Summary
Le protocole décrit la méthodologie de l’enregistrement extracellulaire dans le cortex moteur (MC) pour révéler les propriétés électrophysiologiques extracellulaires chez les souris conscientes se déplaçant librement, ainsi que l’analyse des données des potentiels de champ locaux (LFP) et des pointes, ce qui est utile pour évaluer l’activité neuronale du réseau sous-jacente aux comportements d’intérêt.
Abstract
Le protocole vise à découvrir les propriétés de l’activation neuronale et des potentiels de champ local en réseau (LFP) chez des souris se comportant effectuant des tâches spécifiques en corrélant les signaux électrophysiologiques avec un comportement spontané et/ou spécifique. Cette technique représente un outil précieux dans l’étude de l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents à ces comportements. L’article fournit une procédure détaillée et complète pour l’implantation d’électrodes et l’enregistrement extracellulaire qui en résulte chez des souris conscientes qui se déplacent librement. L’étude comprend une méthode détaillée pour implanter les réseaux de microélectrodes, capturer les signaux de LFP et de pic neuronal dans le cortex moteur (MC) à l’aide d’un système multicanal, et l’analyse ultérieure des données hors ligne. L’avantage de l’enregistrement multicanal chez les animaux conscients est qu’un plus grand nombre de neurones et de sous-types neuronaux peuvent être obtenus et comparés, ce qui permet d’évaluer la relation entre un comportement spécifique et les signaux électrophysiologiques associés. Notamment, la technique d’enregistrement extracellulaire multicanal et la procédure d’analyse des données décrites dans la présente étude peuvent être appliquées à d’autres zones du cerveau lors de la réalisation d’expériences sur des souris qui se comportent.
Introduction
Le potentiel de champ local (LFP), une composante importante des signaux extracellulaires, reflète l’activité synaptique de grandes populations de neurones, qui forment le code neuronal de multiples comportements1. Les pics générés par l’activité neuronale sont considérés comme contribuant à la LFP et sont importants pour le codage neuronal2. Il a été prouvé que les altérations des pics et des LFP sont à l’origine de plusieurs maladies du cerveau, telles que la maladie d’Alzheimer, ainsi que d’émotions telles que la peur, etc.3,4. Il convient de noter que de nombreuses études ont mis en évidence que l’activité des pics diffère considérablement entre les états d’éveil et d’anesthésie chez les animaux5. Bien que les enregistrements chez les animaux anesthésiés offrent la possibilité d’évaluer les LFP avec un minimum d’artefacts dans des états de synchronisation corticale hautement définis, les résultats diffèrent dans une certaine mesure de ce que l’on peut trouver chez les sujets éveillés 6,7,8. Ainsi, il est plus significatif de détecter l’activité neuronale sur de longues échelles de temps et de grandes échelles spatiales dans diverses maladies à l’état de cerveau éveillé à l’aide d’électrodes implantées dans le cerveau. Ce manuscrit fournit des informations pour les débutants sur la façon de créer le système de micro-entraînement et de régler les paramètres à l’aide d’un logiciel commun pour calculer les signaux de pointe et LFP de manière rapide et simple afin de démarrer l’enregistrement et l’analyse.
