Summary
Denna artikel presenterar en manipulation för behandling av kronisk kompression av dorsalrotsgangliet hos råttor med Tuina-terapi, tillsammans med en metod för att utvärdera dess effektivitet baserat på smärtbeteende och histopatologiska resultat.
Abstract
Neuropatisk smärta är ett vanligt tillstånd som drabbar 6,9%-10% av befolkningen och beror på nervskador på grund av olika etiologier, såsom diskbråck i ländryggen, stenos i ryggmärgskanalen och intervertebral foramenstenos. Även om Tuina, en traditionell kinesisk manuell terapi, har visat smärtstillande effekter i klinisk praxis för behandling av neuropatisk smärta, är dess underliggande neurobiologiska mekanismer fortfarande oklara. Djurmodeller är viktiga för att belysa de grundläggande principerna för Tuina. I denna studie föreslår vi ett standardiserat Tuina-protokoll för råttor med kompression av dorsalrotsgangliet (DRG), vilket innebär att inducera DRG-kompression genom att föra in en rostfri stålstav i det intervertebrala foramen, utföra Tuina-manipulation med specifika parametrar för plats, intensitet och frekvens i en kontrollerad miljö och bedöma de beteendemässiga och histopatologiska resultaten av Tuina-behandling. Denna artikel diskuterar också de potentiella kliniska implikationerna och begränsningarna av studien och föreslår riktningar för framtida forskning om Tuina.
Introduction
I kliniska miljöer är det vanligt att observera neurologisk patologisk smärta orsakad av nervrotskompression på grund av olika orsaker. Den mest typiska formen av denna neuropatiska smärta är diskbråck i ländryggen (LDH), som ofta är ihållande, återkommande och svår att bota. Cirka 9 % av världens befolkning är drabbad av LDH, vilket leder till betydande sociala och ekonomiska bördor1. Incidensen av denna typ av neuropatisk smärta ökar årligen, med en trend mot yngre patienter, på grund av förändringar i mänsklig produktion och livsstil2. Trots användning av icke-steroida smärtstillande medel kan patienternas symtom inte lindras helt. Som ett resultat av detta har alternativa terapier, såsom Tuina, för behandling av smärta orsakad av LDH fått allt större uppmärksamhet.
Tuina-terapi, en form av konservativ behandling av LDH, rekommenderas allmänt i olika kliniska riktlinjer över hela världen för att förebygga och behandla smärta i nedre delen av ryggen 3,4. Forskning har visat att Tuina avsevärt kan sänka inflammatoriska faktorer som serum IL-6 och tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α) nivåer hos LDH-patienter samtidigt som patienternas smärta och ländryggsfunktionsförsämringförbättras. Den specifika mekanismen bakom Tuina-terapins smärtlindrande effekter är dock fortfarande oklar.
Djurmodeller är ett värdefullt verktyg för att studera neuropatisk smärta orsakad av LDH6. De möjliggör beteendemätningar för att utvärdera effektiviteten av Tuina-terapi och ger prover på LDH:s patologiska fysiologi. Till exempel kan prover från dorsalrotsganglierna i låret tas för att verifiera förändringar i dorsalrotsganglieceller. Den kroniska kompressionen av dorsalrotsganglionmodellen (CCD) används ofta för att utvärdera den patologiska fysiologin hos LDH, eftersom den orsakar skador på morfologin hos dorsalrotsganglieceller som överensstämmer med de patologiska förändringar som ses i kliniska fall av nervkompression orsakad av diskbråck7.
Många forskare har genomfört flera djurförsök på akupressursmärtlindring 8,9,10. Men när de implementerar akupressuroperationer på djurmodeller imiterar de ofta mänsklig akupressur. Den terapeutiska effekten av akupressur påverkas av faktorer som storleken, frekvensen och riktningen på den applicerade kraften11,12,13. Om experimentet saknar en enhetlig akupressurstandard, såsom kraft, frekvens och varaktighet av operationen, kan detta orsaka en viss avvikelse i experimentresultaten. Den här artikeln introducerar en uppsättning akupressurbehandlingsplaner baserade på egenskaperna hos CCD-råttor och främjar utvecklingen av standardiserade akupressuroperationer i djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta arbete utfördes vid smärtlaboratoriet vid neurobiologiska institutet vid Fudan University. Försöken godkändes och följdes strikt av de riktlinjer för skydd av försöksdjur som fastställts av International Association for the Study of Pain (LASP) för alla kirurgiska ingrepp och djurhantering. Sprague-Dawley (SD) råttor, bestående av 32 hanråttor mellan 40-50 dagar gamla, med en genomsnittlig vikt på 220 ± 1,38 g, användes för den aktuella studien. Dessa råttor erhölls från Experimental Animal Center vid Shanghai Academy of Life Sciences, Chinese Academy of Sciences. Djuren togs om hand på rätt sätt och inhystes i ett särskilt rum med oberoende ventilation, reglerad temperatur (22 ± 1 °C) och luftfuktighet (40-50 %). Råttorna hade tillgång till tillräckligt med mat och vatten i sina burar. Försöksdjursrummet följde en 12 timmar lång cykel mellan ljus och mörker för att upprätthålla regelbundenheten i råttornas dygnsrytm, och utsedd personal bytte regelbundet ut vadderingen. Röntgen utfördes vid röntgenavdelningen vid Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, som är knuten till Shanghai University of Traditional Chinese Medicine.
