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Immunology and Infection

"अलग-अलग सिलीलेटेड फेनोटाइप्स के साथ मोनोसाइट-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं की पीढ़ी"

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65525
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 4,5, 6, 1,2,7
1Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology, Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark, Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa

Summary

एक सियालिडेज़ उपचार का उपयोग करके पृथक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से डी-सिलिएटेड मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं (एमओ-डीसी) उत्पन्न करने के लिए एक अद्वितीय, व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इसके अलावा, एमओ-डीसी के फेनोटाइपिक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन का आकलन करने और मूल्यांकन करने के तरीके कि कैसे सियालिडेज़ उपचार एमओ-डीसी के परिपक्वता स्तर में सुधार करता है, वर्णित हैं।

Abstract

सियालिक एसिड नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए मोनोसैकराइड होते हैं जो आमतौर पर सेल सतह ग्लाइकेन्स की टर्मिनी में पाए जाते हैं। उनकी हाइड्रोफिलिसिटी और बायोफिज़िकल विशेषताओं के कारण, वे कई जैविक प्रक्रियाओं में शामिल होते हैं, जैसे कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मॉड्यूलेशन, स्वयं और गैर-स्व एंटीजन की पहचान, कार्बोहाइड्रेट-प्रोटीन इंटरैक्शन आदि। सियालिक एसिड की सेलुलर सामग्री को सियालिडेज़ द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो सियालिक एसिड अवशेषों को हटाने के लिए उत्प्रेरित करता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि सियालो-ग्लाइकेन प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर सीआईएस और ट्रांस निरोधात्मक सिगलेक रिसेप्टर्स के साथ जुड़कर प्रतिरक्षा निगरानी की निगरानी में महत्वपूर्ण हैं। इसी तरह, कैंसर में ग्लाइको-प्रतिरक्षा चौकियां इम्यूनोथेरेपी विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य बन रही हैं। इसके अतिरिक्त, डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) को इम्यूनोथेरेपी में एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में कल्पना की जाती है, विशेष रूप से कैंसर अनुसंधान में, पेशेवर एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एपीसी) के रूप में उनकी अनूठी भूमिका और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने और प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति उत्पन्न करने की उनकी क्षमता के कारण। फिर भी, डीसी का कार्य उनकी पूर्ण परिपक्वता पर निर्भर है। अपरिपक्व डीसी में परिपक्व डीसी और एक उच्च साइलिक एसिड सामग्री के लिए एक विरोधी कार्य होता है, जो उनके परिपक्वता स्तर को और कम करता है। यह टी-कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए अपरिपक्व डीसी की क्षमता को कम करता है, जिससे एक समझौता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है। नतीजतन, मानव डीसी की कोशिका सतह से सियालिक एसिड को हटाने से उनकी परिपक्वता होती है, इस प्रकार एमएचसी अणुओं और एंटीजन प्रस्तुति की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। इसके अलावा, यह सह-उत्तेजक अणुओं और आईएल -12 की अभिव्यक्ति को बहाल कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप डीसी में टी-कोशिकाओं को टीएच 1 फेनोटाइप की ओर ध्रुवीकृत करने की उच्च क्षमता होती है और विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए साइटोटोक्सिक टी-कोशिकाओं को सक्रिय किया जाता है। इसलिए, सियालिक एसिड डीसी के एक प्रमुख मॉड्यूलेटर के रूप में उभरा है और उनके चिकित्सीय उपयोग को आगे बढ़ाने के लिए एक नए लक्ष्य के रूप में उपयोग किया जा रहा है। यह अध्ययन सियालिडेज़ के साथ इन विट्रो मोनोसाइट-व्युत्पन्न डीसी के इलाज के लिए एक अनूठा दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिसका उद्देश्य विभिन्न सेल सतह साइलिक एसिड फेनोटाइप और अनुरूप परिपक्वता और सह-उत्तेजक प्रोफाइल के साथ डीसी आबादी उत्पन्न करना है।

Introduction

सियालिक एसिड-ले जाने वाले ग्लाइकेन (सियालोग्लाइकेन्स) ने अपनी इम्यूनोमॉड्यूलेटरी भूमिका के कारण महत्वपूर्ण रुचि प्राप्त की है। मोनोसैकराइड सियालिक एसिड, जो एन-एसिटाइलन्यूरामिनिक एसिड के रूप में मनुष्यों में सबसे अधिक प्रचलित है, प्रतिरक्षा विज्ञान में मान्यता प्राप्त भूमिका के साथ लेक्टिन के लिए मौलिक लिगेंड प्रस्तुत करता है, जैसे कि सेलेक्टिन और सिगलेक्स। ये लेक्टिन या तो एक ही कोशिका (सीआईएस) या विभिन्न कोशिकाओं (ट्रांस) पर सियालॉगलाइकेन्स को पहचानते हैं और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन और विभिन्न शारीरिक और पैथोलॉजिकलसेलुलर गतिविधियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, चूंकि सियालिक एसिड सेल सतह ग्लाइकोकॉन्जुगेट के टर्मिनल पदों पर कब्जा कर लेता है, इसलिए यह अंतर्निहित संरचनाओं को छिपा सकता है, इस प्रकार गैर-विशिष्ट प्रतिकारक प्रभावों के माध्यम से सेल-टू-सेल संपर्क को बाधित कर सकता है या अन्य लेक्टिन4 द्वारा पता लगाने में बाधा डाल सकता है। कोशिका के भीतर विभिन्न प्रकार के सिएलिट्रांसफेरेज़ (जो सियालिक एसिड को स्थानांतरित करते हैं) और सियालिडेस (जो सियालिक एसिड बॉन्ड को छोड़ देते हैं) की गतिविधि सतह पर मौजूद सियालिक एसिड की मात्रा निर्धारित करती है। इसके अलावा, मेजबान या रोगजनकों द्वारा व्यक्त घुलनशील सिलिलट्रांसफेरेज़ और सियालिडेज़ कोशिका की सतह पर सियालिकएसिड की मात्रा को बाह्य रूप से संशोधित कर सकते हैं।

असामान्य सिनाइलेशन कई रोग स्थितियों की एक विशेषता है। ऑटोम्यून्यून रोगों में, हाइपोसिनाइलेशन अनियंत्रित प्रतिरक्षा सक्रियण और अंग क्षति में योगदान कर सकता है, क्योंकि सियालिक एसिड स्व-एंटीजन को भेदभाव करने औरभड़काऊ प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में मदद करता है। इसके विपरीत, हाइपरसिनाइलेशन के परिणामस्वरूप सियालोग्लाइकेन्स की अति-अभिव्यक्ति होती है, जैसे कि सियालिल-टीएन, सियालिल-लुईस एंटीजन, पॉलीसिलिक एसिड और गैंग्लियोसाइड्स, जो कुछ कैंसर की पहचान 8,9 का गठन करते हैं। हाइपरसिनाइलेशन विशिष्ट एंजाइमों जैसे एन-एसिटाइलग्लुकोसामिनेलट्रांसफेरेज़ (जीएनटी-वी) की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति पर भी निर्भर करता है, जो हाइपरसिलीलेटेड ट्राइ- और / या टेट्रा-एंटीनारी एन-लिंक्ड ग्लाइकेन उत्पन्न करता है, जो कैंसर के विकास और मेटास्टेसिस10 से जुड़ा हुआ है। सियालिक एसिड सामग्री प्रोटीन स्थिरता और कार्य को भी नियंत्रित करती है, जो प्रासंगिक ऑन्कोजेनिकखिलाड़ियों की भूमिका के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, बढ़े हुए सिनाइलेशन ट्यूमर के विकास, मेटास्टेसिस, दवा प्रतिरोध और प्रतिरक्षा चोरी की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, सियालॉगलिकेन्स का अपरेग्यूलेशन ट्यूमर को प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर निरोधात्मक सिगलेक रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने और प्रतिरक्षा निगरानी से बचने में सक्षम बनाता है। उस कारण से, सियालोगिकेंस को अब ग्लाइको-प्रतिरक्षा चौकियों और आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य माना जाता है। उदाहरण के लिए, सिगलेक-प्रतिरक्षा अक्ष के अवरोधक पहले से ही प्रारंभिक नैदानिक परीक्षणों में हैं, क्योंकि प्रतिरक्षा कोशिका रिसेप्टर सिगलेक (सियालिक-एसिड-बाइंडिंग इम्युनोग्लोबुलिन-जैसे एलईसीटिन) एक प्रतिरक्षा-निरोधात्मकभूमिका निभाता है।

