Summary
Bu makale, Tuina tedavisi kullanılarak sıçanlarda dorsal kök ganglionunun kronik kompresyonunu tedavi etmek için bir manipülasyonun yanı sıra, ağrı davranışına ve histopatolojik sonuçlara dayalı etkinliğini değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.
Abstract
Nöropatik ağrı, lomber disk hernisi, spinal kanal darlığı ve intervertebral foramen stenozu gibi çeşitli etiyolojilere bağlı sinir hasarından kaynaklanan, toplumun %6.9-10'unu etkileyen yaygın bir durumdur. Geleneksel bir Çin manuel terapisi olan Tuina, nöropatik ağrının tedavisi için klinik uygulamada analjezik etkiler göstermiş olsa da, altta yatan nörobiyolojik mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır. Hayvan modelleri, Tuina'nın temel ilkelerini aydınlatmak için gereklidir. Bu çalışmada, dorsal kök ganglionunun (DRG) kompresyonu olan sıçanlar için, intervertebral foramenlere paslanmaz çelik bir çubuk yerleştirilerek DRG kompresyonunun indüklenmesini, kontrollü bir ortamda belirli konum, yoğunluk ve frekans parametreleri ile Tuina manipülasyonu yapılmasını ve Tuina tedavisinin davranışsal ve histopatolojik sonuçlarının değerlendirilmesini içeren standart bir Tuina protokolü öneriyoruz. Bu makale ayrıca çalışmanın potansiyel klinik etkilerini ve sınırlamalarını tartışmakta ve Tuina ile ilgili gelecekteki araştırmalar için yönergeler önermektedir.
Introduction
Klinik ortamlarda, çeşitli nedenlere bağlı olarak sinir kökü sıkışmasının neden olduğu nörolojik patolojik ağrıların görülmesi yaygındır. Bu nöropatik ağrının en tipik şekli, genellikle kalıcı, tekrarlayan ve tedavisi zor olan lomber disk hernisidir (LDH). Küresel nüfusun yaklaşık %9'u LDH'den etkilenmekte ve bu da önemli sosyal ve ekonomik yüklere yol açmaktadır1. Bu tip nöropatik ağrının görülme sıklığı, insan üretimi ve yaşam tarzındaki değişiklikler nedeniyle daha genç hastalara doğru bir eğilimle her yıl artmaktadır2. Steroid olmayan ağrı kesicilerin kullanılmasına rağmen, hastaların semptomları tamamen hafifletilemez. Sonuç olarak, LDH'nin neden olduğu ağrıyı tedavi etmek için Tuina gibi alternatif tedaviler artan ilgi görmüştür.
LDH için bir konservatif tedavi şekli olan Tuina tedavisi, bel ağrısını önlemek ve tedavi etmek için dünya çapında çeşitli klinik uygulama kılavuzlarında yaygın olarak önerilmektedir 3,4. Araştırmalar, Tuina'nın LDH hastalarında serum IL-6 ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) seviyeleri gibi inflamatuar faktörleri önemli ölçüde azaltabildiğini ve hastaların ağrısını ve bel fonksiyon bozukluğunu iyileştirebildiğini göstermiştir5. Bununla birlikte, Tuina terapisinin ağrı giderici etkilerinin arkasındaki spesifik mekanizma belirsizliğini korumaktadır.
Hayvan modelleri, LDH6'nın neden olduğu nöropatik ağrıyı incelemek için değerli bir araçtır. Tuina tedavisinin etkinliğini değerlendirmek ve LDH'nin patolojik fizyolojisinin örneklerini sağlamak için davranışsal ölçümlere izin verirler. Örneğin, dorsal kök ganglion hücrelerindeki değişiklikleri doğrulamak için uyluktaki dorsal kök gangliyonlarından örnekler alınabilir. Dorsal Kök Ganglion (CCD) modelinin kronik kompresyonu, disk herniasyonunun neden olduğu klinik sinir sıkışması vakalarında görülen patolojik değişikliklerle tutarlı olan dorsal kök ganglion hücrelerinin morfolojisine zarar verdiğinden, LDH'nin patolojik fizyolojisini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır7.
Birçok bilim adamı, akupresür analjezi 8,9,10 üzerinde birkaç hayvan deneyi yapmıştır. Bununla birlikte, hayvan modellerinde akupresür operasyonları uygularken, genellikle insan akupresürünü taklit ederler. Akupresürün terapötik etkisi, uygulanan kuvvetin boyutu, sıklığı veyönü gibi faktörlerden etkilenir 11,12,13. Deney, işlemin kuvveti, sıklığı ve süresi gibi birleşik bir akupresür standardından yoksunsa, bu, deney sonuçlarında bir miktar sapmaya neden olabilir. Bu makale, CCD sıçanlarının özelliklerine dayanan bir dizi akupresür tedavi planını tanıtmakta ve hayvan modellerinde standartlaştırılmış akupresür operasyonlarının geliştirilmesini desteklemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Fudan Üniversitesi Nörobiyoloji Enstitüsü Ağrı Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi. Deneyler onaylandı ve tüm cerrahi prosedürler ve hayvanların taşınması için Uluslararası Ağrı Araştırmaları Derneği (LASP) tarafından oluşturulan laboratuvar hayvanlarının korunmasına yönelik yönergelere sıkı sıkıya bağlı kaldı. Bu çalışma için 40-50 günlük 32 erkekten oluşan, ortalama ağırlığı 220 ± 1.38 g olan temiz dereceli Sprague-Dawley (SD) sıçanlar kullanıldı. Bu sıçanlar, Çin Bilimler Akademisi, Şanghay Yaşam Bilimleri Akademisi Deneysel Hayvan Merkezi'nden elde edildi. Hayvanlara uygun şekilde bakıldı ve bağımsız havalandırma, düzenlenmiş sıcaklık (22 ± 1 °C) ve nem (%40-%50) olan özel bir odada barındırıldı. Sıçanların kafeslerinde yeterli yiyecek ve suya erişimi vardı. Laboratuvar hayvan odası, sıçanların sirkadiyen ritimlerinin düzenliliğini korumak için 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü izledi ve belirlenmiş personel düzenli olarak dolguyu değiştirdi. Röntgen, Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'ne bağlı Yueyang Entegre Geleneksel Çin ve Batı Tıbbı Hastanesi Radyoloji Bölümü'nde yapıldı.
