Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering af monocytafledte dendritiske celler med forskellige sialylerede fænotyper

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65525
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 4,5, 6, 1,2,7
1Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology, Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark, Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa

Summary

En unik, omfattende protokol til generering af de-sialylerede humane monocytafledte dendritiske celler (mo-DC'er) fra isolerede mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) ved hjælp af en sialiidasebehandling præsenteres. Endvidere beskrives metoder til vurdering af fænotypisk og funktionel karakterisering af mo-DC'er og evaluering af, hvordan sialiidasebehandling forbedrer modningsniveauet for mo-DC'er.

Abstract

Sialinsyrer er negativt ladede monosaccharider, der typisk findes ved terminalerne af celleoverfladeglykaner. På grund af deres hydrofilicitet og biofysiske egenskaber er de involveret i adskillige biologiske processer, såsom modulering af immunresponset, genkendelse af selv- og ikke-selvantigener, kulhydrat-proteininteraktioner osv. Det cellulære indhold af sialinsyre reguleres af sialidase, som katalyserer fjernelsen af sialinsyrerester. Flere undersøgelser har vist, at sialo-glycaner er afgørende for overvågning af immunovervågning ved at engagere sig med cis - og transhæmmende Siglec-receptorer på immunceller. På samme måde er glykoimmune kontrolpunkter i kræft ved at blive afgørende mål for udvikling af immunterapier. Derudover er dendritiske celler (DC'er) tænkt som en vigtig komponent i immunterapier, især inden for kræftforskning, på grund af deres unikke rolle som professionelle antigenpræsenterende celler (APC) og deres evne til at udløse adaptive immunresponser og generere immunologisk hukommelse. Ikke desto mindre er DC'ernes funktion afhængig af deres fulde modning. Umodne DC'er har en modsat funktion til modne DC'er og et højt sialinsyreindhold, hvilket yderligere dæmper deres modningsniveau. Dette nedregulerer umodne DC'ers evne til at aktivere T-celler, hvilket fører til et kompromitteret immunrespons. Følgelig inducerer fjernelse af sialinsyre fra celleoverfladen af humane DC'er deres modning, hvilket øger ekspressionen af MHC-molekyler og antigenpræsentation. Derudover kan det genoprette ekspressionen af co-stimulerende molekyler og IL-12, hvilket resulterer i, at DC'er har en højere evne til at polarisere T-celler mod en Th1-fænotype og specifikt aktivere cytotoksiske T-celler til at dræbe tumorceller. Derfor er sialinsyre opstået som en nøglemodulator af DC'er og bruges som et nyt mål for at fremme deres terapeutiske anvendelse. Denne undersøgelse giver en unik tilgang til behandling af in vitro monocytafledte DC'er med sialidase, der sigter mod at generere DC-populationer med forskellige sialinsyrefænotyper på celleoverfladen og skræddersyede modnings- og co-stimulerende profiler.

Introduction

Sialsyrebærende glycaner (sialoglycaner) har fået betydelig interesse på grund af deres immunmodulerende rolle. Monosaccharidet sialinsyre, som er mest udbredt hos mennesker i form af N-acetylneuraminsyre, præsenterer grundlæggende ligander for lektiner med en anerkendt rolle i immunologi, såsom Selectins og Siglecs. Disse lektiner genkender sialoglycaner enten på samme celle (cis) eller på forskellige celler (trans) og spiller en væsentlig rolle i værtspatogeninteraktioner og forskellige fysiologiske og patologiske cellulære aktiviteter 1,2,3. Da sialinsyre desuden indtager de terminale positioner af celleoverfladeglycokonjugater, kan den skjule de underliggende strukturer og dermed hæmme celle-til-celle-kontakt via ikke-specifikke frastødende virkninger eller ved at hindre detektion af andre lektiner4. Aktiviteten af en række sialyltransferaser (der overfører sialinsyrer) og af sialidaser (der spalter sialinsyrebindinger) i cellen bestemmer mængden af sialinsyre, der er til stede på overfladen. Desuden kan opløselige sialyltransferaser og sialidaser udtrykt af værten eller patogenerne ekstrinsisk ændre mængden af sialinsyre på celleoverfladen 5,6.

Afvigende sialylering er et træk ved flere patologiske tilstande. I autoimmune sygdomme kan hyposialylering bidrage til uhæmmet immunaktivering og organskader, da sialinsyre hjælper med at diskriminere selvantigener og regulere inflammatoriske reaktioner7. Omvendt resulterer hypersialylering i overekspression af sialoglycaner, såsom sialyl-Tn, sialyl-Lewis-antigener, polysialinsyre og gangliosider, hvilket udgør et kendetegn for nogle kræftformer 8,9. Hypersialylering afhænger også af øget ekspression af specifikke enzymer såsom N-acetylglucosaminyltransferase (GNT-V), som genererer hypersialylerede tri- og / eller tetra-antenner N-bundne glycaner, som har været forbundet med kræftvækst og metastase10. Indholdet af sialinsyre regulerer også proteinstabilitet og -funktion, som er afgørende for relevante onkogene aktørers rolle11. Derfor kan øget sialylering lette tumorudvikling, metastase, lægemiddelresistens og immununddragelse. Desuden gør opreguleringen af sialoglycaner det muligt for tumorer at interagere med hæmmende Siglec-receptorer på immunceller og undgå immunovervågning. Af den grund anses sialoglycaner nu for at være glykoimmune kontrolpunkter og attraktive terapeutiske mål. For eksempel er hæmmere af Siglec-immunaksen allerede i tidlige kliniske forsøg, da immuncellereceptoren Siglec (sialsyrebindende ImmunoGlobulin-lignende LECtin) spiller en immunhæmmende rolle12.

Enzymer er blevet brugt til at modulere glykanprofilen som værktøjer til undersøgelse eller til terapeutiske strategier13,14. Sialidase er blevet anvendt til at ændre kræftcellemalignitet, da sialylerede glycaner såsom sialyl Lewis X er kritiske for cellemigration og kræftmetastase15. Samtidig har sialidasehæmmere, som hæmmer sialinsyrespaltning, nået klinikker til behandling af sialinsyreafhængige virusinfektioner16. For nylig har sialinsyremodulation fået yderligere interesse på grund af sialinsyrers kritiske rolle som ligander i Siglec-immunaksen, hvilket betyder, at de tilbyder nye midler til at reducere kræftflugt fra immunresponser. Denne interesse blev yderligere styrket af nobelpristageren Bertozzi i 2022 og hendes teams bidrag fra flere strategier, der selektivt spalter forskellige sialoglycaner og forbedrer immunresponsermod kræft 17. Således repræsenterer sialidase-baserede strategier en lovende modalitet for glykoimmun checkpoint-terapi. Glykofænotypen af celler i immunsystemet er afhængig af celletypen og deres aktiveringsstatus. Med hensyn til T-celler har glycaner en nøglerolle i de patofysiologiske trin i T-celleudvikling og thymocytudvælgelse, T-celleaktivitet, differentiering og proliferation18. For eksempel påvirker polylactosamin på glycoproteiner basale niveauer af B-lymfocytter og T-lymfocytter og makrofagaktivering19. I makrofager har forskellige glykanekspressionsmønstre en vigtig rolle i makrofagrekruttering til tumormikromiljøet (TME)20. Derfor kan ekspressionen af O-bundne og N-bundne glycaner af immunceller anvendes som potentielle glycobiomarkører for terapeutiske tilgange til behandling af kræft og autoimmune sygdomme.