1. Studiedeltagare och gruppering
- Tilldela 32 råttor till fyra grupper: naiv (kontroll), sham (skenoperation), CCD (kronisk dorsalrotsgangliekompression) och CCD + Tuina (8 råttor/grupp). Råttor hade fri tillgång till mat och vatten i djuranläggningar.
OBS: Naiva råttor hade inget ingrepp, medan skengruppen genomgick samma kirurgiska ingrepp som CCD-gruppråttorna, men utan att lämna en "L"-formad stav av rostfritt stål i L4 och L5 intervertebrala foramen. Råttor i CCD-gruppen genomgick fullständig kronisk dorsalrotsganglionkompressionskirurgi. Råttor i CCD + Tuina-gruppen fick behandling med tuina med början den fjärde dagen efter CCD-operationen.
2. Upprättande av djurmodell
- Administrera isofluoran för att bedöva råttor. När råttorna förlorar medvetandet (ingen svansviftreflex eller benböjningsreflex), raka håret i operationsområdet med en rakhyvel.
OBS: Smärtstillande läkemedel applicerades 15 min före operationen och råttor injicerades subkutant med tramadol 20 mg/kg. - Fäst råttan på en skumskiva (se materialförteckning) och använd gummiband för att fästa dess lemmar och framtänder. Torka av det förberedda området med en steril förberedelse av alkohol och jod omväxlande i minst 3 cykler.
- Sätt i den "L"-formade sonden (se materialförteckning).
- Använd en sax för att göra ett 2-3 cm snitt genom huden, den ytliga fascian och den djupa fascian lager för lager. Lokalisera först den främre övre höftkotpelaren, som motsvarar den femte ländryggen. Lokalisera sedan sekventiellt de tredje och fjärde spinösa processerna.
- Kläm fast den spinösa processen med en tandad pincett och lyft den så att saxen kommer nära den högra sidan av den spinösa processen och klipper av muskeln som är fäst vid den högra sidan av den spinösa processen.
- Dissekera sedan muskeln som är fäst vid den yttre ytan av kotplattan tills det finns motstånd på höger sida. Utsprånget är zygapophysialleden. På samma sätt dissekerar du muskeln och fascian på zygapophysial-leden.
OBS: Den tvärgående processen som pekar mot råttans huvudriktning kommer att beröras först i den nedre yttre fronten av zygapophysialleden. Under den tvärgående processen finns det intervertebrala foramen, som är fyllt med nervrötter och omgivande mjukvävnader och vanligtvis inte är lätt att hitta. - Använd först en "L"-formad sond för att bestämma positionen för det intervertebrala foramen, och använd sedan en "L"-formad stav av rostfritt stål (som måste tillverkas med en diameter på 0,4 mm och en längd på 4 mm) för att sätta in den i det intervertebrala foramen.
- Om dorsalrotsgangliet komprimeras framgångsrikt kommer råttan att uppvisa en svansknyck och benböjningsreflex. Sätt in stången av rostfritt stål i den fjärde och femte ländryggen intervertebrala foramen. Suturera sedan (3-0, se materialtabell) muskeln, fascian och huden lager för lager.
- Placera råttan i en termostatbox tills den vaknar. Efter att ha vaknat, observera om funktionen hos råttans högra bakben är normal. Om det finns drag betyder det att operationen har skadat de motoriska nerverna och råttan bör kasseras. Om funktionen hos höger bakben är normal kan råttan användas och placeras i en bur för utfodring.
3. Tuina-terapi
- Skapa en behaglig miljö: innan du påbörjar behandling med Tuina, vänj råttan vid fasthållningsanordningen i 30 minuter så att den kan anpassa sig (Figur 1). Denna enhet kan helt exponera råttans lår och immobilisera det, vilket underlättar Tuina-manövrar (se materialtabell).