1. Çalışma katılımcıları ve gruplandırma
- Dört gruba 32 sıçan atayın: naif (kontrol), sahte (sahte operasyon), CCD (kronik dorsal kök ganglion sıkışması) ve CCD + Tuina (8 sıçan / grup). Sıçanlar, hayvan tesislerinde yiyecek ve suya ücretsiz erişime sahipti.
NOT: Naif sıçanlara herhangi bir müdahale yapılmazken, sahte gruba CCD grubu sıçanlarla aynı cerrahi prosedür uygulandı, ancak L4 ve L5 intervertebral foramenlerinde "L" şeklinde paslanmaz çelik bir çubuk bırakılmadı. CCD grubundaki sıçanlara tam kronik dorsal kök ganglion kompresyon modeli cerrahisi uygulandı. CCD + Tuina grubundaki sıçanlar, CCD ameliyatından sonraki dördüncü günden itibaren tuina tedavisi aldı.
2. Hayvan modelinin oluşturulması
- Sıçanları uyuşturmak için izofloran uygulayın. Sıçanlar bilincini kaybettiğinde (kuyruk hareketi refleksi veya bacak fleksiyon refleksi yok), cerrahi bölgedeki saçları bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin.
NOT: Analjezik ilaçlar ameliyattan 15 dakika önce uygulandı ve sıçanlara 20 mg/kg tramadol ile subkutan enjekte edildi. - Fareyi bir köpük tahtaya sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve uzuvlarını ve kesici dişlerini sabitlemek için lastik bantlar kullanın. Hazırlanan alanı en az 3 döngü boyunca steril bir alkol ve iyot değişimi ile silin.
- "L" şeklindeki probu yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Deriden, yüzeysel fasyadan ve derin fasyadan katman katman 2-3 cm'lik bir kesi yapmak için makas kullanın. İlk olarak, beşinci lomber omurgaya karşılık gelen anterior superior iliak omurgayı bulun. Ardından, sırayla üçüncü ve dördüncü dikenli süreçleri bulun.
- Dikenli işlemi dişli forseps ile sıkıştırın ve makasın dikenli işlemin sağ tarafına yakın olmasını sağlamak için kaldırın ve dikenli işlemin sağ tarafına bağlı kası kesin.
- Ardından, vertebral plakanın dış yüzeyine bağlı kası, sağ tarafta direnç olana kadar künt bir şekilde inceleyin. Çıkıntı zigapofiziyal eklemdir. Benzer şekilde, zigapofiziyal eklem üzerindeki kas ve fasyayı kör bir şekilde inceleyin.
NOT: Sıçanın kafa yönüne işaret eden enine prosese ilk önce zigafizyal eklemin alt dış ön kısmına dokunulacaktır. Enine sürecin altında, sinir kökleri ve çevresindeki yumuşak dokularla dolu olan ve genellikle bulunması kolay olmayan intervertebral foramen bulunur. - İlk olarak, intervertebral foramenin konumunu belirlemek için "L" şeklinde bir prob kullanın ve ardından intervertebral foramenlere yerleştirmek için "L" şeklinde bir paslanmaz çelik çubuk (0,4 mm çapında ve 4 mm uzunluğunda yapılması gerekir) kullanın.
- Dorsal kök gangliyonu başarılı bir şekilde sıkıştırılırsa, sıçan bir kuyruk hareketi ve bacak fleksiyon refleksi sergileyecektir. Paslanmaz çelik çubuğu dördüncü ve beşinci lomber intervertebral foramenlere yerleştirin. Daha sonra kas, fasya ve cildi katman katman dikin (3-0, Malzeme Tablosuna bakınız).
- Fareyi uyanana kadar termostatik bir kutuya koyun. Uyandıktan sonra, sıçanın sağ arka bacağının işlevinin normal olup olmadığını gözlemleyin. Sürüklenme varsa, operasyonun motor sinirlerine zarar verdiği ve sıçanın atılması gerektiği anlamına gelir. Sağ arka bacağın işlevi normalse, sıçan kullanılabilir ve beslenmek için bir kafese yerleştirilebilir.
