Summary
Il presente protocollo delinea i passaggi per l'allineamento in vivo delle immagini in fibra di tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina allo scopo di verificare la morfologia osservata del fascio assonale delle cellule gangliari retiniche nelle immagini in vivo .
Abstract
Negli ultimi anni, l'imaging retinico in vivo, che fornisce informazioni non invasive, in tempo reale e longitudinali sui sistemi e sui processi biologici, è stato sempre più applicato per ottenere una valutazione obiettiva del danno neurale nelle malattie oculari. L'imaging confocale ex vivo della stessa retina è spesso necessario per convalidare i risultati in vivo , soprattutto nella ricerca sugli animali. In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per allineare un'immagine confocale ex vivo della retina del topo con le sue immagini in vivo . Una nuova tecnologia di imaging clinicamente pronta chiamata fibragrafia per tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) è stata applicata per acquisire immagini in vivo della retina del topo. Abbiamo quindi eseguito l'imaging confocale della stessa retina come "gold standard" per convalidare le immagini in vivo vis-OCTF. Questo studio non solo consente ulteriori indagini sui meccanismi molecolari e cellulari, ma stabilisce anche le basi per una valutazione sensibile e obiettiva del danno neurale in vivo.
Introduction
Le cellule gangliari retiniche (RGC) svolgono un ruolo fondamentale nell'elaborazione delle informazioni visive, ricevendo input sinaptici attraverso i loro alberi dendritici nello strato plessiforme interno (IPL) e trasmettendo le informazioni tramite i loro assoni nello strato di fibre nervose retiniche (RNFL) al cervello 1,2,3,4. In condizioni patologiche come il glaucoma, la degenerazione precoce di RGC può provocare sottili cambiamenti nell'RNFL, nello strato di cellule gangliari (GCL), nell'IPL e nel nervo ottico sia nei pazienti che nei modellidi roditori 5,6,7,8,9. La diagnosi precoce di questi cambiamenti morfologici nelle RGC è quindi essenziale per un intervento tempestivo per prevenire le RGC e la perdita della vista.
Recentemente abbiamo sviluppato una nuova tecnologia di imaging clinicamente pronta chiamata tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCT) per soddisfare la necessità di monitoraggio in vivo del danno RGC. Vis-OCT ha migliorato la risoluzione assiale, raggiungendo 1,3 μm nella retina10,11, consentendo la visualizzazione dei singoli fasci assoniali RGC nell'RNFL. Successivamente, è stata istituita la fibrografia vis-OCT (vis-OCTF) per tracciare e quantificare il danno RGC a livello di singolo fascio assonale nei topi11,12,13. Tuttavia, l'imaging confocale ex vivo della stessa retina del gold standard è spesso necessario per convalidare i risultati in vivo. Pertanto, questo studio dimostrerà come allineare le immagini in vivo acquisite da vis-OCTF con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina. Il protocollo mira a convalidare i risultati in vivo mediante imaging confocale ex vivo e stabilire una base per esaminare i cambiamenti molecolari e cellulari alla base del danno RGC in condizioni patologiche.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Virginia e conformi alle linee guida sull'uso degli animali del National Institute of Health (NIH). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Imaging vis-OCT in vivo
- Il sistema vis-OCT
- Immagina gli occhi dei topi utilizzando un sistema vis-OCT di piccoli animali che utilizza una sorgente di luce supercontinua, che fornisce un'illuminazione a luce visibile tra 480 nm e 650 nm. Assicurarsi che la potenza incidente sulla cornea sia di 1 mW e utilizzare una velocità della linea A di 25 kHz e un tempo di integrazione di 39,3 μs per linea A.
- Assicurarsi che l'intervallo di rilevamento spettrale dello spettrometro sia compreso tra 508 nm e 613 nm, in modo da ottenere una risoluzione assiale di 1,3 μm nella retina. Il volume totale dell'imaging è di circa 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1.500 μm (z). La risoluzione laterale è compresa tra 4,5 μm al centro del campo visivo e 8,7 μm a 350 μm dal centro11,13.