अध्ययन के लिए उपकरण के रूप में या चिकित्सीय रणनीतियोंके लिए ग्लाइकन प्रोफाइल को संशोधित करने के लिए एंजाइमों का उपयोग किया गया है13,14. सियालिडेज़ को कैंसर सेल मैलिग्नेंसी को बदलने के लिए नियोजित किया गया है क्योंकि सिलीलेटेड ग्लाइकेन जैसे कि सियालिल लुईस एक्स सेल माइग्रेशन और कैंसर मेटास्टेसिस15 के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसी समय, सियालिडेज़ इनहिबिटर, जो सियालिक एसिड क्लीवेज को बाधित करते हैं, सियालिक एसिड-निर्भर वायरल संक्रमण16 के इलाज के लिए क्लीनिक तक पहुंच गए हैं। हाल ही में, सिगलेक-प्रतिरक्षा अक्ष में लिगेंड के रूप में सियालिक एसिड की महत्वपूर्ण भूमिका के कारण सियालिक एसिड मॉड्यूलेशन ने और रुचि प्राप्त की है, जिसका अर्थ है कि वे प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से कैंसर के भागने को कम करने के लिए नए साधन प्रदान करते हैं। इस रुचि को 2022 के नोबेल पुरस्कार विजेता बर्टोज़ी और उनकी टीम के कई रणनीतियों के योगदान से और मजबूत किया गया जो चुनिंदा रूप से विविध सियालोगिकन्स को छोड़ देते हैं और कैंसर-विरोधीप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में सुधार करते हैं। इस प्रकार, सियालिडेज़-आधारित रणनीतियाँ ग्लाइको-प्रतिरक्षा चेकपॉइंट थेरेपी के लिए एक आशाजनक साधन का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं का ग्लाइकोफेनोटाइप सेल के प्रकार और उनकी सक्रियण स्थिति पर निर्भर है। टी-कोशिकाओं के संबंध में, ग्लाइकान की टी-सेल विकास और थाइमोसाइट चयन, टी-सेल गतिविधि, भेदभाव और प्रसारके पैथोफिजियोलॉजिकल चरणों में महत्वपूर्ण भूमिका है। उदाहरण के लिए, ग्लाइकोप्रोटीन पर पॉलीलैक्टोसामाइन बी लिम्फोसाइटों और टी लिम्फोसाइटों और मैक्रोफेज सक्रियण19 के बेसल स्तर को प्रभावित करता है। मैक्रोफेज में, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) 20 में मैक्रोफेज भर्ती में अलग-अलग ग्लाइकन अभिव्यक्ति पैटर्न की महत्वपूर्ण भूमिका होती है। इसलिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा ओ-लिंक्ड और एन-लिंक्ड ग्लाइकेन की अभिव्यक्ति का उपयोग कैंसर और ऑटोइम्यून बीमारियों के उपचार में चिकित्सीय दृष्टिकोण के लिए संभावित ग्लाइकोबायोमार्कर के रूप में किया जा सकता है।

डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी) विशिष्ट एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाएं हैं जिनमें प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने की अनूठी क्षमता होती है, जैसे कि एंटी-कैंसर प्रतिरक्षा21। डीसी को टी-कोशिकाओं (सिग्नल 1), सह-उत्तेजक अणुओं को टी-कोशिकाओं (सिग्नल 2) को सक्रिय करने के लिए सह-उत्तेजक अणुओं और आईएल -12 जैसे प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स को पेश करने के लिए अपने एंटीजन-प्रेजेंटिंग एमएचसी अणुओं के अपरेग्यूलेशन से गुजरना होगा, ताकि टाइप 1 हेल्पर टी-सेल प्रसार (सिग्नल 3)22 को ट्रिगर किया जा सके। परिणामस्वरूप प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल को कसकर विनियमित किया जाता है, और स्वस्थ कोशिकाओं पर हमला करने से रोकने के लिए चेकपॉइंट आवश्यक हैं। चूंकि डीसी ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ विभिन्न प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित कर सकते हैं, इसलिए उनका उपयोग सेल-आधारित टीकों के रूप में किया जाता है, और नैदानिक अध्ययनों की एक बड़ी संख्या ने उनके संभावित लाभों का प्रदर्शन कियाहै। एफडीए द्वारा 201025,26 में पहले डीसी-आधारित टीके को मंजूरी देने के बाद, कई अन्य डीसी-आधारित टीके विकसित किए गए हैं। डीसी-आधारित टीके मुख्य रूप से विवो में उत्पादित होते हैं और ट्यूमर के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए रोगियों को प्रशासित किए जाते हैं। हालांकि, अपर्याप्त या संक्षिप्त परिपक्वता वर्तमान में डीसी की नैदानिक प्रभावकारिता को सीमित करने वाले कारकों में से एक है और इसका मतलब है कि महंगे साइटोकिन कॉकटेल का उपयोग किया जाना चाहिए। पर्याप्त परिपक्वता के बिना, डीसी नैदानिक परिस्थितियों में टी-कोशिकाओं को सक्रिय नहीं कर सकते हैं। इसके बजाय, डीसी प्रतिरक्षा चौकियों को व्यक्त करते हैं और एक टोलरोजेनिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं जो साइटोटोक्सिक टी-कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ कार्य करने से रोकता है।

मानव डीसी में भारी सिलिलेटेड सतहहोती है, और परिपक्वता पर और समग्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाके दौरान यह सिनाइलेशन कम हो जाता है। डीसी की परिपक्वता को सियालिडेज़ के साथ इन सियालिक एसिड को खत्म करके प्रेरित किया जा सकता है। न्यूक्लियस 6,28 में एनएफ-केबी ट्रांसक्रिप्शन कारक के स्थानांतरण के कारण आईएल -12 सहित विभिन्न साइटोकिन्स को बहुत अधिक विनियमित करता है। इसके अलावा, डेसिलेशन एमएचसी-आई और एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं29,30 के माध्यम से एंटीजन क्रॉस-प्रस्तुति में सुधार करता है। तदनुसार, सिएलेट्रांसफेरेज़ एसटी 3 गैल.एल और एसटी 6 जीएएल.एल के नॉकआउट, जिनकी डीसी सिनाइलेशन में एक प्रमुख भूमिका है, मुराइन डीसी31 में अधिक परिपक्व फेनोटाइप उत्पन्न करता है।

सियालिडेज़ उपचार डीसी परिपक्वता के सभी पहलुओं को उत्तेजित करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, जिसमें एंटीजन प्रस्तुति में वृद्धि, सह-उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति में वृद्धि, और साइटोकिन उत्पादन में वृद्धि शामिल है, ताकि ऊपर उल्लिखित कमियों को दूर किया जा सके और डीसी को प्रभावी प्रतिक्रियाएं प्राप्त करने में सक्षम बनाया जा सके। यह लेख एक बैक्टीरियल सियालिडेज़ के उपयोग के माध्यम से व्यवहार्य डेसिलिएटेड मानव डीसी प्राप्त करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। डी-सिलीलेटेड डीसी एक बेहतर परिपक्वता प्रोफ़ाइल दिखाते हैं और विट्रो में एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए सेल मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। डीसी रक्त मोनोसाइट्स से प्राप्त किए जाते हैं, जिन्हें तब साइटोकिन इंटरल्यूकिन -4 (आईएल -4) और ग्रैनुलोसाइट मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) की उपस्थिति में विट्रो में विभेदित किया जाता है। यह काम सेल की सतह पर सियालिक एसिड का विश्लेषण करने के लिए लेक्टिन-आधारित तरीकों और डीसी परिपक्वता स्तर पर इम्यूनोफेनोटाइप के तरीकों का भी वर्णन करता है। यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग अन्य सेल प्रकारों को व्यवस्थित करने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार सियालोग्लाइकेन्स की भूमिका की जांच करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो महत्वपूर्ण ग्लाइको-प्रतिरक्षा चौकियां हैं और इम्यूनोमॉड्यूलेशन में प्रासंगिक हैं।

Protocol

कोशिकाओं को स्वस्थ गुमनाम रक्त दाताओं के बफी कोट से अलग किया गया था, जो लिखित और सूचित दाता सहमति प्राप्त करने के बाद राष्ट्रीय रक्त बैंक, इंस्टीट्यूटो पोर्टुगुएस डो सैंग्यू ए दा ट्रांसप्लांटाको (आईपीएसटी) द्वारा प्रदान किए गए स्वयंसेवक थे। मानव ऊतकों और कोशिकाओं के दान, खरीद, परीक्षण, प्रसंस्करण, संरक्षण, भंडारण और वितरण के लिए गुणवत्ता और सुरक्षा के मानकों पर निर्देश 2004/23/ ईसी के अनुसार रक्त के उपयोग को नैतिकता समिति (आईपीएसटी 30072015) द्वारा अनुमोदित किया गया था (पुर्तगाली कानून 22/2007, 29 जून)। आईपीएसटी बायोबैंक एक विशिष्ट प्लास्टिक संग्रह बैग में रक्त एकत्र और संग्रहीत करता है जिसमें साइट्रेट फॉस्फेट डेक्सट्रोज (सीपीडी), एक संरक्षण और थक्कारोधी समाधान होता है, ताकि प्रसंस्करण तक रक्त की अखंडता को बनाए रखा जा सके। यह आकलन करने के लिए कि क्या जैविक सामग्री हेरफेर के लिए उपयुक्त है, ट्रेपोनेमा पैलिडम, हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी), और मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) के लिए एक सीरोलॉजिकल नियंत्रण किया जाता है, जिनमें से सभी को नकारात्मक होना चाहिए। वर्तमान अध्ययन के लिए, आईपीएसटी द्वारा जांच उद्देश्यों के लिए बफी कोट प्रदान किया गया था, साथ ही संग्रह की तारीख, सीरोलॉजिकल परिणाम, रक्त प्रकार और दाता की आयु32 के बारे में जानकारी दी गई थी। बफी कोट अधिकतम 1 दिन के लिए कमरे के तापमान पर रह सकता है।

