Summary
본 프로토콜은 in vivo 이미지에서 관찰된 망막 신경절 세포 축삭 다발 형태를 검증하기 위한 목적으로 in vivo 가시광선 광간섭 단층 촬영 fibergraphy(vis-OCTF) 이미지를 동일한 마우스 망막의 ex vivo 공초점 이미지와 정렬하는 단계를 설명합니다.
Abstract
최근 몇 년 동안 생체 시스템 및 프로세스에 대한 비침습적, 실시간 및 종단 정보를 제공하는 생체 내 망막 영상이 안과 질환의 신경 손상에 대한 객관적인 평가를 얻기 위해 점점 더 많이 적용되고 있습니다. 동일한 망막의 생체 외 공초점 이미징은 특히 동물 연구에서 생체 내 결과를 검증하는 데 필요한 경우가 많습니다. 이 연구에서는 생쥐 망막의 생체 외 공초점 이미지를 생체 내 이미지와 정렬하는 방법을 시연했습니다. 가시광선 광간섭 단층 촬영 섬유촬영(vis-OCTF)이라는 새로운 임상 준비 이미징 기술을 적용하여 생쥐 망막의 생체 내 이미지를 획득했습니다. 그런 다음 "골드 스탠다드"와 동일한 망막의 컨포칼 이미징을 수행하여 in vivo vis-OCTF 이미지를 검증했습니다. 이 연구는 분자 및 세포 메커니즘에 대한 추가 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 생체 내 신경 손상에 대한 민감하고 객관적인 평가를 위한 기반을 마련합니다.
Introduction
망막 신경절 세포(RGC)는 시각 정보 처리에 중요한 역할을 하며, 내부 망상층(IPL)의 수지상 나무를 통해 시냅스 입력을 받고 망막 신경 섬유층(RNFL)의 축삭을 통해 뇌로 정보를 전달합니다 1,2,3,4. 녹내장과 같은 질병이 있는 상태에서, 초기 망막 신경절 변성은 환자와 설치류 모델 모두에서 RNFL, 신경절 세포층(GCL), IPL 및 시신경에 미묘한 변화를 초래할 수 있다 5,6,7,8,9. 따라서 망막 신경절 세포의 이러한 형태학적 변화를 조기에 발견하는 것은 망막 신경절 세포와 시력 상실을 예방하기 위한 적시 개입에 필수적입니다.
당사는 최근 망막 신경절 손상의 생체 내 모니터링에 대한 요구를 충족시키기 위해 가시광선 광간섭 단층촬영(vis-OCT)이라는 새로운 임상 지원 영상 기술을 개발했습니다. Vis-OCT는 망막10,11에서 1.3μm에 도달하여 축 분해능을 개선하여 RNFL에서 개별 망막 신경절 축삭 다발을 시각화할 수 있었습니다. 이어서, 마우스(11,12,13)에서 단일 축삭돌기 다발 수준에서 망막 신경절 손상을 추적하고 정량화하기 위해 vis-OCT 섬유학(vis-OCTF)을 확립하였다. 그러나 황금 표준과 동일한 망막의 생체 외 공초점 이미징은 생체 내 결과를 검증하는 데 필요한 경우가 많습니다. 따라서 본 연구는 vis-OCTF로 획득한 in vivo 이미지를 동일한 마우스 망막의 ex vivo 컨포칼 이미지와 정렬하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 생체 외 컨포칼 이미징을 통해 생체 내 결과를 검증하고 질병 상태에서 망막 신경절 손상의 기저에 있는 분자 및 세포 변화를 조사하기 위한 기반을 구축하는 것을 목표로 합니다.
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Protocol
모든 동물 시술은 버지니아 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 미국 국립보건원(NIH)의 동물 사용 지침을 준수했습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. In vivo vis-OCT 이미징
- vis-OCT 시스템
- 480nm에서 650nm 사이의 가시광선 조명을 제공하는 초연속체 광원을 사용하는 작은 동물 vis-OCT 시스템을 사용하여 쥐의 눈을 이미지화합니다. 각막에 입사되는 전력이 1mW인지 확인하고 25kHz의 A-라인 속도와 A-라인당 39.3μs의 통합 시간을 사용합니다.