- Anestesia per topi
- Anestetizzare topi di origine C57BL/6 e di entrambi i sessi con un'iniezione intraperitoneale di cocktail di ketamina (114 mg/kg) e xilazina (17 mg/kg) e dilatare le pupille utilizzando gocce di tropicamide all'1%. Confermare un'adeguata anestesia con la perdita del riflesso del pedale dopo un forte pizzicamento del dito del piede.
- Durante l'imaging, tenere il mouse al caldo utilizzando una lampada termica a infrarossi. Dopo ogni acquisizione di immagini, applicare lacrime artificiali per prevenire la disidratazione corneale.
- Posizionamento del mouse per l'imaging
- Posizionare il mouse anestetizzato sul supporto per animali e mantenere il mouse in posizione con l'aiuto di due cinghie in velcro.
NOTA: Il supporto per animali consente il movimento in tre dimensioni (regolazione verticale, regolazione orizzontale fine, nonché regolazioni di beccheggio e imbardata) per posizionare il laser nell'occhio del mouse.
- Posizionare il mouse anestetizzato sul supporto per animali e mantenere il mouse in posizione con l'aiuto di due cinghie in velcro.
- Regolazione dei parametri di imaging
- Accendere il computer e aprire il software di riferimento, che accenderà automaticamente il laser.
- Regolare il supporto per animali fino a quando il laser non è stabile e centrato nell'occhio del mouse. Visualizza la parte posteriore dell'occhio attraverso un'anteprima En Face nell'interfaccia software, il campo visivo (FOV) del plesso vascolare superficiale e un B-scan, la sezione trasversale della retina all'interno del FOV.
- Acquisire un volume vis-OCT facendo clic sul pulsante Acquisisci sull'interfaccia software dopo aver eseguito piccole regolazioni della messa a fuoco ottica, che consiste in 512 linee A/B-scan e 512 B-scan/volume.
NOTA: Questo processo richiede ~10.5 s. L'acquisizione delle immagini è guidata da uno stimatore dell'indice di qualità (QI) integrato per garantire che le immagini al di sotto di una soglia predeterminata (QI < 45) non siano incluse.- Per ogni mouse, acquisire quattro volumi vis-OCT dallo stesso occhio. Allineare la testa del nervo ottico (ONH) in ciascuno dei quattro angoli del campo visivo per coprire diverse aree della retina.
NOTA: Tale posizionamento riduce al minimo la curvatura retinica, massimizzando la riflettanza RNFL in tutto il FOV. Richiede ~1 minuto per riposizionare l'occhio tra un'acquisizione e l'altra (Figura 1A,B).
- Per ogni mouse, acquisire quattro volumi vis-OCT dallo stesso occhio. Allineare la testa del nervo ottico (ONH) in ciascuno dei quattro angoli del campo visivo per coprire diverse aree della retina.
- Analisi Vis-OCTF
NOTA: MATLAB viene utilizzato per eseguire l'analisi delle immagini.- Per generare fibrogrammi vis-OCT dal volume vis-OCT, utilizzare un metodo di soglia basato sull'intensità (riga di codice MATLAB 808) per rilevare la superficie della retina.
NOTA: Queste linee utilizzano la funzione di regolazione per regolare i valori di intensità del bscan. L'argomento [0.0087 0.08] passato a imadjust specifica l'intervallo di intensità da mappare all'intera gamma dinamica dell'immagine di output. - Ritaglia l'RNFL selezionando il primo ~16 μm di profondità. Vedere la riga di codice 782 di Matlab.