1. मोनोसाइट-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं को प्राप्त करना

नोट: यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि जब मानव परिधीय रक्त में हेरफेर किया जा रहा है, तो किसी को विशिष्ट सार्वभौमिक सुरक्षा सावधानियों और उचित सामग्री निपटान पर विचार करना चाहिए। शुरू करने से पहले, पुष्टि करें कि सभी अभिकर्मकों और आवश्यक सामग्री तैयार हैं और उपयोग करने के लिए तैयार हैं।

  1. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव।
    1. मानव बफी कोट तक पहुंचें।
      नोट: बफी कोट ल्यूकाफेरेसिस32 के माध्यम से एकत्र किए गए रक्त से प्राप्त एक उप-उत्पाद है, जो सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से सफेद रक्त कोशिकाओं में समृद्ध होता है। सभी चरणों को एक ऊर्ध्वाधर प्रवाह कक्ष जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में किया गया था।
    2. एक स्केलपेल के साथ सील आउटलेट ट्यूब को काटकर बफी कोट पैकेजिंग खोलें, और सामग्री को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 7 एमएल बफी कोट नमूना स्थानांतरित करें, और प्रारंभिक धोने के लिए 6 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड खारा समाधान (पीबीएस) जोड़ें। लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) और प्लाज्मा की काफी मात्रा से नमूने को साफ करने के लिए यह प्रारंभिक धोने का कदम आवश्यक है ताकि नमूना घनत्व ढाल माध्यम के साथ ढाल पृथक्करण के लिए अनुकूलित हो ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. ट्यूब को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1,100 x g पर एक सेंट्रीफ्यूज में एक सेंट्रीफ्यूज में स्विंग रोटर के साथ और ब्रेक बंद करके ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एक पाश्चर पिपेट के साथ ल्यूकोसाइट निलंबन (प्लाज्मा और आरबीसी के बीच सफेद अंगूठी) एकत्र करें, और इसे एक नए बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. अगले पृथक्करण चरण की सहायता के लिए पीबीएस के साथ 10 एमएल तक ल्यूकोसाइट निलंबन भरें, और धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
    6. घनत्व ढाल माध्यम (घनत्व: 1.077 ग्राम / एमएल) समाधान तैयार करें: घनत्व ढाल माध्यम के 3 मिलीलीटर को एक नए बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें, और इसे कमरे के तापमान पर गर्म होने दें।
    7. घनत्व ढाल पृथक्करण करने के लिए घनत्व ढाल माध्यम (5: 3) युक्त शंक्वाकार ट्यूब में पतला ल्यूकोसाइट निलंबन (चरण 1.1.5 से) के 5 मिलीलीटर जोड़ें। घनत्व ढाल माध्यम को परेशान करने से बचने के लिए ट्यूब की दीवारों का उपयोग करके धीरे-धीरे नमूना जोड़ें, बूंद से बूंद करें।
    8. ग्रेडिएंट पृथक्करण: स्विंग रोटर के साथ और ब्रेक बंद करके सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज में 1,100 एक्स जी पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घनत्व ढाल मध्यम निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    9. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेंट्रीफ्यूज से शंक्वाकार ट्यूबों को सावधानीपूर्वक हटा दें। इस चरण के बाद, अच्छी तरह से परिभाषित परतों की एक श्रृंखला दिखाई देती है, जिसमें नीचे से शुरू होने वाली निम्नलिखित शामिल हैं: एक लाल परत (आरबीसी और ग्रैनुलोसाइट्स), घनत्व ढाल माध्यम, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) की एक पतली पीली परत, और प्लाज्मा।
    10. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पीबीएमसी की पतली परत एकत्र करें, और घनत्व ढाल माध्यम को नीचे या ऊपर बहुत अधिक प्लाज्मा लेने से बचें। पीबीएमसी नमूने को एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें, इसे पीबीएस के साथ 25 एमएल तक भरें, और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके नमूने को मिलाएं।
    11. अवशिष्ट कोशिकाओं और मलबे को धोने के लिए 600 x g (सामान्य ब्रेक) पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और ट्यूब को सावधानीपूर्वक घुमाकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
      नोट: यदि बहुत अधिक लाल रक्त कोशिका संदूषण है, जो तब देखा जा सकता है जब सेल गोली या बफी कोट पूरी तरह से अलग नहीं होता है या लाल दिखाई देता है, तो शेष आरबीसी को अलग करने की सिफारिश की जाती है। इस मामले में, आरबीसी लाइसिस बफर के 5 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), अच्छी तरह मिलाएं, और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ 40 एमएल तक भरें, 900 x g (सामान्य ब्रेक) पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और ट्यूब को सावधानीपूर्वक घुमाकर सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    12. पीबीएस के साथ नमूने को 10 एमएल तक भरें, और कोशिकाओं को गिनने के लिए एक एलिकोट लें। प्लेटलेट्स को हटाने के लिए, 400 x g (सामान्य ब्रेक) पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें, और ट्यूब को सावधानीपूर्वक घुमाकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
      नोट: यदि प्लेटलेट्स की पर्याप्त संख्या है, तो 200 x g (सामान्य ब्रेक) पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज दो बार करें। कोशिकाओं की गिनती करते समय नमूने की कल्पना करके प्लेटलेट्स की पहचान की जाती है।
  2. इम्यूनोमैग्नेटिक पृथक्करण द्वारा मोनोसाइट अलगाव।
    1. 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 2 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के साथ पीबीएस को पूरक करके माइक्रोबीड्स बफर तैयार करें। निस्पंदन (0.2 μm) द्वारा घोल को निष्फल करें, और बफर को प्रशीतित (2-8 डिग्री सेल्सियस) रखें।
    2. चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) द्वारा मोनोसाइट सीडी 14 + अलगाव करें।
      1. एक स्वचालित सेल काउंटर (चरण 1.4.1) का उपयोग करके सेल गिनती के बाद, आवश्यक माइक्रोबीड्स बफर और सीडी 14 इम्यूनोमैग्नेटिक बीड्स (सामग्री की तालिका देखें) की उपयुक्त मात्रा की गणना करें। सुनिश्चित करें कि इन समाधानों को बर्फ पर रखा गया है। प्रति 1 x 10 7 कोशिकाओं में माइक्रोबीड्स बफर के 80 μL और प्रति 1 x 107 कोशिकाओं में CD14 मोतियों के 20 μL जोड़ें।
      2. पहले से निर्धारित मात्रा में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस (2-8 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
        नोट: यदि पीबीएमसी नमूनों में मोनोसाइट स्तरों के सत्यापन की आवश्यकता होती है, तो धुंधला एंटीबॉडी (जैसे, सीडी 14 [मोनोक्लोनल टीयूके 4]) का उपयोग करके एक प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण करें। प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण पर विवरण के लिए चरण 3.2 का पालन करें।
      3. प्रति 1 x 107 कोशिकाओं में 1-2 एमएल माइक्रोबीड्स बफर जोड़ें, अनबाउंड मोतियों को हटाने के लिए 600 x g (सामान्य ब्रेक) पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें, और ट्यूब को सावधानीपूर्वक घुमाकर सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
      4. एलएस कॉलम तैयार करें। एलएस कॉलम में फेरोमैग्नेटिक गोले होते हैं, जो चुंबक पर रखे जाने पर, चुंबकीय रूप से लेबल कोशिकाओं33 के सकारात्मक, कोमल प्रतिधारण की अनुमति देते हैं। उपयोग करने से तुरंत पहले, चुंबक पर एक एलएस कॉलम ( सामग्री की तालिका देखें) रखें, पूरी तरह से सूखने के बिना 3 मिलीलीटर माइक्रोबीड्स बफर से कुल्ला करें, और तुरंत अगले चरण पर आगे बढ़ें।
        नोट: उपज से समझौता करने से बचने के लिए प्रक्रिया के दौरान कॉलम को कभी सूखने न दें।
      5. सेल गोली को प्रति 1 x 108 कोशिकाओं में माइक्रोबीड्स बफर के 500 μL में पुन: निलंबित करें। यदि सेल संख्या 4 x 108 से अधिक है, तो सेल एकत्रीकरण को रोकने के लिए 40 μm सेल स्ट्रेनर का उपयोग करें।
      6. कॉलम इनलेट में सेल सस्पेंशन जोड़ें, नकारात्मक सेल अंश को इकट्ठा करने के लिए कॉलम आउटलेट के नीचे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब रखें, और कॉलम को 3 एमएल माइक्रोबीड्स बफर के साथ तीन बार धोएं। नकारात्मक अंश में वे कोशिकाएं शामिल हैं जो सीडी 14 मोतियों (यानी, सीडी 14 - कोशिकाओं) के साथ एकत्र नहीं की गई थीं।
      7. अंतिम धोने के बाद, चुंबक से कॉलम को हटा दें, इसे बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर रखें, कॉलम इनलेट में 5 एमएल माइक्रोबीड्स बफर का पिपेट डालें, और तुरंत सिरिंज प्लंजर को कॉलम इनलेट में डालें और लक्ष्य कोशिकाओं को वितरित करने के लिए धक्का दें।
      8. चुंबकीय रूप से लेबल की गई कोशिकाओं (सीडी 14 + कोशिकाओं) को इकट्ठा करें, और कोशिकाओं को गिनने के लिए एक एलिकोट लें, जैसा कि चरण 1.4.1 में वर्णित है।
      9. 600 x g (सामान्य ब्रेक) पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर दोनों सेल अंशों, CD14− और CD14+ कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, अगले चरणों के लिए सीडी 14 + अंश को बनाए रखें, और यदि आवश्यक हो तो सीडी 14 − अंश को भविष्य के परख के लिए संग्रहीत करें, जैसे कि सह-संस्कृति परख। यदि आवश्यक हो, तो सीडी 14 - अंश से कोशिकाओं को आरपीएमआई -1640 20% एफबीएस और 10% डीएमएसओ में -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोसंरक्षित किया जा सकता है।
  3. डेंड्राइटिक कोशिकाओं में मोनोसाइट भेदभाव।
    1. आरपीएमआई -1640 बेस माध्यम (11.1 एमएम ग्लूकोज युक्त) को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), एल-ग्लूटामाइन के 2 एमएम का 1%, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 1% सोडियम पाइरूवेट और 100 μg / mL पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 1% के साथ पूरक करके पूर्ण आरपीएमआई -1640 माध्यम तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. एमओ-डीसी में मोनोसाइट भेदभाव करें, जो ~ 5-6 दिनों में होता है।
      1. प्राप्त सीडी 14 + कोशिकाओं की संख्या के लिए आवश्यक माध्यम की मात्रा की गणना करें, और निम्नलिखित प्रयोग सेटअप के अनुसार कोशिकाओं को प्लेट करें।
        नोट: इस प्रोटोकॉल में, कोशिका मृत्यु और माप त्रुटियों को ध्यान में रखने के लिए कोशिकाओं को 1.3 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर चढ़ाया गया था, और माध्यम को जीएम-सीएसएफ के 1,000 यू / एमएल और आईएल -4 के 750 यू / एमएल ( सामग्री की तालिका देखें) को एक पूर्ण माध्यम में जोड़कर और इसे अच्छी तरह से मिलाकर तैयार किया गया था।
      2. सीडी 14+ कोशिकाओं में माध्यम की उचित मात्रा जोड़ें, और पाश्चर पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके पुन: निलंबित करें। सेल निलंबन को 24-वेल प्लेटों (प्रति कुएं: 1.3 x 106 कोशिकाओं / एमएल) में प्लेट करें, और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कल्चर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
      3. संस्कृति माध्यम को बदलें, और इसे हर 2-3 दिनों में ताजा साइटोकिन्स के साथ पूरक करें (आमतौर पर प्रति भेदभाव प्रक्रिया में एक बार)। ऐसा करने के लिए, कोशिकाओं को परेशान किए बिना संस्कृति माध्यम के आधे हिस्से को सावधानीपूर्वक हटा दें। साइटोकिन्स की उचित एकाग्रता के साथ ताजा माध्यम की समान मात्रा जोड़ें, जैसा कि चरण 1.3.2.1 के नोट में पहले वर्णित है, और शेष भेदभाव अवधि के लिए इनक्यूबेट करें।
        नोट: डीसी, जब मोनोसाइट्स से अलग होते हैं, तो शिथिल रूप से अनुयायी कोशिकाएं होती हैं। पूरी तरह से विभेदित अपरिपक्व मो-डीसी स्पिंडल के आकार के, मुक्त-फ्लोटिंग और शिथिल रूप से अनुयायी कोशिकाएं हैं। कोशिकाएं रोसेट भी बना सकती हैं, खासकर जबपरिपक्व 34 हों।
      4. भेदभाव के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, पूरे सेल निलंबन को एक बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, और प्लेट के कुओं को पीबीएस के साथ दो बार धोएं, नीचे धीरे से टैप करें (चित्रा 1 ए)।
        नोट: भारी अनुयायी कोशिकाओं को इकट्ठा करने से बचें, क्योंकि ये शायद मैक्रोफेज हैं। अनुचित सेल परिपक्वता या सक्रियण से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अत्यधिक देखभाल के साथ संभाला जाता है।
      5. किसी भी अवशेष या मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए 180 x g (सामान्य ब्रेक) पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, और प्रयोगात्मक सेटअप के लिए उपयुक्त माध्यम / बफर में फिर से निलंबित करें।
    3. एमओ-डीसी की परिपक्वता करें।
      1. यदि एमओ-डीसी की परिपक्वता की आवश्यकता होती है, तो सेल एकाग्रता उदाहरण को ध्यान में रखते हुए एक अच्छी तरह से प्लेट या फ्लास्क का उपयोग करें, जिसका उपयोग पहले किया गया था (1.3 x 10 6 सेल / एमएल), और आईएल -1 (10 एनजी / एमएल), आईएल -6 (1,000 यू / एमएल), प्रोस्टाग्लैंडीन ई 2 (पीजीई 2; 1 μg / mL) सहित साइटोकिन कॉकटेल के साथ माध्यम को पूरक करके साइटोकिन कॉकटेल का प्रबंधन करें। और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर -α (टीएनएफ -α; 10 एनजी / एमएल) ( सामग्री की तालिका देखें)। 24 घंटे या 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. सेल गिनती और व्यवहार्यता
    1. सेल गिनती और ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग करें।
      1. कोशिकाओं की संख्या और सेल निलंबन की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए, सेल निलंबन से 10 μL का एलिकोट लें, और इसे ट्राइपैन ब्लू (1: 1 कमजोर पड़ने) के 10 μL के साथ मिलाएं।
      2. पिछले मिश्रण का 10 μL लें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें।
        नोट: यदि कोशिकाओं की एकाग्रता बहुत अधिक है, तो एलिकोट को पतला करें, और सेल गिनती के बाद, गणना में कमजोर पड़ने वाले कारक पर विचार करें।
      3. प्रयोगात्मक सेटअप के लिए सेल नंबर और मध्यम / बफर समायोजित करें।
    2. सेल व्यवहार्यता और एपोप्टोसिस30 का निर्धारण करें।
      नोट: इस काम में, सियालिडेज़ उपचार (धारा 2) के बाद, व्यवहार्यता परख का प्रदर्शन किया गया था।
      1. 5 μg / mL 7-एमिनोएक्टिनोमाइसिन डी (7-एएडी) और एनेक्सीन वी के साथ मो-डीसी को दाग दें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एपोप्टोसिस निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      2. फ्लो साइटोमेट्री29,30 का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण करें।

