Summary
本プロトコルは、in vivo画像で観察された網膜神経節細胞軸索束形態を検証する目的で、同じマウス網膜のex vivo共焦点画像とin vivo可視光光干渉断層撮影ファイバーグラフィー(vis-OCTF)画像を位置合わせするための手順を概説する。
Abstract
近年、眼疾患の神経損傷を客観的に評価するために、生体内網膜イメージングは、生体システムやプロセスに関する非侵襲的、 リアルタイム、縦 断的情報を提供することがますます適用されています。同じ網膜の Ex vivo 共焦点イメージングは、特に動物研究において 、in vivo 所見を検証するためにしばしば必要になります。本研究では、マウス網膜の ex vivo共焦点像と in vivo 像をアライメントする方法を実証した。可視光光干渉断層撮影ファイバーグラフィー(vis-OCTF)と呼ばれる臨床対応の新しいイメージング技術を適用し、マウス網膜の in vivo 画像を取得しました。次に、「ゴールドスタンダード」と同じ網膜の共焦点イメージングを行い、 in vivo vs-OCTF画像を検証しました。本研究は、分子・細胞機構の解明を可能とするだけでなく、 生体内の神経損傷を高感度かつ客観的に評価するための基盤を確立するものです。
Introduction
網膜神経節細胞(RGC)は、内網状層(IPL)の樹状突起樹を介してシナプス入力を受け取り、網膜神経線維層(RNFL)の軸索を介して脳に情報を伝達する視覚情報処理において重要な役割を果たします1,2,3,4。緑内障などの病態では、早期のRGC変性により、患者とげっ歯類モデルの両方で、RNFL、神経節細胞層(GCL)、IPL、および視神経に微妙な変化が生じる可能性があります5,6,7,8,9。したがって、RGCのこれらの形態学的変化の早期検出は、RGCと視力喪失を予防するためのタイムリーな介入に不可欠です。
最近では、可視光干渉断層撮影法(vis-OCT)と呼ばれる臨床可能な新しいイメージング技術を開発し、RGC損傷の生体内モニタリングのニーズに応えています。Vis-OCTは軸方向分解能を改善し、網膜10,11で1.3μmに達し、RNFLの個々のRGC軸索束の可視化を可能にしました。その後、マウスの単軸索束レベルでのRGC損傷を追跡および定量化するために、vis-OCTファイバーグラフィー(vis-OCTF)が確立されました11,12,13。ただし、ゴールドスタンダードと同じ網膜のex vivo共焦点イメージングは、in vivo所見を検証するために必要になることがよくあります。したがって、この研究では、vis-OCTFによって取得されたin vivo画像を、同じマウス網膜のex vivo共焦点画像と位置合わせする方法を示します。プロトコルはex vivoの共焦点イメージ投射によって生体内の調査結果を検証し、病気の状態のRGCの損傷の根底にある分子および細胞変化を検査するための基盤を確立することを向ける。
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Protocol
すべての動物処置は、バージニア大学の動物実験委員会によって承認され、米国国立衛生研究所(NIH)の動物使用に関するガイドラインに準拠しています。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。
1. in vivo vis-OCTイメージング
- vis-OCTシステム
- 480 nm から 650 nm の可視光照明を提供するスーパーコンティニューム光源を使用する小動物の vis-OCT システムを使用して、マウスの眼を画像化します。角膜に入射する電力が1mWであることを確認し、Aラインレートを25kHz、Aラインあたり39.3μsの積分時間を使用します。
- 分光器のスペクトル検出範囲が508nm〜613nmであり、網膜で1.3μmの軸方向分解能が得られることを確認してください。総イメージングボリュームは約700μm(x)×700μm(y)×1,500μm(z)です。横方向の分解能は、視野の中心で4.5μm、中心から350μmで8.7μmの間である11,13。
- マウス麻酔
- C57BL/6バックグラウンドのマウスを麻酔し、ケタミン(114 mg / kg)とキシラジン(17 mg / kg)カクテルの腹腔内注射を行い、1%トロピカミド滴を使用して瞳孔を拡張します。つま先を強くつまんだ後の足の反射の喪失により、適切な麻酔を確認します。
- イメージング中は、赤外線ヒートランプを使用してマウスを暖かく保ちます。各画像取得後、角膜脱水を防ぐために人工涙液を塗布します。
- イメージング用のマウスの位置
- 麻酔をかけたマウスを動物ホルダーに置き、2本のベルクロストラップでマウスを所定の位置に保ちます。
