Summary
В данной статье представлена манипуляция для лечения хронической компрессии ганглия заднего корешка у крыс с помощью терапии Туйна, а также метод оценки ее эффективности на основе болевого поведения и гистопатологических результатов.
Abstract
Нейропатическая боль является распространенным состоянием, которое поражает 6,9%-10% населения и возникает в результате повреждения нервов различной этиологии, таких как грыжа межпозвоночного диска поясничного отдела, стеноз позвоночного канала и стеноз межпозвонкового отверстия. Несмотря на то, что Туйна, традиционная китайская мануальная терапия, показала обезболивающий эффект в клинической практике для лечения нейропатической боли, лежащие в ее основе нейробиологические механизмы остаются неясными. Животные модели необходимы для выяснения основных принципов Туины. В этом исследовании мы предлагаем стандартизированный протокол Tuina для крыс с компрессией ганглия заднего корешка (DRG), который включает в себя индуцирование компрессии DRG путем введения стержня из нержавеющей стали в межпозвонковое отверстие, выполнение манипуляций Tuina с определенными параметрами локализации, интенсивности и частоты в контролируемой среде, а также оценку поведенческих и гистопатологических исходов лечения Tuina. В этой статье также обсуждаются потенциальные клинические последствия и ограничения исследования и предлагаются направления для будущих исследований Tuina.
Introduction
В клинических условиях часто наблюдается неврологическая патологическая боль, вызванная компрессией нервных корешков по разным причинам. Наиболее типичной формой этой нейропатической боли является грыжа межпозвоночного диска поясничного отдела позвоночника (ЛДГ), которая часто является постоянной, рецидивирующей и трудно излечимой. Примерно 9% населения мира страдают от ЛДГ, что приводит к значительному социальному и экономическому бремени1. Частота возникновения этого типа нейропатической боли увеличивается с каждым годом, с тенденцией к более молодому возрасту пациентов из-за изменений в производстве и образе жизничеловека. Несмотря на применение нестероидных обезболивающих, симптомы пациентов не могут быть полностью облегчены. В результате, альтернативные методы лечения, такие как Tuina, для лечения боли, вызванной ЛДГ, привлекают все большее внимание.
Терапия Tuina, форма консервативного лечения ЛДГ, широко рекомендована в различных клинических руководствах по всему миру для профилактики и лечения боли в пояснице 3,4. Исследования показали, что Tuina может значительно снизить уровень воспалительных факторов, таких как сывороточный IL-6 и фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α) у пациентов с ЛДГ, одновременно уменьшая боль и нарушение функции поясницы у пациентов5. Тем не менее, конкретный механизм, лежащий в основе обезболивающих эффектов терапии Tuina, остается неясным.
Животные модели являются ценным инструментом для изучения нейропатической боли, вызванной ЛДГ6. Они позволяют проводить поведенческие измерения для оценки эффективности терапии Tuina и предоставляют образцы патологической физиологии ЛДГ. Например, образцы из ганглиев задних корешков бедра могут быть взяты для проверки изменений в ганглиозных клетках задних корешков. Хроническая компрессия модели ганглия заднего корешка (CCD) обычно используется для оценки патологической физиологии ЛДГ, поскольку она вызывает повреждение морфологии ганглиозных клеток дорсальных корешков, которые согласуются с патологическими изменениями, наблюдаемыми в клинических случаях компрессии нерва, вызванной грыжей диска7.
Многие ученые провели несколько экспериментов на животных по точечной анальгезии 8,9,10. Однако при выполнении операций точечного массажа на животных моделях часто имитируют точечный массаж человека. На лечебный эффект точечного массажа влияют такие факторы, как величина, частота и направление приложенной силы11,12,13. Если в эксперименте отсутствует единый стандарт точечного массажа, такой как сила, частота и продолжительность операции, это может привести к некоторым отклонениям в результатах эксперимента. В данной статье представлен набор планов лечения точечным массажем, основанных на характеристиках крыс CCD, и содействие разработке стандартизированных операций точечного массажа на животных моделях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта работа была проведена в лаборатории боли Института нейробиологии Фуданьского университета. Эксперименты были одобрены и строго соблюдались в соответствии с рекомендациями по защите лабораторных животных, установленными Международной ассоциацией по изучению боли (LASP) для всех хирургических процедур и обращения с животными. Для настоящего исследования были использованы чистые крысы Спрэга-Доули (SD), состоящие из 32 самцов в возрасте от 40 до 50 дней, со средним весом 220 ± 1,38 г. Эти крысы были получены из Центра экспериментальных животных Шанхайской академии наук о жизни Китайской академии наук. За животными осуществлялся надлежащий уход и размещение в специальном помещении с независимой вентиляцией, регулируемой температурой (22 ± 1 °C) и влажностью (40%-50%). Крысы имели доступ к достаточному количеству пищи и воды в своих клетках. В комнате для лабораторных животных соблюдался 12-часовой цикл света и темноты, чтобы поддерживать регулярность циркадных ритмов крыс, а специальный персонал регулярно заменял подкладку. Рентген был выполнен в отделении радиологии больницы интегрированной традиционной китайской и западной медицины Юэян, аффилированной с Шанхайским университетом традиционной китайской медицины.
