Summary
In diesem Artikel wird eine Manipulation zur Behandlung der chronischen Kompression des Spinalganglions bei Ratten mit der Tuina-Therapie vorgestellt, zusammen mit einer Methode zur Bewertung ihrer Wirksamkeit auf der Grundlage des Schmerzverhaltens und der histopathologischen Ergebnisse.
Abstract
Neuropathische Schmerzen sind eine weit verbreitete Erkrankung, die 6,9 % bis 10 % der Bevölkerung betrifft und auf Nervenschäden aufgrund verschiedener Ätiologien zurückzuführen ist, wie z. B. lumbaler Bandscheibenvorfall, Spinalkanalstenose und Foramenstenose zwischen den Wirbeln. Obwohl Tuina, eine traditionelle chinesische manuelle Therapie, in der klinischen Praxis analgetische Wirkungen zur Behandlung neuropathischer Schmerzen gezeigt hat, sind die zugrunde liegenden neurobiologischen Mechanismen noch unklar. Tiermodelle sind essentiell für die Aufklärung der Grundprinzipien von Tuina. In dieser Studie schlagen wir ein standardisiertes Tuina-Protokoll für Ratten mit Kompression des Spinalganglions (DRG) vor, das die Induktion einer DRG-Kompression durch Einführen eines Edelstahlstabs in das Zwischenwirbelforamen beinhaltet, die Durchführung einer Tuina-Manipulation mit spezifischen Parametern der Lokalisation, Intensität und Häufigkeit in einer kontrollierten Umgebung und die Bewertung der verhaltensbezogenen und histopathologischen Ergebnisse der Tuina-Behandlung. Dieser Artikel diskutiert auch die möglichen klinischen Implikationen und Grenzen der Studie und schlägt Richtungen für die zukünftige Forschung an Tuina vor.
Introduction
Im klinischen Umfeld ist es üblich, neurologische pathologische Schmerzen zu beobachten, die durch eine Nervenwurzelkompression aus verschiedenen Gründen verursacht werden. Die typischste Form dieser neuropathischen Schmerzen ist der lumbale Bandscheibenvorfall (LDH), der oft anhaltend, wiederkehrend und schwer zu heilen ist. Etwa 9 % der Weltbevölkerung sind von LDH betroffen, was zu erheblichen sozialen und wirtschaftlichen Belastungen führt1. Die Häufigkeit dieser Art von neuropathischen Schmerzen nimmt von Jahr zu Jahr zu, mit einem Trend zu jüngeren Patienten, was auf Veränderungen in der menschlichen Produktion und im Lebensstil zurückzuführenist 2. Trotz des Einsatzes von nichtsteroidalen Schmerzmitteln können die Beschwerden der Patienten nicht vollständig gelindert werden. Infolgedessen haben alternative Therapien, wie z. B. Tuina, zur Behandlung von Schmerzen, die durch LDH verursacht werden, zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen.
Die Tuina-Therapie, eine Form der konservativen Behandlung von LDH, wird weltweit in verschiedenen Leitlinien der klinischen Praxis zur Vorbeugung und Behandlung von Rückenschmerzen empfohlen 3,4. Untersuchungen haben gezeigt, dass Tuina Entzündungsfaktoren wie IL-6 im Serum und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) bei LDH-Patienten signifikant senken und gleichzeitig die Schmerzen und die Beeinträchtigung der Lendenwirbelfunktion der Patienten verbessernkann 5. Der spezifische Mechanismus hinter der schmerzlindernden Wirkung der Tuina-Therapie ist jedoch noch unklar.
Tiermodelle sind ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung neuropathischer Schmerzen, die durch LDH6 verursacht werden. Sie ermöglichen Verhaltensmessungen, um die Wirksamkeit der Tuina-Therapie zu bewerten und Proben der pathologischen Physiologie von LDH zu liefern. So können beispielsweise Proben aus den Spinalganglien im Oberschenkel entnommen werden, um Veränderungen der Spinalganglienzellen nachzuweisen. Die chronische Kompression des Modells des Spinalganglions (CCD) wird häufig verwendet, um die pathologische Physiologie der LDH zu bewerten, da sie Schäden an der Morphologie der Spinalganglienzellen verursacht, die mit den pathologischen Veränderungen übereinstimmen, die in klinischen Fällen von Nervenkompression durch Bandscheibenvorfall beobachtet werden7.
Viele Wissenschaftler haben mehrere Tierversuche zur Akupressur-Analgesie durchgeführt 8,9,10. Bei der Durchführung von Akupressuroperationen an Tiermodellen imitieren sie jedoch häufig die menschliche Akupressur. Die therapeutische Wirkung der Akupressur wird von Faktoren wie der Größe, der Häufigkeit und der Richtung der ausgeübten Kraft beeinflusst11,12,13. Wenn dem Experiment ein einheitlicher Akupressurstandard fehlt, wie z. B. Kraft, Häufigkeit und Dauer der Operation, kann dies zu einer Abweichung der Versuchsergebnisse führen. Dieser Artikel stellt eine Reihe von Akupressur-Behandlungsplänen vor, die auf den Merkmalen von CCD-Ratten basieren, und fördert die Entwicklung standardisierter Akupressuroperationen in Tiermodellen.