OBS: Temperaturen i behandlingsrummet bör hållas mellan 22-26 °C och luftfuktigheten bör vara mellan 40%-50%. - Standardisering av Tuina: se till att terapeuterna bär trådlösa fingerskydd som kan övervaka trycket och frekvensen av Tuina och ge återkopplingsdata i realtid. Öva först Tuina med återkopplingsdata från fingerhylsorna och justera kraften till 5 N och frekvensen till 2 Hz. Utför sedan samma manövrar på råttorna och bibehåll en jämn kraft och frekvens under hela proceduren (figur 2).
OBS: Baserat på vårt tidigare arbete är den beräknade optimala presskraften 5 N (se avsnittet Diskussion för detaljer). - Identifiera akupunkten: välj gastrocnemius-muskeln i höger bakben som Tuina-området på råttan, vid korsningen av de två huvudena i gastrocnemius-muskeln, ungefär på platsen för BL5714.
- Utför Tuina: se till att terapeuten är vänd mot den bakre aspekten av råttans lår och håller råttans högra bakben med sin högra övre extremitet. Placera tummen vertikalt på BL57-akupunkten och se till att underarmen och fingrarna utövar kraft för att utföra rytmiska roterande rörelser med litet avstånd samtidigt som du applicerar ett tryck på 5 N (Figur 3).
- Under behandlingen, se till att manipulationsåterkopplingens kraft och frekvens motsvarar de förinställda värdena. Påbörja ingreppet från den fjärde dagen efter operationen, med Tuina som utförs en gång om dagen i 15 minuter, kontinuerligt i 18 dagar.
4. Beteendetestning för smärta
OBS: Beteendetester genomfördes före modellering, efter modellering, på interventionsdag 1, interventionsdag 3, interventionsdag 7, interventionsdag 14, interventionsdag 17 och interventionsdag 21.
- Utför Skin Stimulation Response Threshold (Paw Withdrawal Threshold, PWT) genom att följa stegen nedan (Figur 4).
- Använd von Frey-metoden för att testa responströskeln för mekanisk stimulering i råttornas fötter. Placera råttorna i ett genomskinligt fack av härdat glas som mäter 20 cm × 10 cm × 20 cm, som placerades på ett metallgallerstativ med öppningar på 10 mm × 10 mm på en höjd av 40 cm. Håll rumstemperaturen på 23 ± 2 °C och den omgivande miljön tyst.
- Mät den mekaniska uttagströskeln med elektroniska Von Frey-fibrer (se materialförteckning). Stimulera råttans fotcentrum tills det rör sig märkbart, till exempel genom att höja benet eller undvika det. Maskinen registrerar det maximala tryckvärdet (N) automatiskt.
- Vänta i 15 sekunder eller mer innan du stimulerar samma råtta igen. Håll varje stimulering under 5 s för att förhindra taktil sensibilisering i råttans tassar. Upprepa testet fem gånger tills de tre på varandra följande mätningarna skiljer sig åt med mindre än 10 N.
- Utför Paw Withdrawal Latency (PWL) som svar på termisk stimulering (Figur 5).
- Bedöm PWL med hjälp av Hargreaves-metoden15,16. Placera råttorna i en liten kammare av genomskinligt härdat glas, som mäter 20 cm x 10 cm x 20 cm, med ett genomskinligt glaslock med ventilationshål. Värm den centrala delen av glaslocket till 45 °C med hjälp av en värmeplatta tills den når en stabil temperatur.
- Under beteendetestfasen, acklimatisera råttorna till beteendelabbet i minst 2 timmar varje dag för att minimera miljöpåverkans inverkan på testresultaten.
- Innan den formella testningen, placera råttorna i beteendelabbet i 30 minuter så att de kan anpassa sig till miljön och minska störningar.
- Värm värmeplattan till 45 °C och placera råttans bakben på värmeplattan.
- Tassabsuttagslatensen (PWL) definierades som tiden från början av uppvärmningen till uppkomsten av tasstillbakadragandereflexen som svar på termisk stimulering. I varje test testar du samma bakben tre gånger i rad och medelvärdet för att få svarsfördröjningen för det bakbenet. Efter testet, sätt tillbaka råttorna i sina burar för utfodring.
5. Perfusion
- Förberedelse: förbered en 0,9% saltlösning och en 4% paraformaldehydlösning i förväg. Placera koksaltlösningen i en ugn som är inställd på en konstant temperatur på 37 °C och förvara paraformaldehydlösningen i kylskåp vid 4 °C för senare användning.
- Utför anestesi och etablera åtkomst.