Dendritiske celler (DC'er) er specifikke antigenpræsenterende celler med en unik kapacitet til at udløse immunresponser, såsom anticancerimmunitet21. DC'er skal gennemgå en opregulering af deres antigenpræsenterende MHC-molekyler for at præsentere antigener til T-celler (signal 1), co-stimulerende molekyler for at aktivere T-celler (signal 2) og proinflammatoriske cytokiner, såsom IL-12, for at udløse type 1-hjælper T-celleproliferation (signal 3)22. Den resulterende immunprofil er stramt reguleret, og kontrolpunkter er afgørende for at forhindre sunde celler i at blive angrebet. Da DC'er kan stimulere forskellige immunresponser mod tumorceller, bruges de som cellebaserede vacciner, og et betydeligt antal kliniske undersøgelser har vist deres potentielle fordele23,24. Efter FDA godkendte den første DC-baserede vaccine i 201025,26, er mange andre DC-baserede vacciner blevet udviklet. DC-baserede vacciner produceres hovedsageligt ex vivo og administreres til patienter for at fremkalde immunresponser mod tumorer. Imidlertid er utilstrækkelig eller kortvarig modning i øjeblikket en af de faktorer, der begrænser den kliniske effekt af DC'er og betyder, at dyre cytokincocktails skal anvendes. Uden tilstrækkelig modning kan DC'er ikke aktivere T-celler under kliniske omstændigheder. I stedet udtrykker DC'erne immunkontrolpunkter og udløser et tolerogent immunrespons, der forhindrer cytotoksiske T-celler i at virke mod tumorceller.

Humane DC'er har stærkt sialylerede overflader, og denne sialylering falder ved modning og under et samlet immunrespons27. Modningen af DC'er kan induceres ved at eliminere disse sialinsyrer med sialidase. Desilaylering opregulerer i høj grad forskellige cytokiner, herunder IL-12, på grund af translokationen af NF-kB-transkriptionsfaktoren til kernen 6,28. Derudover forbedrer desialylering antigenkrydspræsentation gennem MHC-I og antitumorimmunrespons29,30. Følgelig genererer knockout af sialyltransferaserne ST3Gal.l og ST6Gal.l, som har en vigtig rolle i DC-sialylering, en mere moden fænotype i murine DC'er31.

Sialidasebehandling giver en metode til stimulering af alle aspekter af DC-modning, herunder øget antigenpræsentation, øget ekspression af co-stimulerende molekyler og øget cytokinproduktion, for at løse de ovennævnte mangler og gøre det muligt for DC'er at fremkalde effektive reaktioner. Denne artikel præsenterer en procedure til opnåelse af levedygtige desialylerede humane DC'er ved anvendelse af en bakteriel sialidase. De-sialylerede DC'er viser en forbedret modningsprofil og kan bruges som cellemodeller til at øge antitumorimmunresponser in vitro. DC'erne opnås fra blodmonocytter, som derefter differentieres in vitro i nærvær af cytokininterleukin-4 (IL-4) og granulocytmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF). Dette arbejde beskriver også lektinbaserede metoder til analyse af sialinsyre ved celleoverfladen og metoder til immunofænotype DC-modningsniveauet. Proceduren beskrevet her kan bruges til at desialylate andre celletyper og dermed give en tilgang til at undersøge rollen som sialoglycaner, som er vitale glykoimmune kontrolpunkter og relevante i immunmodulering.

Protocol

Celler blev isoleret fra buffy coats af raske anonyme bloddonorer, som var frivillige leveret af den nationale blodbank, Instituto Português do Sangue e da Transplantação (IPST), efter skriftligt og informeret donorsamtykke blev opnået (IMP.74.52.4). Anvendelsen af blod blev godkendt af den etiske komité (IPST 30072015) i henhold til direktiv 2004/23/EF om standarder for kvaliteten og sikkerheden ved donation, udtagning, testning, behandling, præservering, opbevaring og distribution af humane væv og celler (portugisisk lov 22/2007, 29. juni). IPST-biobanken indsamler og opbevarer blod i en specifik plastikopsamlingspose, der indeholder citratphosphatdextrose (CPD), en konserverende og antikoagulerende opløsning, for at opretholde blodets integritet indtil behandling. For at vurdere, om det biologiske materiale er egnet til manipulation, udføres en serologisk kontrol for Treponema pallidum, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV) og humant immundefektvirus (HIV), som alle skal være negative. Til denne undersøgelse blev buffy coaten leveret af IPST til undersøgelsesformål sammen med oplysninger om indsamlingsdato, serologiske resultater, blodtype og alder på donor32. Buffy frakken kan forblive ved stuetemperatur i maksimalt 1 dag.

1. Opnåelse af monocytafledte dendritiske celler

BEMÆRK: Det er vigtigt at nævne, at når humant perifert blod manipuleres, bør man overveje specifikke universelle sikkerhedsforanstaltninger og passende materialebortskaffelse. Før du starter, skal du bekræfte, at alle nødvendige reagenser og materialer er forberedt og klar til brug.

