | For CCD models making |
| ALMEMO admeasuring apparatus | ahlborn | 2450-1 | Mechanical Withdrawal Threshold test |
| Constant temperature slicer CM-1900 | Leica | 1491950C1US | For specimen production |
| Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle | LIRCON/Shandong Lilkang | / | For disinfection |
| Disposable sterile syringe 5 mL | Shanghai Misha Wa Medical Industry | / | For injection |
| Electron microscope CX-31 | Olympus, Japan | BJ002318 | For specimen observation |
| Finger pressure recordings | Suzhou Changxian Optoelectronic Technology | CX1003w | For Tuina manipulation |
| Foam board (35 cm x 20 cm) | hand-made | / | It is our homemade apparatus for fixing rats |
| MERSILK W2512 | Johnson & Johnson | / | For tissue suture |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent | 10004160 | For specimen production |
| paraformaldehyde | China National Chemical Reagent | / | For specimen production |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | For anesthesia of rat |
| Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats | IITC Life Science | / | Paw Withdrawal Latency |
| Precision electronic scale for experiment JY3002 | Shanghai Precision Scientific Instrument | / | Weighing of rat |
| Rat hair clipper | Philips | HP6341/00 | Shaving of rat fur |
| Restrainer for rats | Tongji University (self-made) | / | It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs. |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | For specimen production |
| Uratan | China National Chemical Reagent | / | For anesthesia of rat |
| X-ray detector XR-600 | Dongguan Kaso Electronic Technology | / | Examination of CCD models |
| xylene | Shanghai Sinopharm Group | 100092 | For specimen production |
References
- Vos, T., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Amin, R. M., Andrade, N. S., Neuman, B. J.
- Stochkendahl, M. J., et al. National Clinical Guidelines for non-surgical treatment of patients with recent onset low back pain or lumbar radiculopathy. European Spine Journal. 27 (1), 60-75 (2018).
- Bostelmann, R., Steiger, H. J. Comment on "An evidence-based clinical guideline for the diagnosis and treatment of lumbar disc herniation with radiculopathy". The Spine Journal. 14 (9), 2273 (2014).
- Tang, J., et al. Effect of bone-setting massage combined with acupuncture and moxibustion on simple lumbar disc herniation and its effect on pain and sensory disorder of lower limbs. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 38 (10), 244-247 (2020).
- Lin, X. -Y., Yang, J., Li, H. -M., Hu, S. -J., Xing, J. -L. Dorsal root ganglion compression as an animal model of sciatica and low back pain. Neuroscience Bulletin. 28 (5), 618-630 (2012).
- Shi, C., et al. Animal models for studying the etiology and treatment of low back pain. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 36 (5), 1305-1312 (2018).
- Zhao, X. -y, et al. Effect of Tuina on the expression of TNF-α,IL-6,TGF-β1 and CTGF in the degenerative tissue of rabbits′lumbar intervertebral disc. Journal of Chengdu Medical College. 14 (6), 741-745 (2019).
- Zhang, L., Li, Z. -y, Yu, Z. -y, Yue, X. -y, Fu, R. -y Effect of GABA and GABAAR in analgesic loop of CCI rats by pressing manipulation based on "Taking Tenderness as Acupoints" theory. Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. 28 (3), 50-53 (2014).
- Long, B. -cal, et al. Analgesic effect of massage on rats with neuropathic pain and its mechanism. Guangxi Medical Journal. 44 (17), 2003-2009 (2022).
- Al-Bedah, A., Ali, G., Aboushanab, T., Qureshi, N. Tui Na (or Tuina) massage: A minireview of pertinent literature, 1970-2017. Journal of Complementary and Alternative Medical Research. 3, 1-14 (2017).
- Au, D. W. H., et al. Effects of acupressure on anxiety: a systematic review and meta-analysis. Acupuncture in Medicine: Journal of the British Medical Acupuncture Society. 33 (5), 353-359 (2015).
- Hsiung, W. -T., Chang, Y. -C., Yeh, M. -L., Chang, Y. -H. Acupressure improves the postoperative comfort of gastric cancer patients: A randomised controlled trial. Complementary Therapies in Medicine. 23 (3), 339-346 (2015).
- Wu, S., et al. Neural interconnection between acupoint "Chéngshān (BL57)" and sciatic nerve in the rat. World Journal of Acupuncture - Moxibustion. 31 (2), 129-135 (2021).
- Banik, R. K., Kabadi, R. A. A modified Hargreaves method for assessing threshold temperatures for heat nociception. Journal of neuroscience methods. 219 (1), 41-51 (2013).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal pain sensation in rats and mice using the hargreaves test. Bio-protocol. 7 (16), e2506 (2017).
- Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Archives Internationales De Pharmacodynamie Et De Therapie. 111 (4), 409-419 (1957).
- Yan, J. -t Science of Tuina. , Traditional Chinese Medicine Publishing House. (2003).
- Himes, B. T., Tessler, A. Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats. The Journal of Comparative Neurology. 284 (2), 215-230 (1989).