- Börja med att injicera 25 % uretan (0,6 ml/100 g, se materialförteckning) i råttans bukhåla för att inducera djup anestesi. Vänta tills ingen tå-, hornhinne- eller vridreflex observeras. Fäst råttan på en skumbräda.
- Klipp av bröstbenet med en sax och öppna huden och fascian lager för lager. Skär av diafragman och skär av revbenen på båda sidor för att helt exponera hjärtat. Separera hjärtsäcken försiktigt. Separera lungorna från hjärtat.
- Använd en pincett för att dra och exponera aortan genom att dra hjärtat mot sig. Rikta in nålen, vänster kammare och aorta i en rak linje och på samma horisontella plan. För sedan in nålen från vänster kammare i aortan tills nålen är synlig inuti aortan.
- Använd en pincett för att klämma fast aortan och nålen inuti aortan och klipp sedan upp vänster förmak med en sax. Vid denna tidpunkt kommer en stor mängd blod att spruta ut ur vänster förmak. Öppna ventilen för koksaltlösningen och anslut koksaltinsprutningen till perfundera 37 °C koksaltlösning, totalt ca 150-200 ml.
- Efter avslutad koksaltperfusion, byt till 4 % paraformaldehydlösning och perfundera med 4 % paraformaldehydlösning för totalt cirka 400 ml vid 4 °C. När du startar paraformaldehydperfusionen, håll i råttans framtänder med en pincett och dra dem framåt, samtidigt som du håller svansen med ena handen och drar den bakåt, vilket är fördelaktigt för att helt förlänga ryggraden och öka den intervertebrala foramen för att underlätta DRG-provtagning.
- Under perfusionen blir råttans lever, tarmkäxet och det större omentumet gradvis bleka tills levern blir stel. Sakta sedan ner flödeshastigheten och justera den till cirka 2 droppar per sekund tills all paraformaldehyd är perfunderad.
6. Samling av dorsalrotganglion
OBS: Efter perfusion, skär snabbt av ländryggen på råttans ryggrad. Lokalisera L5 och L4 intervertebrala foramen genom att ansluta de högsta punkterna på höftbenskammen på båda sidor till L5 ländryggsutskott med denna positioneringsmetod, och ta bort dorsalrotsgangliet från intervertebrala foramen. Den specifika insamlingsmetoden är följande:
- Från ingången till ryggmärgskanalen (bröstryggmärgskanalen), sätt in saxen i ryggmärgskanalen och klipp av lamellen på båda sidor tills alla lameller kan tas bort helt, vilket exponerar hela ryggmärgskanalen.
OBS: Var försiktig så att du inte skadar ryggmärgen och nervrötterna utanför ryggmärgskanalen när du skär lamellerna. - Ta försiktigt bort ryggmärgen och det bakre längsgående ligamentet. Separera dura mater som är fäst vid det inre hålet i intervertebrala foramen.
- Använd en oftalmisk pincett för att klämma fast och dra ut dorsalrotsgangliet, som är format som en pärla och lätt gulaktigt.
OBS: På grund av nervvävnadens bräcklighet och dåliga seghet är det nödvändigt att ta tag i styrkan och dragriktningen när man drar ut dorsalrotsgangliet och inte använda råstyrka. - När du drar ut dorsalrotsgangliet, se till att rengöra de omgivande mjukvävnaderna, inklusive dura mater och araknoid, i förväg för att underlätta den smidiga dragningen av dorsalrotsgangliet.
- Placera dorsalrotsgangliet på absorberande papper, skär av axonet med ett blad och rengör blodkärlen på ytan av dorsalrotsgangliet.
- Efter trimning vägs dorsalrotsgangliet och sänks ner i en 4-procentig paraformaldehydlösning med en koncentration på 4 % och en temperatur på 4 °C under tillräckligt lång tid, vanligtvis cirka 2–4 timmar, och överför sedan dorsalrotsgangliet till 10 %, 20 % och 30 % PB-sackaroslösning (4 °C) som beretts i förväg för stegvis uttorkning.
7. Kryosektionering
- Börja med att placera dorsalrotsgangliet i en 0,01 M PBS-lösning. Skaka dem i 10 minuter och skölj sedan bort sackaroslösningen. Trimma försiktigt axonfibrerna i båda segmenten av dorsalrotsganglierna. Rengör kryosektionsmaskinens fryshuvud och tillsätt den optimala skärtemperaturen (OCT) till den (se materialförteckning).
- Placera fryshuvudet på ytan av ett metallskal som innehåller flytande kväve, vänta tills vävnaden är frusen, ta bort den och trimma den platt. Placera sedan fryshuvudet på skivarens bas. Tjockleken på dorsalrotsganglierna bör vara 15 mm. Lägg de skivade tunna bitarna i en trälåda i ordning och förvara dem i ett kylskåp på -20 °C, borta från ljus.