1. Участники исследования и группировка
- Распределите 32 крысы по четырем группам: наивная (контроль), симуляция (имитация операции), CCD (хроническая компрессия ганглия заднего корешка) и CCD + Tuina (8 крыс в группе). Крысы имели свободный доступ к пище и воде в животноводческих помещениях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наивные крысы не подвергались вмешательству, в то время как бутафорская группа подверглась той же хирургической процедуре, что и крысы группы CCD, но без оставления «L»-образного стержня из нержавеющей стали в межпозвонковом отверстии L4 и L5. Крысам в группе CCD была проведена полная операция по компрессии ганглия заднего корешка. Крысы в группе CCD + Tuina получали терапию туйной, начиная с четвертого дня после операции CCD.
2. Создание животной модели
- Вводят изофторан для обезболивания крыс. Как только крысы потеряют сознание (нет рефлекса взмахивания хвостом или рефлекса сгибания ног), сбрейте волосы в области операции с помощью бритвы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивающие препараты наносили за 15 мин до операции, а крысам подкожно вводили трамадол в дозе 20 мг/кг. - Закрепите крысу на пенопластовой доске (см. Таблицу материалов) и используйте резинки, чтобы зафиксировать ее конечности и резцы. Протирайте подготовленный участок стерильным препаратом из чередования спирта и йода в течение минимум 3 циклов.
- Вставьте L-образный зонд (см. Таблицу материалов).
- Ножницами сделайте послойный разрез 2-3 см через кожу, поверхностную фасцию и глубокую фасцию. Во-первых, найдите переднюю верхнюю подвздошную кость, которая соответствует пятому поясничному отделу позвоночника. Затем последовательно локализуют третий и четвертый остистые отростки.
- Зажмите остистый отросток зубчатыми щипцами и приподнимите его, чтобы ножницы оказались близко к правой стороне остистого отростка и перерезали мышцу, прикрепленную к правой стороне остистого отростка.
- Затем тупо рассекайте мышцу, прикрепленную к наружной поверхности позвоночной пластинки, до тех пор, пока не возникнет сопротивление с правой стороны. Выпячивание представляет собой скуловой сустав. Аналогично тупо рассеките мышцу и фасцию на скуловом суставе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поперечный отросток, указывающий в направлении головы крысы, сначала затрагивается в нижней наружной передней части зигапофизиального сустава. Ниже поперечного отростка находится межпозвонковое отверстие, которое заполнено нервными корешками и окружающими мягкими тканями, и его обычно нелегко найти. - Сначала с помощью «L»-образного зонда для определения положения межпозвонкового отверстия, а затем с помощью «L»-образного стержня из нержавеющей стали (который нужно изготовить диаметром 0,4 мм и длиной 4 мм) ввести его в межпозвонковое отверстие.
- Если ганглий заднего корешка успешно сдавлен, у крысы будет наблюдаться взмах хвостом и рефлекс сгибания ног. Вставьте стержень из нержавеющей стали в четвертое и пятое поясничное межпозвонковое отверстие. Затем наложите швы (3-0, см. Таблицу материалов) на мышцу, фасцию и кожу слой за слоем.
- Поместите крысу в термостатический ящик, пока она не проснется. После пробуждения понаблюдайте, нормализована ли функция правой задней конечности крысы. Если есть волочение, значит, операция повредила двигательные нервы, и крысу следует выбросить. Если функция правой задней конечности в норме, крысу можно использовать и поместить в клетку для кормления.