  1. Dyrkning af mononukleære celler i perifert blod
    1. Få adgang til den menneskelige buffy frakke.
      BEMÆRK: Buffy coat er et biprodukt afledt af blod indsamlet via leukaferese32, som er beriget i hvide blodlegemer gennem centrifugering. Alle trin blev udført i et vertikalt flowkammer biosikkerhedsskab (BSC).
    2. Åbn buffy coat-emballagen ved at skære det forseglede udløbsrør med en skalpel, og overfør indholdet til et 50 ml rør. Overfør 7 ml buffy coat-prøve pr. sterilt 15 ml konisk rør, og tilsæt 6 ml fosfatbufret saltopløsning (PBS) for at udføre en indledende vask. Dette indledende vasketrin er nødvendigt for at rense prøven for den betydelige mængde røde blodlegemer (RBC) og plasma, så prøven optimeres til gradientseparation med et densitetsgradientmedium (se materialetabellen).
    3. Centrifuger røret ved stuetemperatur i 10 minutter ved 1.100 x g i en centrifuge med en svingrotor og med bremsen slukket (se materialetabellen).
    4. Efter centrifugering opsamles leukocytsuspensionen (den hvide ring mellem plasmaet og RBC'erne) med en Pasteur-pipette og overføres til et nyt sterilt 15 ml konisk rør.
    5. Leukocytsuspensionen fyldes op til 10 ml med PBS for at hjælpe det næste separationstrin, og blandes ved forsigtigt pipettering op og ned.
    6. Forbered densitetsgradientmediet (densitet: 1,077 g / ml) opløsning: Anbring 3 ml densitetsgradientmedium i et nyt sterilt 15 ml konisk rør, og lad det varme op til stuetemperatur.
    7. Der tilsættes 5 ml af den fortyndede leukocytsuspension (fra trin 1.1.5) i det koniske rør indeholdende densitetsgradientmediet (5:3) for at udføre densitetsgradientseparation. Tilsæt prøven langsomt, dråbe for dråbe, ved hjælp af rørvæggene for at undgå at forstyrre densitetsgradientmediet.
    8. Gradientseparation: Centrifuger densitetsgradientmediumopslæmningen ved stuetemperatur i 30 minutter ved 1.100 x g i en centrifuge med en svingrotor og med bremsen slukket.
    9. Efter centrifugering fjernes forsigtigt de koniske rør fra centrifugen. Efter dette trin er en række veldefinerede lag synlige, herunder følgende, startende fra bunden: et rødt lag (RBC'er og granulocytter), densitetsgradientmedium, et tyndt blegt lag af mononukleære celler i perifert blod (PBMC) og plasma.
    10. Opsaml det tynde lag PBMC'er ved hjælp af en Pasteur-pipette, og undgå at optage densitetsgradientmediet under eller for meget plasma over. PBMC-prøven anbringes i et nyt 50 ml konisk rør, fyldes op til 25 ml med PBS, og prøven blandes forsigtigt med pipettering op og ned.
    11. Prøverne centrifugeres ved stuetemperatur i 10 minutter ved 600 x g (normal bremse) for at afvaske restceller og snavs, og supernatanten kasseres ved forsigtigt at vende glasset om.
      BEMÆRK: Hvis der er for meget forurening af røde blodlegemer, som kan observeres, når cellepillen eller buffy coaten ikke er helt adskilt eller fremstår rødlig, anbefales det at lyse de resterende RBC'er. I dette tilfælde tilsættes 5 ml RBC-lysebuffer (se materialetabellen), blandes grundigt og inkuberes i 5 min. PBS fyldes op til 40 ml, prøverne centrifugeres ved stuetemperatur i 10 minutter ved 900 x g (normal bremse), og supernatanten kasseres ved forsigtigt at vende glasset på hovedet.
    12. Fyld prøven op til 10 ml med PBS, og tag en alikvot for at tælle cellerne. For at fjerne blodpladerne centrifugeres ved stuetemperatur i 5 minutter ved 400 x g (normal bremse), og supernatanten kasseres ved forsigtigt at vende glasset på hovedet.
      BEMÆRK: Hvis der er et betydeligt antal blodplader, centrifugeres ved stuetemperatur i 10 minutter ved 200 x g (normal bremse) to gange. Blodpladerne identificeres ved at visualisere prøven, mens cellerne tælles.
  2. Monocytisolering ved immunomagnetisk separation
    1. Forbered mikroperlebufferen ved at supplere PBS med 0,5% bovin serumalbumin (BSA) og 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Opløsningen steriliseres ved filtrering (0,2 μm), og bufferen opbevares nedkølet (2-8 °C).
    2. Udfør monocyt CD14+ isolering ved magnetisk aktiveret cellesortering (MACS).
      1. Efter celletælling ved hjælp af en automatiseret celletæller (trin 1.4.1) beregnes det passende volumen mikroperlebuffer og CD14 immunmagnetiske perler (se materialetabellen), der kræves. Sørg for, at disse løsninger holdes på is. Tilsæt 80 μL mikroperlerbuffer pr. 1 x 10 7 celler og 20 μL CD14-perler pr. 1 x 107 celler.
      2. Cellepellet resuspenderes i de tidligere bestemte mængder, og inkuberes i 15 minutter ved 4 °C (2-8 °C).
        BEMÆRK: Hvis verifikation af monocytniveauerne i PBMC-prøverne er nødvendig, udføres en flowcytometrisk analyse ved hjælp af farvningsantistoffer (f.eks. CD14 [Monoklonal TÜK4]). Følg trin 3.2 for at få oplysninger om den cytometriske flowanalyse.
      3. Der tilsættes 1-2 ml mikroperlebuffer pr. 1 x 107 celler, centrifugeres ved stuetemperatur i 10 minutter ved 600 x g (normal bremse) for at fjerne ubundne perler, og supernatanten kasseres ved forsigtigt at vende røret på hovedet.
      4. Forbered LS-kolonnen. LS-søjlerne indeholder ferromagnetiske kugler, der, når de placeres på en magnet, tillader positiv, blid tilbageholdelse af magnetisk mærkede celler33. Umiddelbart før brug placeres en LS-kolonne (se materialetabellen) på magneten, skylles med 3 ml mikroperlebuffer uden fuldstændig tørring, og fortsæt straks til næste trin.
        BEMÆRK: Lad aldrig søjlen tørre ud under proceduren for at undgå at kompromittere udbyttet.
      5. Resuspender cellepillen i 500 μL mikroperlebuffer pr. 1 x 108 celler. Hvis celletallet er højere end 4 x 108, skal du bruge en 40 μm cellesi for at forhindre celleaggregering.
      6. Tilsæt cellesuspensionen til kolonneindgangen, anbring et 15 ml konisk rør under kolonneudløbet for at opsamle den negative cellefraktion, og vask kolonnen tre gange med 3 ml mikroperlebuffer. Den negative fraktion omfatter de celler, der ikke blev indsamlet med CD14-perlerne (dvs. CD14-cellerne ).
      7. Efter den sidste vask fjernes kolonnen fra magneten, placeres på et sterilt 15 ml konisk rør, pipette 5 ml mikroperlebuffer i søjleindløbet, og sprøjtens stempel indsættes straks i kolonneindtaget og skubbes for at dispensere målcellerne.
      8. De magnetisk mærkede celler (CD14+ -celler) indsamles, og der tages en prøve for at tælle cellerne som beskrevet i trin 1.4.1.
      9. Begge cellefraktioner, CD14− og CD14+ celler, centrifugeres ved stuetemperatur i 10 minutter ved 600 x g (normal bremse). Supernatanten kasseres, CD14+-fraktionen bevares i de næste trin, og CD14-fraktionen opbevares om nødvendigt til fremtidige assays, f.eks. co-kulturanalyser. Om nødvendigt kan cellerne fra CD14-fraktionen kryopræserveres i RPMI-1640 20% FBS og 10% DMSO ved -80 °C.
  3. Monocytdifferentiering i dendritiske celler
    1. Forbered komplet RPMI-1640-medium ved at supplere RPMI-1640-basemediet (indeholdende 11,1 mM glucose) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% 2 mM L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 1% natriumpyruvat og 1% 100 μg / ml penicillin / streptomycin (se materialetabellen).
    2. Udfør monocytdifferentiering i mo-DC'er, som forekommer over ~ 5-6 dage.
      1. Beregn det nødvendige medievolumen for antallet af opnåede CD14+ celler, og plade cellerne i henhold til følgende eksperimentopsætning.
        BEMÆRK: I denne protokol blev cellerne belagt i en koncentration på 1,3 x 106 celler / ml for at tage højde for celledød og målefejl, og mediet blev fremstillet ved at tilsætte 1.000 U / ml GM-CSF og 750 U / ml IL-4 (se materialetabellen) i et komplet medium og blande det grundigt.
      2. Tilsæt den passende mængde medium til CD14+ -cellerne, og genophæng ved pipettering op og ned med en Pasteur-pipette. Cellesuspensionen plades i plader med 24 huller (pr. hul: 1,3 x 106 celler/ml), og inkuberes i en dyrkningsinkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
      3. Skift dyrkningsmediet, og suppler det med friske cytokiner hver 2-3 dage (normalt en gang pr. Differentieringsproces). For at udføre dette skal du forsigtigt fjerne halvdelen af kulturmediet uden at forstyrre cellerne. Der tilsættes den samme mængde frisk substrat med den passende koncentration af cytokiner som beskrevet tidligere i noten til trin 1.3.2.1, og der inkuberes i den resterende differentieringsperiode.
        BEMÆRK: DC'er, når de adskiller sig fra monocytter, er løst klæbende celler. Fuldt differentierede umodne mo-DC'er er spindelformede, fritflydende og løst klæbende celler. Cellerne kan også danne rosetter, især når de er modne34.
      4. For at opsamle cellerne efter differentiering skal du bruge en mikropipette til at overføre hele cellesuspensionen til et sterilt konisk rør og vaske pladens brønde to gange med PBS og banke forsigtigt på bunden (figur 1A).
        BEMÆRK: Undgå at samle de stærkt klæbende celler, da disse sandsynligvis er makrofager. For at undgå forkert cellemodning eller aktivering skal du sørge for, at cellerne håndteres med ekstrem omhu.
      5. Centrifuger cellerne ved stuetemperatur i 10 minutter ved 180 x g (normal bremse) for at fjerne eventuelle rester eller døde celler, og resuspender dem i det relevante medium/buffer til forsøgsopstillingen.
    3. Udfør modningen af mo-DC'er.
      1. Hvis modning af mo-DC'er er påkrævet, skal du bruge en brøndplade eller kolbe under hensyntagen til det cellekoncentrationseksempel, der tidligere blev brugt (1,3 x 10 6 celler / ml), og administrere en cytokincocktail ved at supplere mediet med en cytokincocktail bestående af IL-1β (10 ng / ml),IL-6 (1.000 U / ml), prostaglandin E2 (PGE2; 1 μg / ml), og tumornekrosefaktor-α (TNF-α; 10 ng / ml) (se materialetabellen). Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer eller 48 timer.
  4. Celletælling og levedygtighed
    1. Udfør celletælling og trypanblå farvning.
      1. For at bestemme antallet af celler og levedygtigheden af en cellesuspension udtages en prøve på 10 μL fra cellesuspensionen og blandes med 10 μL trypanblåt (1:1 fortynding).
      2. Tag 10 μL af den forrige blanding, og brug den automatiske celletæller til at tælle antallet af celler i henhold til producentens anvisninger.
        BEMÆRK: Hvis koncentrationen af celler er for høj, fortyndes prøven, og efter celletællingen skal du overveje fortyndingsfaktoren i beregningerne.
      3. Juster cellenummeret og mediet/bufferen til den eksperimentelle opsætning.
    2. Bestem cellelevedygtigheden og apoptose30.
      BEMÆRK: I dette arbejde blev levedygtighedsanalysen udført efter sialiidasebehandlingen (afsnit 2).
      1. Plet mo-DC'erne med 5 μg / ml 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og annexin V, og bestem apoptose i henhold til producentens anvisninger (se materialetabellen).
      2. Analyser resultaterne ved hjælp af flowcytometri29,30.