8. Färgning av hematoxylin och eosin
- Placera delarna 2 minuter i xylen och torka dem i en serie alkoholer, inklusive 100 %, 95 %, 80 % och 70 %, i 2 minuter vardera. Placera sedan sektionerna 2 min i destillerat vatten, 1 min i hematoxylin, utför 5 min kranvattensköljning och utför differentiering i 1% saltlösning i 30 s, följt av 30 s i mättat litiumkarbonat.
- Lägg sedan skivorna 2 minuter vardera i destillerat vatten och kranvatten, 5 minuter i eosinlösning (0,5 %), en 1 minut snabb sköljning i destillerat vatten, två omgångar på 2 minuter vardera i 95 % och 100 % alkohol, 30 s i 100 % xylen med tillsatt natriumbikarbonat, tre omgångar på 3 minuter vardera i xylen och slutligen, tätning med neutral balsam (se materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tuina-terapi kan hjälpa till att minska råttornas mekaniska och termiska stimuleringströsklar som orsakas av CCD-modellering
Efter 17 dagars behandling med Tuina observerades en signifikant skillnad i PWT-tröskelvärden mellan CCD-råttorna som fick behandling med Tuina och den obehandlade CCD-gruppen (P = 0,021, <0,05) (Figur 6 och tabell 1).
Råttorna i CCD-gruppen som fick Tuina-behandling visade en förbättring av smärttröskeln från början av behandlingen, och en signifikant skillnad i termisk smärttröskel hittades mellan CCD-gruppen och gruppen som fick Tuina-behandling från dag 14 efter modellering (P = 0,0047, 0,0056, 0,0049, < 0,01) (Figur 7 och tabell 2).
Användningen av Tuina-terapi förbättrade inte cellnekrosen som orsakades av CCD-modellen
Baserat på HE-färgningen av dorsalrotsganglierna hade CCD-gruppen av råttor, som utsattes för fysisk kompression med en "L"-formad stav av rostfritt stål, ådragit sig cellmembranskador och apoptos (Figur 8). Däremot hade kontrollgruppen av råttor prydligt definierade kanter, intakta neuronkonturer och fullständiga cellkroppar (Figur 9). I CCD + Tuina-gruppen var vissa neuronkonturer i dorsalrotsganglierna hos råttor ofullständiga (Figur 10).
Figur 1: Fasthållning för råttor. Det är en hemmagjord apparat tillverkad av Tongji University, som effektivt kan immobilisera råttorna och helt exponera deras bakben. Silverskruven styr baffeln som håller fast råttans svans och håller fast råttan. Den svarta skruven justerar enheten till råttans längd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bär trådlösa fingerhylsor för taktil kraftmätning. En enhet som mäter och visar kraften och frekvensen av fingertryck ger feedback i realtid om intensiteten och frekvensen under Tuina-manipulation. a) Tryckgivare och transmissionsutrustning. b) Mätningar av fingertryck. c) Den kraft som uppmätts under Tuina-manipulationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kroppsposition och akupunktsplacering för råtta Tuina. Råtthållaren kan helt exponera positionen för BL57. Lemmarna, tillsammans med tummen, tar tag i råttans nedre extremiteter för att fixera den på plats så att råttan kan samarbeta tyst under behandlingen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Tröskeltest för tassuttag. Detta är ett test för att mäta smärtbeteende hos råttor. Det handlar om att mekaniskt stimulera deras fötter och mäta deras tasstillbakadragande latens. (a) visar apparaturen, och (b) visar hur den manipulerades på musen under experimentet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Fördröjningstest för tassuttag. Denna uppställning mäter råttornas smärttröskel genom deras känslighet för värmen som genereras av en strålkastare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Resultat av testet av tröskelvärdet för uttag av tassar. Mätningarna representeras med hjälp av medelvärdet plus eller minus standardfelet (