Bien que l’enregistrement non invasif des fonctions cérébrales, par exemple à l’aide d’électroencéphalogrammes (EEG) et de potentiels liés aux événements (ERP) enregistrés à partir du cuir chevelu, ait été largement utilisé dans les études sur les humains et les rongeurs, les données EEG et ERP ont de faibles propriétés spatiales et temporelles et, par conséquent, ne peuvent pas détecter les signaux précis produits par l’activité synaptique dendritique voisine dans une zone spécifique du cerveau1. Actuellement, en tirant parti de l’enregistrement multicanal chez les animaux conscients, l’activité neuronale dans les couches profondes du cerveau peut être enregistrée de manière chronique et progressive en implantant un système de micro-entraînement dans le cerveau des primates ou des rongeurs lors de multiples tests comportementaux 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . En bref, les chercheurs peuvent construire un système de micro-entraînement qui peut être utilisé pour le positionnement indépendant des électrodes ou des tétrodes afin de cibler différentes parties du cerveau10,11. Par exemple, Chang et al. ont décrit des techniques permettant d’enregistrer les pics et les LFP chez la souris en assemblant un micro-lecteur léger et compact12. De plus, des sondes en silicium micro-usinées avec des composants accessoires sur mesure sont disponibles dans le commerce pour enregistrer plusieurs neurones et LFP chez les rongeurs lors de tâches comportementales13. Bien que différents modèles aient été utilisés pour l’assemblage de systèmes de micro-entraînement, ceux-ci ont encore un succès limité en termes de complexité et de poids de l’ensemble du système de micro-entraînement. Par exemple, Lansink et al. ont montré un système de micro-entraînement multicanal avec une structure complexe pour l’enregistrement à partir d’une seule région du cerveau14. Sato et al. ont fait état d’un système de micro-entraînement multicanal affichant une fonction de positionnement hydraulique automatique15. Les principaux inconvénients de ces systèmes de micro-entraînement sont qu’ils sont trop lourds pour que les souris puissent se déplacer librement et qu’ils sont difficiles à assembler pour les débutants. Bien que l’enregistrement extracellulaire multicanal se soit avéré être une technologie appropriée et efficace pour mesurer l’activité neuronale lors de tests comportementaux, il n’est pas facile pour les débutants d’enregistrer et d’analyser les signaux acquis par le système complexe de micro-entraînement. Étant donné qu’il est difficile de démarrer l’ensemble du processus de fonctionnement de l’enregistrement extracellulaire multicanal et de l’analyse des données chez les souris en mouvement libre16,17, le présent article présente des directives simplifiées pour introduire le processus détaillé de fabrication du système de micro-entraînement à l’aide de composants et de paramètres couramment disponibles ; les paramètres du logiciel commun pour calculer les signaux de pointe et LFP de manière rapide et simple sont également fournis. De plus, dans ce protocole, la souris peut se déplacer librement grâce à l’utilisation d’un ballon d’hélium, ce qui contribue à compenser le poids de la tête et du système de micro-entraînement. De manière générale, dans la présente étude, nous décrivons comment construire facilement un système de micro-entraînement et optimiser les processus d’enregistrement et d’analyse des données.
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Protocol
Toutes les souris ont été obtenues commercialement et maintenues dans un cycle de lumière de 12 h / 12 h d’obscurité (lumière allumée à 08h00 heure locale) à une température ambiante de 22-25 °C et une humidité relative de 50%-60%. Les souris avaient accès à un approvisionnement continu en nourriture et en eau. Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université normale de Chine du Sud et approuvées par le Comité institutionnel d’éthique animale. Des souris mâles C57BL/6J âgées de 3 à 5 mois ont été utilisées pour les expériences.
1. Assemblage du système de micro-entraînement
- Connectez deux cartes conçues par ordinateur à l’aide de deux goujons et d’une vis qui maintient le micro-variateur mobile et fixez le connecteur à une carte (Figure 1A, Bi-iii). Entraînez le micro-entraînement en tournant une vis (0,5 mm/cercle).
- Assurez-vous que le micro-entraînement peut transporter deux ensembles de huit tubes de guidage (~3 cm de long, ~50 μm de diamètre interne, ~125 μm de diamètre externe) pour chaque côté de la région MC, puis coupez-le à la même longueur (au moins 15 mm ; Graphique 1Biv, v).
- Coupez 16 fils Ni-chrome (~5 cm de long) d’un diamètre de 35 μm, puis chargez-les successivement dans les tubes de guidage, puis appliquez la colle pour les fixer (Figure 1Bi, vi, vii).
- Dénudez l’isolant du fil, enroulez successivement chaque fil exposé à chaque broche du connecteur en suivant la carte des canaux, ainsi que les électrodes de référence et de terre, puis appliquez lentement de la peinture conductrice sur chaque broche (Figure 1Bviii-x).
- Recouvrez les broches à l’aide d’une résine époxy (Figure 1Axi, xii), puis effectuez un placage à l’or à l’aide d’un testeur d’impédance pour réduire l’impédance des pointes d’électrode à ~350 kOhm (Figure 1Bxiii, xiv). Réglez les paramètres du testeur d’impédance comme suit : −10,08 μA courant continu pendant 1 s avec une solution de placage d’or, dont 5 mM PtCl4.
- Enfin, déplacez le micro-lecteur vers le haut en tournant une vis. Vérifiez la taille globale du système de micro-entraînement modifié comme indiqué à la figure 1A (environ 15 mm de long, 10 mm de largeur, 20 mm de hauteur, ~1 g de poids). Vérifiez les spécifications détaillées de la carte et du composant mobile conçus par ordinateur à la figure 1Ai, ii.