NOTA: Lo spessore tipico di RNFL in vivo in un topo adulto wild-type C57BL/6 è di ~14 μm e può variare tra i diversi metodi di segmentazione13. - Modificare i percorsi del file RAW (riga 9), File per la ricostruzione (riga 11) e nome del file (riga 15), fare clic su Esegui e attendere che l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office venga analizzata dal codice MATLAB. Calcola la proiezione dell'intensità media lungo la direzione assiale (z) (linee di codice MATLAB 905-908) per generare l'immagine del fibrogramma composta da fasci di assoni RGC e vascolarizzazione circostante. Montare le quattro immagini dopo l'elaborazione del fibrogramma per ogni FOV allineando i vasi sanguigni con un editor grafico a scelta, coprendo ~1,2 x 1,2 mm in totale. I file RAW vengono solitamente salvati nella cartella: Halo Data, sotto la data dell'imaging OCT (ad esempio, 0606 Opticent).
NOTA: I codici MATLAB sono disponibili nel file supplementare 1.
- Per generare fibrogrammi vis-OCT dal volume vis-OCT, utilizzare un metodo di soglia basato sull'intensità (riga di codice MATLAB 808) per rilevare la superficie della retina.
2. Imaging confocale ex vivo
- Eutanasia del topo
- Dopo aver acquisito i dati vis-OCT, sopprimere i topi con una miscela di pentobarbital sodico (390 mg/mL) e fenitoina sodica (50 mg/mL). La fenitoina sodica agisce amplificando gli effetti del pentobarbital sodico, che è stato ampiamente applicato nell'eutanasia dei roditori14,15. Per ciascun topo, utilizzare 0,2 mL/20 g della miscela diluita (156 mg/mL) e perfuse con 20 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi 20 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS16,17.
- Dissezione e orientamento dell'occhio
- Enucleare gli occhi e fare un segno sul lato temporale per indicare l'orientamento.
- Dopo aver rimosso con cura la camera anteriore, il cristallino oculare, il vitreo e fissare le conchiglie oculari in PFA per 30 min.
- Lavare le conchiglie oculari con PBS per 30 minuti e sostituire la soluzione PBS 3 volte durante il lavaggio. Quindi, lavare con Triton X-100 allo 0,5% in PBS (pH 7,5) per 30 minuti.
- Incubare le conchiglie oculari in tampone bloccante (5% siero d'asina con 2,5% albumina sierica bovina e 0,5% Triton X-100 in soluzione salina tamponata Tris [pH 7,5]) per 2 ore a temperatura ambiente.
- Immunocolorazione
NOTA: Le conchiglie oculari sono ora pronte per essere colorate con gli anticorpi primari di topo anti-Tuj1 per rilevare i fasci assonali RGC e di ratto anti-ICAM-2 per rilevare i vasi sanguigni.- Incubare le conchiglie oculari per una notte con gli anticorpi primari, anti-Tuj1 di topo (1:200 in tampone bloccante) e anti-ICAM-2 di ratto (1:500 in tampone bloccante), a 4 °C.
- Lavare le conchiglie oculari 3-5 volte per 1 ora ogni volta, con una soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,5% di Triton X-100 (PBST) per ridurre al minimo il fondo e rimuovere eventuali anticorpi non legati.
- Dopo il lavaggio, incubare le conchiglie oculari per una notte con gli anticorpi secondari, l'immunoglobulina G anti-topo dell'asino coniugata al colorante Alexa Fluor 488 (fluorescenza verde) e l'IgG anti-ratto dell'asino coniugato al colorante Alexa Fluor 594 (fluorescenza rossa), tutti diluiti 1:1000 in tampone bloccante, a 4 °C.
- Il giorno seguente, lavare le conchiglie oculari 3-5 volte per 1 ora ciascuna con PBST per ridurre al minimo il fondo e rimuovere l'anticorpo non legato.
- Trasferire le conchiglie oculari in una capsula di Petri di PBS prima del montaggio piatto.
- Retina piatta
- Dopo il processo di immunocolorazione, isolare le retine dalle conchiglie oculari al microscopio.
- Tagliare le retine in quattro foglie e montarle in piano con lo strato RGC rivolto verso l'alto. Lasciare il segno sul lato temporale attaccato alla retina per indicare l'orientamento.
- Vetrino coprioggetto delle retine con mezzo di montaggio13,18. Sigillare i vetrini con lo smalto13,18,19.