- 분광계의 스펙트럼 검출 범위가 508nm에서 613nm 사이인지 확인하여 망막에서 1.3μm의 축 분해능을 제공합니다. 총 이미징 부피는 약 700μm(x) x 700μm(y) x 1,500μm(z)입니다. 측면 해상도는 시야 중심에서 4.5μm, 중심에서 350μm에서 8.7μm 사이입니다(11,13).
- 마우스 마취
- 케타민(114mg/kg)과 자일라진(17mg/kg) 칵테일의 복강내 주사로 C57BL/6 배경의 마우스를 마취하고 1% 트로피카미드 방울을 사용하여 동공을 확장합니다. 단단한 발가락 꼬집기 후 페달 반사의 손실로 적절한 마취를 확인하십시오.
- 이미징하는 동안 적외선 열 램프를 사용하여 마우스를 따뜻하게 유지하십시오. 각 이미지 획득 후 각막 탈수를 방지하기 위해 인공 눈물을 적용합니다.
- 이미징을 위한 마우스 위치 지정
- 마취된 마우스를 동물 홀더에 놓고 두 개의 벨크로 스트랩을 사용하여 마우스를 제자리에 고정합니다.
알림: 동물 홀더를 사용하면 3차원(수직 조정, 미세한 수평 조정, 피치 및 요 조정)으로 이동하여 레이저를 마우스 눈에 넣을 수 있습니다.
- 마취된 마우스를 동물 홀더에 놓고 두 개의 벨크로 스트랩을 사용하여 마우스를 제자리에 고정합니다.
- 이미징 파라미터 조정
- 컴퓨터를 켜고 참조된 소프트웨어를 열면 레이저가 자동으로 켜집니다.
- 레이저가 안정되고 쥐의 눈 중앙에 올 때까지 동물 홀더를 조정합니다. 소프트웨어 인터페이스의 En Face 미리보기, 표재성 혈관신경총의 시야(FOV) 및 FOV 내 망막의 단면인 B-스캔을 통해 눈의 뒤쪽 부분을 시각화합니다.
- 512 A-라인/B-스캔 및 512 B-스캔/볼륨으로 구성된 광학 초점을 약간 조정한 후 소프트웨어 인터페이스에서 Acquire 버튼을 클릭하여 vis-OCT 볼륨을 획득합니다.
참고: 이 프로세스는 ~10.5초가 걸립니다. 이미지 획득은 미리 결정된 임계값(QI < 45) 미만의 이미지가 포함되지 않도록 하기 위해 내장된 품질 지수(QI) 추정기에 의해 안내됩니다.- 각 마우스에 대해 동일한 눈에서 4개의 vis-OCT 볼륨을 획득합니다. 망막의 다른 영역을 덮기 위해 FOV의 네 모서리 각각에 시신경두(ONH)를 정렬합니다.
참고: 이러한 배치는 망막 곡률을 최소화하여 FOV 전체에서 RNFL 반사율을 최대화합니다. 각 획득 사이에 눈의 위치를 변경하는 데 ~1분이 필요합니다(그림 1A,B).
- 각 마우스에 대해 동일한 눈에서 4개의 vis-OCT 볼륨을 획득합니다. 망막의 다른 영역을 덮기 위해 FOV의 네 모서리 각각에 시신경두(ONH)를 정렬합니다.
- Vis-OCTF 분석
참고: MATLAB은 이미지 분석을 수행하는 데 사용됩니다.- vis-OCT 볼륨에서 vis-OCT 파이버그램을 생성하려면 강도 기반 임계값 방법(MATLAB 코드 라인 808)을 사용하여 망막 표면을 검출하십시오.
참고: 이 라인은 imadjust 함수를 사용하여 bscan의 명암 값을 조정합니다. imadjust 에 전달된 [0.0087 0.08] 인수는 출력 영상의 전체 동적 범위에 매핑할 명암 범위를 지정합니다. - 깊이의 처음 ~16μm를 선택하여 RNFL을 자릅니다. Matlab 코드 라인 782를 참조하십시오.