3. Tuina terapisi
- Rahat bir ortam oluşturun: Tuina terapisine başlamadan önce, uyum sağlaması için fareyi 30 dakika boyunca kısıtlayıcıya alıştırın (Şekil 1). Bu cihaz, sıçanın uyluğunu tamamen açığa çıkarabilir ve hareketsiz hale getirerek Tuina manevralarını kolaylaştırabilir (bkz.
NOT: Tedavi odasındaki sıcaklık 22-26 °C arasında, nem oranı %40-%50 arasında tutulmalıdır. - Tuina'nın standardizasyonu: Terapistlerin Tuina'nın basıncını ve sıklığını izleyebilen ve gerçek zamanlı geri bildirim verileri sağlayabilen kablosuz parmak kılıfları taktığından emin olun. İlk olarak, Tuina'yı parmak manşonlarının geri bildirim verileriyle uygulayın, kuvveti 5 N'ye ve frekansı 2 Hz'e ayarlayın. Ardından, prosedür boyunca tutarlı bir kuvvet ve frekansı koruyarak sıçanlar üzerinde aynı manevraları yapın (Şekil 2).
NOT: Önceki çalışmalarımıza dayanarak, hesaplanan optimum baskı kuvveti 5 N'dir (ayrıntılar için Tartışma bölümüne bakın). - Akupunktur noktasını tanımlayın: sağ arka ekstremitenin gastroknemius kasını sıçanın Tuina alanı olarak, gastroknemius kasının iki başının birleştiği yerde, yaklaşık olarak BL5714'ün bulunduğu yerde seçin.
- Tuina'yı gerçekleştirin: terapistin sıçanın uyluğunun arka yönüne baktığından ve sıçanın sağ arka bacağını sağ üst uzuvlarıyla tuttuğundan emin olun. Başparmağınızı BL57 akupunktur noktasına dikey olarak yerleştirin ve 5 N'luk bir basınç uygularken ön kol ve parmakların ritmik küçük aralıklı dönme hareketi gerçekleştirmek için kuvvet uyguladığından emin olun (Şekil 3).
- Tedavi sırasında, manipülasyon geri bildiriminin kuvvetinin ve frekansının önceden ayarlanmış değerlere karşılık geldiğinden emin olun. Ameliyattan sonraki dördüncü günden itibaren müdahaleyi başlatın, Tuina 15 dakika boyunca günde bir kez, 18 gün boyunca sürekli olarak gerçekleştirilir.
4. Ağrı için davranış testi
NOT: Davranış testleri modelleme öncesi, modelleme sonrası, müdahale günü 1, müdahale günü 3, müdahale günü 7, müdahale günü 14, müdahale günü 17 ve müdahale günü 21'de yapılmıştır.
- Aşağıdaki adımları izleyerek Mekanik Stimülasyon Yanıt Eşiğini (Pençe Geri Çekilme Eşiği, PWT) gerçekleştirin (Şekil 4).
- Sıçanların ayaklarındaki mekanik stimülasyonun yanıt eşiğini test etmek için von Frey yöntemini kullanın. Sıçanları, 40 cm yükseklikte 10 mm × 10 mm açıklıklara sahip metal tel ızgara standına yerleştirilmiş 20 cm × 10 cm × 20 cm ölçülerinde şeffaf temperli cam bölmeye yerleştirin. Oda sıcaklığını 23 ± 2 °C'de ve çevredeki ortamı sessiz tutun.
- Elektronik Von Frey lifleri ile mekanik çekilme eşiğini ölçün (bkz. Sıçanın ayak merkezini, bacağını kaldırmak veya ondan kaçınmak gibi gözle görülür şekilde hareket edene kadar uyarın. Makine maksimum basınç değerini (N) otomatik olarak kaydeder.
- Aynı fareyi tekrar uyarmadan önce 15 saniye veya daha fazla bekleyin. Sıçanın pençelerinde dokunsal hassasiyetlenmeyi önlemek için her stimülasyonu 5 saniyenin altında tutun. Ardışık üç ölçüm 10 N'den daha az farklılık gösterene kadar testi beş kez tekrarlayın.
- Termal stimülasyona yanıt olarak Pençe Çekme Gecikmesi (PWL) gerçekleştirin (Şekil 5).
- PWL'yi Hargreaves yöntemini kullanarak değerlendirin15,16. Sıçanları, 20 cm x 10 cm x 20 cm ölçülerinde şeffaf temperli camdan yapılmış, havalandırma deliği olan şeffaf bir cam kapaklı küçük bir odaya yerleştirin. Cam kapağın orta alanını, sabit bir sıcaklığa ulaşana kadar bir ısıtma plakası kullanarak 45 °C'ye ısıtın.
- Davranışsal test aşamasında, çevresel faktörlerin test sonuçları üzerindeki etkisini en aza indirmek için sıçanları her gün en az 2 saat davranış laboratuvarına alıştırın.
- Resmi testten önce, çevreye uyum sağlamalarına ve paraziti azaltmalarına izin vermek için fareleri 30 dakika boyunca davranış laboratuvarına yerleştirin.
- Isıtma plakasını 45 °C'ye ısıtın ve farenin arka bacaklarını ısıtma plakasına yerleştirin.