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Protocol
Diese Arbeit wurde im Schmerzlabor des Instituts für Neurobiologie an der Fudan-Universität durchgeführt. Die Versuche wurden genehmigt und strikt an die Richtlinien zum Schutz von Versuchstieren gehalten, die von der International Association for the Study of Pain (LASP) für alle chirurgischen Eingriffe und den Umgang mit Tieren festgelegt wurden. Für die vorliegende Studie wurden reine Sprague-Dawley (SD)-Ratten, bestehend aus 32 Männchen im Alter zwischen 40 und 50 Tagen, mit einem Durchschnittsgewicht von 220 ± 1,38 g verwendet. Diese Ratten stammen aus dem Experimental Animal Center der Shanghai Academy of Life Sciences der Chinesischen Akademie der Wissenschaften. Die Tiere wurden ordnungsgemäß versorgt und in einem speziellen Raum mit unabhängiger Belüftung, regulierter Temperatur (22 ± 1 °C) und Luftfeuchtigkeit (40%-50%) untergebracht. Die Ratten hatten in ihren Käfigen Zugang zu ausreichend Futter und Wasser. Der Versuchstierraum folgte einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, um die Regelmäßigkeit des zirkadianen Rhythmus der Ratten aufrechtzuerhalten, und das zuständige Personal tauschte die Polsterung regelmäßig aus. Die Röntgenaufnahme wurde in der radiologischen Abteilung des Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine durchgeführt, das der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine angegliedert ist.
1. Studienteilnehmer und Gruppierung
- Ordnen Sie 32 Ratten vier Gruppen zu: naiv (Kontrolle), Schein-Ratten (Scheinoperation), CCD (chronische Spinalganglienkompression) und CCD + Tuina (8 Ratten/Gruppe). Ratten hatten freien Zugang zu Futter und Wasser in Tierhaltungen.
ANMERKUNG: Naive Ratten hatten keine Intervention, während die Scheingruppe den gleichen chirurgischen Eingriff wie die Ratten der CCD-Gruppe durchlief, jedoch ohne einen "L"-förmigen Edelstahlstab im L4- und L5-Zwischenwirbelforamen zu hinterlassen. Die Ratten in der CCD-Gruppe unterzogen sich einer kompletten chronischen Spinalganglien-Kompressionsmodelloperation. Die Ratten in der CCD + Tuina-Gruppe erhielten ab dem vierten Tag nach der CCD-Operation eine Tuina-Therapie.
2. Etablierung eines Tiermodells
- Verabreichen Sie Isofluoran, um Ratten zu betäuben. Sobald die Ratten das Bewusstsein verlieren (kein Schwanz- oder Beinbeugereflex), rasieren Sie die Haare im Operationsbereich mit einem Rasierer.
HINWEIS: Analgetika wurden 15 Minuten vor der Operation verabreicht und Ratten wurden subkutan mit Tramadol 20 mg/kg injiziert. - Befestigen Sie die Ratte auf einer Schaumstoffplatte (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie Gummibänder, um ihre Gliedmaßen und Schneidezähne zu sichern. Wischen Sie den vorbereiteten Bereich mindestens 3 Zyklen lang mit einem sterilen Präparat aus Alkohol und Jod ab.
- Setzen Sie die "L"-förmige Sonde ein (siehe Materialtabelle).
- Machen Sie mit einer Schere Schicht für Schicht einen 2-3 cm langen Schnitt durch die Haut, die oberflächliche Faszie und die tiefen Faszien. Lokalisieren Sie zunächst die vordere obere Darmbeinwirbelsäule, die der fünften Lendenwirbelsäule entspricht. Lokalisieren Sie dann nacheinander den dritten und vierten Dornfortsatz.
- Klemmen Sie den Dornfortsatz mit einer Zahnzange und heben Sie ihn an, damit sich die Schere nahe an der rechten Seite des Dornfortsatzes befindet, und schneiden Sie den Muskel, der an der rechten Seite des Dornfortsatzes befestigt ist.
- Sezieren Sie dann stumpf den Muskel, der an der Außenfläche der Wirbelplatte befestigt ist, bis ein Widerstand auf der rechten Seite vorhanden ist. Bei der Ausstülpung handelt es sich um das Zygapophysialgelenk. In ähnlicher Weise sollten Sie den Muskel und die Faszie am Zygapophysialgelenk stumpf präzieren.
HINWEIS: Der Querfortsatz, der in Richtung des Kopfes der Ratte zeigt, wird zuerst an der unteren äußeren Vorderseite des Zygapophysialgelenks berührt. Unterhalb des Querfortsatzes befindet sich das Foramen intervertebralis, das mit Nervenwurzeln und umgebenden Weichteilen gefüllt ist und in der Regel nicht leicht zu finden ist. - Verwenden Sie zunächst eine "L"-förmige Sonde, um die Position des Zwischenwirbelforamens zu bestimmen, und führen Sie ihn dann mit einem "L"-förmigen Edelstahlstab (der mit einem Durchmesser von 0,4 mm und einer Länge von 4 mm hergestellt werden muss) in das Zwischenwirbelforamen ein.