참고: 성체 야생형 C57BL/6 마우스의 일반적인 in vivo RNFL 두께는 ~14μm이며, 분할 방법에 따라 다를 수 있다13. - RAW 파일의 경로(라인 9), 재구성할 파일(라인 11), 파일 이름(라인 15)을 변경하고 실행(Run)을 클릭한 다음 MATLAB 코드에서 OCT 이미지를 분석할 때까지 기다립니다. 축(z) 방향(MATLAB 코드 라인 905-908)을 따라 평균 강도 투영을 계산하여 망막 신경절 축삭 다발과 주변 혈관 구조로 구성된 파이버그램 영상을 생성합니다. 총 ~1.2 x 1.2mm를 커버하는 선택한 그래픽 편집기로 혈관을 정렬하여 각 FOV에 대한 파이버그램 처리 후 4개의 이미지를 몽타주합니다. RAW 파일은 일반적으로 OCT 이미징 날짜(예: 0606 Opticent)의 Halo Data 폴더에 저장됩니다.
참고: MATLAB 코드는 보충 파일 1에서 사용할 수 있습니다.
- vis-OCT 볼륨에서 vis-OCT 파이버그램을 생성하려면 강도 기반 임계값 방법(MATLAB 코드 라인 808)을 사용하여 망막 표면을 검출하십시오.
2. Ex vivo 컨포칼 이미징
- 쥐 안락사
- vis-OCT 데이터를 획득한 후 펜토바르비탈 나트륨(390mg/mL)과 페니토인 나트륨(50mg/mL)의 혼합물로 마우스를 안락사시킵니다. 페니토인 나트륨은 펜토바르비탈 나트륨의 효과를 증폭시켜 기능하며, 이는 설치류 안락사에 널리 적용되어 왔다14,15. 각 마우스에 0.2mL/20g의 희석된 혼합물(156mg/mL)을 사용하고 20mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 관류한 다음 PBS16,17에서 20mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 관류합니다.
- 눈 해부 및 방향
- 눈을 적출하고 측두부에 방향을 표시하십시오.
- 전방, 안구 수정체, 유리체를 조심스럽게 제거한 후 30분 동안 PFA에 아이컵을 고정합니다.
- PBS로 아이컵을 30분 동안 세척하고 세척하는 동안 PBS 용액을 3번 교체합니다. 그런 다음 PBS(pH 7.5)의 0.5% Triton X-100으로 30분 동안 세척합니다.
- 차단 완충액(5% 소 혈청 알부민이 함유된 2.5% 당나귀 세럼 및 트리스 완충 식염수[pH 7.5]에 0.5% Triton X-100)에 아이컵을 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
- 면역염색
참고: 이제 아이컵은 망막 신경절 축삭 다발을 검출하기 위한 마우스 항-Tuj1 및 혈관을 검출하기 위한 쥐 항-ICAM-2의 1차 항체로 염색할 준비가 되었습니다.- 4°C에서 1차 항체인 mouse anti-Tuj1(차단 완충액에서 1:200) 및 rat anti-ICAM-2(차단 완충액에서 1:500)로 아이컵을 밤새 배양합니다.
- 0.5% Triton X-100(PBST)이 함유된 인산염 완충 식염수로 매번 1시간 동안 아이컵을 3-5회 세척하여 배경을 최소화하고 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
- 세척 후, 2차 항체, Alexa Fluor 488 염료(녹색 형광)에 접합된 donkey anti-mouse Immunoglobulin G 및 Alexa Fluor 594 dye(적색 형광)에 접합된 donkey anti-rat IgG를 4°C에서 차단 완충액에 1:1000으로 희석하여 밤새 배양합니다.
- 다음 날, PBST로 아이컵을 각각 1시간 동안 3-5회 세척하여 배경을 최소화하고 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
- 플랫 마운트 전에 아이컵을 PBS의 페트리 접시로 옮깁니다.
- 평면 장착 망막
- 면역염색 과정이 끝나면 현미경으로 아이컵에서 망막을 분리합니다.
- 망막을 4개의 잎으로 자르고 망막 신경절 층이 위를 향하도록 평평하게 장착합니다. 망막에 부착된 측두면에 방향을 나타내는 표시를 남겨 둡니다.