3. Туинотерапия
- Создайте комфортные условия: перед началом терапии Tuina акклиматизируйте крысу в ограничителе в течение 30 минут, чтобы дать ей возможность адаптироваться (рис. 1). Это приспособление может полностью обнажить бедро крысы и обездвижить его, облегчая маневры Туина (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура в процедурном кабинете должна поддерживаться в пределах 22-26 °C, а влажность должна быть в пределах 40%-50%. - Стандартизация Tuina: убедитесь, что терапевты носят беспроводные рукава для пальцев, которые могут контролировать давление и частоту Tuina и предоставлять данные обратной связи в режиме реального времени. Сначала потренируйтесь с данными обратной связи пальцевых рукавов, регулируя усилие до 5 Н и частоту до 2 Гц. Затем выполните те же маневры на крысах, сохраняя постоянную силу и частоту на протяжении всей процедуры (рис. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на нашей предыдущей работе, рассчитанное оптимальное усилие прессования составляет 5 Н (подробнее см. раздел «Обсуждение»). - Определите акупунктурную точку: выберите икроножную мышцу правой задней конечности в качестве области Туина крысы, в месте соединения двух головок икроножной мышцы, примерно в месте расположения BL5714.
- Выполните Туину: убедитесь, что терапевт смотрит на заднюю часть бедра крысы и держит правую заднюю конечность крысы правой верхней конечностью. Расположите большой палец вертикально на акупунктурной точке BL57 и убедитесь, что предплечье и пальцы прилагают усилие для выполнения ритмичных вращательных движений на малом расстоянии, прилагая давление 5 Н (Рисунок 3).
- Во время лечения следите за тем, чтобы сила и частота обратной связи манипуляций соответствовали заданным значениям. Начните вмешательство с четвертого дня после операции, при этом Туйна выполняется один раз в день по 15 мин, непрерывно в течение 18 дней.
4. Поведенческое тестирование боли
ПРИМЕЧАНИЕ: Поведенческие тесты проводились до моделирования, после моделирования, в 1-й день вмешательства, 3-й день вмешательства, 7-й день вмешательства, 14-й день вмешательства, 17-й день вмешательства и 21-й день вмешательства.
- Выполните определение порога реакции на механическую стимуляцию (Paw Withdrawal Threshold, PWT), выполнив следующие действия (рис. 4).
- Используйте метод фон Фрея для проверки порога реакции на механическую стимуляцию в ногах крыс. Поместите крыс в прозрачный отсек из закаленного стекла размером 20 см × 10 см × 20 см, который поместили на подставку из металлической проволочной сетки с отверстиями 10 мм × 10 мм на высоте 40 см. Поддерживайте температуру в помещении на уровне 23 ± 2 °C, а окружающую среду — в тишине.
- Измерьте механический порог отвода с помощью электронных волокон фон Фрея (см. таблицу материалов). Стимулируйте центр стопы крысы до тех пор, пока она не начнет заметно двигаться, например, поднимать ногу или избегать ее. Машина автоматически регистрирует максимальное значение давления (Н).
- Подождите 15 секунд или больше, прежде чем снова стимулировать ту же крысу. Каждая стимуляция не должна превышать 5 с, чтобы предотвратить тактильную сенсибилизацию в лапах крысы. Повторите испытание пять раз до тех пор, пока три последовательных измерения не будут отличаться менее чем на 10 Н.
- Выполните латентность вывода лапы (PWL) в ответ на тепловую стимуляцию (рис. 5).
- Оценивают PWL по методу Харгривза15,16. Поместите крыс в небольшую камеру из прозрачного закаленного стекла, размером 20 см х 10 см х 20 см, с прозрачной стеклянной крышкой с вентиляционным отверстием. Нагрейте центральную часть стеклянной крышки до 45 °C с помощью нагревательной пластины, пока она не достигнет стабильной температуры.
- Во время фазы поведенческого тестирования акклиматизируйте крыс в поведенческой лаборатории не менее 2 часов каждый день, чтобы свести к минимуму влияние факторов окружающей среды на результаты тестирования.
- Перед формальным тестированием поместите крыс в поведенческую лабораторию на 30 минут, чтобы они могли адаптироваться к окружающей среде и уменьшить помехи.
- Нагрейте нагревательную пластину до 45 °C и поместите задние конечности крысы на нагревательную пластину.
- Латентность отведения лапы (PWL) определялась как время от начала нагрева до появления рефлекса отведения лапы в ответ на тепловую стимуляцию. В каждом тесте проверяйте одну и ту же заднюю конечность три раза подряд и среднее значение, чтобы получить латентность ответа этой задней конечности. После тестирования верните крыс в клетки для кормления.
5. Перфузия
- Приготовление: заранее приготовьте 0,9% солевой раствор и 4% раствор параформальдегида. Поместите солевой раствор в духовку с постоянной температурой 37 °C и храните раствор параформальдегида в холодильнике при температуре 4 °C для последующего использования.
- Проведите анестезию и установите доступ.