- Imaging confocale
NOTA: L'elaborazione delle immagini confocali è stata eseguita utilizzando il software di microscopia ZEN.- Accendere il microscopio confocale e, in modalità Localizza, trovare l'area di interesse utilizzando l'oculare del microscopio.
- In modalità di acquisizione, impostare i riquadri in modo da coprire l'intera retina e le sezioni dello z-stack in modo da coprire tutti i livelli di informazioni. Immagine di almeno 25 tessere sull'intera retina per coprire il volume totale di 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) con una dimensione dei pixel di 1,24 μm/pixel.
- Proiettare le fette Z-stack per creare immagini bidimensionali al microscopio confocale en face (Figura 1C,D)11,13,19,20,21.
3. Allineamento di immagini in vivo ed ex vivo
- Dopo aver elaborato il fibrogramma, crea un'immagine composita che includa le quattro immagini acquisite da ciascun mouse allineando tutti i vasi sanguigni con un editor grafico a scelta.
NOTA: In media, l'immagine composita finale è di circa 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), come mostrato nella Figura 1B. - Utilizzare la testa del nervo ottico (ONH) e il modello dei vasi sanguigni come punti di riferimento per allineare il fibrogramma composito. Ottenere l'allineamento in vivo ed ex vivo sovrapponendo il pattern dei vasi sanguigni delle immagini OCT composite con le immagini confocali della stessa retina colorata con ICAM-2.
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Representative Results
Il fibrogramma composito vis-OCT viene confrontato con la corrispondente immagine confocale della retina piatta immunocolorata con Tuj-1 per gli assoni RGC (Figura 1D, pannello in alto). I fasci di assoni ripresi da vis-OCTF possono essere abbinati ai fasci di assoni marcati con Tu-j1 sull'immagine confocale. I vasi sanguigni di solito mostrano strutture ramificate distinguibili rispetto ai fasci assoniali circostanti nelle immagini a fibragramma, che possono essere abbinate ai vasi sanguigni marcati con ICAM-2 sull'immagine confocale (Figura 1D, pannello inferiore).
Il confronto fianco a fianco tra microscopia confocale ex vivo e vis-OCT in vivo ha rivelato reti di fasci assoniali RGC identiche e vascolarizzazione retinica circostante. Si noti che l'immagine confocale potrebbe non corrispondere perfettamente alle immagini in vivo , soprattutto nella regione periferica; Questo perché la retina è stata montata in piano sul vetrino. Nel loro insieme, questi risultati convalidano la capacità della fibrografia vis-OCT di risolvere in vivo due fasci assoniali RGC adiacenti di dimensioni variabili.
Figura 1: Illustrazione schematica dell'allineamento dell'immagine in vivo con l'immagine ex vivo della stessa retina murina. (A) Schema dell'imaging di un occhio di topo per il sistema vis-OCT di piccoli animali; (B) Allineamento delle quattro immagini acquisite dallo stesso occhio con la testa del nervo ottico posta ai quattro angoli del campo visivo; (C) Rappresentazione schematica della dissezione della retina (a sinistra), della retina piatta con orientamento tracciato (al centro) e della retina ripresa mediante microscopia confocale (a destra); (D) Confronto tra la fibrografia vis-OCT e la microscopia confocale Immagini del fascio assonale RGC (pannello superiore) e En-Face in vivo con l'immagine di microscopia confocale ex vivo dell'immunocolorazione per i vasi sanguigni (pannello inferiore). Le quattro immagini provengono dallo stesso occhio. Barre di scala gialle = 100 μm. I numeri (1-11) nel pannello D rappresentano ciascuno i vasi sanguigni. Abbreviazioni: ONH = testa del nervo ottico; vis-OCTF = fibrografia con tomografia a coerenza ottica a luce visibile; RGC = cellula gangliare retinica; S = superiore; I = inferiore; T = temporale; N = nasale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Codici MATLAB per l'analisi delle immagini. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
Ci sono due passaggi in questo protocollo che richiedono attenzione. Innanzitutto, è necessario assicurarsi che l'animale sia in anestesia profonda e che i suoi occhi siano completamente dilatati prima dell'imaging vis-OCT. Se i topi non sono adeguatamente anestetizzati la loro respirazione veloce può portare a movimenti instabili delle immagini en face , che possono influire negativamente sulla qualità del fibrogramma. Inoltre, una dilatazione insufficiente può anche avere un impatto negativo sulla qualità dell'immagine poiché l'iride può ostruire la luce, impedendole di raggiungere la retina. In secondo luogo, è importante contrassegnare l'occhio sinistro o destro, così come il lato temporale dell'occhio, dopo la perfusione ma prima di rimuovere il bulbo oculare dall'orbita del topo. Poiché la retina piatta è rivolta verso l'alto con l'RNFL sullo strato superficiale, la marcatura del lato temporale consentirà il corretto orientamento della retina piatta.