注意: アニマルホルダーは、レーザーをマウスの目に入れるために、3次元の動き(垂直調整、水平微調整、ピッチとヨーの調整)を可能にします。
- 麻酔をかけたマウスを動物ホルダーに置き、2本のベルクロストラップでマウスを所定の位置に保ちます。
- イメージングパラメータの調整
- コンピューターの電源を入れ、参照されているソフトウェアを開くと、レーザーが自動的にオンになります。
- レーザーが安定し、マウスの目の中央に来るまで、動物ホルダーを調整します。ソフトウェアインターフェースの En Face プレビュー、浅血管神経叢の視野(FOV)、およびFOV内の網膜の断面であるB-スキャンにより、眼球の後部を視覚化します。
- 512 Aライン/B-スキャンと512 B-スキャン/ボリュームで構成される光学フォーカスの微調整を行った後、ソフトウェアインターフェイスの [取得 ]ボタンをクリックして、可視OCTボリュームを取得します。
注: このプロセスには ~10.5 秒かかります。画像取得は、所定のしきい値(QI < 45)を下回る画像が含まれないように、組み込みの品質指数(QI)推定器によってガイドされます。- 各マウスについて、同じ眼から 4 つの vis-OCT ボリュームを取得します。視神経乳頭(ONH)を視野の4つの角のそれぞれに合わせ、網膜のさまざまな領域をカバーします。
注:このような配置により、網膜の湾曲が最小限に抑えられ、FOV全体でRNFL反射率が最大化されます。各取得の合間にアイの位置を変えるのに~1分かかります(図1A、B)。
- 各マウスについて、同じ眼から 4 つの vis-OCT ボリュームを取得します。視神経乳頭(ONH)を視野の4つの角のそれぞれに合わせ、網膜のさまざまな領域をカバーします。
- Vis-OCTF分析
注:MATLABは画像解析の実行に使用されます。- vis-OCT ボリュームから vis-OCT ファイバーグラムを生成するには、強度ベースのしきい値法 (MATLAB コード行 808) を使用して網膜の表面を検出します。
注: これらの行は、 imadjust 関数を使用して、bscan の強度値を調整します。 imadjust に渡される引数 [0.0087, 0.08] は、出力イメージのフル ダイナミック レンジにマッピングする強度の範囲を指定します。 - 最初の~16 μmの深さを選択してRNFLをトリミングします。Matlab コードの 782 行目を参照してください。
注:成体野生型C57BL/6マウスの典型的な in vivo RNFLの厚さは~14 μmであり、セグメンテーション方法によって異なる場合があります13。 - RAW ファイル (9 行目)、再構成用ファイル (11 行目)、ファイル名 (15 行目) のパスを変更し、[ 実行] をクリックして、OCT イメージが MATLAB コードによって解析されるのを待ちます。軸 (z) 方向 (MATLAB コード行 905 から 908) に沿った平均強度投影を計算して、RGC 軸索束と周囲の血管系で構成されるファイバーグラム イメージを生成します。ファイバーグラム処理後の4枚の画像をモンタージュし、選択したグラフィックエディタで血管の位置合わせを行い、合計で~1.2 x 1.2 mmをカバーします。RAWファイルは通常、OCTイメージングの日付(例:0606 Opticent)の下のHalo Dataフォルダに保存されます。
注: MATLAB コードは 補足ファイル 1 にあります。
- vis-OCT ボリュームから vis-OCT ファイバーグラムを生成するには、強度ベースのしきい値法 (MATLAB コード行 808) を使用して網膜の表面を検出します。
2. Ex vivo 共焦点イメージング
- マウスの安楽死
- OCTのvis-データを取得した後、ペントバルビタールナトリウム(390 mg/mL)とフェニトインナトリウム(50mg/mL)の混合物でマウスを安楽死させる。フェニトインナトリウムは、げっ歯類の安楽死に広く適用されているペントバルビタールナトリウムの効果を増幅することによって機能します14,15。各マウスについて、希釈混合物0.2 mL/20 g(156 mg/mL)を使用し、20 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で灌流し、次に20 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSに溶かします16,17。
- 眼の解剖と向き
- 眼球を摘出し、側頭側にマークをつけて向きを示します。
- 前房を慎重に取り除いた後、眼球レンズ、硝子体、およびアイカップをPFAで30分間固定します。
- アイカップをPBSで30分間洗浄し、洗浄中にPBS溶液を3回交換します。その後、0.5% Triton X-100 in PBS(pH 7.5)で30分間洗浄します。