2. Behandling af cellerne med sialidase

BEMÆRK: Efter differentieringen i mo-DC'er er cellerne på den sjette dag klar til sialiidase-behandlingsanalysen.

  1. I betragtning af den ønskede eksperimentelle opsætning skal du indsamle ~ 10 x 10 6 mo-DC'er fra 10 brønde af 24-brøndpladerne med 1,3 x 106 celler / brønd og overføre dem til et nyt sterilt 15 ml konisk rør.
    BEMÆRK: Antag noget celletab; På dette stadium er den fundne koncentration typisk 1,3 x 106 celler / ml, fordi mo-DC'erne og deres forstadier ikke formerer sig og oplever 20% levedygtighedstab under differentiering i mo-DC'er.
  2. Der centrifugeres ved stuetemperatur i 5-7 minutter ved 300 x g (normal bremse), og supernatanten kasseres for at fjerne døde celler og snavs.
  3. Der tilsættes 10 ml RPMI-1640-medium (indeholdende 11,1 mM glucose), centrifugeres ved stuetemperatur i 4 minutter ved 300 x g (normal bremse), supernatanten kasseres, der tilsættes 2 ml RPMI-1640, og der blandes grundigt.
  4. Placer 1 ml celler i RPMI-1640 i nye sterile mikrorør, #1 og #2; Hvert mikrorør indeholder ca. 5 x 106 celler.
  5. Til mikrorør #1 tilsættes 500 mU sialidase fra Clostridium perfringens (se materialetabellen). Til mikrorør #2 skal du tilføje mock-behandlet sialidase, som er en negativ kontrol, for at bekræfte, om de observerede virkninger er direkte relateret til fjernelse af sialinsyre og ikke skyldes artefakter. Den mock-behandlede sialidase er varmeinaktiveret sialidase, som opnås ved kogning af enzymet i 20 minutter ved 100 °C.
  6. Der inkuberes i 60 minutter ved 37 °C.
  7. Efter inkubation placeres cellerne i nye sterile 15 ml koniske rør med samme nummerering, #1 og #2. Tilsæt ca. 4 ml komplet RPMI-1640-medium (indeholdende 10% FBS) til begge rør for at stoppe den enzymatiske reaktion.
  8. Der centrifugeres ved stuetemperatur i 4 minutter ved 300 x g (normal bremse), og supernatanten kasseres.
  9. Tilsæt 5 ml komplet RPMI-1640-medium til hvert rør, og plade 1 ml celler pr. Brønd.

3. Bestemmelse af sialinsyreprofilen

  1. Lectin farvning
    1. Opsaml og vask cellerne ved stuetemperatur i 5 min ved 300 x g (normal bremse).
    2. Resuspender cellerne i RPMI-1640 + 10% FBS, og fordel cellerne (100.000/100 μL) i mikrorørene.
    3. Udfør farvning for flowcytometri i RPMI-1640 med 10% FBS ved anvendelse af en koncentration på 0,01 mg / ml for hver lektin: Sambucus nigra (SNA) lectin, peanut agglutinin (PNA) lectin og Maackia amurensis (MAA) lectin (se materialetabellen). Der inkuberes i 30 minutter ved 4 °C.
    4. Cellerne vaskes med 1 ml PBS indeholdende 10 % FBS eller 10 % BSA, og centrifugeres ved stuetemperatur i 4 minutter ved 300 x g (normal bremse).
    5. Til cellerne farvet med de biotinylerede lektiner tilsættes 0,0005 mg / ml streptavidin-PE (se materialetabellen) og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Cellerne vaskes med 1 ml PBS, og centrifugeres ved stuetemperatur i 4 minutter ved 300 x g (normal bremse).
    6. Supernatanten kasseres, og til hvert glas tilsættes 300 μL 2% paraformaldehyd (PFA 2%). Beskyt rørene mod lys, og opbevar om nødvendigt ved 4 °C indtil dataindsamling.
    7. Hent dataene ved hjælp af et flowcytometer inden for 1 uge efter prøveforberedelse 29,30.
  2. Flow cytometri
    1. Resuspender cellerne i 1 ml PBS, og erhverver prøven med et flowcytometer til øjeblikkelig dataindsamling.
    2. Ved forsinket dataindsamling resuspenderes i 300 μL 2% PFA, og dataene indsamles inden for 1 uge.
  3. Konfokal laserscanningsmikroskopi
    1. Pladerne på polylysinbelagte glasdæksler med en diameter på 12 mm og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Centrifuger dækslerne ved stuetemperatur i 1 min ved 100 x g (normal bremse) for at fremme celleadhæsion.
    3. Fastgør ved stuetemperatur i 30 min med 4% PFA før vask med 1% BSA i PBS.
    4. Brug FITC-konjugeret SNA-lektin (0,01 mg/ml) til at plette α2,6-bundne sialinsyrer på celleoverfladerne (se materialetabellen).
    5. Få billeder på et konfokalmikroskop (se materialetabellen).
    6. Efter Z-stack-behandling skal du vælge repræsentative konfokale tværsnitsbilleder.
    7. Analytisk kvantificere farvningsintensiteten ved hjælp af den korrigerede total cellefluorescens (CTCF).
      BEMÆRK: CTCF = Integreret massefylde − (Areal af valgt celle × Gennemsnitlig fluorescens af baggrundsaflæsninger)29.