Uno dei vantaggi è che il protocollo può essere applicato a diversi modelli murini di malattie oculari, come l'ischemia retinica e la retinopatia diabetica, purché gli occhi anteriori siano chiari per l'imaging ottico. Tuttavia, una limitazione di questo metodo è che anche se la retina è correttamente fissata per l'immunocolorazione e l'imaging confocale, la morfologia del fascio assonale può cambiare. Ciò si verifica a causa di operazioni errate durante la dissezione della retina, che possono causare rotture nei fasci assonali. Inoltre, mentre le retine sono strutture curve a forma di ciotola quando vengono visualizzate in vivo, vengono appiattite su vetrini per l'imaging confocale. Di conseguenza, potrebbe esserci una sovrapposizione incompleta tra le immagini in vivo vis-OCT e le immagini confocali ex vivo della retina periferica.
Per la risoluzione dei problemi: questa tecnica comprende principalmente due parti. Innanzitutto, per la parte vis-OCT, la qualità dell'occhio del topo può avere un grande impatto sul successo dell'acquisizione di fibrogrammi trasparenti. Pertanto, le lacrime artificiali sono state costantemente applicate all'occhio del topo per mantenerlo umido e luminoso. Anche la posizione del corpo del mouse è stata messa a punto per far brillare il laser il più perpendicolarmente possibile sulla retina. L'insieme di queste misure ha garantito la qualità dell'immagine. In secondo luogo, per la parte di dissezione della retina, abbiamo scoperto che tagliare la sclera che circonda la retina, piuttosto che strapparla, era fondamentale per mantenere l'integrità della struttura dell'ONH. Quando la sclera è stata strappata via con il forcipe, l'ONH è apparso come un buco nero di discrete dimensioni al microscopio confocale, con il tessuto retinico mancante dal centro. Il mantenimento di una struttura ONH completa è essenziale per gli allineamenti in vivo ed ex vivo .
In sintesi, abbiamo stabilito vis-OCTF per quantificare e tracciare direttamente i cambiamenti a livello di singolo fascio di assoni in vivo11,12,13. Questo protocollo fornisce le istruzioni per l'allineamento dell'imaging confocale in vivo vis-OCTF ed ex vivo delle stesse retine. Questi studi gettano le basi per stabilire una valutazione obiettiva del danno neurale negli esseri umani, che può migliorare significativamente la diagnosi e il trattamento del glaucoma in futuro.
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Disclosures
Chang, S., Nessuno; Xu, W., Nessuno; Ventilatore, W., Nessuno; McDaniel, J.A., Nessuno; D.A. Mugnaio, Nessuno; M. Grannonico, Nessuno; M. Liu, Nessuno; X. Liu, Nessuno; H.F. Zhang ha interessi finanziari in Opticent Health, che non ha sostenuto questo lavoro.
Acknowledgments
Questo studio è supportato dalla Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, dal 4-CA Cavalier Collaborative Award, dalla R01EY029121, dalla R01EY035088 e dalla Knights Templar Eye Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
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