- Начните с введения 25% уретана (0,6 мл/100 г, см. таблицу материалов) в брюшную полость крысы, чтобы вызвать глубокую анестезию. Подождите, пока не исчезнет рефлекс пальца ноги, роговицы или поворота. Закрепите крысу на пенокартоне.
- Разрежьте грудную кость ножницами и вскрывайте кожу и фасцию слой за слоем. Отрежьте диафрагму и отрежьте ребра с обеих сторон, чтобы полностью обнажить сердце. Аккуратно отделите перикард. Отделите легкие от сердца.
- Используйте щипцы, чтобы потянуть и обнажить аорту, потянув сердце на себя. Совместите иглу, левый желудочек и аорту по прямой линии и в одной горизонтальной плоскости. Затем введите иглу из левого желудочка в аорту до тех пор, пока игла не станет видна внутри аорты.
- С помощью щипцов зажмите аорту и иглу внутри аорты, а затем разрежьте левое предсердие ножницами. В это время из левого предсердия будет хлестать большое количество крови. Откройте клапан для физиологического раствора и подсоедините инъекцию физиологического раствора к перфузии физиологического раствора с температурой 37 °C, в общей сложности около 150-200 мл.
- После завершения перфузии физиологического раствора переключитесь на 4% раствор параформальдегида и перфузируйте 4% раствором параформальдегида в общей сложности около 400 мл при 4 °C. При начале перфузии параформальдегида удерживайте передние зубы крысы одной парой щипцов и тяните их вперед, придерживая хвост одной рукой и тяну его назад, что выгодно для полного вытяжения позвоночника и увеличения межпозвонкового отверстия для облегчения отбора проб DRG.
- Во время перфузии печень крысы, брыжейка и большой сальник постепенно бледнеют до тех пор, пока печень не станет жесткой. Затем уменьшите скорость потока и отрегулируйте ее примерно до 2 капель в секунду, пока весь параформальдегид не будет перфузирован.
6. Скопление ганглия заднего корешка
ПРИМЕЧАНИЕ: После перфузии быстро отрежьте поясничный отдел позвоночника крысы. Найдите межпозвонковое отверстие L5 и L4, соединив самые высокие точки гребня подвздошной кости с обеих сторон с поясничным остистым отростком L5 с помощью этого метода позиционирования, и удалите ганглий заднего корешка из межпозвонкового отверстия. Конкретный метод сбора следующий:
- От входа в спинномозговой канал (грудной позвоночный канал) введите ножницы в спинномозговой канал и отрежьте пластинку с обеих сторон до тех пор, пока все пластинки не будут полностью удалены, обнажив весь спинномозговой канал.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить спинной мозг и нервные корешки за пределами спинномозгового канала при разрезании пластинок. - Осторожно извлеките спинной мозг и заднюю продольную связку. Отделяют твердую мозговую оболочку, прикрепленную к внутреннему отверстию межпозвоночного отверстия.
- Используйте офтальмологические щипцы, чтобы пережать и вытащить ганглий заднего корешка, который имеет форму жемчужины и слегка желтоватый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за хрупкости и плохой жесткости нервной ткани необходимо ухватиться за силу и направление тяги при вытаскивании ганглия заднего корешка и не использовать грубую силу. - При вытягивании ганглия заднего корешка заранее очистите окружающие мягкие ткани, включая твердую мозговую оболочку и паутинную оболочку, чтобы облегчить плавное вытягивание ганглия заднего корешка.
- Поместите ганглий заднего корешка на впитывающую бумагу, отрежьте аксон лезвием и очистите кровеносные сосуды на поверхности ганглия заднего корешка.
- После обрезки взвешивают ганглий заднего корешка и погружают его в 4%-ный раствор параформальдегида с концентрацией 4% и температурой 4 °С на достаточное время, обычно около 2-4 ч, затем переносят ганглий заднего корня в заранее приготовленный 10%, 20% и 30% раствор сахарозы PB (4 °С) для ступенчатого обезвоживания.
7. Криосекционирование
- Начните с помещения ганглия заднего корешка в раствор PBS 0,01 М. Встряхните их в течение 10 минут, а затем смойте раствором сахарозы. Аккуратно обрежьте волокна аксонов обоих сегментов ганглиев задних корешков. Очистите замораживающую головку криосекционной машины и добавьте в нее компаунд оптимальной температуры резки (OCT) (см. Таблицу материалов).