2. Implantation d’un réseau d’électrodes
- Stérilisez les trousses chirurgicales, portez des gants stériles et enfilez la blouse blanche stérile d’un médecin avant le début de l’opération.
- Pour gérer la douleur, utiliser une injection sous-cutanée (s.c.) de méloxicam injectable (5 mg/kg) pour la souris dans une chambre d’induction. Anesthésier ensuite la souris par une injection intrapéritonéale (i.p.) de pentobarbital (80 mg/kg) dans une chambre d’induction18,19. Appliquez une dose supplémentaire de pentobarbital (20 mg/kg/h) si le réflexe de pincement des orteils est toujours présent.
- Fixez la souris dans un appareil stéréotaxique et maintenez sa température rectale à 37 °C à l’aide d’un régulateur de température.
- Appliquez une pommade ophtalmique à la tétracycline sur les deux yeux de la souris et changez à nouveau de gants stériles avant la chirurgie.
- Rasez la fourrure de la souris et désinfectez le site chirurgical avec trois cycles alternés de gommage à la bétadine et d’alcool à l’aide d’un applicateur stérile à embout de coton en cercles concentriques en commençant par le centre et en allant vers l’extérieur (Figure 2i, ii). Faites une petite incision médiane (~15 mm) pour exposer son crâne. Immédiatement, appliquez localement la lidocaïne à 1 % sur les muscles du cou pour soulager la douleur. Ensuite, retirez le tissu résiduel à l’aide de ciseaux et nettoyez le crâne à l’aide de cotons-tiges enduits de solution saline (Figure 2iii).
- À l’aide d’une microélectrode en verre remplie d’encre, marquez les emplacements souhaités de la MC bilatérale pour l’implantation (Figure 2iv, v). Sur la base d’une étude antérieure 20, les emplacements de la MC bilatérale sont les suivants : 0,74 mm en avant du bregma et1,25 mm latéralement à la ligne médiane.
- Implantez quatre vis en acier inoxydable (0,8 mm de diamètre) pour protéger le système de micro-entraînement, puis reliez toutes les vis entre elles avec les électrodes de référence et de masse, puis recouvrez avec un mélange de ciment dentaire pour former des parois (Figure 2vi-xi).
- Percez soigneusement deux petits trous (~1,5 mm2) à l’aide d’une perceuse à crâne sur les côtés gauche et droit du crâne coordonné dans les régions MC (Figure 2xii). Utilisez les coordonnées stéréotaxiques de la MC bilatérale : 0,74 mm en avant du bregma, 1,25 mm latéralement à la ligne médiane et 0,5 mm ventrale à la dure-mère.
- Retirez délicatement la dure-mère des trous à l’aide d’une pince fine (figure 2xiii).
- Insérez le système de micro-entraînement au centre des trous à l’aide d’un micromanipulateur à 10 μm/s (Figure 2xiv-xvii).
- Versez la vaseline dans les parois en ciment dentaire après avoir terminé l’insertion du système de micro-entraînement (Figure 2xviii).
- Joignez la plaque inférieure du système de micro-entraînement et les parois en ciment dentaire avec le ciment dentaire mélangé (Figure 2xix)
- Lavez l’incision avec une solution saline suivie d’un traitement local avec un gel contenant du chlorhydrate de lincomycine et du chlorhydrate de lidocaïne pour soulager la douleur post-chirurgicale.
- Enroulez le ruban adhésif en feuille de cuivre conducteur autour du système de micro-entraînement implanté (Figure 2xx).
- Déplacez la souris dans une cage maintenue à 31-33 °C et surveillez la souris pour qu’elle se remette de l’anesthésie.
- Laissez les souris récupérer pendant 1 semaine avec une alimentation séparée. Vérifiez et traitez l’incision avec 3 jours d’application continue d’un gel contenant du chlorhydrate de lincomycine et du chlorhydrate de lidocaïne.
3. Enregistrement multicanal dans le MC bilatéral chez les souris en mouvement libre
- Tenez la tête d’une souris éveillée légèrement et soigneusement. Déplacez-vous vers le bas des réseaux d’électrodes (~0,1 mm de profondeur) en tournant la vis sur la partie mobile du système de micro-entraînement (Figure 1Aii) au moins 1 jour à l’avance.
- Tenez la tête de la souris éveillée légèrement et soigneusement. Reliez le centre de la scène et un ballon d’hélium (rempli d’environ 0,02 L d’hélium) à l’aide d’un filetage pour compenser le poids de la tête de scène et du système de micro-entraînement (Figure 3A, B).