- Wenn das Spinalganglion erfolgreich komprimiert wird, zeigt die Ratte einen Schwanz- und Beinbeugereflex. Führen Sie den Edelstahlstab in das vierte und fünfte lumbale Zwischenwirbelforamen ein. Dann werden Muskeln, Faszien und Haut Schicht für Schicht vernäht (3-0, siehe Materialtabelle).
- Lege die Ratte in eine Thermostatbox, bis sie aufwacht. Beobachten Sie nach dem Aufwachen, ob die Funktion der rechten Hintergliedmaße der Ratte normal ist. Wenn es zieht, bedeutet dies, dass die Operation die motorischen Nerven verletzt hat und die Ratte verworfen werden sollte. Wenn die Funktion der rechten Hintergliedmaße normal ist, kann die Ratte verwendet und zur Fütterung in einen Käfig gesetzt werden.
3. Tuina-Therapie
- Schaffen Sie eine angenehme Umgebung: Bevor Sie mit der Tuina-Therapie beginnen, akklimatisieren Sie die Ratte 30 Minuten lang in der Fixierung, damit sie sich anpassen kann (Abbildung 1). Dieses Gerät kann den Oberschenkel der Ratte vollständig freilegen und immobilisieren, was Tuina-Manöver erleichtert (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Temperatur im Behandlungsraum sollte zwischen 22-26 °C und die Luftfeuchtigkeit zwischen 40% und 50% liegen. - Standardisierung von Tuina: Stellen Sie sicher, dass die Therapeuten drahtlose Fingermanschetten tragen, die den Druck und die Frequenz von Tuina überwachen und Echtzeit-Feedback-Daten liefern können. Üben Sie zunächst Tuina mit den Feedback-Daten der Fingerhülsen, stellen Sie die Kraft auf 5 N und die Frequenz auf 2 Hz ein. Führen Sie dann die gleichen Manöver an den Ratten durch und behalten Sie dabei eine konstante Kraft und Frequenz während des gesamten Eingriffs bei (Abbildung 2).
HINWEIS: Basierend auf unseren bisherigen Arbeiten beträgt die berechnete optimale Presskraft 5 N (siehe Abschnitt "Diskussion" für Details). - Identifizieren Sie den Akupunkturpunkt: Wählen Sie den Musculus gastrocnemius der rechten Hintergliedmaße als Tuina-Bereich der Ratte aus, an der Kreuzung der beiden Köpfe des Musculus gastrocnemius, ungefähr an der Stelle von BL5714.
- Führen Sie die Tuina durch: Stellen Sie sicher, dass der Therapeut auf die hintere Seite des Oberschenkels der Ratte gerichtet ist und die rechte Hintergliedmaße der Ratte mit der rechten oberen Extremität hält. Positionieren Sie den Daumen vertikal auf dem BL57-Akupunkturpunkt und stellen Sie sicher, dass der Unterarm und die Finger Kraft ausüben, um rhythmische Drehbewegungen im kleinen Bereich auszuführen, während Sie einen Druck von 5 N ausüben (Abbildung 3).
- Stellen Sie während der Behandlung sicher, dass die Kraft und Frequenz des Manipulationsfeedbacks den voreingestellten Werten entsprechen. Beginnen Sie den Eingriff ab dem vierten Tag nach der Operation, wobei Tuina einmal täglich für 15 Minuten und 18 Tage lang ununterbrochen durchgeführt wird.
4. Verhaltenstests auf Schmerzen
HINWEIS: Verhaltenstests wurden vor der Modellierung, nach der Modellierung, an Interventionstag 1, Interventionstag 3, Interventionstag 7, Interventionstag 14, Interventionstag 17 und Interventionstag 21 durchgeführt.
- Führen Sie die mechanische Stimulationsreaktionsschwelle (Pfotenrücknahmeschwelle, PWT) durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen (Abbildung 4).
- Mit der von-Frey-Methode testen Sie die Reaktionsschwelle der mechanischen Stimulation in den Füßen der Ratten. Legen Sie die Ratten in ein transparentes Fach aus gehärtetem Glas mit den Maßen 20 cm × 10 cm × 20 cm, das auf einem Metalldrahtgitterständer mit 10 mm × 10 mm Öffnung in einer Höhe von 40 cm platziert wurde. Halten Sie die Raumtemperatur bei 23 ± 2 °C und die Umgebung ruhig.
- Messen Sie die mechanische Entnahmeschwelle mit elektronischen Von-Frey-Fasern (siehe Materialtabelle). Stimulieren Sie die Fußmitte der Ratte, bis sie sich merklich bewegt, z. B. indem Sie das Bein anheben oder ihm ausweichen. Die Maschine erfasst automatisch den maximalen Druckwert (N).
- Warten Sie 15 Sekunden oder länger, bevor Sie dieselbe Ratte erneut stimulieren. Halten Sie jede Stimulation unter 5 s, um eine taktile Sensibilisierung in den Pfoten der Ratte zu verhindern. Wiederholen Sie den Test fünfmal, bis die drei aufeinanderfolgenden Messungen weniger als 10 N voneinander abweichen.