- Поместите замораживающую головку на поверхность металлической оболочки, содержащей жидкий азот, подождите, пока ткань замерзнет, извлеките ее и обрежьте. После этого поместите замораживающую головку на основание слайсера. Толщина срезов ганглиев задних корешков должна составлять 15 мм. Разложите нарезанные тонкие срезы в деревянной коробке по порядку и храните их в холодильнике при температуре -20 °C, вдали от света.
8. Окрашивание гематоксилином и эозином
- Поместите срезы на 2 минуты в ксилол и обезвоживайте их в ряде спиртов, включая 100%, 95%, 80% и 70%, в течение 2 минут каждый. Затем срезы помещают на 2 мин в дистиллированную воду, 1 мин в гематоксилин, проводят 5 мин промывки водопроводной водой и проводят дифференцировку в 1% солевом спиртовом растворе в течение 30 с, а затем 30 с в насыщенном карбонате лития.
- Затем поместите ломтики на 2 минуты каждый в дистиллированную воду и водопроводную воду, на 5 минут в раствор эозина (0,5%), быстрое полоскание на 1 минуту в дистиллированной воде, два раунда по 2 минуты в 95% и 100% спирте, 30 с в 100% ксилол с добавлением бикарбоната натрия, три раунда по 3 минуты в ксилоле и, наконец, уплотнить нейтральным бальзамом (см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Туйна-терапия может помочь снизить пороги механической и тепловой стимуляции крыс, вызванные ПЗС-моделированием
Через 17 дней терапии Туина наблюдалась достоверная разница в пороговых значениях ЛУП между крысами с ПЗС, получавшими терапию Туйной, и группой, не получавшей ПЗС (P = 0,021, <0,05) (рис. 6 и табл. 1).
У крыс в группе CCD, получавших терапию Tuina, наблюдалось улучшение болевого порога с начала лечения, а также выявлена достоверная разница в тепловом болевом пороге между группой CCD и группой, получавшей терапию Tuina с 14-го дня после моделирования (P = 0,0047, 0,0056, 0,0049, < 0,01) (рис. 7 и табл. 2).
Применение терапии Tuina не улучшило некроз клеток, вызванный CCD-моделью
На основании HE-окрашивания ганглиев задних корешков, группа крыс CCD, которая была подвергнута физическому сжатию L-образным стержнем из нержавеющей стали, повредила клеточную мембрану и апоптоз (рис. 8). Напротив, контрольная группа крыс имела четко очерченные края, неповрежденные контуры нейронов и полные клеточные тела (рис. 9). В группе CCD + Tuina некоторые контуры нейронов в ганглиях задних корешков крыс были неполными (рис. 10).
Рисунок 1: Ограничитель для крыс. Это самодельный аппарат, изготовленный Университетом Тунцзи, который может эффективно обездвижить крыс и полностью обнажить их задние конечности. Серебряный винт управляет перегородкой, которая удерживает хвост крысы и удерживает ее. Черный винт подстраивает устройство под длину крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Ношение беспроводных нарукавников для измерения тактильной силы. Устройство, которое измеряет и отображает силу и частоту нажатия пальца, обеспечивает обратную связь в режиме реального времени об интенсивности и частоте во время манипуляций Tuina. а) Датчик давления и передаточное оборудование. (b) Измерение давления пальцами. (c) Сила, измеренная во время манипуляций с Туйной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Положение тела и расположение акупунктурных точек крысы Туина. Ограничитель для крыс может полностью обнажить положение BL57. Конечности вместе с большим пальцем захватывают нижние конечности крысы, чтобы зафиксировать ее на месте, чтобы крыса могла спокойно взаимодействовать во время лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Тест на порог отведения лапы. Это тест для измерения болевого поведения у крыс. Он включает в себя механическую стимуляцию ног и измерение задержки отвода лапы. (а) показывает аппарат и (б) показывает, как им манипулировали на мыши во время эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Тест задержки вывода лапы. Эта установка измеряет болевой порог крыс по их чувствительности к теплу, выделяемому прожектором. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Результаты теста на порог вывода лапы. Измерения представляются с использованием среднего значения плюс или минус стандартной ошибки (