- アイカップをブロッキングバッファー(5%ロバ血清と2.5%ウシ血清アルブミン、0.5%Triton X-100トリス緩衝生理食塩水[pH 7.5])で室温で2時間インキュベートします。
- 免疫染色
注:これで、マウス抗Tuj1の一次抗体で撲色してRGC軸索束を検出し、ラット抗ICAM-2の一次抗体で染色して血管を検出する準備が整いました。- 一次抗体であるマウス抗Tuj1(ブロッキングバッファー中1:200)およびラット抗ICAM-2(ブロッキングバッファー中1:500)とともに、4°Cでアイカップを一晩インキュベートします。
- 0.5% Triton X-100(PBST)を含むリン酸緩衝生理食塩水で、毎回3〜5回1時間アイカップを洗浄し、バックグラウンドを最小限に抑え、結合していない抗体を除去します。
- 洗浄後、二次抗体、Alexa Fluor 488色素に結合したロバ抗マウス免疫グロブリンG(緑色蛍光)およびAlexa Fluor 594色素に結合したロバ抗ラットIgG(赤色蛍光)を、ブロッキングバッファー中で1:1000に希釈し、4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、PBSTでアイカップを3〜5回1時間ずつ洗浄し、バックグラウンドを最小限に抑え、結合していない抗体を除去します。
- フラットマウントの前に、アイカップをPBSのペトリ皿に移します。
- フラットマウント網膜
- 免疫染色プロセスの後、顕微鏡下で網膜をアイカップから分離します。
- 網膜を4枚の葉に切り、RGC層を上に向けて平らに取り付けます。側頭側のマークは、方向を示すために網膜に付けたままにします。
- 網膜を封入剤13,18でカバースリップする。スライドをマニキュア13,18,19で密封します。
- 共焦点イメージング
注:共焦点画像の画像処理は、ZEN顕微鏡ソフトウェアを使用して実行されました。- 共焦点顕微鏡の電源を入れ、 Locate(位置特定)モードで、顕微鏡の接眼レンズを使用して関心領域を見つけます。
- 取得モードでは、網膜全体をカバーするタイルを設定し、情報のすべてのレイヤーをカバーするように z スタック スライスを設定します。1.24 μm/ピクセルのピクセルサイズで、5.99 mm (x) x 5.88 mm (y) x 30 μm (z) の総体積をカバーするために、網膜全体で少なくとも 25 枚のタイルを画像化します。
- Zスタックスライスを投影して、2次元の面共焦点顕微鏡画像を作成します(図1C、D)11、13、19、20、21。
3. in vivo 画像と ex vivo 画像のアライメント
- ファイバーグラムを処理した後、選択したグラフィックエディタですべての血管を位置合わせすることにより、各マウスから取得した4つの画像を含む合成画像を作成します。
注: 図1Bに示すように、平均して最終的な合成画像は約1.2 mm(x)x 1.2 mm(y)です。 - 視神経乳頭(ONH)と血管のパターンを目印として使用して、複合ファイバーグラムをアライメントします。合成OCT画像の血管パターンとICAM-2で染色した同じ網膜の共焦点画像を重ね合わせて、 in vivoおよび ex vivo のアライメントを取得します。
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Representative Results
複合vis-OCTファイバーグラムを、RGC軸索のTuj-1で免疫染色したフラットマウント網膜の対応する共焦点画像と比較します(図1D、上パネル)。vis-OCTFによって画像化された軸索束は、共焦点画像上のTu-j1標識軸索束と一致することができます。血管は通常、ファイバーグラム画像では周囲の軸索束と比較して区別可能な分岐構造を示し、共焦点画像上のICAM-2標識血管と一致する可能性があります(図1D、下パネル)。
ex vivo共焦点顕微鏡とin vivo vs-OCTを並べて比較したところ、同一のRGC軸索束ネットワークと周囲の網膜血管系が明らかになりました。共焦点画像は、特に末梢領域において、in vivo画像と完全に一致しない場合があることに注意してください。これは、網膜がスライドに平らに取り付けられているためです。まとめると、これらの結果は、in vivoでサイズの異なる2つの隣接するRGC軸索束を分離するvis-OCTファイバーグラフィーの能力を実証するものです。