- Pençe çekme gecikmesi (PWL), termal stimülasyona yanıt olarak ısıtmanın başlangıcından pençe çekme refleksinin ortaya çıkmasına kadar geçen süre olarak tanımlandı. Her testte, aynı arka uzuv arka arkaya üç kez test edin ve bu arka uzuvun yanıt gecikmesini elde etmek için ortalama değer. Testten sonra, fareleri beslenmek için kafeslerine geri koyun.
5. Perfüzyon
- Hazırlık: önceden %0.9 tuzlu su çözeltisi ve %4 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın. Tuzlu su çözeltisini 37 °C sabit sıcaklığa ayarlanmış bir fırına koyun ve paraformaldehit çözeltisini daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de buzdolabında saklayın.
- Anestezi uygulayın ve erişim sağlayın.
- Derin anesteziyi indüklemek için sıçanın karın boşluğuna% 25 Üretan (0.6 mL / 100 g, Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte ederek başlayın. Ayak parmağı, kornea veya dönme refleksi gözlenene kadar bekleyin. Fareyi bir köpük tahtaya sabitleyin.
- Göğüs kemiğini makasla kesin ve cildi ve fasyayı katman katman açın. Diyaframı kesin ve kalbi tamamen ortaya çıkarmak için her iki taraftaki kaburgaları kesin. Perikardları dikkatlice ayırın. Akciğerleri kalpten ayırın.
- Kalbi kendine doğru çekerek aortu çekmek ve ortaya çıkarmak için forseps kullanın. İğneyi, sol ventrikülü ve aortu düz bir çizgide ve aynı yatay düzlemde hizalayın. Daha sonra iğneyi sol ventrikülden aort içine sokun, iğne aort içinde görünene kadar.
- Aortu ve aort içindeki iğneyi kelepçelemek için forseps kullanın ve ardından sol atriyumu makasla kesin. Bu sırada, sol atriyumdan büyük miktarda kan fışkıracaktır. Salin çözeltisi için valfi açın ve salin enjeksiyonunu toplamda yaklaşık 150-200 mL perfüz 37 °C salin çözeltisine bağlayın.
- Salin perfüzyonu tamamlandıktan sonra, %4 paraformaldehit çözeltisine geçin ve %4 paraformaldehit çözeltisi ile 4 °C'de toplam yaklaşık 400 mL perfüzasyon yapın. Paraformaldehit perfüzyonunu başlatırken, sıçanın ön dişlerini bir çift forseps ile tutun ve bir elinizle kuyruğu tutup geriye doğru çekerken öne doğru çekin, bu da omurgayı tamamen uzatmak ve DRG örneklemesini kolaylaştırmak için intervertebral foramenleri artırmak için avantajlıdır.
- Perfüzyon sırasında, sıçanın karaciğeri, mezenter ve büyük omentum, karaciğer sertleşene kadar yavaş yavaş soluklaşır. Ardından, akış hızını yavaşlatın ve tüm paraformaldehit perfüze olana kadar saniyede yaklaşık 2 damlaya ayarlayın.
6. Dorsal kök ganglion koleksiyonu
NOT: Perfüzyondan sonra, sıçan omurgasının bel bölümünü hızla kesin. Bu konumlandırma yöntemini kullanarak her iki taraftaki iliak krestin en yüksek noktalarını L5 lomber spinöz prosese bağlayarak L5 ve L4 intervertebral foramenini bulun ve dorsal kök ganglionunu intervertebral foramenlerden çıkarın. Spesifik toplama yöntemi aşağıdaki gibidir:
- Omurilik kanalının (torasik omurilik kanalı) girişinden, makası omurilik kanalına sokun ve tüm laminalar tamamen çıkarılana kadar her iki taraftaki laminaları kesin ve tüm omurilik kanalını açığa çıkarın.
NOT: Laminaları keserken omurilik ve omurilik kanalı dışındaki sinir köklerine zarar vermemeye dikkat edin. - Omuriliği ve posterior longitudinal ligament'i dikkatlice çıkarın. İntervertebral foramenin iç deliğine bağlı dura mater'i ayırın.
- İnci şeklinde ve hafif sarımsı olan dorsal kök ganglionunu kelepçelemek ve çıkarmak için oftalmik forseps kullanın.
NOT: Sinir dokusunun kırılganlığı ve zayıf tokluğu nedeniyle, dorsal kök ganglionunu çekerken gücü ve çekme yönünü kavramak ve kaba kuvvet kullanmamak gerekir. - Dorsal kök ganglionunu çıkarırken, dorsal kök ganglionunun düzgün çekilmesini kolaylaştırmak için dura mater ve araknoid dahil olmak üzere çevredeki yumuşak dokuları önceden temizlediğinizden emin olun.
- Dorsal kök ganglionunu emici kağıda yerleştirin, aksonu bir bıçakla kesin ve dorsal kök ganglionunun yüzeyindeki kan damarlarını temizleyin.
- Kırpma işleminden sonra, dorsal kök ganglionunu tartın ve yeterli bir süre boyunca, genellikle yaklaşık 2-4 saat boyunca,% 4 konsantrasyonda ve 4 ° C sıcaklıkta %4'lük bir paraformaldehit çözeltisine daldırın, ardından dorsal kök ganglionunu kademeli dehidrasyon için önceden hazırlanmış% 10,% 20 ve% 30 PB sükroz çözeltisine (4 ° C) aktarın.