). Приведены результаты порогового теста рефлекса отведения задних конечностей, индуцированного механическим раздражителем, на разных этапах для каждой группы крыс. Достоверные различия (P < 0,05) наблюдались между группами ПЗС+Туина и модельными группами ПЗС, начиная с 17-го дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Результаты теста задержки при выводе лапы. Измерения представляются с использованием среднего значения плюс или минус стандартной ошибки (). Результаты порогового тестирования рефлекса отведения ног, индуцированного тепловой стимуляцией, на разных стадиях крыс в каждой группе. Достоверные различия наблюдались между группой ПЗС+Туина и модельной группой ПЗС, начиная с седьмого дня (P < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Микроскопическое наблюдение нейронов ганглия дорсальных корешков в группе ПЗС (продольный разрез). Это изображение было получено путем сканирования окрашенного HE образца ганглия заднего корешка. Красный эллипс на рисунке указывает на то, что некоторые нейроны подвергаются некрозу. Это указывает на то, что ПЗС-модель вызвала повреждение нейронов в ганглии заднего корешка. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9. Микроскопическое наблюдение нейронов ганглия дорсальных корешков в наивной группе (продольный срез и поперечный срез). Как показано на рисунке выше, (а) – продольное сечение, а (б) – поперечное. В области, где собрана пустая группа ганглиев задних корешков крыс, не наблюдается явления вакансии группы CCD. Нейроны непрерывны и компактны, а тела клеток заполнены. Сателлитные глиальные клетки расположены между нейронами. Масштабная линейка: (a), 50 мкм; (b), 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Микроскопическое наблюдение нейронов ганглия дорсальных корешков в группе CCD + Tuina (поперечный срез). Нейроны непрерывны, и происходит явление растворения клеток. Это указывает на то, что в краткосрочной перспективе массажная терапия не смогла улучшить некроз клеток (красный эллипс), вызванный ПЗС-моделью. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Испытание под давлением Tuina. Крысы с минимальными значениями компрессионного рефлекса шипения варьируются по размеру от 5 Н до 25 Н. Абсцисса представляет собой степень давления, в то время как ордината представляет количество крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 12: Рентгеновские снимки ПЗС-крыс. Валидация изготовления ПЗС-матриц с использованием рентгеновской визуализации моделей крыс. (a) показывает рентгеновский снимок, сделанный в вертикальной плоскости, и (b) показывает рентгеновский снимок, сделанный в сагиттальной плоскости. Два рентгеновских луча с различным поперечным сечением позволяют получить более четкое представление о положении L-образного стержня из нержавеющей стали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| N | Перед моделированием | Д1 | Д3 | Д7 | Д14 | Д17 | Д21 | |
| Наивный | 8 | 18.1±1.4 | 16.8+1.5 | 16,8±1,5 | 18,6±1,7 | 16,8±1,5 | 15,6±1,8 | 16,8±1,5 |
| Притворство | 8 | 18,0±1,7 | 18,6±1,7 | 16.0±1.3 | 17.6±1.7 | 16,8±1,5 | 18,9±1,7 | 16,8±1,5 |
| ПЗС-матрица | 8 | 17,7±1,1 | 10.7±2.8# | 10,0±1,5 | 4.4±2.2 | 3,8±1,7 | 4.1±2.4 | 3,8±2,5 |
| ПЗС-матрица + Туйна | 8 | 18,9±1,7 | 9.8±2.3# | 8.3±1.4 | 4.8±1.2 | 5,8±2,0 | 7,2±1,8* | 7,5±1,8* |
| #Сравнение до и моделирования D1, стр<0.05. | ||||||||
| * Сравнение между группами CCD и CCD+Tuina, стр<0,05. | ||||||||
Таблица 1: Порог вывода лапы, PWT (, с). Сравнение до и D1 моделирования, #p < 0.05. Сравнение группы CCD и группы CCD + Tuina, *p < 0,05.