2. सियालिडेज़ के साथ कोशिकाओं का उपचार

नोट: एमओ-डीसी में भेदभाव के बाद, छठे दिन, कोशिकाएं सियालिडेज़ उपचार परख के लिए तैयार हैं।

  1. वांछित प्रयोगात्मक सेटअप को ध्यान में रखते हुए, 1.3 x 106 कोशिकाओं / कुएं के साथ 24-वेल प्लेटों के 10 कुओं से ~ 10 x 106 मो-डीसी एकत्र करें, और उन्हें एक नए बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: कुछ सेल हानि मान लें; आमतौर पर, इस स्तर पर, पाया गया एकाग्रता 1.3 x 106 सेल / एमएल है क्योंकि एमओ-डीसी और उनके अग्रदूत प्रसार नहीं करते हैं और एमओ-डीसी में भेदभाव के दौरान 20% व्यवहार्यता हानि का अनुभव करते हैं।
  2. 300 x g (सामान्य ब्रेक) पर 5-7 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें, और मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
  3. आरपीएमआई -1640 मध्यम (11.1 एमएम ग्लूकोज युक्त) के 10 एमएल जोड़ें, 300 x g (सामान्य ब्रेक) पर 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, आरपीएमआई -1640 के 2 एमएल जोड़ें, और अच्छी तरह मिलाएं।
  4. आरपीएमआई -1640 में 1 एमएल कोशिकाओं को नए बाँझ माइक्रोट्यूब, # 1 और # 2 में रखें; प्रत्येक माइक्रोट्यूब में लगभग 5 x 106 कोशिकाएं होंगी।
  5. माइक्रोट्यूब # 1 के लिए, क्लोस्ट्रीडियम पेरिंजन्स से 500 एमयू सियालिडेज़ जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। माइक्रोट्यूब # 2 में, मॉक-ट्रीटेड सियालिडेज़ जोड़ें, जो एक नकारात्मक नियंत्रण है, यह पुष्टि करने के लिए कि क्या देखे गए प्रभाव सीधे सियालिक एसिड हटाने से संबंधित हैं और कलाकृतियों के कारण नहीं हैं। मॉक-ट्रीटेड सियालिडेज़ गर्मी-निष्क्रिय सियालिडेज़ है, जिसे एंजाइम को 100 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए उबालकर प्राप्त किया जाता है।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को एक ही संख्या, # 1 और # 2 के साथ नए बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में रखें। एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए दोनों ट्यूबों में पूर्ण आरपीएमआई -1640 माध्यम (10% एफबीएस युक्त) के लगभग 4 एमएल जोड़ें।
  8. 300 x g (सामान्य ब्रेक) पर 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें।
  9. प्रत्येक ट्यूब में पूर्ण आरपीएमआई -1640 माध्यम के 5 एमएल जोड़ें, और प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल कोशिकाओं की प्लेट जोड़ें।