7. Kriyoseksiyon
- Dorsal kök ganglionunu 0.01 M PBS çözeltisine yerleştirerek başlayın. Onları 10 dakika çalkalayın ve ardından sükroz çözeltisini yıkayın. Dorsal kök gangliyonlarının her iki segmentinin akson liflerini dikkatlice kesin. Kriyoseksiyon makinesinin dondurma kafasını temizleyin ve buna optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğini ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Dondurma kafasını sıvı nitrojen içeren metal bir kabuğun yüzeyine yerleştirin, doku donana kadar bekleyin, çıkarın ve düz bir şekilde kesin. Bundan sonra, dondurma kafasını dilimleyicinin tabanına yerleştirin. Dorsal kök gangliyon dilimlerinin kalınlığı 15 mm olmalıdır. Dilimlediğiniz ince kesitleri tahta bir kutuya sırayla dizin ve -20 °C buzdolabında, ışıktan uzakta saklayın.
8. Hematoksilen ve Eozin boyama
- Bölümleri 2 dakika ksilene yerleştirin ve her biri 2 dakika boyunca %100, %95, %80 ve %70 dahil olmak üzere bir dizi alkolde kurutun. Daha sonra bölümleri 2 dakika damıtılmış suya, 1 dakika hematoksilene, 5 dakika musluk suyuyla durulama yapın ve 30 saniye boyunca% 1 tuzlu alkol çözeltisinde, ardından 30 saniye doymuş lityum karbonatta farklılaşma gerçekleştirin.
- Daha sonra, dilimleri her biri 2 dakika damıtılmış su ve musluk suyuna, 5 dakika eozin çözeltisine (%0,5), damıtılmış suda 1 dakika hızlı durulama, her biri %95 ve %100 alkolde 2 dakikalık iki tur, sodyum bikarbonat eklenmiş %100 ksilen içinde 30 s, her biri 3 dakikalık üç tur ksilen ve son olarak, nötr balzam ile kapatın (bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tuina terapisi, CCD modellemesinin neden olduğu sıçanların mekanik ve termal stimülasyon eşiklerini azaltmaya yardımcı olabilir
17 günlük Tuina tedavisinden sonra, Tuina tedavisi alan CCD sıçanları ile tedavi edilmeyen CCD grubu arasında PWT eşiklerinde anlamlı bir fark gözlendi (P = 0.021, <0.05) (Şekil 6 ve Tablo 1).
Tuina tedavisi alan CCD grubundaki sıçanlar, tedavinin başlangıcından itibaren ağrı eşiğinde iyileşme gösterdi ve modellemeden sonra 14. günden itibaren CCD grubu ile Tuina tedavisi alan grup arasında termal ağrı eşiğinde anlamlı bir fark bulundu (P = 0.0047, 0.0056, 0.0049, < 0.01) (Şekil 7 ve Tablo 2).
Tuina tedavisinin uygulanması, CCD modelinin neden olduğu hücre nekrozunu iyileştirmedi
Dorsal kök gangliyonlarının HE boyamasına dayanarak, "L" şeklinde paslanmaz çelik bir çubukla fiziksel sıkıştırmaya maruz bırakılan CCD sıçan grubu, hücre zarı hasarına ve apoptoza maruz kalmıştır (Şekil 8). Buna karşılık, sıçanların kontrol grubu düzgün bir şekilde tanımlanmış kenarlara, sağlam nöron konturlarına ve tam hücre gövdelerine sahipti (Şekil 9). CCD + Tuina grubunda, sıçanların dorsal kök gangliyonlarındaki bazı nöron konturları eksikti (Şekil 10).
Şekil 1: Sıçanlar için kısıtlayıcı. Tongji Üniversitesi tarafından üretilen, fareleri etkili bir şekilde hareketsiz hale getirebilen ve arka bacaklarını tamamen açığa çıkarabilen ev yapımı bir cihazdır. Gümüş vida, sıçanın kuyruğunu tutan ve sıçanı kısıtlayan bölmeyi kontrol eder. Siyah vida, cihazı farenin uzunluğuna göre ayarlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kablosuz dokunma kuvveti ölçümü parmak kılıfları takma. Parmak basıncının kuvvetini ve sıklığını ölçen ve görüntüleyen bir cihaz, Tuina manipülasyonu sırasında yoğunluk ve frekans hakkında gerçek zamanlı geri bildirim sağlar. (a) Basınç sensörü ve iletim ekipmanı. (b) Parmak basıncı ölçümleri. (c) Tuina manipülasyonu sırasında ölçülen kuvvet. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sıçan Tuina için vücut pozisyonu ve akupunktur noktası konumu. Sıçan tutucu, BL57'nin konumunu tamamen açığa çıkarabilir. Uzuvlar, başparmakla birlikte, sıçanın alt uzuvlarını yerine sabitlemek için kavrar, böylece sıçan tedavi sırasında sessizce işbirliği yapabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Pençe çekme eşiği testi. Bu, sıçanlarda ağrı davranışını ölçmek için yapılan bir testtir. Ayaklarını mekanik olarak uyarmayı ve pençe çekme gecikmelerini ölçmeyi içerir. (a) aparatı gösterir ve (b) deney sırasında fare üzerinde nasıl manipüle edildiğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Pençe çekme gecikme testi. Bu kurulum, sıçanların ağrı eşiğini, bir spot ışığı tarafından üretilen ısıya duyarlılıklarına göre ölçer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Pençe çekme eşiği testinin sonuçları. Ölçümler, ortalama artı veya eksi standart hata (
) kullanılarak temsil edilir. Her sıçan grubu için farklı aşamalarda mekanik uyarana bağlı arka bacak yoksunluk refleks eşiği testinin sonuçları. 17. günden itibaren CCD + Tuina ve CCD model grupları arasında anlamlı farklılıklar (P < 0.05) gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Pençe çekme gecikme testinin sonuçları. Ölçümler, ortalama artı veya eksi standart hata () kullanılarak temsil edilir. Her gruptaki sıçanların farklı aşamalarında ısı stimülasyonuna bağlı bacak geri çekilme refleksinin eşik testinin sonuçları. Yedinci günden itibaren CCD + Tuina grubu ile CCD model grubu arasında anlamlı farklılıklar gözlendi (P < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: CCD grubundaki (uzunlamasına kesit) dorsal kök ganglion nöronlarının mikroskobik gözlemi. Bu görüntü, dorsal kök ganglionunun HE boyalı örneğinin taranmasıyla elde edildi. Şekildeki kırmızı elips, bazı nöronların nekroz geçirdiğini gösterir. Bu, CCD modelinin dorsal kök ganglionundaki nöronlara zarar verdiğini gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9. Naif grupta dorsal kök ganglion nöronlarının mikroskobik gözlemi (uzunlamasına kesit ve kesit). Yukarıdaki şekilde gösterildiği gibi, (a) uzunlamasına bir kesittir ve (b) enine bir kesittir. Boş grup sıçanların dorsal kök gangliyonlarının toplandığı alanda CCD grubu boşluk fenomeni yoktur. Nöronlar sürekli ve kompakttır ve hücre gövdeleri doludur. Uydu glial hücreler nöronlar arasında bulunur. Ölçek çubuğu: (a),50 μm; (b), 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: CCD + Tuina grubundaki dorsal kök ganglion nöronlarının mikroskobik gözlemi (kesit). Nöronlar süreklidir ve bir hücre çözünme olgusu vardır. Bu, kısa vadede, masaj terapisinin CCD modelinin neden olduğu hücre nekrozunu (kırmızı elips) iyileştiremediğini gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Tuina basınç testi. Minimum tıslama-kaçış refleks kompresyon değerlerine sahip sıçanların boyutları 5 N ila 25 N arasında değişir. Apsis, basınç derecesini temsil ederken, ordinat sıçan sayısını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 12: CCD sıçanlarının X-ışını görüntüleri. Sıçan modellerinin X-ışını görüntülemesi kullanılarak CCD üretiminin doğrulanması. (a) dikey düzlemde alınan X-ışınını gösterir ve (b) sagital düzlemde alınan X-ışınını gösterir. İki farklı kesit X-ışını, "L" şeklindeki paslanmaz çelik çubuğun konumunun daha net bir şekilde görülmesini sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| N | Modellemeden Önce | D1 | D3 | D7 Serisi | D14 Serisi | D17 Serisi | D21 Serisi | |
| Saf | 8 | 18.1±1.4 | 16.8+1.5 | 16.8±1.5 | 18.6±1.7 | 16.8±1.5 | 15.6±1.8 | 16.8±1.5 |
| Sahte | 8 | 18.0±1.7 | 18.6±1.7 | 16.0±1.3 | 17.6±1.7 | 16.8±1.5 | 18.9±1.7 | 16.8±1.5 |
| CCD | 8 | 17.7±1.1 | 10.7±2.8# | 10.0±1.5 | 4.4±2.2 | 3.8±1.7 | 4.1±2.4 | 3.8±2.5 |
| CCD + Tuina | 8 | 18.9±1.7 | 9.8±2.3# | 8.3±1.4 | 4.8±1.2 | 5.8±2.0 | 7.2±1.8* | 7,5±1,8* |
| #Öncesi ve D1 modelleme karşılaştırması, s<0.05. | ||||||||
| *CCD grubu ile CCD+Tuina grubu arasındaki karşılaştırma, s<0.05. | ||||||||
Tablo 1: Pençe Çekme Eşiği, PWT (, s). Öncesi karşılaştırma ve D1 modellemesi, #p < 0.05. CCD grubu ile CCD + Tuina grubu arasındaki karşılaştırma, *p < 0.05.