| N | Перед моделированием | Д1 | Д3 | Д7 | Д14 | Д17 | Д21 | |
| Наивный | 8 | 11.9±1.2 | 12.0±1.6 | 12.2±1.9 | 12.4±1.1 | 12.2±1.9 | 12.0±1.4 | 12.0±1.4 |
| Притворство | 8 | 11.9±1.2 | 11,6±1,5 | 12.2±1.9 | 11,6±1,5 | 12,2±0,9 | 11,6±1,5 | 11,6±1,5 |
| ПЗС-матрица | 8 | 10.8±1.1 | 8.9±0.7# | 7,9±0,8 | 7,7±0,5 | 7,8±1,0 | 7,7±0,8 | 7,7±0,8 |
| ПЗС-матрица + Туйна | 8 | 11.3±1.5 | 9.1±0.6# | 8,0±0,7 | 8,3±0,7* | 8,9±0,6* | 9,1±0,7* | 9,2±0,9* |
| #Сравнение до и D1 моделирования, стр < 0,05. | ||||||||
| Сравнение группы CCD и группы CCD+Tuina,*p < 0,05. | ||||||||
Таблица 2: Задержка вывода лапы, PWL (, s). Сравнение до и D1 моделирования, #p < 0.05. Сравнение группы CCD и группы CCD + Tuina,*p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша исследовательская группа провела соответствующие исследования по параметрам манипуляций Туина на ранней стадии. Во-первых, важно установить интенсивность силы для манипуляции Туйна. В клинике Tuina практикующие врачи регулируют интенсивность силы в соответствии со своим опытом и субъективными ощущениями пациентов, достигая наилучшего эффекта Туйна через общение. Однако в экспериментах на животных это невозможно. В экспериментах на животных для определения интенсивности манипуляций с Туиной используется «порог ответа». Они судят о том, является ли приложенная сила туина уместной, основываясь на инстинктивной реакции животного. Рэндаллиспользовал этот метод для изучения болевого поведения в моделях воспаления крыс. Разница в том, что Рэндалл оперировал в области локального воспаления, в то время как этот эксперимент действовал в области, не подверженной травме. Тяжелые манипуляции с Туиной заставят крыс кричать и убегать от них. Установка этой интенсивности тяжелой силы определяет, что формальная интенсивность силы Туйна меньше, чем эта интенсивность тяжелой силы. Основываясь на распределении максимальных значений крика и рефлекса бегства у 150 крыс в диапазоне 5-25 Н, со средним значением и стандартным отклонением 9,93 и 3,018 (рис. 11), наша предыдущая работа рассчитала оптимальное значение силы нажатия 5 Н. Во-вторых, рабочая частота метода Туйна описана в «Науке Туина» как 120-160 раз/мин18. Поэтому частота Туйна в этом эксперименте была установлена равной 2 Гц.
ПЗС-модель – это хирургическая модель, которая может быть травматичной, так как требует воздействия на суставной отросток и межпозвонковое отверстие. Поэтому крысам нужно 1-3 дня, чтобы восстановиться после операции. Согласно как литературным, так и предварительным экспериментальным данным, болевое поведение крыс, как правило, стабильно на четвертый день после операции. Это обеспечивает благоприятное время для наблюдения обезболивающего эффекта вмешательства Туины. Тем не менее, длительный прием Туина может не оказывать положительного влияния на обезболивающий эффект крыс и может привести к повреждению тканей. В этом исследовании сравнивались обезболивающие эффекты туйны и разминания в течение 5, 15 и 30 минут, и в конечном итоге было выбрано 15 минут в качестве оптимальной продолжительности вмешательства.
Этот метод имеет ограничения, так как только часть клинических операций использовалась для выбора манипуляций и частей тела. BL57 (Chengshan) расположен в трицепсовых сурах крыс и иннервируется ганглиями задних корешков L4 и L519. Поскольку мышцы трицепса толстые и подходят для Tuina, массаж этой области может оказывать непосредственное воздействие на ганглии задних корешков L4 и L5 в поясничных позвонках крыс, которые используются для экспериментального отбора проб.
В процессе формования необходимо обеспечить точное введение «L»-образного стержня из нержавеющей стали в межпозвонковые отверстия L4 и L5 в ПЗС-модели боли, выполнив рентгенологическую проверку. Перед рентгенологией крысам вводили внутрибрюшинную анестезию продолжительностью 25% (0,6 мл/100 г). Рентгенография подтвердила успешное введение L-образного стержня из нержавеющей стали в межпозвонковые отверстия L4 и L5 (рис. 12).
В целом, это исследование было сосредоточено на наблюдении за операциями по лечению Tuina и оценке терапевтических эффектов Tuina на крысах CCD. Команда провела эксперимент на животных, чтобы узнать, как установить параметры Tuina, выбрать подходящие детали и определить подходящее время обработки. Это обеспечивает стандартизированную и воспроизводимую демонстрацию вмешательства на животных моделях для будущих исследований обезболивающего эффекта Tuina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Шанхайским проектом строительства критических клинических специальностей (номер гранта: Shslczdzk04001); Парусная программа Шанхайской комиссии по науке и технике (номер гранта: 22YF1444300); Проекты в рамках бюджета Шанхайского университета традиционной китайской медицины (номер гранта: 2021LK091).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter) | hand-made | / | For CCD models making |
| ALMEMO admeasuring apparatus | ahlborn | 2450-1 | Mechanical Withdrawal Threshold test |
| Constant temperature slicer CM-1900 | Leica | 1491950C1US | For specimen production |
| Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle | LIRCON/Shandong Lilkang | / | For disinfection |
| Disposable sterile syringe 5 mL | Shanghai Misha Wa Medical Industry | / | For injection |
| Electron microscope CX-31 | Olympus, Japan | BJ002318 | For specimen observation |
| Finger pressure recordings | Suzhou Changxian Optoelectronic Technology | CX1003w | For Tuina manipulation |
| Foam board (35 cm x 20 cm) | hand-made | / | It is our homemade apparatus for fixing rats |
| MERSILK W2512 | Johnson & Johnson | / | For tissue suture |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent | 10004160 | For specimen production |
| paraformaldehyde | China National Chemical Reagent | / | For specimen production |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | For anesthesia of rat |
| Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats | IITC Life Science | / | Paw Withdrawal Latency |
| Precision electronic scale for experiment JY3002 | Shanghai Precision Scientific Instrument | / | Weighing of rat |
| Rat hair clipper | Philips | HP6341/00 | Shaving of rat fur |
| Restrainer for rats | Tongji University (self-made) | / | It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs. |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | For specimen production |
| Uratan | China National Chemical Reagent | / | For anesthesia of rat |
| X-ray detector XR-600 | Dongguan Kaso Electronic Technology | / | Examination of CCD models |
| xylene | Shanghai Sinopharm Group | 100092 | For specimen production |
References
- Vos, T., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Amin, R. M., Andrade, N. S., Neuman, B. J.