). Resultat av det mekaniska stimulusinducerade reflextestet för tillbakadragande av bakbenen i olika stadier för varje grupp av råttor. Signifikanta skillnader (P < 0,05) observerades mellan CCD + Tuina och CCD-modellgrupperna från dag 17 och framåt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Resultat av latenstestet för tasstillbakadragande. Mätningarna representeras med hjälp av medelvärdet plus eller minus standardfelet (). Resultat av tröskeltestning av värmestimuleringsinducerad bentillbakadragandereflex i olika stadier hos råttor i varje grupp. Signifikanta skillnader observerades mellan CCD + Tuina-gruppen och CCD-modellgruppen från och med den sjunde dagen (P < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Mikroskopisk observation av dorsalrotsganglieneuroner i CCD-gruppen (longitudinellt snitt). Denna bild erhölls genom att skanna det HE-färgade provet av dorsalrotsgangliet. Den röda ellipsen i figuren indikerar att vissa neuroner genomgår nekros. Detta tyder på att CCD-modellen har orsakat skador på nervcellerna i dorsalrotsgangliet. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9. Mikroskopisk observation av dorsalrotsganglieneuroner i den naiva gruppen (längsgående snitt och tvärsnitt). Som visas i figuren ovan är (a) en längsgående sektion och (b) en tvärgående sektion. Det finns inget fenomen med vakans i CCD-gruppen i det område där den tomma gruppen av råttors dorsalrotsganglier samlas. Neuronerna är kontinuerliga och kompakta, och cellkropparna är fyllda. Satellitgliaceller finns mellan nervcellerna. Skalstapel: (a),50 μm; (b), 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Mikroskopisk observation av dorsalrotsganglieneuroner i CCD + Tuina-gruppen (tvärsnitt). Neuronerna är kontinuerliga, och det finns ett cellupplösningsfenomen. Detta indikerar att massageterapi på kort sikt inte kunde förbättra cellnekrosen (röd ellips) orsakad av CCD-modellen. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Tuina trycktest. Råttor med minimala kompressionsvärden för väsande-flyktreflex varierar i storlek, från 5 N till 25 N. Abskissan representerar graden av tryck, medan koordinaten representerar antalet råttor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 12: Röntgenbilder av CCD-råttor. Validering av CCD-tillverkning med hjälp av röntgenavbildning av råttmodeller. (a) visar röntgenbilden tagen i vertikalplanet och (b) visar röntgenbilden tagen i sagittalplanet. De två olika tvärsnittsröntgenstrålarna ger en tydligare bild av positionen för den "L"-formade rostfria stålstången. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| N | Före modellering | D1 | D3 | D7 | D14 | D17 | D21 | |
| Naiv | 8 | 18.1±1.4 | 16.8+1.5 | 16,8±1,5 | 18,6±1,7 | 16,8±1,5 | 15.6±1.8 | 16,8±1,5 |
| Bluff | 8 | 18,0±1,7 | 18,6±1,7 | 16.0±1.3 | 17.6±1.7 | 16,8±1,5 | 18,9±1,7 | 16,8±1,5 |
| CCD | 8 | 17.7±1.1 | 10.7±2.8# | 10.0±1.5 | 4.4±2.2 | 3.8±1.7 | 4.1±2.4 | 3.8±2.5 |
| CCD + Tuina | 8 | 18,9±1,7 | 9.8±2.3# | 8.3±1.4 | 4.8±1.2 | 5.8±2.0 | 7.2±1.8* | 7.5±1.8* |
| #Jämförelse före och D1-modellering, s<0,05. | ||||||||
| *Jämförelse mellan CCD-gruppen och CCD+Tuina-gruppen, s<0,05. | ||||||||
Tabell 1: Tröskelvärde för uttag av tassar, PWT (, s). Jämförelse före och D1-modellering, #p < 0,05. Jämförelse mellan CCD-gruppen och CCD + Tuina-gruppen, *p < 0,05.