4. Modningsprofilering af mo-DC'er

  1. Antistoffarvning og flowcytometri
    1. Saml en ny prøve af cellerne af interesse for at udføre antistoffarvning. Cellerne vaskes ved stuetemperatur i 5 minutter ved 300 x g (normal bremse), og cellerne fordeles i mikrorørene (100.000 celler pr. rør).
    2. Udfør farvning til flowcytometri ved hjælp af de ønskede antistoffer (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 og CD86 (se materialetabellen).
    3. Den fluorescenskonjugerede ab inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    4. Cellerne vaskes med 1 ml PBS, og centrifugeres ved stuetemperatur i 5 minutter ved 300 x g (normal bremse).
      BEMÆRK: Hvis du bruger umærket ab, tilsættes fluorescerende konjugeret sekundær ab og inkuberes i mørke i 15 minutter i henhold til producentens anvisninger. Cellerne vaskes med 1 ml PBS, og centrifugeres ved stuetemperatur i 5 minutter ved 300 x g (normal bremse).
    5. Til alle mikrorørene tilsættes op til 100 μL PBS, cellerne resuspenderes i 300 μL 2% paraformaldehyd (PFA 2%), og rørene holdes i mørke ved 4 °C indtil dataindsamlingen.
    6. Hent dataene ved hjælp af et flowcytometer.
      BEMÆRK: Efter farvning og fiksering kan prøverne erhverves ved flowcytometri straks eller inden for en periode på 1 uge. I så fald opbevares glassene ved 4 °C i mørke.

5. Enzymbundet immunosorbentassay (ELISA)

BEMÆRK: I dette arbejde blev IFN-γ-produktionen målt ved hjælp af ELISA-analysen efter producentens anvisninger (se materialetabellen).

  1. Til belægning af pladen i en belægningsbuffer fortyndes indfangningsantistoffet (1:100, indfangningsantistof i PBS), 100 μL af denne arbejdsløsning overføres til hvert hul og inkuberes natten over ved stuetemperatur.
  2. Kassér indfangningsantistoffet helt.
  3. Tilsæt blokeringsbufferen (f.eks. PBS + 2% BSA + 0,05% Tween20), og inkuber i 1 time ved stuetemperatur, før blokeringsbufferen fjernes.
  4. Standarden og prøven tilsættes med den respektive blanding og fortyndinger, og der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Vask fem gange med vaskebuffer.
  5. Tilsæt det biotinylerede detektorantistof, og inkuber i 2 timer ved stuetemperatur efterfulgt af fem vaske.
  6. Der tilsættes poly-HRP-streptavidin-HS, og der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af fem vaske med vaskebuffer.
  7. Der tilsættes TMB-substrat (se materialetabellen), og inkuberes i op til 60 minutter ved stuetemperatur under hensyntagen til det anvendte testsystem. Vask fem gange med vaskebuffer.
  8. Aflæs prøverne på en mikropladelæser ved 450 nm.

Representative Results

Monocytisolering og monocytdifferentiering i mo-DC'er
I overensstemmelse med protokollen blev humane PBMC'er isoleret fra buffy-pelsen ved hjælp af densitetsgradientseparation med densitetsgradientmedium og grundigt vasket. Trypanblå blev anvendt til at foretage levedygtig celletælling på isolationsdagen som beskrevet tidligere i trin 1.4.1. Derefter blev CD14+ monocytisolering udført gennem positiv selektion. For at opnå dette blev PBMC'er inkuberet med magnetiske perler indeholdende et antistof, der genkender CD14-antigenet. De udvalgte CD14+ monocytter blev dyrket i et medium suppleret med GM-CSF og IL-4 i 5-6 dage27 for at differentiere til umodne mo-DC'er (figur 1A). Modningen af mo-DC'er kan opnås ved at anvende en cocktail af cytokiner, herunder IL-6, IL-1β, TNF-α og PGE235 (figur 1A).

Under differentieringsprocessen, som et resultat af IL-4 og GMCSF stimulering, forventes cellefænotypen at ændre sig. Data viser, at mo-DC'er mister ekspression af overflademarkør CD14, hovedsageligt udtrykt af monocytter (figur 1B), og får signifikant ekspression af CD1a, en markør udtrykt af humane DC'er36,37. mo-DC'er opnår også højere MHC-II (HLA-DR) ekspression, et antigenpræsenterende molekyle udtrykt af humane DC'er og andre antigenpræsenterende celler38 (figur 1B).

Indhold af sialinsyre på celleoverfladen
Behandlingen af mo-DC'er med sialidase reducerer sialinsyreindholdet på overfladen af mo-DC'er, hvilket kan bekræftes ved farvning med lektiner, som er proteiner, der er i stand til at binde til kulhydrater39. Da det anvendte enzym fjerner både α2,3 og α2,6-bundne sialinsyrer fra celleoverfladen, blev mo-DC'er farvet med PNA, som genkender T-antigen-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr, samt MAA- og SNA-lektiner, der binder til henholdsvis α2,3- og α2,6-sialsyre. Effektiviteten af sialiidasebehandlingen blev evalueret ved flowcytometri og ved konfokal mikroskopi (figur 2). Som vist i figur 2A reducerede sialiidasebehandling signifikant MAA- og SNA-bindingen, samtidig med at PNA-farvningen steg. Faldet i SNA-farvning efter sialiidasebehandling blev yderligere bekræftet ved konfokal mikroskopianalyse, der viste en signifikant reduceret SNA-farvning på celleoverfladen (figur 2B).

Funktionel karakterisering af sialidase-behandlede mo-DC'er
For at evaluere, hvordan sialiidasebehandling påvirker mo-DC-funktioner, blev modningsniveauet for mo-DC'er vurderet efter sialiidasebehandling. Som vist i figur 3A fører sialidasebehandlingen til en signifikant stigning i ekspressionen af de antigenpræsenterende molekyler MHC I og MHC II og ekspressionen af de co-stimulerende molekyler CD80 og CD86. For at vurdere effekten af fjernelse af sialinsyre på mo-DCs evne til at inducere T-celleresponser blev sialidasebehandlede mo-DC'er fyldt med tumorcellelysater anvendt til at prime autologe T-celler (figur 3). Dernæst blev profilen af de resulterende T-celler karakteriseret ud fra deres evne til at udskille Th1 cytokin IFN-γ. Som vist i figur 3B, sammenlignet med T-celler primet af fuldt sialylerede mo-DC'er, udskilte T-cellerne primet af sialidase-behandlede mo-DC'er signifikant højere niveauer af IFN-γ. Disse resultater tyder på, at sialidase-behandlede mo-DC'er har forbedret kapaciteten til at prime autologe T-celler.

Celle levedygtighed
Efter behandling med sialidase blev der udført en levedygtighedsanalyse for at sikre, at behandlingen ikke var cytotoksisk for cellerne. Efter behandling blev mo-DC'er farvet med 7-AAD og Annexin V for at detektere ikke-levedygtige og apoptotiske celler og analyseret ved flowcytometri (figur 4). Data viser ingen signifikant forskel i cellelevedygtighed mellem ubehandlede (figur 4, venstre panel) og sialidase-behandlede celler (figur 4, højre panel).