- 장착 매체13,18로 망막을 커버슬립합니다. 매니큐어13,18,19로 슬라이드를 밀봉합니다.
- 컨포칼 이미징
참고: 컨포칼 이미지의 이미지 처리는 ZEN 현미경 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.- 컨포칼 현미경을 켜고 위치 찾기 모드에서 현미경의 접안렌즈를 사용하여 관심 영역을 찾습니다.
- 획득 모드에서 전체 망막을 덮도록 타일을 설정하고 모든 정보 계층을 덮도록 z-stack 조각을 설정합니다. 픽셀당 1.24μm의 픽셀 크기에서 5.99mm(x) x 5.88mm(y) x 30μm(z)의 총 부피를 커버하기 위해 전체 망막에 걸쳐 최소 25타일을 이미지화합니다.
- Z 스택 슬라이스를 투영하여 2차원 얼굴 컨포칼 현미경 이미지를 생성합니다(그림 1C,D)11,13,19,20,21.
3. in vivo 및 ex vivo 이미지의 정렬
- 파이버그램을 처리한 후 선택한 그래픽 편집기로 모든 혈관을 정렬하여 각 마우스에서 획득한 4개의 이미지를 포함하는 합성 이미지를 만듭니다.
참고: 평균적으로 최종 합성 이미지는 그림 1B와 같이 약 1.2mm(x) x 1.2mm(y)입니다. - 시신경두(ONH)와 혈관 패턴을 랜드마크로 사용하여 복합 섬유그램을 정렬합니다. 복합 OCT 이미지의 혈관 패턴을 ICAM-2로 염색된 동일한 망막의 컨포칼 이미지와 겹쳐서 in vivo 및 ex vivo 정렬을 얻습니다.
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Representative Results
복합 vis-OCT 파이버그램은 망막 신경절 축삭돌기에 대해 Tuj-1로 면역염색된 평판 장착 망막의 해당 컨포칼 이미지와 비교됩니다(그림 1D, 상단 패널). vis-OCTF로 이미징된 축삭 다발은 공초점 이미지에서 Tu-j1 표지된 축삭 다발과 일치시킬 수 있습니다. 혈관은 일반적으로 섬유그램 이미지에서 주변 축삭 다발과 비교하여 구별 가능한 분지 구조를 나타내며, 이는 공초점 이미지에서 ICAM-2 표지 혈관과 일치할 수 있습니다(그림 1D, 하단 패널).
체외 공초점 현미경과 in vivo vis-OCT를 나란히 비교한 결과, 동일한 망막 신경절 축삭 다발 네트워크와 주변 망막 혈관 구조가 밝혀졌습니다. 공초점 이미지는 특히 주변 영역에서 생체 내 이미지와 완벽하게 일치하지 않을 수 있습니다. 망막이 슬라이드에 평평하게 장착되었기 때문입니다. 종합하면, 이러한 결과는 생체 내에서 다양한 크기의 인접한 두 개의 망막 신경절 축삭 다발을 분해하는 vis-OCT 섬유학의 능력을 검증합니다.
그림 1: in vivo 이미지와 동일한 마우스 망막의 ex vivo 이미지 정렬에 대한 개략도. (A) 쥐 눈의 소동물 vis-OCT 시스템 이미징의 개략도; (B) 시야의 네 모서리에 배치된 시신경두와 동일한 눈에서 획득한 4개의 이미지의 정렬; (C) 망막 박리(왼쪽), 방향이 추적된 평면 장착 망막(가운데), 컨포칼 현미경으로 이미징된 망막(오른쪽)의 개략도; (D) vis-OCT 섬유 및 컨포칼 현미경 RGC 축삭 번들 이미지(상단 패널) 및 혈관 면역염색의 생체 외 컨포칼 현미경 이미지(하단 패널)와 in vivo En-Face를 비교합니다. 네 개의 이미지는 같은 눈에서 찍은 것입니다. 노란색 눈금 막대 = 100μm. 패널 D의 숫자(1-11)는 각각 혈관을 나타냅니다. 약어: ONH = 시신경두; vis-OCTF = 가시광선 광간섭 단층 촬영 섬유학; 망막 신경절 세포(RGC = retinal ganglion cell); S = 우수; I = 열등; T = 시간적; N = 비강. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 이미지 분석을 위한 MATLAB 코드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에는 주의가 필요한 두 단계가 있습니다. 첫째, 동물이 깊은 마취 상태인지 확인하고 vis-OCT 영상 전에 눈이 완전히 확장되었는지 확인해야 합니다. 마우스가 적절하게 마취되지 않으면 빠른 호흡으로 인해 얼굴 이미지의 불안정한 움직임이 발생할 수 있으며, 이는 파이버그램의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 불충분한 팽창은 홍채가 빛을 차단하여 망막에 도달하는 것을 방해할 수 있기 때문에 이미지 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 왼쪽 또는 오른쪽 눈과 눈의 측두엽을 관류 후 쥐의 안와에서 안구를 제거하기 전에 표시하는 것이 중요합니다. 편평하게 장착된 망막은 표층에서 RNFL과 함께 위쪽을 향하고 있기 때문에 측두면을 표시하면 편평하게 장착된 망막의 올바른 방향이 가능합니다.