- Führen Sie die Pfotenrückzugslatenz (PWL) als Reaktion auf die thermische Stimulation durch (Abbildung 5).
- Beurteilen Sie die PWL mit der Hargreaves-Methode15,16. Setzen Sie die Ratten in eine kleine Kammer aus transparentem gehärtetem Glas mit den Maßen 20 cm x 10 cm x 20 cm mit einem transparenten Glasdeckel mit einem Entlüftungsloch. Den mittleren Bereich des Glasdeckels mit einer Heizplatte auf 45 °C erhitzen, bis er eine stabile Temperatur erreicht hat.
- Gewöhnen Sie die Ratten während der Verhaltenstestphase jeden Tag für mindestens 2 Stunden an das Verhaltenslabor, um den Einfluss von Umweltfaktoren auf die Testergebnisse zu minimieren.
- Setzen Sie die Ratten vor dem formalen Test für 30 Minuten in das Verhaltenslabor, damit sie sich an die Umgebung anpassen und Störungen reduzieren können.
- Erhitzen Sie die Heizplatte auf 45 °C und legen Sie die Hinterbeine der Ratte auf die Heizplatte.
- Die Pfotenrückzugslatenz (PWL) wurde definiert als die Zeit vom Beginn der Erwärmung bis zum Auftreten des Pfotenrückzugsreflexes als Reaktion auf thermische Stimulation. Testen Sie bei jedem Test dieselbe Hintergliedmaße dreimal hintereinander und den Durchschnittswert, um die Antwortlatenz dieser Hintergliedmaße zu erhalten. Bringen Sie die Ratten nach dem Test zur Fütterung in ihre Käfige zurück.
5. Durchblutung
- Zubereitung: Bereiten Sie im Voraus eine 0,9%ige Kochsalzlösung und eine 4%ige Paraformaldehydlösung vor. Die Kochsalzlösung in einen Ofen geben, der auf eine konstante Temperatur von 37 °C eingestellt ist, und die Paraformaldehydlösung für die spätere Verwendung im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahren.
- Führen Sie eine Anästhesie durch und stellen Sie den Zugang her.
- Beginnen Sie mit der Injektion von 25 % Urethan (0,6 ml/100 g, siehe Materialtabelle) in die Bauchhöhle der Ratte, um eine tiefe Anästhesie einzuleiten. Warten Sie, bis kein Zehen-, Hornhaut- oder Drehreflex beobachtet wird. Befestigen Sie die Ratte auf einer Schaumstoffplatte.
- Schneiden Sie das Brustbein mit einer Schere ab und öffnen Sie Haut und Faszien Schicht für Schicht. Schneiden Sie das Zwerchfell ab und schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten ab, um das Herz vollständig freizulegen. Trennen Sie den Herzbeutel vorsichtig ab. Trenne die Lunge vom Herzen.
- Verwende eine Pinzette, um an der Aorta zu ziehen und sie freizulegen, indem du das Herz zu dir ziehst. Richten Sie die Nadel, die linke Herzkammer und die Aorta in einer geraden Linie und auf derselben horizontalen Ebene aus. Dann führen Sie die Nadel von der linken Herzkammer in die Aorta ein, bis die Nadel in der Aorta sichtbar ist.
- Klemmen Sie die Aorta und die Nadel mit einer Pinzette in die Aorta und schneiden Sie dann den linken Vorhof mit einer Schere auf. Zu diesem Zeitpunkt spritzt eine große Menge Blut aus dem linken Vorhof. Öffnen Sie das Ventil für die Kochsalzlösung und schließen Sie die Kochsalzinjektion an, um eine 37 °C heiße Kochsalzlösung für insgesamt etwa 150-200 ml zu perfundieren.
- Nach Beendigung der Kochsalzperfusion auf die 4%ige Paraformaldehydlösung umstellen und mit 4%iger Paraformaldehydlösung insgesamt ca. 400 ml bei 4 °C perfundieren. Wenn Sie mit der Paraformaldehydperfusion beginnen, halten Sie die Vorderzähne der Ratte mit einer Pinzette fest und ziehen Sie sie nach vorne, während Sie den Schwanz mit einer Hand festhalten und nach hinten ziehen, was vorteilhaft ist, um die Wirbelsäule vollständig zu strecken und das Zwischenwirbelforamen zu vergrößern, um die DRG-Probenentnahme zu erleichtern.
- Während der Perfusion werden die Leber, das Mesenterium und das große Omentum der Ratte allmählich blass, bis die Leber steif wird. Verlangsamen Sie dann die Durchflussrate und stellen Sie sie auf etwa 2 Tropfen pro Sekunde ein, bis das gesamte Paraformaldehyd durchblutet ist.