Figure 1
Figur 1: Differentiering af isolerede monocytter i mo-DC'er. (A) CD14+ monocytter blev isoleret fra buffy coats og dyrket i en koncentration på 1,3 x 106 celler/ml ved 37 °C. Monocytterne blev differentieret i medium suppleret med 750 E / ml IL-4 og 1.000 E / ml GM-CSF. Mikroskopisk analyse af morfologien af monocytter isoleret fra human buffy frakke på dag 0 (øverste billede). Umodne mo-DC'er; celler blev differentieret i en periode på 5 dage ved anvendelse af IL-4 og GM-CSF (midterste billede). Modne mo-DC'er blev opnået ved anvendelse af IL-6, IL-1β, TNF-α og PGE2 cytokiner i 24 timer (nederste billede). Skalastænger: 100 μm. (B) Cellerne blev analyseret på dag 0, dag 2 og dag 5 i hele differentieringsperioden ved hjælp af flowcytometri. Følgende antistoffer blev anvendt til at karakterisere celleoverflademarkører: (a-c) CD14; (d-f) CD1a og (g-i) HLA-DR (MHC klasse II). Figuren viser repræsentative histogrammer af mindst tre uafhængige assays. Panel (B) er blevet ændret fra Videira et al.40, patent WO2017002045A1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sialidasebehandling af humane mo-DC'er for at fjerne α2,6- og α2,3-bundne sialinsyrer fra celleoverfladen. (A) Analyse af mo-DC'er ved flowcytometri ved hjælp af lektinfarvning for at teste effekten af sialiidasebehandling. Humane mo-DC'er blev behandlet med sialidase (grå bjælker) eller efterladt ubehandlede (hvide bjælker) og farvet med SNA-lectin (genkendelse af [2,6]-sialinsyrer), MAA-lektin (genkendelse af [2,3]-sialinsyrer) og PNA-lectin (genkendelse af T-antigen-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr). Værdierne repræsenterer den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) for mindst tre uafhængige assays. Den statistiske signifikans blev bestemt ved hjælp af en tosidet parret t-test (*P < 0,05 eller ***P < 0,0001), der henviser til forskellen mellem de ubehandlede og sialidasebehandlede DC'er. Sialidasebehandling reducerede MAA-bindingen og øgede PNA-farvning i humane mo-DC'er som følge af fjernelse af α(2,3)-bundne sialinsyrer; fjernelse af α(2,6)-bundne sialinsyrer efter behandling med sialidase blev påvist ved et fald i SNA-farvning. B) Konfokal mikroskopi af mo-DC'er behandlet med sialidase og forberedt på dæksedler til observation. En række z-stack-billeder blev indsamlet fra forskellige celler og behandlet for at inkludere den gennemsnitlige farvningsintensitet. Skalastænger: 20 μm. Panel (A) er blevet ændret fra Silva et al.30; panel (B) er blevet ændret fra Silva et al.29. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Sialidasebehandling af mo-DC'er, der inducerer en højere ekspression af modningsmarkører. (A) mo-DC'er behandlet med sialidase viste en højere modningsfænotype end fuldt sialylerede mo-DC'er. Flowcytometri blev brugt til at evaluere ekspressionen af flere modningsmarkører. Mo-DC'erne blev behandlet med sialidase i 1 time ved 37 °C; grafværdierne repræsenterer den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) (gennemsnitlig ± SEM) for mindst tre uafhængige assays. Statistisk signifikante forskelle blev beregnet ved hjælp af en t-test (*P < 0,05, **P < 0,01), der henviser til forskellen mellem de ubehandlede og sialidase-behandlede tilstande. (B) Desialylerede humane mo-DC'er fyldt med hele tumorantigener inducerede specifikke T-celleresponser. Mo-DC'erne blev behandlet med sialidase i 1 time ved 37 °C eller efterladt ubehandlet, efterfulgt af belastning med MCF-7-lysater (TL) som kilde til heltumorcelleantigener. Co-kultur mellem mo-DC'er og autologe T-celler blev udført i 4-8 dage i nærvær af IL-2 (10 E / ml). T-celler primet med desialylerede mo-DC'er viste signifikant højere sekretion af Th1-cytokinet, IFN-γ. Efter T-cellestimulering med mo-DC'er blev cytokinerne, der blev udskilt i co-kultursupernatanterne, målt med ELISA (n = 7). Grafværdierne repræsenterer koncentrationen (pg/ml) (gennemsnitlig ± SEM). Statistisk signifikante forskelle blev beregnet ved hjælp af en t-test (*P < 0,05). Figuren er ændret fra Silva et al.30. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Sialiidasebehandlingens manglende indvirkning på levedygtigheden af humane mo-DC'er. Ubehandlede mo-DC'er (venstre panel) og sialidase-behandlede mo-DC'er (højre panel) blev udsat for dobbelt farvning med annexin V og 7-AAD, og farvningen blev analyseret ved flowcytometri. Dataene viste ingen signifikant forskel i cellelevedygtighed mellem de ubehandlede og sialidase-behandlede celler, hvilket tyder på, at mo-DC'er kan tolerere sialiidasebehandling og forblive levedygtige til at udøve deres immunologiske funktion. Figuren er ændret fra Silva et al.30. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Monocytisolering
Dette manuskript beskriver en protokol til generering af mo-DC'er fra humant isolerede monocytter CD14+ (figur 1A), efterfulgt af udførelse af en sialidasebehandling for at reducere sialinsyreindholdet på overfladen af disse celler.

Der er forskellige måder at opnå humane DC'er på, såsom direkte fra perifert blod eller væv eller gennem differentiering fra prækursorer såsom stamceller eller monocytter. Opnåelse af DC'er differentieret fra monocytter isoleret fra perifert blod er langt mere ligetil på grund af den lette opnåelse af store mængder monocytter sammenlignet med andre DC-kilder41. For at opnå en høj procentdel af isolerede monocytter skal alle protokoltrin følges nøje. For eksempel kan densitetsgradientmediet være giftigt for cellerne, og for at forhindre celledød skal man undgå langvarig cellekontakt med densitetsgradientmediet og vaske cellerne grundigt. Cellemanipulation skal udføres så hurtigt som muligt for at undgå tab af cellelevedygtighed. Fra PBMC'er kan monocytter isoleres gennem positiv selektion ved hjælp af MACS-metoden (magnetisk aktiveret cellesortering), som er en egnet teknologi til at give et stort antal monocytter. Derudover har mo-DC'er afledt af MACS-isolerede monocytter sammenlignet med andre monocytudvælgelsesmetoder en større evne til at stimulere antitumor-T-celleaktivitet42. I denne protokol blev monocytterne, når de var isoleret, inkuberet med IL-4 og GM-CSF i en periode på 5-6 dage for at opnå differentieringen i umodne mo-DC'er (figur 1). Resultaterne viste, at morfologisk (figur 1A) og fænotypisk (figur 1B) differentierede de isolerede monocytter sig i umodne mo-DC'er. Desuden mistede mo-DC'erne gennem differentieringen ekspressionen af CD14-markører og opnåede ekspressionen af CD1a og MHC-II (figur 1B), som er nødvendige for antigenpræsentation til T-celler.