장점 중 하나는 전안이 광학 이미징을 위해 깨끗하다면 망막 허혈 및 당뇨병성 망막병증과 같은 안과 질환의 다양한 마우스 모델에 프로토콜을 적용할 수 있다는 것입니다. 그러나 이 방법의 한 가지 한계는 면역염색 및 공초점 이미징을 위해 망막이 적절하게 고정되더라도 축삭돌기 다발 형태가 변할 수 있다는 것입니다. 이것은 망막 절제 중 오작동으로 인해 발생하며, 축삭 다발에 파열을 일으킬 수 있습니다. 또한 망막은 in vivo 이미징 시 곡선형 그릇 모양의 구조이지만 컨포칼 이미징을 위해 슬라이드에서 평평해집니다. 결과적으로, 말초 망막의 in vivo vis-OCT 이미지와 ex vivo 컨포칼 이미지 사이에 불완전한 중첩이 있을 수 있습니다.
문제 해결: 이 기술에는 주로 두 부분이 포함됩니다. 첫째, vis-OCT 부분의 경우 마우스 눈의 품질이 투명 섬유그램 획득의 성공에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 쥐의 눈을 촉촉하고 밝게 유지하기 위해 지속적으로 인공 눈물을 도포했습니다. 마우스의 몸 위치도 미세 조정되어 레이저가 망막에 가능한 한 수직으로 빛나도록 했습니다. 이러한 조치들이 함께 이미지 품질을 보장했습니다. 둘째, 망막 박리 부분의 경우, 망막을 둘러싼 공막을 뜯어내는 것이 아니라 잘라내는 것이 ONH 구조의 무결성을 유지하는 데 중요하다는 것을 발견했습니다. 공막이 겸자로 찢어졌을 때, ONH는 컨포칼 현미경 검사에서 망막 조직이 중앙에서 사라진 적당한 크기의 어두운 구멍으로 나타났습니다. 완전한 ONH 구조를 유지하는 것은 in vivo 및 ex vivo 정렬에 필수적입니다.
요약하면, 우리는 생체 내 단일 축삭 번들 수준에서 변화를 직접 정량화하고 추적하기 위해 vis-OCTF를 확립했습니다 11,12,13. 이 프로토콜은 동일한 망막의 in vivo vis-OCTF 및 ex vivo 컨포칼 이미징을 정렬하기 위한 지침을 제공합니다. 이러한 연구는 인간의 신경 손상에 대한 객관적인 평가를 확립하기 위한 토대를 마련하여 향후 녹내장 진단 및 치료를 크게 개선할 수 있습니다.
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Disclosures
Chang, S., 없음; Xu, W., 없음; 팬, W., 없음; McDaniel, J.A., 없음; D.A. 밀러, 없음; M. 그라노니코, 없음; M. 리우, 없음; X. 리우, 없음; H.F. Zhang 은 Opticent Health에 재정적 이해관계를 가지고 있으며, Opticent Health는 이 작업을 지원하지 않았습니다.
Acknowledgments
이 연구는 녹내장 연구 재단 Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 및 Knights Templar Eye Foundation의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
References
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