3. साइलिक एसिड प्रोफाइल का निर्धारण

  1. लेक्टिन धुंधला होना
    1. 300 x g (सामान्य ब्रेक) पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें और धोएं।
    2. RPMI-1640 + 10% FBS में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, और कोशिकाओं (100,000/100 μL) को माइक्रोट्यूबों में वितरित करें।
    3. प्रत्येक लेक्टिन के लिए 0.01 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता का उपयोग करके 10% एफबीएस के साथ आरपीएमआई -1640 में फ्लो साइटोमेट्री के लिए धुंधलापन करें: संबूकस निग्रा (एसएनए) लेक्टिन, मूंगफली एग्लूटीनिन (पीएनए) लेक्टिन, और मैकिया एमुरेन्सिस (एमएए) लेक्टिन ( सामग्री की तालिका देखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 10% एफबीएस या 10% बीएसए युक्त पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं, और 300 x g (सामान्य ब्रेक) पर 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. बायोटिनीलेटेड लेक्टिन से सना कोशिकाओं में, 0.0005 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टाविडिन-पीई ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं, और 300 x g (सामान्य ब्रेक) पर 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और, प्रत्येक ट्यूब में, 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए 2%) के 300 μL जोड़ें। ट्यूबों को प्रकाश से बचाएं, और, यदि आवश्यक हो, तो डेटा अधिग्रहण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. नमूना तैयार करने के 1 सप्ताह के भीतर फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके डेटा प्राप्त करें29,30.
  2. फ्लो साइटोमेट्री
    1. पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और तत्काल डेटा अधिग्रहण के लिए फ्लो साइटोमीटर के साथ नमूना प्राप्त करें।
    2. विलंबित डेटा अधिग्रहण के लिए, 2% पीएफए के 300 μL में पुन: निलंबित करें, और 1 सप्ताह के भीतर डेटा प्राप्त करें।
  3. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी
    1. 12 मिमी व्यास पॉलीलाइसिन-लेपित ग्लास कवरलिप्स पर कोशिकाओं को प्लेट करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. सेल आसंजन को बढ़ावा देने के लिए 100 x g (सामान्य ब्रेक) पर 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कवरलिप्स को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. पीबीएस में 1% बीएसए के साथ धोने से पहले 4% पीएफए के साथ 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठीक करें।
    4. सेल सतहों पर 2,6-लिंक्ड साइलिक एसिड दागने के लिए एफआईटीसी-संयुग्मित एसएनए लेक्टिन (0.01 मिलीग्राम / एमएल) का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    5. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर छवियों को प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. जेड-स्टैक प्रोसेसिंग के बाद, प्रतिनिधि कॉन्फोकल क्रॉस-सेक्शन छवियों का चयन करें।
    7. विश्लेषणात्मक रूप से सही कुल सेल फ्लोरेसेंस (सीटीसीएफ) का उपयोग करके धुंधला तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: सीटीसीएफ = एकीकृत घनत्व − (चयनित सेल का क्षेत्र × पृष्ठभूमि रीडिंग का औसत प्रतिदीप्ति)29।

4. एमओ-डीसी की परिपक्वता प्रोफाइलिंग

  1. एंटीबॉडी धुंधला पन और फ्लो साइटोमेट्री।
    1. एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए रुचि की कोशिकाओं का एक नया नमूना एकत्र करें। 300 x g (सामान्य ब्रेक) पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को धोएं, और कोशिकाओं को माइक्रोट्यूब (प्रति ट्यूब 100,000 कोशिकाएं) में वितरित करें।
    2. वांछित एंटीबॉडी (एबी), एमएचआई-1, एमएचसी-II, सीडी 80 और सीडी 86 का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री के लिए धुंधलापन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति-संयुग्मित एबी को इनक्यूबेट करें।
    4. 1 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, और 300 x g (सामान्य ब्रेक) पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: यदि बिना लेबल वाले एबी का उपयोग कर रहे हैं, तो फ्लोरोसेंटली संयुग्मित द्वितीयक एबी जोड़ें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार 15 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें। पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं, और 300 x g (सामान्य ब्रेक) पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. सभी माइक्रोट्यूबों के लिए, पीबीएस के 100 μL तक जोड़ें, 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA 2%) के 300 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, और डेटा अधिग्रहण तक ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखें।
    6. फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके डेटा प्राप्त करें।
      नोट: धुंधला और निर्धारण के बाद, नमूने प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा तुरंत या 1 सप्ताह की अवधि के भीतर प्राप्त किए जा सकते हैं। इस मामले में, अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को स्टोर करें।

5. एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा)

नोट: इस काम में, आईएफएन -γ उत्पादन को निर्माता के निर्देशों के बाद एलिसा परख का उपयोग करके मापा गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. एक कोटिंग बफर में प्लेट को कोटिंग करने के लिए, कैप्चर एंटीबॉडी (1: 100, पीबीएस में एंटीबॉडी कैप्चर करें) को पतला करें, इस काम करने वाले समाधान के 100 μL को प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. कैप्चर एंटीबॉडी को पूरी तरह से त्याग दें।
  3. ब्लॉकिंग बफर जोड़ें (जैसे, पीबीएस + 2% बीएसए + 0.05% ट्वीन 20), और ब्लॉकिंग बफर को हटाने से पहले कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. संबंधित मिश्रण और कमजोर पड़ने के साथ मानक और नमूना जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। वॉशिंग बफर से पांच बार धोएं।
  5. बायोटिनीलेटेड डिटेक्टर एंटीबॉडी जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, इसके बाद पांच वॉश करें।
  6. पॉली-एचआरपी-स्ट्रेप्टाविडिन-एचएस जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, इसके बाद वॉशिंग बफर के साथ पांच वॉश करें।
  7. टीएमबी सब्सट्रेट जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), और उपयोग की जा रही परीक्षण प्रणाली को ध्यान में रखते हुए कमरे के तापमान पर 60 मिनट तक इनक्यूबेट करें। वॉशिंग बफर से पांच बार धोएं।
  8. 450 एनएम पर एक माइक्रोप्लेट रीडर पर नमूने पढ़ें।

Representative Results

मोनोसाइट अलगाव और मोनोसाइट भेदभाव मो-डीसी में
प्रोटोकॉल के अनुसार, मानव पीबीएमसी को घनत्व ढाल माध्यम के साथ घनत्व ढाल पृथक्करण का उपयोग करके बफी कोट से अलग किया गया था और अच्छी तरह से धोया गया था। ट्राइपैन ब्लू का उपयोग अलगाव के दिन व्यवहार्य सेल गिनती करने के लिए किया गया था, जैसा कि पहले चरण 1.4.1 में वर्णित है। इसके बाद, सीडी 14 + मोनोसाइट अलगाव सकारात्मक चयन के माध्यम से किया गया था। इसे प्राप्त करने के लिए, पीबीएमसी को चुंबकीय मोतियों के साथ इनक्यूबेट किया गया था जिसमें एक एंटीबॉडी था जो सीडी 14 एंटीजन को पहचानता है। चयनित सीडी 14+ मोनोसाइट्स को अपरिपक्व एमओ-डीसी (चित्रा 1 ए) मेंअंतर करने के लिए 5-6 दिनों के लिए जीएम-सीएसएफ और आईएल -4 के साथ पूरक माध्यम में संवर्धित किया गया था। एमओ-डीसी की परिपक्वता आईएल -6, आईएल -1, टीएनएफ -α और पीजीई 235 (चित्रा 1 ए) सहित साइटोकिन्स के कॉकटेल को लागू करके प्राप्त की जा सकती है।

भेदभाव प्रक्रिया के दौरान, आईएल -4 और जीएमसीएसएफ उत्तेजना के परिणामस्वरूप, सेल फेनोटाइप बदलने की उम्मीद है। डेटा से पता चलता है कि एमओ-डीसी सतह मार्कर सीडी 14 की अभिव्यक्ति खो देते हैं, जो मुख्य रूप से मोनोसाइट्स (चित्रा 1 बी) द्वारा व्यक्त किया जाता है, और सीडी 1 ए की महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति प्राप्त करता है, जो मानव डीसी36,37 द्वारा व्यक्त एक मार्कर है। एमओ-डीसी उच्च एमएचसी-द्वितीय (एचएलए-डीआर) अभिव्यक्ति भी प्राप्त करते हैं, जो मानव डीसी और अन्य एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं द्वारा व्यक्त एक एंटीजन-प्रेजेंटिंग अणु38 (चित्रा 1 बी) है।