| N | Modellemeden Önce | D1 | D3 | D7 Serisi | D14 Serisi | D17 Serisi | D21 Serisi | |
| Saf | 8 | 11.9±1.2 | 12.0±1.6 | 12.2±1.9 | 12.4±1.1 | 12.2±1.9 | 12.0±1.4 | 12.0±1.4 |
| Sahte | 8 | 11.9±1.2 | 11.6±1.5 | 12.2±1.9 | 11.6±1.5 | 12.2±0.9 | 11.6±1.5 | 11.6±1.5 |
| CCD | 8 | 10.8±1.1 | 8.9±0.7# | 7.9±0.8 | 7.7±0.5 | 7.8±1.0 | 7.7±0.8 | 7.7±0.8 |
| CCD + Tuina | 8 | 11.3±1.5 | 9.1±0.6# | 8.0±0.7 | 8,3±0,7* | 8,9±0,6* | 9,1±0,7* | 9,2±0,9* |
| #Öncesi ve D1 modelleme karşılaştırması, p < 0.05. | ||||||||
| CCD grubu ile CCD+Tuina grubu arasındaki karşılaştırma,*p < 0.05. | ||||||||
Tablo 2: Pençe Çekme Gecikmesi, PWL (, s). Öncesi karşılaştırma ve D1 modellemesi, #p < 0.05. CCD grubu ile CCD + Tuina grubu arasındaki karşılaştırma,*p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Araştırma grubumuz, erken dönemde Tuina manipülasyonunun parametreleri ile ilgili çalışmalar yapmıştır. İlk olarak, Tuina manipülasyonu için kuvvet yoğunluğunu ayarlamak önemlidir. Klinik Tuina'da, uygulayıcılar kuvvet yoğunluğunu deneyimlerine ve hastaların öznel duygularına göre ayarlayarak iletişim yoluyla en iyi Tuina etkisini elde ederler. Ancak, hayvan deneylerinde bu mümkün değildir. Hayvan deneylerinde, Tuina manipülasyonunun yoğunluğunu tanımlamak için bir "yanıt eşiği" kullanılır. Bunlar, uygulanan Tuina kuvvetinin hayvanın içgüdüsel tepkisine göre uygun olup olmadığına karar verir. Randall 17 , sıçan iltihabı modellerinde ağrı davranışını incelemek için bu yöntemi kullandı. Aradaki fark, Randall'ın lokal iltihaplanma bölgesinde ameliyat olması, bu deneyin ise yaralanma olmayan alanda çalışmasıdır. Ağır Tuina manipülasyonu, sıçanların çığlık atmasına ve reflekslerden kaçmasına neden olur. Bu ağır kuvvet yoğunluğunun ayarı, resmi Tuina kuvvet yoğunluğunun bu ağır kuvvet yoğunluğundan daha az olduğunu belirler. Ortalama ve standart sapması 9.93 ile 3.018 arasında olan 150 sıçanın maksimum çığlık ve kaçış refleks basış değerlerinin 5-25 N arasındaki dağılımına göre (Şekil 11), önceki çalışmamızda optimal baskı kuvveti değeri 5 N olarak hesaplanmıştır. İkincisi, Tuina yönteminin çalışma frekansı Tuina Bilimi'nde 120-160 kez/dak18 olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, bu deneydeki Tuina frekansı 2 Hz olarak ayarlanmıştır.
CCD modeli, eklem sürecine ve intervertebral foramenlere maruz kalmayı gerektirdiğinden travmatik olabilen cerrahi bir modeldir. Bu nedenle, sıçanların ameliyattan sonra iyileşmesi için 1-3 güne ihtiyacı vardır. Hem literatüre hem de ön deneysel verilere göre, sıçanların ağrı davranışı ameliyattan sonraki dördüncü günde stabil olma eğilimindedir. Bu, Tuina müdahalesinin analjezik etkisini gözlemlemek için uygun bir zaman sağlar. Bununla birlikte, uzun süreli Tuina, sıçanların analjezik etkisine faydalı olmayabilir ve doku hasarına yol açabilir. Bu çalışma, Tuina'nın analjezik etkilerini ve 5, 15 ve 30 dakika boyunca yoğurmayı karşılaştırdı ve sonuçta müdahalenin optimal süresi olarak 15 dakikayı seçti.
Bu yöntemin sınırlamaları vardır, çünkü klinik operasyonların sadece bir kısmı manipülasyonları ve vücut kısımlarını seçmek için kullanılmıştır. BL57 (Chengshan), sıçanların triceps surae'sinde bulunur ve L4 ve L519'un dorsal kök gangliyonları tarafından innerve edilir. Triceps surae kasları kalın ve Tuina için uygun olduğundan, bu bölgeye masaj yapmak, deneysel örnekleme için kullanılan sıçan bel omurlarında L4 ve L5'in dorsal kök gangliyonları üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olabilir.
Kalıplama işlemi sırasında, X-ışını doğrulaması yapılarak CCD ağrı modelinde "L" şeklindeki paslanmaz çelik çubuğun L4 ve L5'in intervertebral foraminasına doğru bir şekilde yerleştirilmesi gerekir. Röntgen çekilmeden önce sıçanlara anestezi uygulamak için intraperitoneal %25 süreli anestezi (0.6 mL/100 g) uyguladık. X-ışını, "L" şeklindeki paslanmaz çelik çubuğun L4 ve L5'in intervertebral foraminasına başarılı bir şekilde yerleştirildiğini doğruladı (Şekil 12).