- Capturez les signaux bruts à l’aide des électrodes d’enregistrement et des systèmes multicanaux en échantillonnant à 30 kHz dans le logiciel d’enregistrement, puis numérisez-les à l’aide d’un convertisseur numérique-analogique (DA) des systèmes multicanaux.
- Extrayez les signaux LFP des données brutes en les rééchantillonnant à 10 kHz dans le logiciel d’enregistrement, puis utilisez un filtre coupe-bande du logiciel d’enregistrement pour supprimer le bruit de ligne de 50 Hz.
- Enregistrez des données brutes dans un état stable à partir d’une souris en mouvement libre pendant au moins 60 s. Une fois l’enregistrement terminé, retirez lentement la connexion entre la tête de scène et le système de micro-entraînement et remettez la souris dans sa cage d’origine.
- Stockez les données enregistrées dans l’ordinateur et analysez-les hors ligne (Figure 4 et Figure 5).
- Une fois l’expérience terminée, effectuez l’euthanasie selon les directives de l’institut, puis confirmez l’emplacement des électrodes en utilisant l’alimentation à la sortie 3 V pour effectuer une lésion électrolytique de 1 minute, suivie d’une analyse histologique. Découpez le cerveau de la souris en tranches de 30 μm à l’aide d’un microtome de congélation, collectez les sections MC, puis capturez les images au microscope (Figure 3C, D).
4. Tri et analyse des pointes
- Cliquez sur Fichier > Ouvrir les fichiers > Nev dans le logiciel de tri des pointes pour ouvrir les données de pointes échantillonnées à 30 kHz (Figure 4Ai).
- Cliquez sur Info pour sélectionner le canal non trié, puis sélectionnez Trier > Modifier la méthode de tri > Utiliser les K-Means. Appuyez sur le bouton Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting pour obtenir les unités triées (Figure 4Aii, iii).
- Cliquez sur Fichier > Enregistrer sous, enregistrez les données de pointe triées avec une extension de nom de fichier .nev, puis sélectionnez Fichier > Exporter les données par forme d’onde pour exporter les résultats de l’ACP avec une extension de nom de fichier .txt (Figure 4Aiv).
- Cliquez sur Fichier > Importer des données > fichier Blackrock dans le logiciel d’analyse des données neurophysiologiques pour ouvrir le fichier de pointe trié (Figure 4Bi).
- Cliquez sur Analyse > Autocorrélogrammes pour obtenir l’autocorrélogramme de l’unité sélectionnée, puis définissez les paramètres comme suit : la valeur minimale X à −0,05 s, la valeur maximale X à 0,05 s et la valeur B à 0,001 (Figure 4Bii, iii).
- Chargez les données de pic triées, cliquez sur Analysis > Interspike Interval Histograms (Histogrammes d’intervalle d’interspike) pour obtenir l’histogramme d’intervalle inter-spike, puis définissez les paramètres comme suit : la valeur de l’intervalle min. à 0 s, la valeur de l’intervalle max. à 0,1 s et la valeur Bin à 0,001 (Figure 4Biv, v).
- Cliquez sur Analyse > Corrélations croisées pour obtenir le corrélogramme croisé entre deux événements unitaires triés, puis définissez les événements et paramètres de référence comme suit : la valeur minimale X à −0,1 s, la valeur maximale X à 0,1 s et la valeur Catégorie à 0,001 (Figure 4Bvi, vii).
- Cliquez sur Résultats > Résultats numériques pour enregistrer les résultats de l’autocorrélogramme, de l’histogramme d’intervalle inter-pics et du correlogram croisé avec .xls extensions de nom de fichier (Figure 4Bviii, ix). Analysez les données et dessinez le graphique.
5. Analyse LFP
- Cliquez sur File Import Data > Blackrock File dans le logiciel d’analyse des données neurophysiologiques pour ouvrir les données de signal continu échantillonnées à 10 kHz (Figure 5Ai).
- Cliquez sur Analyse > spectre pour le continu pour analyser le spectre de puissance du LFP à partir du canal sélectionné. Réglez les paramètres comme suit : le nombre de valeurs de fréquence à 8 192, la valeur des cônes multiples à 3-5, la normalisation du pourcentage de la densité spectrale de puissance totale (PSD) et la plage de fréquences de 1 Hz à 100 Hz (Figure 5Aii, iii).