6. Entnahme von Spinalganglien
HINWEIS: Nach der Perfusion wird der Lendenwirbelsäule der Ratte schnell abgeschnitten. Lokalisieren Sie das Foramen intervertebralis L5 und L4, indem Sie die höchsten Punkte des Beckenkamms auf beiden Seiten mit dem Lendendornfortsatz L5 mit dieser Positionierungsmethode verbinden, und entfernen Sie das Spinalganglion aus dem Foramen intervertebralis. Die spezifische Erfassungsmethode lautet wie folgt:
- Vom Eingang des Spinalkanals (thorakaler Spinalkanal) aus führen Sie die Schere in den Wirbelkanal ein und schneiden die Lamina auf beiden Seiten ab, bis alle Lamellen vollständig entfernt werden können, wobei der gesamte Wirbelkanal freigelegt wird.
HINWEIS: Achten Sie darauf, das Rückenmark und die Nervenwurzeln außerhalb des Wirbelkanals nicht zu beschädigen, wenn Sie die Laminae durchtrennen. - Entfernen Sie vorsichtig das Rückenmark und das hintere Längsband. Trennen Sie die Dura mater, die am inneren Loch des Foramen intervertebralis befestigt ist.
- Verwenden Sie eine Augenpinzette, um das dorsale Wurzelganglion, das wie eine Perle geformt und leicht gelblich ist, abzuklemmen und herauszuziehen.
HINWEIS: Aufgrund der Zerbrechlichkeit und der geringen Zähigkeit des Nervengewebes ist es notwendig, die Kraft und Zugrichtung beim Herausziehen des Spinalganglions zu erfassen und keine rohe Gewalt anzuwenden. - Achten Sie beim Herausziehen des Spinalganglions darauf, die umliegenden Weichteile, einschließlich der Dura mater und der Arachnoide, im Voraus zu reinigen, um das reibungslose Ziehen des Spinalganglions zu erleichtern.
- Legen Sie das Spinalganglion auf saugfähiges Papier, schneiden Sie das Axon mit einer Klinge ab und reinigen Sie die Blutgefäße auf der Oberfläche des Spinalganglions.
- Nach dem Trimmen wird das Spinalganglion gewogen und für eine ausreichende Zeit, in der Regel ca. 2-4 h, in eine 4%ige Paraformaldehydlösung mit einer Konzentration von 4 % und einer Temperatur von 4 °C getaucht, dann wird das Spinalganglion in 10 %, 20 % und 30 % PB-Saccharoselösung (4 °C) überführt, die im Voraus für eine schrittweise Dehydratisierung vorbereitet wurde.
7. Kryoschnitt
- Beginnen Sie damit, das Spinalganglion in eine 0,01 M PBS-Lösung zu legen. Schütteln Sie sie 10 Minuten lang und waschen Sie dann die Saccharoselösung ab. Schneiden Sie die Axonfasern beider Segmente der Spinalganglien vorsichtig ab. Reinigen Sie den Gefrierkopf der Kryosektionsmaschine und geben Sie die OCT-Mischung (Optimal Cutting Temperature) hinzu (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie den Gefrierkopf auf die Oberfläche einer Metallhülle, die flüssigen Stickstoff enthält, warten Sie, bis das Gewebe gefroren ist, entfernen Sie ihn und schneiden Sie ihn flach. Danach setzen Sie den Gefrierkopf auf den Boden des Schneidemaschiners. Die Dicke der Spinalganglienscheiben sollte 15 mm betragen. Ordnen Sie die geschnittenen Dünnschnitte in einer Holzkiste der Reihe nach an und lagern Sie sie lichtgeschützt im Kühlschrank bei -20 °C.
8. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
- Legen Sie die Abschnitte 2 Minuten in Xylol und dehydrieren Sie sie in einer Reihe von Alkoholen, einschließlich 100 %, 95 %, 80 % und 70 % für jeweils 2 Minuten. Dann legen Sie die Abschnitte 2 Minuten in destilliertes Wasser, 1 Minute in Hämatoxylin, spülen Sie 5 Minuten mit Leitungswasser und führen Sie eine Differenzierung in 1%iger Kochsalzalkohollösung für 30 s durch, gefolgt von 30 s in gesättigtem Lithiumcarbonat.
- Als nächstes legen Sie die Scheiben jeweils 2 Minuten in destilliertes Wasser und Leitungswasser, 5 Minuten in Eosinlösung (0,5 %), eine 1-minütige schnelle Spülung in destilliertem Wasser, zwei Runden von je 2 Minuten in 95 % und 100 % Alkohol, 30 Sekunden in 100 % Xylol mit zugesetztem Natriumbicarbonat, drei Runden von je 3 Minuten in Xylol und schließlich, mit neutralem Balsam versiegeln (siehe Werkstofftabelle).
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Representative Results
Die Tuina-Therapie kann dazu beitragen, die durch die CCD-Modellierung verursachten mechanischen und thermischen Stimulationsschwellen von Ratten zu senken
Nach 17 Tagen Tuina-Therapie wurde ein signifikanter Unterschied in den PWT-Schwellenwerten zwischen den CCD-Ratten, die eine Tuina-Therapie erhielten, und der unbehandelten CCD-Gruppe beobachtet (p = 0,021, <0,05) (Abbildung 6 und Tabelle 1).