- Stochkendahl, M. J., et al. National Clinical Guidelines for non-surgical treatment of patients with recent onset low back pain or lumbar radiculopathy. European Spine Journal. 27 (1), 60-75 (2018).
- Bostelmann, R., Steiger, H. J. Comment on "An evidence-based clinical guideline for the diagnosis and treatment of lumbar disc herniation with radiculopathy". The Spine Journal. 14 (9), 2273 (2014).
- Tang, J., et al. Effect of bone-setting massage combined with acupuncture and moxibustion on simple lumbar disc herniation and its effect on pain and sensory disorder of lower limbs. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 38 (10), 244-247 (2020).
- Lin, X. -Y., Yang, J., Li, H. -M., Hu, S. -J., Xing, J. -L. Dorsal root ganglion compression as an animal model of sciatica and low back pain. Neuroscience Bulletin. 28 (5), 618-630 (2012).
- Shi, C., et al. Animal models for studying the etiology and treatment of low back pain. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 36 (5), 1305-1312 (2018).
- Zhao, X. -y, et al. Effect of Tuina on the expression of TNF-α,IL-6,TGF-β1 and CTGF in the degenerative tissue of rabbits′lumbar intervertebral disc. Journal of Chengdu Medical College. 14 (6), 741-745 (2019).
- Zhang, L., Li, Z. -y, Yu, Z. -y, Yue, X. -y, Fu, R. -y Effect of GABA and GABAAR in analgesic loop of CCI rats by pressing manipulation based on "Taking Tenderness as Acupoints" theory. Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. 28 (3), 50-53 (2014).
- Long, B. -cal, et al. Analgesic effect of massage on rats with neuropathic pain and its mechanism. Guangxi Medical Journal. 44 (17), 2003-2009 (2022).
- Al-Bedah, A., Ali, G., Aboushanab, T., Qureshi, N. Tui Na (or Tuina) massage: A minireview of pertinent literature, 1970-2017. Journal of Complementary and Alternative Medical Research. 3, 1-14 (2017).
- Au, D. W. H., et al. Effects of acupressure on anxiety: a systematic review and meta-analysis. Acupuncture in Medicine: Journal of the British Medical Acupuncture Society. 33 (5), 353-359 (2015).
- Hsiung, W. -T., Chang, Y. -C., Yeh, M. -L., Chang, Y. -H. Acupressure improves the postoperative comfort of gastric cancer patients: A randomised controlled trial. Complementary Therapies in Medicine. 23 (3), 339-346 (2015).
- Wu, S., et al. Neural interconnection between acupoint "Chéngshān (BL57)" and sciatic nerve in the rat. World Journal of Acupuncture - Moxibustion. 31 (2), 129-135 (2021).
- Banik, R. K., Kabadi, R. A. A modified Hargreaves method for assessing threshold temperatures for heat nociception. Journal of neuroscience methods. 219 (1), 41-51 (2013).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal pain sensation in rats and mice using the hargreaves test. Bio-protocol. 7 (16), e2506 (2017).
- Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Archives Internationales De Pharmacodynamie Et De Therapie. 111 (4), 409-419 (1957).
- Yan, J. -t Science of Tuina. , Traditional Chinese Medicine Publishing House. (2003).
- Himes, B. T., Tessler, A. Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats. The Journal of Comparative Neurology. 284 (2), 215-230 (1989).