- Cliquez sur Analyse > cohérence pour Continu pour analyser la cohérence de deux LFP à partir des côtés gauche et droit du MC. Définissez le canal de référence et les paramètres comme suit : Calculez aux valeurs de cohérence, le nombre de valeurs de fréquence à 8 192, la valeur des cônes multiples à 3-5 et la plage de fréquences de 1 Hz à 100 Hz (Figure 5Aiv, v).
- Cliquez sur Analysis > Corr. with Cont. Variables pour analyser la corrélation entre deux LFP à partir des côtés gauche et droit du MC. Définissez le canal de référence (données LFP) et les paramètres comme suit : la valeur minimale X à −0,1 s, la valeur maximale X à 0,1 s et la valeur Bin à 0,001 (Figure 5Avi, vii).
- Cliquez sur Résultats > Résultats numériques pour enregistrer les résultats de la DSP, de la cohérence et de la corrélation avec une extension de nom de fichier .xls (Figure 5Aviii, ix).
- Sélectionnez le canal pour lequel les traces représentatives doivent être extraites pour chaque bande de fréquences, cliquez sur Modifier > Filtrage numérique des variables continues pour obtenir chaque bande de fréquences, puis définissez les paramètres comme suit : la réponse de la fréquence du filtre en tant que passe-bande, l’implémentation du filtre à réponse impulsionnelle infinie (IIR) Butterworth et la valeur de l’ordre du filtre à 2. Enfin, définissez la plage de fréquences d’intérêt (Figure 5Bi-iv).
REMARQUE : Les gammes de fréquences utilisées ici étaient les suivantes : oscillations delta (δ, 1-4 Hz), thêta (θ, 5-12 Hz), bêta (β, 13-30 Hz), gamma faible (γ basse, 30-70 Hz) et gamma élevée (γ élevé, 70-100 Hz). - Analysez les données et dessinez le graphique.
6. Corrélations entre le pic et le LFP
- Cliquez sur Fichier > Importer des données > fichier Blackrock dans le logiciel d’analyse des données neurophysiologiques pour ouvrir les données de signal continu et les données de pointe.
- Cliquez sur Analyse > Analyse de cohérence pour analyser la cohérence entre les pointes et le LFP du canal sélectionné. Définissez la variable de référence (synchronisation des pics) et les paramètres comme suit : Calculer les valeurs de cohérence, le nombre de valeurs de fréquence à 512, la valeur des cônes multiples à 3-5 et la plage de fréquences de 1 Hz à 100 Hz (Figure 5Ci, ii).
- Cliquez sur Résultats > Résultats numériques pour enregistrer le résultat de la cohérence du champ de pointe avec une extension de nom de fichier .xls (Figure 5Ciii, iv).
- Analysez les données et dessinez le graphique.
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Representative Results
Un filtre passe-haut (250 Hz) a été appliqué pour extraire les pics multi-unités des signaux bruts (figure 6A). De plus, les unités enregistrées dans le MC d’une souris normale triées par ACP ont été vérifiées (Figure 7A-D), et la largeur de la vallée et la durée de la forme d’onde des unités dans le MC de la souris ont été enregistrées. Les résultats ont montré que la largeur de la vallée et la durée de la forme d’onde des neurones pyramidaux putatifs MC (Pyn) chez la souris sont plus élevées que celles des interneurones putatifs (IN) (Figure 7E, F ; test de Mann-Whitney à deux échantillons ; pour la largeur de la vallée, Pyn putatif : 0,636 ms ± 0,004 ms, IN putatif : 0,614 ms ± 0,001 ms, p = 0,002 ; pour la durée de la forme d’onde, putatif Pyn : 0,095 ms ± 0,004 ms, putatif IN : 0,054 ms ± 0,002 ms, p = 1,402 x 10−16), correspondant aux caractéristiques de Pyn et IN dans les études précédentes21. Nous avons également calculé le corrélogramme croisé entre Pyn putatif et IN en définissant les pics de Pyn putatifs comme référence et avons trouvé un pic positif à ~18 ms (Figure 7G), indiquant que le pic Pyn putatif se produit avant le pic putatif IN avec une fenêtre de ~18 ms.