सेल सतह सियालिक एसिड सामग्री।
सियालिडेज़ के साथ मो-डीसी का उपचार मो-डीसी की सतह पर सियालिक एसिड सामग्री को कम करता है, जिसे लेक्टिन के साथ धुंधला करके पुष्टि की जा सकती है, जो कार्बोहाइड्रेट को बांधने में सक्षम प्रोटीनहैं। चूंकि उपयोग किया जाने वाला एंजाइम कोशिका की सतह से अल्फा 2,3 और 2,6-लिंक्ड सियालिक एसिड दोनों को हटा देता है, इसलिए मो-डीसी को पीएनए से दाग दिया गया था, जो टी एंटीजन-गैल्1-3 गैलनाक1-सेर / टीएचआर, साथ ही एमएए और एसएनए लेक्टिन को पहचानता है, जो क्रमशः 2,3- और 2,6-सिलिक से बंधते हैं। सियालिडेज़ उपचार की प्रभावशीलता का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा किया गया था। जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, सियालिडेज़ उपचार ने पीएनए धुंधला पन को बढ़ाते हुए एमएए और एसएनए बाइंडिंग को काफी कम कर दिया। सियालिडेज़ उपचार के बाद एसएनए धुंधलापन में कमी की पुष्टि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण द्वारा की गई थी, जिसमें सेल की सतह पर एसएनए धुंधलापन काफी कम हो गया था (चित्रा 2 बी)।

सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी का कार्यात्मक लक्षण वर्णन।
यह मूल्यांकन करने के लिए कि सियालिडेज़ उपचार एमओ-डीसी कार्यों को कैसे प्रभावित करता है, सियालिडेज़ उपचार के बाद एमओ-डीसी के परिपक्वता स्तर का मूल्यांकन किया गया था। जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, सियालिडेज़ उपचार एंटीजन-प्रस्तुत अणुओं एमएचसी I और एमएचसी II की अभिव्यक्ति और सीडी 80 और सीडी 86 सह-उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि की ओर जाता है। टी-सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए मो-डीसी की क्षमता पर सियालिक एसिड हटाने के प्रभाव का आकलन करने के लिए, ट्यूमर सेल लाइसेट से भरे सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी का उपयोग प्राइम ऑटोलॉगस टी-कोशिकाओं (चित्रा 3) के लिए किया गया था। इसके बाद, परिणामी टी-कोशिकाओं की प्रोफ़ाइल को टीएच 1 साइटोकिन आईएफएन -γ को स्रावित करने की उनकी क्षमता के आधार पर विशेषता दी गई थी। जैसा कि चित्र 3बी में दिखाया गया है, जब पूरी तरह से सिलिलेटेड मो-डीसी द्वारा प्राइमेड टी-कोशिकाओं की तुलना की जाती है, तो सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी द्वारा प्राइमेड टी-कोशिकाओं ने आईएफएन -γ के काफी उच्च स्तर का स्राव किया। इन परिणामों से पता चलता है कि सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी ने प्रमुख ऑटोलॉगस टी-कोशिकाओं की क्षमता में सुधार किया है।

सेल व्यवहार्यता
सियालिडेज़ उपचार के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए एक व्यवहार्यता परख की गई थी कि उपचार कोशिकाओं के लिए साइटोटोक्सिक नहीं था। उपचार के बाद, गैर-व्यवहार्य और एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एमओ-डीसी को 7-एएडी और एनेक्सिन वी के साथ दाग दिया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 4) द्वारा विश्लेषण किया गया था। डेटा अनुपचारित (चित्रा 4, बाएं पैनल) और सियालिडेज़-उपचारित कोशिकाओं (चित्रा 4, दाएं पैनल) के बीच सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाता है।

Figure 1
(ए) सीडी 14+ मोनोसाइट्स को बफी कोट से अलग किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.3 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर सुसंस्कृत किया गया था। मोनोसाइट्स को आईएल -4 के 750 यू / एमएल और जीएम-सीएसएफ के 1,000 यू / एमएल के साथ पूरक माध्यम में विभेदित किया गया था। दिन 0 पर मानव बफी कोट से अलग मोनोसाइट्स की आकृति विज्ञान का सूक्ष्म विश्लेषण (शीर्ष छवि)। अपरिपक्व मो-डीसी; आईएल -4 और जीएम-सीएसएफ (मध्य छवि) का उपयोग करके 5 दिनों की अवधि के दौरान कोशिकाओं को विभेदित किया गया था। परिपक्व एमओ-डीसी को 24 घंटे (नीचे की छवि) के लिए आईएल -6, आईएल -1 , टीएनएफ -α और पीजीई 2 साइटोकिन्स का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। (बी) फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके विभेदन अवधि के दौरान दिन 0, दिन 2 और दिन 5 में कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया था। सेल सतह मार्करों को चिह्नित करने के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था: (ए-सी) सीडी 14; (d-f) सीडी 1 ए, और (जी-आई) एचएलए-डीआर (एमएचसी वर्ग द्वितीय)। आंकड़ा कम से कम तीन स्वतंत्र परखों के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम दिखाता है। पेटेंट WO2017002045A1 के अनुसार पैनल (बी) को विदिरा एट अल.40 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कोशिका की सतह से 2,6- और 2,3-लिंक्ड साइलिक एसिड को हटाने के लिए मानव मो-डीसी का सियालिडेज़ उपचार। (ए) सियालिडेज़ उपचार की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए लेक्टिन स्टेनिंग का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मो-डीसी का विश्लेषण। मानव मो-डीसी का इलाज सियालिडेज़ (ग्रे बार) या अनुपचारित (सफेद सलाखों) के साथ किया गया था और एसएनए लेक्टिन ([2,6]-सियालिक एसिड को पहचानना), एमएए लेक्टिन ([2,3]-सियालिक एसिड को पहचानना), और पीएनए लेक्टिन (टी एंटीजन-गैल्1-3 गैलना1-सेर / टीएचआर को पहचानना) के साथ दाग दिया गया था। मान कम से कम तीन स्वतंत्र परखों की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व को दो पूंछ वाले युग्मित टी-टेस्ट (*P < 0.05 या **P < 0.0001) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था α, जो अनुपचारित और सियालिडेज़-उपचारित डीसी के बीच अंतर का उल्लेख करता है। सियालिडेज़ उपचार के बाद α (2,6) से जुड़े सियालिक एसिड को हटाने से एसएनए धुंधला पन में कमी का पता चला था। (बी) मो-डीसी की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी को सियालिडेज़ के साथ इलाज किया गया और अवलोकन के लिए कवरलिप्स पर तैयार किया गया। विभिन्न कोशिकाओं से जेड-स्टैक छवियों की एक श्रृंखला एकत्र की गई थी और औसत धुंधला तीव्रता को शामिल करने के लिए संसाधित किया गया था। स्केल बार: 20 μm. पैनल (ए) सिल्वा एट अल .30 से संशोधित किया गया है; पैनल (बी) सिल्वा एट अल 29 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: परिपक्वता मार्करों की उच्च अभिव्यक्ति को प्रेरित करने वाले मो-डीसी का सियालिडेज़ उपचार। (ए) सियालिडेज़ के साथ इलाज किए गए मो-डीसी ने पूरी तरह से सिलिलेट मो-डीसी की तुलना में उच्च परिपक्वता फेनोटाइप दिखाया। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग कई परिपक्वता मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। एमओ-डीसी को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सियालिडेज़ के साथ इलाज किया गया था; ग्राफ मान कम से कम तीन स्वतंत्र परखों के औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) (औसत ± एसईएम) का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतरों की गणना टी-टेस्ट (* पी < 0.05, ** पी < 0.01) का उपयोग करके की गई थी, जो अनुपचारित और सियालिडेज़-उपचारित स्थितियों के बीच अंतर का उल्लेख करती है। (बी) पूरे ट्यूमर एंटीजन से भरे हुए डेसिलेटेड मानव एमओ-डीसी ने विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित किया। एमओ-डीसी को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सियालिडेज़ के साथ इलाज किया गया था या अनुपचारित छोड़ दिया गया था, इसके बाद पूरे ट्यूमर सेल एंटीजन के स्रोत के रूप में एमसीएफ -7 लाइसेट (टीएल) के साथ लोड किया गया था। एमओ-डीसी और ऑटोलॉगस टी-कोशिकाओं के बीच सह-संस्कृति आईएल -2 (10 यू / एमएल) की उपस्थिति में 4-8 दिनों के लिए की गई थी। डेसिलिएटेड मो-डीसी के साथ प्राइमेड टी-कोशिकाओं ने टीएच 1 साइटोकिन, आईएफएन -γ का काफी अधिक स्राव दिखाया। एमओ-डीसी के साथ टी-सेल उत्तेजना के बाद, सह-संस्कृति सुपरनैटेंट में स्रावित साइटोकिन्स को एलिसा (एन = 7) द्वारा मापा गया था। ग्राफ मान एकाग्रता (pg/mL) (औसत ± SEM) का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर ों की गणना टी-टेस्ट (* पी < 0.05) का उपयोग करके की गई थी। आंकड़ा सिल्वा एट अल .30 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मानव एमओ-डीसी की व्यवहार्यता पर सियालिडेज़ उपचार के प्रभाव की कमी। अनुपचारित एमओ-डीसी (बाएं पैनल) और सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी (दाएं पैनल) को एनेक्सीन वी और 7-एएडी के साथ दोहरे धुंधलापन के अधीन किया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा धुंधलापन का विश्लेषण किया गया था। डेटा ने अनुपचारित और सियालिडेज़-उपचारित कोशिकाओं के बीच सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया, यह सुझाव देते हुए कि मो-डीसी सियालिडेज़ उपचार को सहन कर सकते हैं और अपने प्रतिरक्षाविज्ञानी कार्य को लागू करने के लिए व्यवहार्य बने रह सकते हैं। आंकड़ा सिल्वा एट अल .30 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