Genel olarak, bu çalışma Tuina tedavi operasyonlarını gözlemlemeye ve Tuina'nın CCD sıçanları üzerindeki terapötik etkilerini değerlendirmeye odaklanmıştır. Ekip, Tuina parametrelerinin nasıl ayarlanacağını, uygun parçaların nasıl seçileceğini ve uygun tedavi sürelerinin nasıl belirleneceğini araştırmak için bir hayvan deneyi yaptı. Bu, Tuina'nın analjezik etkisi üzerine gelecekteki araştırmalar için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir hayvan modeli müdahale gösterimi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Şangay Kritik Klinik Uzmanlıklar İnşaat Projesi (Hibe Numarası: Shslczdzk04001) tarafından desteklenmiştir; Şanghay Bilim ve Teknoloji Komisyonu'nun Yelken programı (Hibe Numarası: 22YF1444300); Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi bütçesi dahilindeki projeler (Hibe Numarası: 2021LK091).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter) | hand-made | / | For CCD models making |
| ALMEMO admeasuring apparatus | ahlborn | 2450-1 | Mechanical Withdrawal Threshold test |
| Constant temperature slicer CM-1900 | Leica | 1491950C1US | For specimen production |
| Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle | LIRCON/Shandong Lilkang | / | For disinfection |
| Disposable sterile syringe 5 mL | Shanghai Misha Wa Medical Industry | / | For injection |
| Electron microscope CX-31 | Olympus, Japan | BJ002318 | For specimen observation |
| Finger pressure recordings | Suzhou Changxian Optoelectronic Technology | CX1003w | For Tuina manipulation |
| Foam board (35 cm x 20 cm) | hand-made | / | It is our homemade apparatus for fixing rats |
| MERSILK W2512 | Johnson & Johnson | / | For tissue suture |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent | 10004160 | For specimen production |
| paraformaldehyde | China National Chemical Reagent | / | For specimen production |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | For anesthesia of rat |
| Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats | IITC Life Science | / | Paw Withdrawal Latency |
| Precision electronic scale for experiment JY3002 | Shanghai Precision Scientific Instrument | / | Weighing of rat |
| Rat hair clipper | Philips | HP6341/00 | Shaving of rat fur |
| Restrainer for rats | Tongji University (self-made) | / | It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs. |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | For specimen production |
| Uratan | China National Chemical Reagent | / | For anesthesia of rat |
| X-ray detector XR-600 | Dongguan Kaso Electronic Technology | / | Examination of CCD models |
| xylene | Shanghai Sinopharm Group | 100092 | For specimen production |
References
- Vos, T., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Amin, R. M., Andrade, N. S., Neuman, B. J.
- Stochkendahl, M. J., et al. National Clinical Guidelines for non-surgical treatment of patients with recent onset low back pain or lumbar radiculopathy. European Spine Journal. 27 (1), 60-75 (2018).
- Bostelmann, R., Steiger, H. J. Comment on "An evidence-based clinical guideline for the diagnosis and treatment of lumbar disc herniation with radiculopathy". The Spine Journal. 14 (9), 2273 (2014).
- Tang, J., et al. Effect of bone-setting massage combined with acupuncture and moxibustion on simple lumbar disc herniation and its effect on pain and sensory disorder of lower limbs. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 38 (10), 244-247 (2020).
- Lin, X. -Y., Yang, J., Li, H. -M., Hu, S. -J., Xing, J. -L. Dorsal root ganglion compression as an animal model of sciatica and low back pain. Neuroscience Bulletin. 28 (5), 618-630 (2012).
- Shi, C., et al. Animal models for studying the etiology and treatment of low back pain. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 36 (5), 1305-1312 (2018).
- Zhao, X. -y, et al. Effect of Tuina on the expression of TNF-α,IL-6,TGF-β1 and CTGF in the degenerative tissue of rabbits′lumbar intervertebral disc. Journal of Chengdu Medical College. 14 (6), 741-745 (2019).
- Zhang, L., Li, Z. -y, Yu, Z. -y, Yue, X. -y, Fu, R. -y Effect of GABA and GABAAR in analgesic loop of CCI rats by pressing manipulation based on "Taking Tenderness as Acupoints" theory. Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. 28 (3), 50-53 (2014).
- Long, B. -cal, et al. Analgesic effect of massage on rats with neuropathic pain and its mechanism. Guangxi Medical Journal. 44 (17), 2003-2009 (2022).
- Al-Bedah, A., Ali, G., Aboushanab, T., Qureshi, N. Tui Na (or Tuina) massage: A minireview of pertinent literature, 1970-2017. Journal of Complementary and Alternative Medical Research. 3, 1-14 (2017).
- Au, D. W. H., et al. Effects of acupressure on anxiety: a systematic review and meta-analysis. Acupuncture in Medicine: Journal of the British Medical Acupuncture Society. 33 (5), 353-359 (2015).
- Hsiung, W. -T., Chang, Y. -C., Yeh, M. -L., Chang, Y. -H. Acupressure improves the postoperative comfort of gastric cancer patients: A randomised controlled trial. Complementary Therapies in Medicine. 23 (3), 339-346 (2015).
- Wu, S., et al. Neural interconnection between acupoint "Chéngshān (BL57)" and sciatic nerve in the rat. World Journal of Acupuncture - Moxibustion. 31 (2), 129-135 (2021).
- Banik, R. K., Kabadi, R. A. A modified Hargreaves method for assessing threshold temperatures for heat nociception. Journal of neuroscience methods. 219 (1), 41-51 (2013).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal pain sensation in rats and mice using the hargreaves test. Bio-protocol. 7 (16), e2506 (2017).
- Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Archives Internationales De Pharmacodynamie Et De Therapie. 111 (4), 409-419 (1957).
- Yan, J. -t Science of Tuina. , Traditional Chinese Medicine Publishing House. (2003).
- Himes, B. T., Tessler, A. Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats. The Journal of Comparative Neurology. 284 (2), 215-230 (1989).