Die Ratten in der CCD-Gruppe, die eine Tuina-Therapie erhielten, zeigten eine Verbesserung der Schmerzschwelle von Beginn der Behandlung an, und es wurde ein signifikanter Unterschied in der thermischen Schmerzschwelle zwischen der CCD-Gruppe und der Gruppe, die ab dem 14. Tag nach der Modellierung eine Tuina-Therapie erhielt, festgestellt (P = 0,0047, 0,0056, 0,0049 < 0,01) (Abbildung 7 und Tabelle 2).
Die Anwendung der Tuina-Therapie verbesserte die durch das CCD-Modell verursachte Zellnekrose nicht
Basierend auf der HE-Färbung der Spinalganglien hatte die CCD-Gruppe von Ratten, die einer physikalischen Kompression mit einem "L"-förmigen Edelstahlstab unterzogen wurden, Zellmembranschäden und Apoptose erlitten (Abbildung 8). Im Gegensatz dazu hatte die Kontrollgruppe der Ratten sauber definierte Kanten, intakte Neuronenkonturen und volle Zellkörper (Abbildung 9). In der CCD + Tuina-Gruppe waren einige Neuronenkonturen in den Spinalganglien von Ratten unvollständig (Abbildung 10).
Abbildung 1: Rückhaltesystem für Ratten. Es handelt sich um einen selbstgebauten Apparat, der von der Tongji-Universität hergestellt wurde und die Ratten effektiv immobilisieren und ihre Hintergliedmaßen vollständig entblößen kann. Die silberne Schraube steuert die Schallwand, die den Schwanz der Ratte hält und die Ratte zurückhält. Die schwarze Schraube passt das Gerät an die Länge der Ratte an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Tragen von drahtlosen Fingermanschetten zur taktilen Kraftmessung. Ein Gerät, das die Kraft und Frequenz des Fingerdrucks misst und anzeigt, gibt Echtzeit-Feedback über die Intensität und Frequenz während der Tuina-Manipulation. a) Drucksensoren und Übertragungseinrichtungen. b) Messung des Fingerdrucks. (c) Die Kraft, die während der Tuina-Manipulation gemessen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Körperposition und Akupunkturposition der Ratte Tuina. Der Rattenhalter kann die Position von BL57 vollständig freilegen. Die Gliedmaßen greifen zusammen mit dem Daumen die unteren Gliedmaßen der Ratte, um sie zu fixieren, so dass die Ratte während der Behandlung ruhig kooperieren kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Test der Pfotenentzugsschwelle. Dies ist ein Test zur Messung des Schmerzverhaltens bei Ratten. Dabei werden die Füße mechanisch stimuliert und die Latenz beim Pfotenrückzug gemessen. (a) zeigt die Apparatur und (b) zeigt, wie sie während des Experiments an der Maus manipuliert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Latenztest für den Pfotenentzug. Dieser Aufbau misst die Schmerzgrenze der Ratten anhand ihrer Empfindlichkeit gegenüber der Hitze, die von einem Scheinwerfer erzeugt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Ergebnisse des Pfotenentzugsschwellentests. Die Messungen werden mit dem mittleren Plus- oder Minus-Standardfehler (
) dargestellt. Ergebnisse des durch mechanische Reize induzierten Tests zur Reflexschwelle für den Rückzugsreflex der Hintergliedmaßen in verschiedenen Stadien für jede Gruppe von Ratten. Signifikante Unterschiede (P < 0,05) wurden ab Tag 17 zwischen der CCD + Tuina und den CCD-Modellgruppen beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Ergebnisse des Latenztests für den Pfotenrückzug. Die Messungen werden mit dem mittleren Plus- oder Minus-Standardfehler () dargestellt. Ergebnisse von Schwellentests des durch Wärmestimulation induzierten Beinrückzugsreflexes in verschiedenen Stadien von Ratten in jeder Gruppe. Signifikante Unterschiede wurden zwischen der CCD + Tuina-Gruppe und der CCD-Modellgruppe ab dem siebten Tag beobachtet (P < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Mikroskopische Beobachtung von Spinalganglienneuronen in der CCD-Gruppe (Längsschnitt). Dieses Bild wurde durch Scannen der HE-gefärbten Probe des Spinalganglions erhalten. Die rote Ellipse in der Abbildung zeigt an, dass einige Neuronen eine Nekrose durchlaufen. Dies deutet darauf hin, dass das CCD-Modell die Neuronen im Spinalganglion geschädigt hat. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9. Mikroskopische Beobachtung von Spinalganglienneuronen in der naiven Gruppe (Längsschnitt und Querschnitt). Wie in der obigen Abbildung gezeigt, ist (a) ein Längsschnitt und (b) ein Querschnitt. Es gibt kein CCD-Gruppen-Vakanz-Phänomen in dem Bereich, in dem die Spinalganglien der leeren Gruppe von Ratten gesammelt werden. Die Neuronen sind durchgehend und kompakt, und die Zellkörper sind gefüllt. Die Satelliten-Gliazellen befinden sich zwischen den Neuronen. Maßstab: (a), 50 μm; (b), 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Mikroskopische Beobachtung von Spinalganglienneuronen in der CCD + Tuina-Gruppe (Querschnitt). Die Neuronen sind kontinuierlich, und es gibt ein Zellauflösungsphänomen. Dies deutet darauf hin, dass die Massagetherapie kurzfristig nicht in der Lage war, die durch das CCD-Modell verursachte Zellnekrose (rote Ellipse) zu verbessern. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11: Tuina-Drucktest. Ratten mit minimalen Zischreflex-Kompressionswerten variieren in der Größe und reichen von 5 N bis 25 N. Die Abszisse stellt den Grad des Drucks dar, während die Ordinate die Anzahl der Ratten darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 12: Röntgenbilder von CCD-Ratten. Validierung der CCD-Herstellung mittels Röntgenbildgebung von Rattenmodellen. (a) zeigt die Röntgenstrahlung, die in der vertikalen Ebene aufgenommen wurde, und (b)zeigt die Röntgenaufnahme, die in der Sagittalebene aufgenommen wurde. Die beiden unterschiedlichen Querschnitts-Röntgenaufnahmen ermöglichen eine klarere Sicht auf die Position des "L"-förmigen Edelstahlstabes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| N | Vor der Modellierung | D1 | D3 | D7 | D14 | D17 | D21 | |
| Naiv | 8 | 18,1±1,4 | 16.8+1.5 | 16,8±1,5 | 18,6±1,7 | 16,8±1,5 | 15,6±1,8 | 16,8±1,5 |
| Schein | 8 | 18,0±1,7 | 18,6±1,7 | 16,0±1,3 | 17,6±1,7 | 16,8±1,5 | 18,9±1,7 | 16,8±1,5 |
| CCD | 8 | 17,7±1,1 | 10.7±2.8# | 10,0±1,5 | 4.4±2.2 | 3,8±1,7 | 4.1±2.4 | 3,8±2,5 |
| CCD + Tuina | 8 | 18,9±1,7 | 9.8±2.3# | 8.3±1.4 | 4,8±1,2 | 5,8±2,0 | 7,2±1,8* | 7,5±1,8* |
| #Vergleich vor und D1-Modellierung, S<0,05. | ||||||||
| *Vergleich zwischen CCD-Gruppe und CCD+Tuina-Gruppe, S<0,05. | ||||||||
Tabelle 1: Pfotenentzugsschwelle, PWT (, s). Vergleich vor und D1-Modellierung, #p < 0,05. Vergleich zwischen der CCD-Gruppe und der CCD + Tuina-Gruppe, *p < 0,05.
| N | Vor der Modellierung | D1 | D3 | D7 | D14 | D17 | D21 | |
| Naiv | 8 | 11,9±1,2 | 12,0±1,6 | 12,2±1,9 | 12.4±1.1 | 12,2±1,9 | 12,0±1,4 | 12,0±1,4 |
| Schein | 8 | 11,9±1,2 | 11,6±1,5 | 12,2±1,9 | 11,6±1,5 | 12,2±0,9 | 11,6±1,5 | 11,6±1,5 |
| CCD | 8 | 10,8±1,1 | 8.9±0.7# | 7,9±0,8 | 7,7±0,5 | 7,8±1,0 | 7,7±0,8 | 7,7±0,8 |
| CCD + Tuina | 8 | 11,3±1,5 | 9.1±0.6# | 8,0±0,7 | 8,3±0,7* | 8,9±0,6* | 9,1±0,7* | 9,2±0,9* |
| #Vergleich vor und D1-Modellierung, S. < 0,05. | ||||||||
| Vergleich zwischen CCD-Gruppe und CCD+Tuina-Gruppe*p < 0,05. | ||||||||
Tabelle 2: Pfotenrückzugslatenz, PWL (, s). Vergleich vor und D1-Modellierung, #p < 0,05. Vergleich zwischen der CCD-Gruppe und der CCD + Tuina-Gruppe*p < 0,05.
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Discussion
Unsere Forschungsgruppe hat einschlägige Studien zu den Parametern der Tuina-Manipulation in einem frühen Stadium durchgeführt. Zunächst ist es wichtig, die Kraftintensität für die Tuina-Manipulation einzustellen. In der klinischen Tuina passen die Behandler die Kraftintensität entsprechend ihrer Erfahrung und dem subjektiven Empfinden der Patienten an, um durch Kommunikation den besten Tuina-Effekt zu erzielen. Im Tierversuch ist dies jedoch nicht umsetzbar. Im Tierversuch wird eine "Antwortschwelle" verwendet, um die Intensität der Tuina-Manipulation zu definieren. Diese beurteilen, ob die angewandte Tuina-Kraft angemessen ist, basierend auf der instinktiven Reaktion des Tieres. Randall,17 , nutzte diese Methode, um das Schmerzverhalten in Ratten-Entzündungsmodellen zu untersuchen. Der Unterschied besteht darin, dass Randall im Bereich der lokalen Entzündung operierte, während dieses Experiment im Bereich der Nichtverletzung operierte. Starke Tuina-Manipulation bringt Ratten dazu, Schreie zu produzieren und Fluchtreflexe zu entwickeln. Die Einstellung dieser starken Kraftintensität bestimmt, dass die formale Tuina-Kraftintensität kleiner ist als diese starke Kraftintensität. Basierend auf der Verteilung der maximalen Schrei- und Fluchtreflex-Presswerte von 150 Ratten zwischen 5-25 N, mit einer Mittelwert- und Standardabweichung von 9,93 und 3,018 (Abbildung 11), berechnete unsere vorherige Arbeit den optimalen Presskraftwert von 5 N. Zweitens wird die Betriebsfrequenz der Tuina-Methode in der Wissenschaft von Tuina mit 120-160 mal/min beschrieben18. Daher wurde die Tuina-Frequenz in diesem Experiment auf 2 Hz festgelegt.