मोनोसाइट अलगाव;
यह पांडुलिपि मानव-पृथक मोनोसाइट्स सीडी 14 + (चित्रा 1 ए) से मो-डीसी उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है, इसके बाद इन कोशिकाओं की सतह पर सियालिक एसिड सामग्री को कम करने के लिए एक सियालिडेज़ उपचार किया जाता है।

मानव डीसी प्राप्त करने के विभिन्न तरीके हैं, जैसे कि परिधीय रक्त या ऊतकों से सीधे या स्टेम सेल या मोनोसाइट्स जैसे अग्रदूतों से भेदभाव के माध्यम से। परिधीय रक्त से अलग मोनोसाइट्स से विभेदित डीसी प्राप्त करना अन्यडीसी स्रोतों की तुलना में उच्च मात्रा में मोनोसाइट्स प्राप्त करने में आसानी के कारण कहीं अधिक सरल है। फिर भी, पृथक मोनोसाइट्स का एक उच्च प्रतिशत प्राप्त करने के लिए, सभी प्रोटोकॉल चरणों का सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, घनत्व ढाल माध्यम कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है, और कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए, किसी को घनत्व ढाल माध्यम के साथ लंबे समय तक सेल संपर्क से बचना चाहिए और कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोना चाहिए। सेल व्यवहार्यता के नुकसान से बचने के लिए सेल हेरफेर को जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। पीबीएमसी से, मोनोसाइट्स को चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) विधि का उपयोग करके सकारात्मक चयन के माध्यम से अलग किया जा सकता है, जो उच्च संख्या में मोनोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक उपयुक्त तकनीक है। इसके अलावा, अन्य मोनोसाइट चयन विधियों की तुलना में, एमएसीएस-पृथक मोनोसाइट्स से प्राप्त मो-डीसी में एंटी-ट्यूमर टी-सेल गतिविधिको उत्तेजित करने की अधिक क्षमता होती है। इस प्रोटोकॉल में, एक बार अलग होने के बाद, मोनोसाइट्स को अपरिपक्व एमओ-डीसी (चित्रा 1) में भेदभाव प्राप्त करने के लिए 5-6 दिनों की अवधि के लिए आईएल -4 और जीएम-सीएसएफ के साथ इनक्यूबेट किया गया था। परिणामों से पता चला कि रूपात्मक (चित्रा 1 ए) और फेनोटाइपिक रूप से (चित्रा 1 बी), पृथक मोनोसाइट्स अपरिपक्व मो-डीसी में विभेदित होते हैं। इसके अलावा, भेदभाव के दौरान, एमओ-डीसी ने सीडी 14 मार्करों की अभिव्यक्ति खो दी और सीडी 1 ए और एमएचसी -2 (चित्रा 1 बी) की अभिव्यक्ति प्राप्त की, जो टी-कोशिकाओं को एंटीजन प्रस्तुति के लिए आवश्यक हैं।

मो-डीसी में मोनोसाइट्स का यह अलगाव और भेदभाव इस प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं। अलगाव प्रक्रिया एक संवेदनशील कदम है जिसे कोशिका मृत्यु से बचने के लिए सावधानीपूर्वक और तेजी से निष्पादित किया जाना चाहिए, और यह कदम हर बार एक नए प्रयोग के लिए मो-डीसी की आवश्यकता होने पर भी किया जाना चाहिए। भेदभाव प्रक्रिया में 5-6 दिन लगते हैं जो उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए इस विधि को नियोजित करने के मामले में कठिनाई पैदा करता है। बहरहाल, अलगाव विधि और मो-डीसी को अलग करने के लिए साइटोकिन्स का उपयोग प्रयोग उद्देश्यों के लिए विट्रो में उच्च संख्या में कार्यात्मक मो-डीसी उत्पन्न करने के लिए उपयोगी हैं। इस प्रोटोकॉल में उत्पन्न मो-डीसी सियालिडेज़ उपचार, फ्लो साइटोमेट्री, एलिसा, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, और इतने पर से गुजरने में सक्षम हैं, इस प्रकारइस विधि के महत्व और उपयोगिता पर जोर देते हैं।

अपरिपक्व मो-डीसी और सियालिडेज़ उपचार।
सियालिडेज़ सिनाइलेशन विनियमन में आवश्यक हैं और सेल सतह ग्लाइकेन से सियालिक एसिड को हटाने के लिए जिम्मेदार हैं। मो-डीसी में, सियालिडेज़ द्वारा सियालिक एसिड हटाने से इन कोशिकाओं की परिपक्वता होती है, जो एंटीजन-क्रॉस प्रस्तुति और बाद में टी-सेल सक्रियण और एंटी-ट्यूमर गतिविधि30 को बढ़ाती है।

परिपक्व एमओ-डीसी31,43 की तुलना में अपरिपक्व मानव एमओ-डीसी सेल सतह α (2,6)- और α (2,3)-लिंक्ड सियालिक एसिड27 की उच्च सामग्री प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, सियालिडेज़ के साथ मो-डीसी का इलाज करके सियालिक एसिड को हटाने से डीसी 28,30,31 की परिपक्वता में सुधार होता है। इस प्रयोग के लिए चुना गया सियालिडेज़ जीवाणु क्लोस्ट्रीडियम पेरिंजन्स से था।फिर भी, अन्य जीव भी सियालिडेस का उत्पादन करते हैं, जैसे कि बैक्टीरिया स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया, विब्रियो कोलेरा, या साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम44, जोंक मैकरोडेला डेकोरा45, और यहां तक कि होमो सेपियन्स46, और इन जीवों से सियालिडेज़ का भी प्रयोगात्मक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, प्रत्येक सियालिडेज़ में अलग-अलग सब्सट्रेट विशिष्टताएं होती हैं। इसके अतिरिक्त, सियालिडेज़ एंजाइम का उपयोग करने की अपनी सीमाएं हो सकती हैं; उदाहरण के लिए, उपचार के दौरान एमओ-डीसी का हेरफेर इन कोशिकाओं को और उत्तेजित कर सकता है। इसके अलावा, सियालिडेज़ की मात्रा और इनक्यूबेशन समय का उपयोग की जा रही कोशिकाओं के प्रकार और उनकी सियालिक एसिड संरचना के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। सियालिक एसिड हटाने एक स्थायी प्रभाव नहीं है, बल्कि एक क्षणिक घटना है, क्योंकि सेल अपनी सेल सतह सियालिक एसिड सामग्री को बहाल करेगा। सियालिडेज़ के अलावा, कोशिकाओं की सतह पर सियालिक एसिड अणुओं को कम करने के अन्य तरीके हैं, जैसे कि सिएलिट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर का उपयोग करना, सिएलिट्रांसफेरेज़ जीन के जीन नॉकआउट, या सियालिक एसिड मिमेटिक्स47,48,49 का उपयोग करके सियालिक एसिड की चयापचय नाकाबंदी। बहरहाल, ये विधियां कोशिकाओं पर अलग-अलग प्रभाव पेश कर सकती हैं, और डिसिलेशन के अलावा, सेल व्यवहार्यता पर विचार किया जाना चाहिए। सेल व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए सेल सतह साइलिक एसिड को प्रभावी ढंग से और क्षणिक रूप से हटाने के लिए सियालिडेज़ एंजाइम उपचार एक व्यावहारिक विधि है।

इस काम में, 500 mU / 5 x 106 कोशिकाओं / mL की एकाग्रता पर अपरिपक्व mo-DCs में सियालिडेज़ जोड़ा गया था, और कोशिकाओं को 60 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट किया गया था। सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करने और सीरम 30 में मौजूद सिलिलेटेड अणुओं के बीच किसी भी बातचीत से बचने के लिए सीरम के बिना आरपीएमआई -1640 का उपयोग करके उपचार किया गया था। सियालिडेज़ उपचार आरपीएमआई के अलावा अन्य बफर के साथ किया जा सकता है, जैसे कि 50 एमएम सोडियम एसीटेट, पीएच 5.1 (सी परफिंगेंस सियालिडेज़ के मामले में), या पीबीएस50,51,52। बहरहाल, आरपीएमआई -1640 डीसी के लिए सबसे आम संस्कृति माध्यम है क्योंकि यह प्रक्रिया के दौरान निरंतर प्रयोगात्मक स्थितियों को बनाए रखता है, परिपक्वता को प्रेरित करने से बचता है, और किसी भी तनाव को कम करता है जो सियालिडेज़ बफर या पीबीएस53,54,55,56 के कारण हो सकता है। सियालिडेज़ के साथ इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को सीरम-पूरक माध्यम से अच्छी तरह से धोना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि एंजाइम प्रतिक्रिया बंद हो गई है। सीरम में सिलिलेटेड अणुओं की उपस्थिति सियालिडेज़ के लिए सब्सट्रेट के रूप में प्रतिस्पर्धा करेगी, इस प्रकार तेजी से प्रतिक्रिया रोकने का आश्वासन देगी।

फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा सतह मार्कर लक्षण वर्णन।
साइलिक एसिड प्रोफाइल के निर्धारण के लिए, प्रोटोकॉल खंड 3 में, हमने फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के बाद लेक्टिन स्टेनिंग का उपयोग किया। सेल धुंधला प्रक्रिया के लिए, दोनों मामलों में, लेक्टिन सांद्रता और इनक्यूबेशन स्थितियों को सेल एग्लूटीनेशन और मृत्यु से बचने के लिए अनुकूलित किया गया था। लेक्टिन के गैर-विशिष्ट बंधन से बचने के लिए एफबीएस या बीएसए के कम से कम 2% वाले बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, 10% एफबीएस युक्त आरपीएमआई -1640 का उपयोग निरंतर प्रयोगात्मक स्थितियों को बनाए रखने और सेल तनाव से बचने के लिए किया गया था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के संबंध में, आकृति विज्ञान को संरक्षित करने, ऑटोलिसिस को रोकने और एंटीजेनिसिटी को बनाए रखने के लिए धुंधला होने से पहले कोशिकाओं का निर्धारण आवश्यक है।

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मो-डीसी फेनोटाइप के विश्लेषण से पता चला है कि सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी में एमएमए और एसएनए लेक्टिन की तुलना में सेल की सतह से बंधे पीएनए लेक्टिन की काफी अधिक मात्रा थी, जो सियालिडेज़ उपचार के बाद कम हो गई (चित्रा 2 ए)। जैसा कि अपेक्षित था, पीएनए धुंधलापन बढ़ गया, क्योंकि पीएनए एमएए और एसएनए के विपरीत गैर-सिलीलेटेड एंटीजन को पहचानता है, जो क्रमशः 2,3- और 2,6-सियालिक एसिड से सीधे जुड़तेहैं। यह धुंधलापन इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सेल की सतह से सियालिक एसिड के प्रभावी निष्कासन की पुष्टि करता है। एक अन्य विधि जिसका उपयोग उपचार को मान्य करने और सेल सतह साइलिक एसिड सामग्री का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, वह लेक्टिन धुंधला है, जिसके बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी है, जैसा कि चित्रा 2 बी में उदाहरण दिया गया है।

पूर्व उदाहरणों के अलावा, सियालिक एसिड सामग्री का मूल्यांकन और विशेषता करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण मौजूद हैं, जैसे कि पश्चिमी सोख्ता द्वारा लेक्टिन जांच। वैकल्पिक साइलिक एसिड-विशिष्ट लेक्टिन भी उपलब्ध हैं, जैसे कि सिगल्स, लेक्टिन का एक समूह जिसमें साइलिक एसिड प्रकारों और लिंकेज57 के लिए एक अलग प्राथमिकता है। किसी भी तकनीक (फ्लो साइटोमेट्री, माइक्रोस्कोपी, या वेस्टर्न ब्लॉट) में लेक्टिन का उपयोग करने के अलावा, एंटीबॉडी का उपयोग करके सियालिक एसिड सामग्री को चिह्नित करना भी संभव है; उदाहरण के लिए, 2,8-सियालिक एसिड का मूल्यांकन क्लोन 735 जैसे एंटीबॉडी द्वारा किया जा सकता है, जो पॉलीसिलिक एसिड58 के लिए विशिष्ट है। इसके अलावा, सियालिडेज़ उपचार के बाद, कोशिकाओं को उनके फेनोटाइप और टी-कोशिकाओंको सक्रिय करने की क्षमता का मूल्यांकन करके उनकी जैविक या चिकित्सीय दक्षता के लिए कार्यात्मक रूप से परीक्षण किया जा सकता है। वास्तव में, जैसा कि प्रदान किए गए उदाहरणों में दिखाया गया है, सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी ने उच्च परिपक्वता फेनोटाइप दिखाया, साथ ही एंटीजन-प्रेजेंटिंग और सह-उत्तेजक अणुओं की एक उन्नत अभिव्यक्ति भी दिखाई।

इसके अलावा, सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी को एंटीजन के साथ लोड किया जा सकता है और टी-कोशिकाओं या अन्य कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत किया जा सकता है और फिर फेनोटाइप, साइटोकिन स्राव प्रोफ़ाइल या अन्य विशेषताओं के बारे में अध्ययन किया जा सकता है। प्रदान किए गए उदाहरण में, डेटा से पता चलता है कि सियालिडेज़-उपचारित मो-डीसी को ट्यूमर एंटीजन के साथ लोड किया जा सकता है और फिर टी-कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। वास्तव में, परिणामी टी-कोशिकाओं ने आईएफएन -γ स्राव में वृद्धि दिखाई, जो टी-कोशिकाओं 27,28,29,30,31 को सक्रिय करने के लिए एमओ-डीसी की क्षमता को बढ़ाने पर सियालिक एसिड की कमी के प्रभाव पर पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल सियालिडेज़ के साथ उपचार द्वारा सियालिक एसिड सामग्री हेरफेर के लिए एमओ-डीसी उत्पन्न करने के लिए एक व्यवहार्य, व्यवहार्य और व्यावहारिक विधि दिखाता है। यह प्रोटोकॉल एक पद्धति प्रस्तुत करता है जो विभिन्न उद्देश्यों और अनुप्रयोगों की सेवा कर सकता है। यह विधि न केवल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की परिपक्वता और प्रतिक्रिया में सियालिक एसिड की भूमिका को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है, बल्कि इसका उपयोग इम्यूनोमॉड्यूलेटरी टूल के रूप में भी किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों या हितों के अन्य टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक यूरोपीय आयोग ग्लाइकोट्विनिंग जीए 101079417 और ईजेपीआरडी / 0001/2020 यूरोपीय संघ 825575 से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं; एफसीटी 2022.04607.पीटीडीसी, यूआईडीपी/04378/2020, यूआईडीबी/04378/2020 (यूसीआईबीओ), और एलए/पी/0140/2020 (आई4एचबी) अनुदान के तहत पुर्तगाल के लिए फंडाको को मंजूरी दी गई है। एफसीटी-नोवा। और स्टेममैटर्स को फंडो यूरोपू डी डेसेनवोल्विमेंटो रीजनल (फेडर) द्वारा भी वित्त पोषित किया गया था, जो एसआई आई एंड आई के लिए प्रोग्राम ओपेरा रीजनल डो नॉर्ट (नॉर्ट 2020) के माध्यम से था। डीटी डीसीमैटर्स परियोजना (NORTE-01-0247-FEDER-047212)। हम एफसीटी-नोवा और ग्लाइकोविड नोवा साउड में बायोलैब्स सुविधा को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube AstiK’s CTGP-E15-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
24-well plate Greiner Bio-one 662 160 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
50 mL conical tube AstiK’s CTGP-E50-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) BioLegend 420404 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Annexin V Immunotools 31490013 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific  Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
BSA Sigma - Aldrich A3294-100G Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile
CD14 (Monoclonal TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
CD80 Immunotools 21270803 Maturation Profiling of mo-DCs
CD86 Immunotools 21480863 Maturation Profiling of mo-DCs
Cell counting slides and trypan blue EVE EVS-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Centrifuge Eppendorf 5430 R Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Density gradient medium (Histopaque) Sigma - Aldrich 10771-100ML Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
EDTA Gibco, ThermoFisher 15400054 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Elisa kit (IFN-γ) Immunotools 31673539 Maturation Profiling of mo-DCs
EVE automated cell count NanoEntek 10027-452 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500064 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Miltenyi Biotec   130-093-864 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) Miltenyi Biotec 130-050-201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-1β Sigma - Aldrich I9401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-4 Miltenyi Biotec 130-093-919 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-6 Sigma - Aldrich SRP3096 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
L-glutamine Gibco A2916801 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
LS column and plunger Miltenyi Biotec 130-042-401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin - Biotinylated) Vector labs B-1265-1 Determination of Sialic Acid Profile
MHC-I (HLA-ABC) Immunotools 21159033 Maturation Profiling of mo-DCs
MHC-II (HLA-DR) Immunostep HLADRA-100T Maturation Profiling of mo-DCs
Microtubes AstiK’s PCRP-E015-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Neuraminidase (Sialidase) Roche 11585886001 Treatment of Cells with Sialidase
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Paraformaldehyde (PFA 2%) Polysciences Europe 25085-1 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Paraformaldehyde (PFA 4%) Biotium 22023 Determination of Sialic Acid Profile
Pasteur pipettes Labbox PIPP-003-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin - FITC) Vector labs FL-1071 Determination of Sialic Acid Profile
Penicillin/streptomycin Gibco 15140163 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) NZYTech   MB18201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Prostaglandin E2 (PGE2) Sigma - Aldrich P0409 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RBC lysis buffer BioLegend 420302 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) Gibco 31870074 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - Biotinylated) Vector labs   B-1305-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - FITC) Vector labs FL-1301-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sodium pyruvate Thermofisher 11360-070 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
SpectroMax190 Molecular Devices Maturation Profiling of mo-DCs
Streptavidin-PE BioLegend   405203 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma - Aldrich T0440 Maturation Profiling of mo-DCs
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) Sigma - Aldrich H8916 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Zeiss LSM710 confocal microscope Zeiss Determination of Sialic Acid Profile

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References

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Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral, P., Tanwar, A., Paterson, R. L., Videira, P. A. Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes. J. Vis. Exp. (200), e65525, doi:10.3791/65525 (2023).

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