Des traces représentatives de chaque bande de fréquences ont été filtrées à partir du LFP par le filtre IIR du logiciel pour l’analyse des données neurophysiologiques (Figure 6A). Dans l’analyse LFP, les LFP du MC gauche et droit chez les souris normales étaient similaires dans le spectre de puissance, ce qui suggère des activités synchronisées entre le MC gauche et droit (Figure 8A, B ; test de Mann-Whitney à deux échantillons ; pour δ, MC gauche : 50,71 ± 1,136, MC droit : 50,47 ± 1,213, p = 0,70 ; pour θ, MC gauche : 2,197 ± 0,187, MC droit : 2,068 ± 0,193, p = 0,40 ; pour β, MC gauche : 0,222 ± 0,058, MC droite : 0,206 ± 0,055, p = 0,70 ; pour les γ basses, MC gauche : 0,114 ± 0,034, MC droite : 0,093 ± 0,018, p = 0,70 ; pour les γ élevés, MC gauche : 0,054 ± 0,027, MC droit : 0,04 ± 0,015, p = 0,40). Nous avons ensuite calculé la cohérence et la corrélation entre le MC gauche et le MC droit (Figure 8C,D ; le LFP MC gauche suit dans une fenêtre de ~1,2 ms après le LFP MC droit, −1,167 ms ± 0,667 ms) et calculé l’amplitude du pic Pyn ou IN putatif synchronisé avec le LFP (1-100 Hz) dans le MC gauche d’une souris normale (Figure 8E). Cela a montré une faible cohérence γ plus forte pour l’IN putatif par rapport au Pyn.
Figure 1 : Schéma des électrodes et du système d’enregistrement multicanal. (A) Illustration du système de micro-entraînement. Je. Dessin et spécification de la carte conçue par ordinateur. ii. Schéma de principe du micro-entraînement mobile. (B) Système de micro-entraînement et marches à électrode unique mobiles multicanaux. Je. Les fils Ni-chrome ; ii. Les éléments constitutifs de l’électrode ; iii. Assemblage des cartes conçues par ordinateur ; iv. Assemblage préliminaire des électrodes, y compris les connecteurs et les huit tubes de guidage ; v. L’autre côté du micro-lecteur ; vi,vii. Les fils Ni-chrome sont successivement chargés dans les tubes de guidage ; viii-x. Chaque fil exposé est successivement enroulé à chaque broche, suivi d’un revêtement de peinture conductrice sur chaque broche ; xi,xii. Les broches sont recouvertes de résine époxy ; xiii,xiv. Placage à l’or. (C) Conception expérimentale de l’enregistrement extracellulaire dans le MC d’une souris en mouvement libre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Procédure chirurgicale étape par étape. i,ii. Rasez la fourrure de la souris et désinfectez le site chirurgical avec trois cycles alternés de gommage à la bétadine et d’alcool. iii. Nettoyez le crâne de la souris. iv. Mise à niveau. v. Marquez l’emplacement du cerveau. vi. Marquez les positions des vis en acier inoxydable. vii. Insérez des vis en acier inoxydable. viii. Reliez les vis ensemble avec les électrodes de référence et de masse. ix,x. Mélangez le ciment dentaire. xi. Construisez un mur avec du ciment dentaire. xii, xiii. Percez deux petits trous au-dessus du MC bilatéral, puis retirez la dure-mère. xiv. Préparez le système de micro-entraînement. xv-xix. Implanter le système de micro-entraînement suivi d’un traitement local avec un gel contenant du chlorhydrate de lincomycine et du chlorhydrate de lidocaïne pour soulager la douleur post-chirurgicale. xx. Protégez le système de micro-entraînement avec du ruban adhésif en feuille de cuivre conducteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Illustration d’un enregistrement à tête fixe dans une souris consciente. (A) Schéma de principe pour l’enregistrement en mouvement libre. (B) Détails des images de l’enregistrement en mouvement libre. Je. Forme en plan du système de micro-entraînement implanté ; ii. Tête de scène ; iii,iv. Le système de micro-entraînement et la tête de scène sont connectés ; v. Le ballon d’hélium est appliqué pour compenser le poids de la tête de l’étage et du système de micro-entraînement. (C) Illustration de la vérification de l’emplacement du site d’enregistrement à l’aide d’une lésion électrolytique. (D) Les sites d’enregistrement marqués par des lésions électrolytiques dans le MC d’une souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Illustration du tri et de l’analyse des pointes. (A) Les paramètres de regroupement des données de pointes et d’exportation des résultats. Je. Importez les données de pointe ; ii. Choisissez la méthode de tri ; iii. Trier les données de pic à l’aide de l’algorithme κ-means ; iv. Exportez les résultats de l’unité triée. (B) Le processus d’analyse de l’histogramme de l’intervalle entre