Das CCD-Modell ist ein chirurgisches Modell, das traumatisch sein kann, da es eine Exposition des Gelenkfortsatzes und des Foramen intervertebralis erfordert. Daher benötigen Ratten nach der Operation 1-3 Tage, um sich zu erholen. Sowohl der Literatur als auch vorläufigen experimentellen Daten zufolge ist das Schmerzverhalten von Ratten am vierten Tag nach der Operation tendenziell stabil. Dies bietet einen günstigen Zeitpunkt, um die analgetische Wirkung der Tuina-Intervention zu beobachten. Eine längere Tuina-Behandlung ist jedoch möglicherweise nicht vorteilhaft für die analgetische Wirkung von Ratten und kann zu Gewebeschäden führen. In dieser Studie wurden die analgetischen Wirkungen von Tuina und das Kneten für 5, 15 und 30 Minuten verglichen und schließlich 15 Minuten als optimale Dauer des Eingriffs gewählt.
Diese Methode hat ihre Grenzen, da nur ein Teil der klinischen Operationen zur Auswahl von Manipulationen und Körperteilen verwendet wurde. BL57 (Chengshan) befindet sich im Trizeps surae der Ratte und wird von den Spinalganglien von L4 und L519 innerviert. Da die Muskeln des Trizeps surae dick und für Tuina geeignet sind, kann die Massage dieses Bereichs einen direkten Einfluss auf die Spinalganglien von L4 und L5 in den Lendenwirbeln der Ratte haben, die für experimentelle Proben verwendet werden.
Während des Formgebungsprozesses muss sichergestellt werden, dass der "L"-förmige Edelstahlstab im CCD-Schmerzmodell durch Röntgenüberprüfung genau in die Zwischenwirbelforamina von L4 und L5 eingeführt wird. Vor der Röntgenaufnahme verabreichten wir eine intraperitoneale 25%ige Anästhesie (0,6 ml/100 g), um die Ratten zu betäuben. Die Röntgenaufnahme bestätigte das erfolgreiche Einsetzen des "L"-förmigen Edelstahlstabes in die Zwischenwirbelforamina von L4 und L5 (Abbildung 12).
Insgesamt konzentrierte sich diese Studie auf die Beobachtung von Tuina-Behandlungsvorgängen und die Bewertung der therapeutischen Wirkungen von Tuina auf CCD-Ratten. Das Team führte einen Tierversuch durch, um zu untersuchen, wie man Tuina-Parameter einstellt, geeignete Teile auswählt und geeignete Behandlungszeiten bestimmt. Dies bietet eine standardisierte und reproduzierbare Demonstration der Tiermodellintervention für zukünftige Forschungen zur analgetischen Wirkung von Tuina.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch ShanghaiCritical Clinical Specialties ConstructionProject (Fördernummer: Shslczdzk04001); das Segelprogramm der Shanghai Science and Technology Commission (Fördernummer: 22YF1444300); Projekte im Rahmen des Budgets der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Fördernummer: 2021LK091).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter) | hand-made | / | For CCD models making |
| ALMEMO admeasuring apparatus | ahlborn | 2450-1 | Mechanical Withdrawal Threshold test |
| Constant temperature slicer CM-1900 | Leica | 1491950C1US | For specimen production |
| Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle | LIRCON/Shandong Lilkang | / | For disinfection |
| Disposable sterile syringe 5 mL | Shanghai Misha Wa Medical Industry | / | For injection |
| Electron microscope CX-31 | Olympus, Japan | BJ002318 | For specimen observation |
| Finger pressure recordings | Suzhou Changxian Optoelectronic Technology | CX1003w | For Tuina manipulation |
| Foam board (35 cm x 20 cm) | hand-made | / | It is our homemade apparatus for fixing rats |
| MERSILK W2512 | Johnson & Johnson | / | For tissue suture |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent | 10004160 | For specimen production |
| paraformaldehyde | China National Chemical Reagent | / | For specimen production |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | For anesthesia of rat |
| Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats | IITC Life Science | / | Paw Withdrawal Latency |
| Precision electronic scale for experiment JY3002 | Shanghai Precision Scientific Instrument | / | Weighing of rat |
| Rat hair clipper | Philips | HP6341/00 | Shaving of rat fur |
| Restrainer for rats | Tongji University (self-made) | / | It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs. |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | For specimen production |
| Uratan | China National Chemical Reagent | / | For anesthesia of rat |
| X-ray detector XR-600 | Dongguan Kaso Electronic Technology | / | Examination of CCD models |
| xylene | Shanghai Sinopharm Group | 100092 | For specimen production |
References
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