Denne isolering og differentiering af monocytter i mo-DC'er er begrænsninger for denne protokol. Isolationsprocessen er et følsomt trin, der skal udføres omhyggeligt og hurtigt for at undgå celledød, og dette trin skal også udføres, hver gang mo-DC'er er nødvendige for et nyt eksperiment. Differentieringsprocessen tager 5-6 dage, hvilket giver et problem med hensyn til at anvende denne metode til analyser med høj kapacitet. Ikke desto mindre er isolationsmetoden og anvendelse af cytokiner til differentiering af mo-DC'er nyttige til generering af et stort antal funktionelle mo-DC'er in vitro til forsøgsformål. Mo-DC'erne, der genereres i denne protokol, er i stand til at gennemgå sialiidasebehandling, flowcytometri, ELISA, konfokalmikroskopi og så videre, hvilket understreger vigtigheden og anvendeligheden af denne metode30.

Umodne mo-DC'er og sialidasebehandling
Sialidaser er essentielle i sialyleringsregulering og er ansvarlige for at fjerne sialinsyrer fra celleoverfladeglykanerne. I mo-DC'er fører sialinsyrefjernelse af sialidase til modning af disse celler, hvilket øger antigen-krydspræsentation og efterfølgende T-celleaktivering og antitumoraktivitet30.

Umodne humane mo-DC'er viser et højt indhold af celleoverflade α(2,6)- og α(2,3)-bundne sialinsyrer27 sammenlignet med modne mo-DC'er 31,43. Desuden forbedrer fjernelse af sialinsyrer ved behandling af mo-DC'er med sialidase modningen af DC'erne 28,30,31. Den sialidase, der blev udvalgt til dette eksperiment, var fra bakterien Clostridium perfringens. Alligevel producerer andre organismer også sialidaser, såsom bakterierne Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae eller Salmonella typhimurium44, iglen Macrobdella decora45 og endda Homo sapiens46, og sialidaser fra disse organismer anvendes også eksperimentelt. Hver sialidase har imidlertid forskellige substratspecificiteter. Derudover kan brug af sialiidaseenzymet have sine begrænsninger; for eksempel kan manipulation af mo-DC'er under behandlingen yderligere stimulere disse celler. Desuden skal mængden af sialidase og inkubationstiderne optimeres ud fra den type celler, der anvendes, og deres sialinsyresammensætning. Fjernelse af sialinsyre er ikke en permanent effekt, men snarere et forbigående fænomen, fordi cellen vil genoprette sit celleoverfladeindhold af sialinsyre. Udover sialidase er der andre metoder til at reducere sialinsyremolekylerne på overfladen af celler, såsom anvendelse af sialyltransferasehæmmere, genudslag af sialyltransferasegener eller metabolisk blokade af sialinsyre ved hjælp af sialinsyreefterligning47,48,49. Ikke desto mindre kan disse metoder have forskellige virkninger på celler, og udover desialylering skal cellens levedygtighed overvejes. Sialiidaseenzymbehandlingen er en praktisk metode til effektivt og forbigående at fjerne sialinsyrer på celleoverfladen, samtidig med at cellens levedygtighed opretholdes.

I dette arbejde blev sialidase tilsat til de umodne mo-DC'er i en koncentration på 500 mU/5 x 106 celler/ml, og cellerne blev inkuberet ved 37 °C i 60 minutter. Behandlingen blev udført under anvendelse af RPMI-1640 uden serum for at bevare cellelevedygtigheden og undgå enhver interaktion mellem de sialylerede molekyler, der er til stede i serum30. Behandling med Sialidase kan udføres med andre buffere end RPMI, såsom 50 mM natriumacetat, pH 5,1 (i tilfælde af C. perfingens sialidase) eller PBS50,51,52. Ikke desto mindre er RPMI-1640 det mest almindelige dyrkningsmedium for DC'er, da det opretholder konstante eksperimentelle betingelser under proceduren, undgår at inducere modning og reducerer enhver stress, der kan være forårsaget af sialiidasebuffere eller PBS53,54,55,56. Efter inkubation med sialidase er det afgørende at vaske cellerne grundigt med et serumsuppleret medium for at garantere, at enzymreaktionen er stoppet. Tilstedeværelsen af sialylerede molekyler i serumet vil konkurrere som substrater for sialidase, hvilket sikrer et hurtigt reaktionsstop.

Karakterisering af overflademarkør ved flowcytometri og konfokal mikroskopi
Til bestemmelse af sialinsyreprofilen anvendte vi i protokolafsnit 3 lektinfarvning efterfulgt af flowcytometri og konfokal laserscanningsmikroskopi. Til cellefarvningsproceduren blev lektinkoncentrationerne og inkubationsbetingelserne i begge tilfælde optimeret for at undgå celleagglutination og død. Det er afgørende at udføre inkubationen ved 4 °C i buffere, der indeholder mindst 2% af enten FBS eller BSA for at undgå ikke-specifik binding af lektinerne. I denne protokol blev RPMI-1640 indeholdende 10% FBS anvendt til at opretholde konstante eksperimentelle betingelser og undgå cellestress. Med hensyn til konfokal mikroskopi er fiksering af cellerne før farvning afgørende for at bevare morfologien, forhindre autolyse og opretholde antigenicitet.

Analysen af mo-DC-fænotypen ved flowcytometri viste, at sialidase-behandlede mo-DC'er havde en signifikant højere mængde PNA-lektin bundet til celleoverfladen sammenlignet med MMA- og SNA-lektiner, som faldt efter sialiidasebehandlingen (figur 2A). Som forventet steg PNA-farvningen, da PNA genkender ikke-sialylerede antigener i modsætning til MAA og SNA, som binder direkte til henholdsvis α2,3- og α2,6-sialinsyrer. Denne farvning bekræfter den effektive fjernelse af sialinsyrer fra celleoverfladen ved hjælp af denne protokol. En anden metode, der kan bruges til at validere behandlingen og analysere celleoverfladens sialinsyreindhold, er lektinfarvning efterfulgt af konfokal mikroskopi, som eksemplificeret i figur 2B.

Udover de tidligere eksempler findes der alternative tilgange til at evaluere og karakterisere sialinsyreindholdet, såsom lectinsondering ved western blotting. Alternative sialinsyrespecifikke lektiner er også tilgængelige, såsom Siglecs, en gruppe lektiner, der har en tydelig præference for sialinsyretyper og bindinger57. Udover at bruge lektiner i begge teknikker (flowcytometri, mikroskopi eller western blot), er det også muligt at karakterisere sialinsyreindholdet ved hjælp af antistoffer; For eksempel kan α2,8-sialinsyrer vurderes ved hjælp af antistoffer såsom klon 735, som er specifik for polysialinsyre58. Derudover kan celler efter sialiidasebehandling funktionelt testes for deres biologiske eller terapeutiske effektivitet ved at evaluere deres fænotype og evne til at aktivere T-celler40. Faktisk, som vist i de givne eksempler, viste sialidasebehandlede mo-DC'er højere modningsfænotype såvel som en forhøjet ekspression af antigenpræsenterende og co-stimulerende molekyler.

Desuden kan sialidasebehandlede mo-DC'er fyldes med antigener og dyrkes sammen med T-celler eller andre celler og kan derefter undersøges med hensyn til fænotypen, cytokinsekretionsprofilen eller andre funktioner. I det angivne eksempel viser dataene, at sialidase-behandlede mo-DC'er kan fyldes med tumorantigener og derefter bruges til at aktivere T-celler. Faktisk viste de resulterende T-celler øget IFN-γ-sekretion, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter om effekten af sialinsyremangel på at øge mo-DC'ernes kapacitet til at aktivere T-celler 27,28,29,30,31.