| N | Före modellering | D1 | D3 | D7 | D14 | D17 | D21 | |
| Naiv | 8 | 11.9±1.2 | 12,0±1,6 | 12.2±1.9 | 12.4±1.1 | 12.2±1.9 | 12.0±1.4 | 12.0±1.4 |
| Bluff | 8 | 11.9±1.2 | 11.6±1.5 | 12.2±1.9 | 11.6±1.5 | 12.2±0.9 | 11.6±1.5 | 11.6±1.5 |
| CCD | 8 | 10.8±1.1 | 8.9±0.7# | 7,9±0,8 | 7.7±0.5 | 7.8±1.0 | 7,7±0,8 | 7,7±0,8 |
| CCD + Tuina | 8 | 11.3±1.5 | 9.1±0.6# | 8,0±0,7 | 8,3±0,7* | 8,9±0,6* | 9.1±0.7* | 9,2±0,9* |
| #Jämförelse före och D1-modellering, p < 0,05. | ||||||||
| Jämförelse mellan CCD-gruppen och CCD+Tuina-gruppen,*p < 0,05. | ||||||||
Tabell 2: Tassuttagslatens, PWL (, s). Jämförelse före och D1-modellering, #p < 0,05. Jämförelse mellan CCD-gruppen och CCD + Tuina-gruppen,*p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår forskargrupp har genomfört relevanta studier av parametrarna för Tuina-manipulation i ett tidigt skede. För det första är det viktigt att ställa in kraftintensiteten för Tuina-manipulation. I klinisk Tuina anpassar utövarna kraftintensiteten efter sin erfarenhet och patienternas subjektiva känslor, vilket ger den bästa Tuina-effekten genom kommunikation. Detta är dock inte möjligt i djurförsök. I djurförsök används en "responströskel" för att definiera intensiteten av Tuina-manipulationen. Dessa bedömer om den applicerade Tuina-kraften är lämplig baserat på djurets instinktiva reaktion. Randall17 använde denna metod för att studera smärtbeteende i råttinflammationsmodeller. Skillnaden är att Randall opererade i det lokala inflammationsområdet, medan detta experiment opererade i det icke-skadeområdet. Tung Tuina-manipulation kommer att få råttor att producera skrik och fly reflexer. Inställningen av denna intensitet för tung kraft bestämmer att den formella intensiteten för Tuina-kraften är mindre än denna intensitet för tung kraft. Baserat på fördelningen av maximala pressvärden för skrik och flyktreflex hos 150 råttor mellan 5-25 N, med ett medelvärde och standardavvikelse på 9,93 och 3,018 (figur 11), beräknade vårt tidigare arbete det optimala presskraftsvärdet till 5 N. För det andra beskrivs Tuina-metodens arbetsfrekvens i Science of Tuina som 120-160 gånger/min18. Därför sattes Tuina-frekvensen i detta experiment till 2 Hz.
CCD-modellen är en kirurgisk modell som kan vara traumatisk, eftersom den kräver exponering för artikulära processen och intervertebrala foramen. Därför behöver råttor 1-3 dagar för att återhämta sig efter operationen. Enligt både litteraturen och preliminära experimentella data tenderar smärtbeteendet hos råttor att vara stabilt på den fjärde dagen efter operationen. Detta ger en gynnsam tidpunkt för att observera den smärtstillande effekten av Tuina-interventionen. Långvarig Tuina kan dock inte vara till nytta för den smärtstillande effekten hos råttor och kan leda till vävnadsskador. I denna studie jämfördes de smärtstillande effekterna av Tuina och knådning i 5, 15 och 30 minuter, och valde slutligen 15 minuter som den optimala varaktigheten av interventionen.
Denna metod har sina begränsningar, eftersom endast en del av den kliniska verksamheten användes för att välja manipulationer och kroppsdelar. BL57 (Chengshan) är belägen i triceps surae hos råttor, och den innerveras av dorsalrotsganglierna i L4 och L519. Eftersom triceps surae-musklerna är tjocka och lämpliga för Tuina, kan massage av detta område ha en direkt inverkan på dorsalrotsganglierna i L4 och L5 i ländkotorna hos råttor som används för experimentell provtagning.
Under gjutningsprocessen måste man säkerställa korrekt införande av den "L"-formade rostfria stålstaven i den intervertebrala foramina av L4 och L5 i CCD-smärtmodellen genom att utföra röntgenverifiering. Innan röntgen togs administrerade vi intraperitoneal 25% duration anestesi (0,6 ml/100 g) för att söva råttorna. Röntgen bekräftade att den L-formade staven av rostfritt stål framgångsrikt förts in i de intervertebrala foramina av L4 och L5 (figur 12).
Sammantaget fokuserade denna studie på att observera Tuina-behandlingsoperationer och utvärdera de terapeutiska effekterna av Tuina på CCD-råttor. Teamet utförde ett djurförsök för att undersöka hur man ställer in Tuina-parametrar, väljer lämpliga delar och bestämmer lämpliga behandlingstider. Detta ger en standardiserad och reproducerbar interventionsdemonstration av djurmodeller för framtida forskning om den smärtstillande effekten av Tuina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ShanghaiCritical Clinical Specialties ConstructionProject (anslagsnummer: Shslczdzk04001); seglingsprogrammet för Shanghai Science and Technology Commission (bidragsnummer: 22YF1444300); Projekt inom budgeten förShanghai University of Traditional ChineseMedicine(Anslagsnummer: 2021LK091).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter) | hand-made | / | For CCD models making |
| ALMEMO admeasuring apparatus | ahlborn | 2450-1 | Mechanical Withdrawal Threshold test |
| Constant temperature slicer CM-1900 | Leica | 1491950C1US | For specimen production |
| Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle | LIRCON/Shandong Lilkang | / | For disinfection |
| Disposable sterile syringe 5 mL | Shanghai Misha Wa Medical Industry | / | For injection |
| Electron microscope CX-31 | Olympus, Japan | BJ002318 | For specimen observation |
| Finger pressure recordings | Suzhou Changxian Optoelectronic Technology | CX1003w | For Tuina manipulation |
| Foam board (35 cm x 20 cm) | hand-made | / | It is our homemade apparatus for fixing rats |
| MERSILK W2512 | Johnson & Johnson | / | For tissue suture |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent | 10004160 | For specimen production |
| paraformaldehyde | China National Chemical Reagent | / | For specimen production |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | For anesthesia of rat |
| Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats | IITC Life Science | / | Paw Withdrawal Latency |
| Precision electronic scale for experiment JY3002 | Shanghai Precision Scientific Instrument | / | Weighing of rat |
| Rat hair clipper | Philips | HP6341/00 | Shaving of rat fur |
| Restrainer for rats | Tongji University (self-made) | / | It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs. |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | For specimen production |
| Uratan | China National Chemical Reagent | / | For anesthesia of rat |
| X-ray detector XR-600 | Dongguan Kaso Electronic Technology | / | Examination of CCD models |
| xylene | Shanghai Sinopharm Group | 100092 | For specimen production |
References
- Vos, T., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Amin, R. M., Andrade, N. S., Neuman, B. J.
- Stochkendahl, M. J., et al. National Clinical Guidelines for non-surgical treatment of patients with recent onset low back pain or lumbar radiculopathy. European Spine Journal. 27 (1), 60-75 (2018).
- Bostelmann, R., Steiger, H. J. Comment on "An evidence-based clinical guideline for the diagnosis and treatment of lumbar disc herniation with radiculopathy". The Spine Journal. 14 (9), 2273 (2014).
- Tang, J., et al. Effect of bone-setting massage combined with acupuncture and moxibustion on simple lumbar disc herniation and its effect on pain and sensory disorder of lower limbs. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 38 (10), 244-247 (2020).
- Lin, X. -Y., Yang, J., Li, H. -M., Hu, S. -J., Xing, J. -L. Dorsal root ganglion compression as an animal model of sciatica and low back pain. Neuroscience Bulletin. 28 (5), 618-630 (2012).
- Shi, C., et al. Animal models for studying the etiology and treatment of low back pain. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 36 (5), 1305-1312 (2018).
- Zhao, X. -y, et al. Effect of Tuina on the expression of TNF-α,IL-6,TGF-β1 and CTGF in the degenerative tissue of rabbits′lumbar intervertebral disc. Journal of Chengdu Medical College. 14 (6), 741-745 (2019).
- Zhang, L., Li, Z. -y, Yu, Z. -y, Yue, X. -y, Fu, R. -y Effect of GABA and GABAAR in analgesic loop of CCI rats by pressing manipulation based on "Taking Tenderness as Acupoints" theory. Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. 28 (3), 50-53 (2014).
- Long, B. -cal, et al. Analgesic effect of massage on rats with neuropathic pain and its mechanism. Guangxi Medical Journal. 44 (17), 2003-2009 (2022).
- Al-Bedah, A., Ali, G., Aboushanab, T., Qureshi, N. Tui Na (or Tuina) massage: A minireview of pertinent literature, 1970-2017. Journal of Complementary and Alternative Medical Research. 3, 1-14 (2017).
- Au, D. W. H., et al. Effects of acupressure on anxiety: a systematic review and meta-analysis. Acupuncture in Medicine: Journal of the British Medical Acupuncture Society. 33 (5), 353-359 (2015).
- Hsiung, W. -T., Chang, Y. -C., Yeh, M. -L., Chang, Y. -H. Acupressure improves the postoperative comfort of gastric cancer patients: A randomised controlled trial. Complementary Therapies in Medicine. 23 (3), 339-346 (2015).
- Wu, S., et al. Neural interconnection between acupoint "Chéngshān (BL57)" and sciatic nerve in the rat. World Journal of Acupuncture - Moxibustion. 31 (2), 129-135 (2021).
- Banik, R. K., Kabadi, R. A. A modified Hargreaves method for assessing threshold temperatures for heat nociception. Journal of neuroscience methods. 219 (1), 41-51 (2013).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal pain sensation in rats and mice using the hargreaves test. Bio-protocol. 7 (16), e2506 (2017).
- Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Archives Internationales De Pharmacodynamie Et De Therapie. 111 (4), 409-419 (1957).
- Yan, J. -t Science of Tuina. , Traditional Chinese Medicine Publishing House. (2003).
- Himes, B. T., Tessler, A. Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats. The Journal of Comparative Neurology. 284 (2), 215-230 (1989).