図1:同じマウス網膜の in vivo 画像と ex vivo 画像の位置合わせの模式図。 (A)マウスの眼の小動物対OCTシステムイメージングの模式図;(B)同じ眼から取得した4つの画像を、視野の四隅に配置された視神経乳頭と位置合わせすること。(C)網膜解剖(左)、網膜を平らに取り付けた方位(中央)、共焦点顕微鏡で画像化された網膜(右)の模式図。(D)可視OCTファイバーグラフィーと共焦点顕微鏡のRGC軸索束画像(上パネル)、 およびin vivo En-Face と血管免疫染色の ex vivo 共焦点顕微鏡画像(下パネル)の比較。4つの画像は同じ目で撮影したものです。黄色のスケールバー = 100 μm。パネル D の数字(1〜11)は、それぞれ血管を表す。略語:ONH =視神経乳頭;vis-OCTF = 可視光光干渉断層撮影ファイバーグラフィー;RGC = 網膜神経節細胞;S =スーペリア;I =劣っている。T = 時間的;N =鼻。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:画像解析用のMATLABコード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルには、注意が必要な 2 つのステップがあります。まず、OCT画像診断の前に、動物が深い麻酔下にあり、目が完全に拡張していることを確認する必要があります。マウスに十分な麻酔がかけられていないと、呼吸が速くなり、 顔 画像の動きが不安定になり、ファイバーグラムの品質に悪影響を及ぼす可能性があります。さらに、拡張が不十分な場合、虹彩が光を遮り、網膜に届かなくなる可能性があるため、画質に悪影響を与える可能性もあります。第二に、灌流後、マウスの眼窩から眼球を取り除く前に、左目または右目、および目の側頭側に印を付けることが重要です。平坦な網膜は上を向いており、表層にはRNFLがあるため、側頭側をマークすることで、平らな網膜の適切な向きが可能になります。
利点の1つは、前眼が光学イメージングのためにクリアである限り、網膜虚血や糖尿病性網膜症などの眼疾患のさまざまなマウスモデルにプロトコルを適用できることです。しかし、この方法の限界の一つは、免疫染色や共焦点イメージングのために網膜を適切に固定しても、軸索束の形態が変化する可能性があることです。これは、網膜解離中の誤操作が原因で発生し、軸索束の破裂を引き起こす可能性があります。さらに、網膜はin vivoで画像化すると湾曲したお椀状の構造になりますが、共焦点イメージングではスライド上で平らになります。その結果、末梢網膜の in vivo vis-OCT画像と ex vivo 共焦点画像の間に不完全な重複がある可能性があります。
トラブルシューティングの場合: この手法には、主に 2 つの部分があります。まず、OCTの視領域では、マウスの目の質が透明なファイバーグラムの獲得に大きく影響します。そのため、マウスの目には絶えず人工涙液を塗布して、湿潤で明るい状態を保ちました。マウスの体の位置も微調整され、レーザーが網膜にできるだけ垂直に照らされるようにしました。これらの対策が組み合わさって、画質が保証されました。第二に、網膜解離の部分では、網膜を取り囲む強膜を剥がすのではなく、切り落とすことがONH構造の完全性を維持するために重要であることがわかりました。強膜を鉗子で引き剥がすと、ONHは共焦点顕微鏡下でかなりの大きさの暗い穴として現れ、網膜組織は中心から欠落していました。完全なONH構造を維持することは、 in vivoおよび ex vivo のアライメントに不可欠です。
要約すると、in vivo 11,12,13 の単一軸索束レベルでの変化を直接定量化および追跡するための vis-OCTF を確立しました。このプロトコルは同じ網膜の生体内の対OCTFおよび前の生体内の共焦点イメージ投射を一直線に並べるための指示を提供する。これらの研究は、ヒトの神経損傷の客観的な評価を確立するための基礎を築き、将来の緑内障の診断と治療を大幅に改善する可能性があります。
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Disclosures
Chang、S.、なし。 徐、W.、なし; ファン、W.、なし。 マクダニエル、JA、なし。 D.A.ミラー 何一つ; M.グラノニコ、 何一つ; M. Liu, (劉 昌劉) 何一つ; X.劉、 何一つ; H.F. Zhang はOpticent Healthに金銭的利益を持っていますが、Opticent Healthはこの研究を支援していません。
Acknowledgments
この研究は、緑内障研究財団シェイファー助成金、4-CA Cavalier Collaborative Award、R01EY029121、R01EY035088、およびテンプル騎士団眼科財団によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
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