les pointes, de l’autocorrélogramme et du corrélogramme croisé de l’unité triée. Je. Importez les données de pointe triées ; ii. Effectuer l’analyse d’autocorrélation ; iii. Définir les paramètres de l’autocorrélogramme ; iv. Obtenir l’histogramme de l’intervalle entre les pointes ; v. Définissez les paramètres de l’histogramme de l’intervalle entre les pics ; vi. Calculer la corrélation croisée entre les pointes des unités triées ; vii. Définir les paramètres du corrélogramme croisé ; VIII,ix. Exportez les résultats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Illustration de l’analyse continue des données. (A) Le processus et les paramètres d’analyse des signaux LFP qui ont été calculés à l’aide du spectre de puissance des LFP, de la cohérence et de la corrélation entre deux LFP. i. Importer les données LFP ; ii. Calculer la densité spectrale de puissance pour les LFP à partir du MC bilatéral ; Aiii. Calculer la densité spectrale de puissance pour le LFP ; iv,v. Calculer la cohérence entre les LFP ; vi,vii. Calculer la corrélation entre deux LFP. viii,ix. Exportez les résultats. (B) Le processus de filtrage de chaque gamme de fréquences à partir du signal LFP. i. Extraire les différentes bandes de fréquences des données LFP ; ii,iii. Affichez les LFP filtrés ; iv. Enregistrez les LFP filtrés en tant que métafichier amélioré. (C) Le processus d’analyse de la cohérence entre les pics neuronaux et la LFP. i,ii. Calculer la cohérence entre le LFP et les pointes triées ; iii,iv. Exportez les résultats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Traces représentatives des signaux enregistrés. Le pic a été filtré passe-haut à 250 Hz à partir des données brutes échantillonnées à 30 kHz. Le LFP était les données brutes échantillonnées à 10 kHz. δ était la bande de fréquences delta filtrée par passe-bande à 1-4 Hz à partir du LFP. θ était la bande de fréquences thêta filtrée à 5-12 Hz à partir du LFP. β’était la bande de fréquence bêta filtrée à 13-30 Hz à partir du LFP. Le γ bas était la bande de fréquences gamma basse filtrée à 30-70 Hz à partir du LFP. La haute γ était la bande de fréquences gamma élevée filtrée à 70-100 Hz à partir du LFP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Caractéristiques des unités triées et de leur mode de cuisson. (A,B) Les unités triées ont été regroupées à l’aide d’une analyse en composantes principales (ACP) à partir de la même électrode. (C,D) Autocorrélations (en haut) et histogrammes d’intervalle inter-spike (en bas) pour un neurone excitateur putatif (Pyn) et un neurone inhibiteur putatif (IN). (E) La largeur de la vallée du Pyn putatif était significativement plus élevée que celle de l’IN putatif (Pyn putatif : n = 1 055 pointes, IN putatif : n = 1 985 pointes). (F) La durée de la forme d’onde du Pyn putatif était plus forte que celle de l’IN putatif (Pyn putatif : n = 1 005 pointes, IN putatif : n = 1 059 pointes). (G) La corrélation croisée entre le Pyn putatif et IN. Analyse statistique à l’aide d’un test de Mann-Whitney. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’erreur type de la moyenne, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Analyse de deux LFP du MC bilatéral et de la cohérence entre les événements de pointe et le LFP chez la souris. (A,B) Spectres de puissance normalisés du MC bilatéral à chaque bande de fréquences chez la souris (n = 3). (C) La courbe de cohérence de deux LFP entre le MC gauche et le MC droit (n = 3). (D) La courbe de corrélation croisée de deux LFP montrant une corrélation entre le MC gauche et droit à des décalages temporels de ±100 ms (n = 3). (E) La courbe de cohérence du champ de pointe dans le MC d’une souris. Analyse statistique à l’aide d’un test de Mann-Whitney. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ±'erreur-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’enregistrement multicanal chez les souris en mouvement libre a été considéré comme une technologie utile dans les études en neurosciences, mais il est encore assez difficile pour les débutants d’enregistrer et d’analyser les signaux. Dans la présente étude, nous fournissons des directives simplifiées pour la fabrication de systèmes de micro-entraînement et l’implantation d’électrodes, ainsi que des procédures simplifiées pour la capture et l’analyse des signaux électriques via un logiciel de tri des pointes et un logiciel d’analyse des données neurophysiologiques.
Étant donné que la qualité d’un système de micro-entraînement sur mesure contribue grandement à l’acquisition de signaux stables et qualitatifs chez les souris en mouvement libre14,15,16,17, nous avons conçu et utilisé une structure plus robuste et plus légère pour le système de micro-entraînement dans cette étude, et les débutants peuvent facilement et clairement suivre les étapes de fabrication pour construire le système de micro-entraînement. De plus, la structure du système de micro-entraînement conçu implique des matériaux peu coûteux qui sont facilement disponibles dans les quincailleries, contrairement aux systèmes de micro-entraînement plus grands et plus lourds utilisés dans les études précédentes14,15. Ce système de micro-entraînement peut réduire l’inconfort et résister à l’impact des souris qui se déplacent librement pendant les enregistrements. Pendant ce temps, nous avons encore amélioré la taille et la forme du système de micro-entraînement, ce qui pourrait être utile pour les débutants en leur permettant d’observer, d’insérer et donc de déplacer les pointes des électrodes dans le cerveau pendant la chirurgie. De plus, la structure coulissante simple appliquée dans le système de micro-entraînement progresse avec précision dans le cerveau à l’aide d’une vis de haute précision, ce qui signifie que ce système offre un contrôle précis dans la mesure de plusieurs couches de la zone cérébrale ciblée ; En effet, c’est extrêmement important pour capter les signaux extracellulaires chez un animal en mouvement libre sur une période expérimentale à long terme. Les avantages de ce système de micro-entraînement sont avant tout sa simplicité et sa flexibilité ; Cependant, le plus petit nombre de canaux et l’utilisation d’un réseau d’électrodes simples devraient encore être améliorés dans une nouvelle version.
Il y a plusieurs améliorations dans la présente étude qui méritent également d’être notées. En raison de la taille plus petite et de la forme modifiée du système de micro-entraînement par rapport aux systèmes précédents, une vision plus large et un espace de travail plus large ont été fournis pour l’opération. De plus, les parois du crâne de la souris étaient constituées de ciment dentaire et de vis en acier inoxydable, ce qui a permis au système de micro-entraînement d’être solidement fixé à la tête de la souris. De plus, les parois en ciment dentaire permettaient de charger de la vaseline pour couvrir les trous dans le crâne de la souris avant de verser le ciment dentaire, ce qui avait des effets protecteurs sur la surface du cerveau sans la dure-mère et la partie mobile du système de micro-entraînement. Ensemble, ces améliorations sont utiles, car elles permettent aux débutants d’implanter le système de micro-entraînement facilement et en toute confiance dans le cerveau de la souris.
Dans les enregistrements extracellulaires multicanaux, il est largement admis qu’une autre difficulté réside dans l’analyse des signaux enregistrés à l’aide d’un langage de programmation mathématiquement complexe17. Ainsi, nous fournissons des directives claires pour les débutants, notamment en termes de tri des pointes, d’analyse des données LFP et de calcul de la relation entre eux à l’aide d’un logiciel couramment utilisé en électrophysiologie. De plus, nous suggérons fortement que l’unité enregistrée à partir d’un test à électrode unique regroupée par des méthodes d’ACP devrait avoir un nombre élevé de caractéristiques pour l’analyse, telles que les intervalles inter-pics neuronaux triés et la largeur entre sa vallée et son pic, car ces valeurs sont utiles pour les débutants afin de réduire le biais lorsque les unités sont regroupées automatiquement avec un logiciel de tri hors ligne. Il est important de noter que la relation entre les signaux qui incluent des pics et le LFP est essentielle pour la médiation de plusieurs comportements. Nous fournissons également une série d’illustrations simples pour mesurer les corrélations pointe-pointe, LFP-LFP et pointe-LFP à l’aide de scripts crédibles dans le logiciel pour l’analyse des données neurophysiologiques ; Ces illustrations permettront aux débutants de commencer à traiter et à analyser rapidement les signaux enregistrés chez les souris en mouvement libre. De plus, les résultats et les données traités avec ce logiciel propriétaire peuvent être utilisés en conjonction avec une boîte à outils open source telle que Fieldtrip pour une analyse supplémentaire à l’avance.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31871170, 32170950 et 31970915), de la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (2021A1515010804 et 2023A1515010899), de la Fondation des sciences naturelles du Guangdong pour le projet de culture majeure (2018B030336001) et de la subvention Guangdong : Technologies clés pour le traitement des troubles cérébraux (2018B030332001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
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