Afslutningsvis viser denne protokol en gennemførlig, levedygtig og praktisk metode til at generere mo-DC'er til manipulation af sialinsyreindhold ved behandling med sialidase. Denne protokol præsenterer en metode, der kan tjene forskellige formål og applikationer. Denne metode kan ikke kun have en afgørende rolle i forståelsen af sialinsyrers rolle i modning og respons af immunceller, men kan også bruges som et immunmodulerende værktøj.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender finansiering fra Europa-Kommissionens GA 101079417 og EJPRD/0001/2020 EU 825575; Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, under tilskud FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) og LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. og Stemmatters blev også finansieret af Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) gennem Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) til SI I& DT DCMatters-projektet (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Vi anerkender Biolabs facilitet på FCT-NOVA og GLYCOVID NOVA Saude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube AstiK’s CTGP-E15-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
24-well plate Greiner Bio-one 662 160 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
50 mL conical tube AstiK’s CTGP-E50-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) BioLegend 420404 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Annexin V Immunotools 31490013 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific  Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
BSA Sigma - Aldrich A3294-100G Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile
CD14 (Monoclonal TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
CD80 Immunotools 21270803 Maturation Profiling of mo-DCs
CD86 Immunotools 21480863 Maturation Profiling of mo-DCs
Cell counting slides and trypan blue EVE EVS-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Centrifuge Eppendorf 5430 R Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Density gradient medium (Histopaque) Sigma - Aldrich 10771-100ML Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
EDTA Gibco, ThermoFisher 15400054 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Elisa kit (IFN-γ) Immunotools 31673539 Maturation Profiling of mo-DCs
EVE automated cell count NanoEntek 10027-452 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500064 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Miltenyi Biotec   130-093-864 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) Miltenyi Biotec 130-050-201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-1β Sigma - Aldrich I9401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-4 Miltenyi Biotec 130-093-919 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-6 Sigma - Aldrich SRP3096 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
L-glutamine Gibco A2916801 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
LS column and plunger Miltenyi Biotec 130-042-401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin - Biotinylated) Vector labs B-1265-1 Determination of Sialic Acid Profile
MHC-I (HLA-ABC) Immunotools 21159033 Maturation Profiling of mo-DCs
MHC-II (HLA-DR) Immunostep HLADRA-100T Maturation Profiling of mo-DCs
Microtubes AstiK’s PCRP-E015-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Neuraminidase (Sialidase) Roche 11585886001 Treatment of Cells with Sialidase
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Paraformaldehyde (PFA 2%) Polysciences Europe 25085-1 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Paraformaldehyde (PFA 4%) Biotium 22023 Determination of Sialic Acid Profile
Pasteur pipettes Labbox PIPP-003-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin - FITC) Vector labs FL-1071 Determination of Sialic Acid Profile
Penicillin/streptomycin Gibco 15140163 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) NZYTech   MB18201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Prostaglandin E2 (PGE2) Sigma - Aldrich P0409 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RBC lysis buffer BioLegend 420302 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) Gibco 31870074 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - Biotinylated) Vector labs   B-1305-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - FITC) Vector labs FL-1301-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sodium pyruvate Thermofisher 11360-070 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
SpectroMax190 Molecular Devices Maturation Profiling of mo-DCs
Streptavidin-PE BioLegend   405203 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma - Aldrich T0440 Maturation Profiling of mo-DCs
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) Sigma - Aldrich H8916 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Zeiss LSM710 confocal microscope Zeiss Determination of Sialic Acid Profile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varki, A., Gagneux, P. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).
  2. Bochner, B. S., Zimmermann, N. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).
  3. Smith, B. A. H., Bertozzi, C. R. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).
  4. Schauer, R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).
  5. Manhardt, C. T., Punch, P. R., Dougher, C. W. L., Lau, J. T. Y. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).
  6. Cabral, M. G., et al. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).
  7. Bordron, A., et al. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402 (2021).
  8. Julien, S., Videira, P. A., Delannoy, P. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).
  9. Munkley, J. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248 (2022).
  10. Dennis, J. W., Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M. L., Kerbel, R. S. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).
  11. Pinho, S. S., Reis, C. A. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).
  12. Manni, M., Läubli, H. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).
  13. Sjögren, J., Lood, R., Nägeli, A. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).
  14. Trastoy, B., et al. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).
  15. Pascoal, C., et al. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731 (2023).
  16. von Itzstein, M., et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).
  17. Gray, M. A., et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).
  18. Fernandes, Â, et al. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).
  19. Togayachi, A., et al. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).
  20. Park, D. D. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).
  21. Steinman, R. M. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).
  22. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).
  23. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  24. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  25. So-Rosillo, R., Small, E. J. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).
  26. Cheever, M. A., Higano, C. S. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).
  27. Videira, P. A., et al. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).
  28. Cabral, M. G., et al. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).
  29. Silva, Z., et al. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249 (2020).
  30. Silva, M., et al. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).
  31. Crespo, H. J., et al. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).
  32. Council of Europe. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , Strasbourg, France. (2017).
  33. LS Columns. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012).
  34. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, Unit 7.32 (2012).
  35. Wu, X., Xu, F., Liu, J., Wang, G. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).
  36. Naeim, F., Nagesh Rao, P., Song, S., Phan, R. Chapter 2 - Principles of Immunophenotyping. Atlas of Hematopathology. , Academic Press. Cambridge, MA. 29-56 (2018).
  37. Cernadas, M., Lu, J., Watts, G., Brenner, M. B. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).
  38. Santambrogio, L., Strominger, J. L. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).
  39. Raposo, C. D., Canelas, A. B., Barros, M. T. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188 (2021).
  40. Videira, P. A. Q., et al. Patent WO2017002045. A viable cell population, method for production and uses thereof. Portugal patent. , Universidade NOVA de Lisboa. Lisbon, Portugal. (2017).
  41. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).
  42. Marques, G. S., Silva, Z., Videira, P. A. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4 (2018).
  43. Bax, M., et al. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).
  44. Chinoy, Z. S., Montembault, E., Moremen, K. W., Royou, A., Friscourt, F. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).
  45. Chou, M. -Y., Li, S. -C., Li, Y. -T. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).
  46. Crespo, H. J., Lau, J. T. Y., Videira, P. A. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491 (2013).
  47. Büll, C. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).
  48. Ohmi, Y., et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).
  49. Chung, C., et al. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502 (2017).
  50. Hyvärinen, S., Meri, S., Jokiranta, T. S. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).
  51. Powell, L. D., Whiteheart, S. W., Hart, G. W. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).
  52. Corfield, A. P., Higa, H., Paulson, J. C., Schauer, R. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).
  53. Tkachenko, N., Wojas, K., Tabarkiewicz, J., Rolinski, J. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes - Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).
  54. Kim, S. J., et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).
  55. Calmeiro, J., et al. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363 (2021).
  56. Stamatos, N. M., et al. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).
  57. Lehmann, F., Tiralongo, E., Tiralongo, J. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).
  58. Frosch, M., Görgen, I., Boulnois, G. J., Timmis, K. N., Bitter-Suermann, D. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).

Tags

Monocytafledte dendritiske celler Sialylerede fænotyper Sialinsyrer Immunresponsmodulation Immunovervågning Glykoimmune kontrolpunkter Immunterapier Dendritiske celler (DC'er) Antigenpræsenterende celler (APC) Modning af DC'er Sialsyreindhold T-celleaktivering
Generering af monocytafledte dendritiske celler med forskellige sialylerede fænotyper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral,… More

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral, P., Tanwar, A., Paterson, R. L., Videira, P. A. Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes. J. Vis. Exp. (200), e65525, doi:10.3791/65525 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter