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Neuroscience

स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में मल्टीचैनल एक्स्ट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65245
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2Panyu Central Hospital Joint Laboratory of Translational Medical Research, Panyu Central Hospital, South China Normal University
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल मोटर कॉर्टेक्स (एमसी) में बाह्य रिकॉर्डिंग की पद्धति का वर्णन करता है ताकि स्वतंत्र रूप से चलने वाले जागरूक चूहों में बाह्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को प्रकट किया जा सके, साथ ही स्थानीय क्षेत्र क्षमता (एलएफपी) और स्पाइक्स के डेटा विश्लेषण को प्रकट किया जा सके, जो रुचि के नेटवर्क तंत्रिका गतिविधि अंतर्निहित व्यवहार के मूल्यांकन के लिए उपयोगी है।

Abstract

प्रोटोकॉल का उद्देश्य सहज और / या विशिष्ट व्यवहार के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संकेतों को सहसंबंधित करके विशिष्ट कार्यों को करने वाले चूहों में न्यूरोनल फायरिंग और नेटवर्क लोकल फील्ड पोटेंशियल (एलएफपी) के गुणों को उजागर करना है। यह तकनीक इन व्यवहारों को अंतर्निहित न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधि का अध्ययन करने में एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है। लेख मुक्त रूप से चलने वाले जागरूक चूहों में इलेक्ट्रोड आरोपण और परिणामस्वरूप बाह्य रिकॉर्डिंग के लिए एक विस्तृत और पूर्ण प्रक्रिया प्रदान करता है। अध्ययन में माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों को प्रत्यारोपित करने, मल्टीचैनल सिस्टम का उपयोग करके मोटर कॉर्टेक्स (एमसी) में एलएफपी और न्यूरोनल स्पाइकिंग संकेतों को कैप्चर करने और बाद में ऑफ़लाइन डेटा विश्लेषण के लिए एक विस्तृत विधि शामिल है। जागरूक जानवरों में मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग का लाभ यह है कि स्पाइकिंग न्यूरॉन्स और न्यूरोनल उपप्रकारों की एक बड़ी संख्या प्राप्त और तुलना की जा सकती है, जो एक विशिष्ट व्यवहार और संबंधित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संकेतों के बीच संबंधों के मूल्यांकन की अनुमति देता है। विशेष रूप से, मल्टीचैनल बाह्य कोशिकीय रिकॉर्डिंग तकनीक और वर्तमान अध्ययन में वर्णित डेटा विश्लेषण प्रक्रिया को चूहों के व्यवहार में प्रयोगों का संचालन करते समय अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

स्थानीय क्षेत्र क्षमता (एलएफपी), बाह्य संकेतों का एक महत्वपूर्ण घटक, न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी की सिनैप्टिक गतिविधि को दर्शाता है, जो कईव्यवहारों के लिए तंत्रिका कोड बनाता है। न्यूरोनल गतिविधि द्वारा उत्पन्न स्पाइक्स को एलएफपी में योगदान करने के लिए माना जाता है और तंत्रिका कोडिंग2 के लिए महत्वपूर्ण हैं। स्पाइक्स और एलएफपी में परिवर्तन कई मस्तिष्क रोगों, जैसे अल्जाइमर रोग, साथ ही भय आदि जैसी भावनाओं को मध्यस्थ करने के लिए साबित हुए हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि कई अध्ययनों ने इस बात पर प्रकाश डाला है कि स्पाइकगतिविधि जानवरों में जागृत और एनेस्थेटाइज्ड अवस्थाओं के बीच काफी भिन्न होती है। यद्यपि एनेस्थेटाइज्ड जानवरों में रिकॉर्डिंग अत्यधिक परिभाषित कॉर्टिकल सिंक्रनाइज़ेशन राज्यों में न्यूनतम कलाकृतियों के साथ एलएफपी का आकलन करने का अवसर प्रदान करती है, लेकिन परिणाम जागृत विषयों 6,7,8 में पाए जाने वाले परिणामों से कुछ हद तक भिन्न होते हैं। इस प्रकार, मस्तिष्क में प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का उपयोग करके जागृत मस्तिष्क अवस्था में विभिन्न रोगों में लंबे समय के पैमाने और बड़े स्थानिक तराजू पर तंत्रिका गतिविधि का पता लगाना अधिक सार्थक है। यह पांडुलिपि शुरुआती लोगों के लिए माइक्रो-ड्राइव सिस्टम बनाने के बारे में जानकारी प्रदान करती है और रिकॉर्डिंग और विश्लेषण शुरू करने के लिए तेज और सीधे तरीके से स्पाइक और एलएफपी संकेतों की गणना के लिए सामान्य सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पैरामीटर सेट करती है।

यद्यपि मस्तिष्क के कार्यों की गैर-इनवेसिव रिकॉर्डिंग, जैसे कि खोपड़ी से दर्ज इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राम (ईईजी) और घटना-संबंधी क्षमता (ईआरपी) का उपयोग करके, मानव और कृंतक अध्ययनों में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, ईईजी और ईआरपी डेटा में कम स्थानिक और अस्थायी गुण हैं और इस प्रकार, एक विशिष्टमस्तिष्क क्षेत्र के भीतर आस-पास के डेंड्राइटिक सिनैप्टिक गतिविधि द्वारा उत्पादित सटीक संकेतों का पता नहीं लगाया जा सकता है।. वर्तमान में, जागरूक जानवरों में मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग का लाभ उठाकर, मस्तिष्क की गहरी परतों में तंत्रिका गतिविधि को कई व्यवहार परीक्षणों के दौरान प्राइमेट्स या कृन्तकों के दिमाग में एक माइक्रो-ड्राइव सिस्टम प्रत्यारोपित करके क्रोनिक और उत्तरोत्तर दर्ज किया जा सकता है 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . संक्षेप में, शोधकर्ता एक माइक्रो-ड्राइव सिस्टम का निर्माण कर सकते हैं जिसकाउपयोग मस्तिष्क के विभिन्न हिस्सों को लक्षित करने के लिए इलेक्ट्रोड या टेट्रोड्स की स्वतंत्र स्थिति के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चांग एट अल ने एक हल्के और कॉम्पैक्ट माइक्रो-ड्राइव12 को इकट्ठा करके चूहों में स्पाइक्स और एलएफपी रिकॉर्ड करने की तकनीकों का वर्णन किया। इसके अलावा, कस्टम-निर्मित सहायक घटकों के साथ माइक्रो-मशीनसिलिकॉन जांच व्यावसायिक रूप सेव्यवहार कार्यों के दौरान कृन्तकों में कई एकल न्यूरॉन्स और एलएफपी को रिकॉर्ड करने के लिए उपलब्ध हैं। यद्यपि माइक्रो-ड्राइव सिस्टम को इकट्ठा करने के लिए विभिन्न डिजाइनों का उपयोग किया गया है, फिर भी पूरे माइक्रो-ड्राइव सिस्टम की जटिलता और वजन के मामले में इन्हें सीमित सफलता मिली है। उदाहरण के लिए, लैंसिंक एट अल ने एकल मस्तिष्क क्षेत्र14 से रिकॉर्डिंग के लिए एक जटिल संरचना के साथ एक मल्टीचैनल माइक्रो-ड्राइव सिस्टम दिखाया। सातो एट अल ने एक मल्टीचैनल माइक्रो-ड्राइव सिस्टम की सूचना दी जो एक स्वचालित हाइड्रोलिक पोजिशनिंग फ़ंक्शन15 प्रदर्शित करता है। इन माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के मुख्य नुकसान यह है कि वे चूहों के लिए स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए बहुत भारी हैं और शुरुआती लोगों के लिए इकट्ठा करना मुश्किल है। यद्यपि मल्टीचैनल एक्स्ट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग को व्यवहार परीक्षणों के दौरान तंत्रिका गतिविधि को मापने के लिए एक उपयुक्त और कुशल तकनीक के रूप में दिखाया गया है, लेकिन शुरुआती लोगों के लिए जटिल माइक्रो-ड्राइव सिस्टम द्वारा प्राप्त संकेतों को रिकॉर्ड करना और विश्लेषण करना आसान नहीं है। यह देखते हुए कि मल्टीचैनल एक्स्ट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग की पूरी ऑपरेशन प्रक्रिया को प्राप्त करना मुश्किल है और डेटा विश्लेषण स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों16,17 में शुरू किया गया है, यह वर्तमान लेख आमतौर पर उपलब्ध घटकों और सेटिंग्स का उपयोग करके माइक्रो-ड्राइव सिस्टम बनाने की विस्तृत प्रक्रिया को पेश करने के लिए सरलीकृत दिशानिर्देश प्रस्तुत करता है; स्पाइक और एलएफपी संकेतों को तेज और सीधे तरीके से गणना करने के लिए सामान्य सॉफ्टवेयर में पैरामीटर भी प्रदान किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में, माउस हीलियम गुब्बारे के उपयोग के कारण स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ सकता है, जो हेडस्टेज और माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के वजन को कम करने में योगदान देता है। आम तौर पर, वर्तमान अध्ययन में, हम वर्णन करते हैं कि आसानी से माइक्रो-ड्राइव सिस्टम का निर्माण कैसे करें और रिकॉर्डिंग और डेटा विश्लेषण की प्रक्रियाओं को अनुकूलित करें।

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Protocol

सभी चूहों को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था और 22-25 डिग्री सेल्सियस के कमरे के तापमान और 50% -60% की सापेक्ष आर्द्रता पर 12 घंटे के प्रकाश / 12 घंटे के अंधेरे चक्र (स्थानीय समयानुसार 08:00 बजे प्रकाश) में बनाए रखा गया था। चूहों को भोजन और पानी की निरंतर आपूर्ति तक पहुंच थी। सभी प्रयोग दक्षिण चीन सामान्य विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे और संस्थागत पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित थे। प्रयोगों के लिए 3-5 महीने की उम्र के नर C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया गया था।

1. माइक्रो-ड्राइव सिस्टम असेंबली

  1. दो स्टल्स और एक स्क्रू का उपयोग करके दो कंप्यूटर-डिज़ाइन किए गए बोर्डों को कनेक्ट करें जो मूवेबल माइक्रो-ड्राइव को रखता है और कनेक्टर को एक बोर्ड से संलग्न करता है (चित्रा 1 ए, बाई-iii)। एक स्क्रू (0.5 मिमी / सर्कल) को घुमाकर माइक्रो-ड्राइव ड्राइव करें।
  2. सुनिश्चित करें कि माइक्रो-ड्राइव एमसी क्षेत्र के प्रत्येक पक्ष के लिए आठ गाइड ट्यूबों (~ 3 सेमी लंबा, ~ 50 μm आंतरिक व्यास, ~ 125 μm बाहरी व्यास) के दो सेट ले जा सकता है, और फिर इसे एक ही लंबाई (कम से कम 15 मिमी) तक काट सकता है; चित्र 1Biv, v)।
  3. 35 μm व्यास के साथ 16 Ni-chrome तारों (~ 5 सेमी लंबे) को काटें, और फिर उन्हें गाइड ट्यूबों में क्रमिक रूप से लोड करें, इसके बाद उन्हें ठीक करने के लिए गोंद लगाएं (चित्रा 1बी, vi, vii)।
  4. तार इन्सुलेशन को पट्टी करें, चैनल मानचित्र के साथ-साथ संदर्भ और ग्राउंड इलेक्ट्रोड के बाद कनेक्टर से प्रत्येक पिन में प्रत्येक उजागर तार को क्रमिक रूप से घुमाएं, और फिर धीरे-धीरे प्रत्येक पिन पर पेंट का संचालन करें (चित्रा 1Bviii-x)।
  5. एपॉक्सी राल (चित्रा 1Axi, xii) का उपयोग करके पिन को कवर करें, और फिर इलेक्ट्रोड युक्तियों के प्रतिबाधा को ~ 350 kOhm (चित्रा 1Bxiii, xiv) तक कम करने के लिए प्रतिबाधा परीक्षक के माध्यम से सोने की चढ़ाना करें। प्रतिबाधा परीक्षक के मापदंडों को निम्नानुसार सेट करें: −10.08 μA सोने के प्लेटिंग समाधान के साथ 1 s के लिए प्रत्यक्ष धारा, जिसमें 5 mM PTCL4 शामिल है।
  6. अंत में, एक पेंच को घुमाकर माइक्रो-ड्राइव को शीर्ष पर ले जाएं। चित्रा 1 ए (लगभग 15 मिमी लंबा, 10 मिमी चौड़ाई, 20 मिमी ऊंचाई, ~ 1 ग्राम वजन) में दिखाए गए अनुसार संशोधित माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के समग्र आकार की जांच करें। चित्र 1एआई, ii में कंप्यूटर-डिज़ाइन किए गए बोर्ड और जंगम घटक के विस्तृत विनिर्देशों की जांच करें।

2. इलेक्ट्रोड सरणी प्रत्यारोपण

  1. सर्जरी किट को स्टरलाइज़ करें, बाँझ दस्ताने पहनें और ऑपरेशन शुरू होने से पहले डॉक्टर के बाँझ सफेद कोट पहनें।
  2. दर्द का प्रबंधन करने के लिए, एक प्रेरण कक्ष में माउस के लिए मेलोक्सिकैम इंजेक्टेबल (5 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे (एससी) इंजेक्शन का उपयोग करें। फिर एक प्रेरण कक्ष18,19 में पेंटोबार्बिटल (80 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल (यानी) इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें। यदि पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स अभी भी मौजूद है, तो पेंटोबार्बिटल (20 मिलीग्राम / किग्रा / घंटा) की पूरक खुराक लागू करें।
  3. एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में माउस को ठीक करें और तापमान नियंत्रक का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर अपने मलाशय के तापमान को बनाए रखें।
  4. माउस की दोनों आंखों पर टेट्रासाइक्लिन आई मलहम लगाएं और सर्जरी से पहले बाँझ दस्ताने फिर से बदलें।
  5. माउस के फर को शेव करें और केंद्र से शुरू होने वाले और बाहर की ओर बढ़ने वाले संकेंद्रित वृत्तों में बाँझ कपास-टिंप एप्लिकेटर का उपयोग करके बीटाडीन स्क्रब और अल्कोहल के तीन वैकल्पिक राउंड के साथ सर्जिकल साइट को कीटाणुरहित करें (चित्र 2i, ii)। इसकी खोपड़ी को उजागर करने के लिए एक छोटा मध्य रेखा चीरा (~ 15 मिमी) बनाएं। तुरंत, दर्द से राहत के लिए गर्दन की मांसपेशियों पर स्थानीय रूप से 1% लिडोकेन लागू करें। फिर, कैंची का उपयोग करके अवशिष्ट ऊतक को हटा दें, और खारा-लेपित कपास कलियों का उपयोग करके खोपड़ी को साफ करें (चित्रा 2 iii)।
  6. स्याही से भरे एक ग्लास माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करके, आरोपण के लिए द्विपक्षीय एमसी के वांछित स्थानों को चिह्नित करें (चित्रा 2iv, v)। पिछले अध्ययन 20 के आधार पर, द्विपक्षीय एमसी के स्थान निम्नानुसार हैं: ब्रेग्मा के लिए 0.74 मिमी पूर्वकाल, और मध्य रेखा के लिए1.25 मिमी पार्श्व।
  7. माइक्रो-ड्राइव सिस्टम की रक्षा के लिए चार स्टेनलेस स्टील स्क्रू (0.8 मिमी व्यास) प्रत्यारोपित करें, और फिर सभी स्क्रू को संदर्भ और ग्राउंड इलेक्ट्रोड के साथ एक साथ लिंक करें, इसके बाद दीवारों को बनाने के लिए मिश्रित दंत सीमेंट के साथ कवर करें (चित्रा 2vi-xi)।
  8. एमसी क्षेत्रों में समन्वित खोपड़ी के बाएं और दाएं दोनों किनारों पर खोपड़ी ड्रिल के साथ दो छोटे छेद (~ 1.5 मिमी2) को सावधानीपूर्वक ड्रिल करें (चित्रा 2xii)। द्विपक्षीय एमसी के स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक का उपयोग करें: ब्रेग्मा के लिए 0.74 मिमी पूर्वकाल, मध्य रेखा के लिए 1.25 मिमी पार्श्व, और ड्यूरा के लिए 0.5 मिमी उदर।
  9. छेद ों से ड्यूरा मैटर को बारीक बल के साथ सावधानीपूर्वक निकालें (चित्र 2xiii)।
  10. माइक्रो-ड्राइव सिस्टम को 10 μm/s पर एक माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके छेद के केंद्र में डालें (चित्रा 2xiv-xvii)।
  11. माइक्रो-ड्राइव सिस्टम (चित्रा 2xviii) के सम्मिलन को पूरा करने के बाद डेंटल सीमेंट की दीवारों में पेट्रोलियम जेली भरें।
  12. मिश्रित दंत सीमेंट के साथ माइक्रो-ड्राइव सिस्टम और दंत सीमेंट की दीवारों की निचली प्लेट में शामिल हों (चित्रा 2xix)।
  13. शल्य चिकित्सा के बाद के दर्द से राहत पाने के लिए लिनकोमाइसिन हाइड्रोक्लोराइड और लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड युक्त जेल के साथ स्थानीय उपचार के बाद चीरे को नमकीन से धोएं।
  14. प्रत्यारोपित माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के चारों ओर प्रवाहकीय तांबा पन्नी टेप को हवा दें (चित्रा 2xx)।
  15. माउस को 31-33 डिग्री सेल्सियस पर रखे पिंजरे में ले जाएं और संज्ञाहरण से वसूली के लिए माउस की निगरानी करें।
  16. चूहों को अलग-अलग भोजन के साथ 1 सप्ताह के लिए ठीक होने दें। लिनकोमाइसिन हाइड्रोक्लोराइड और लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड युक्त जेल के 3 दिनों के निरंतर आवेदन के साथ चीरा की जांच और उपचार करें।

3. फ्री-मूविंग चूहों में द्विपक्षीय एमसी में मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग।

  1. एक जागृत माउस के सिर को हल्के से और सावधानी से पकड़ें। कम से कम 1 दिन पहले माइक्रो-ड्राइव सिस्टम (चित्रा 1एआईआई) के जंगम भाग पर पेंच को घुमाकर इलेक्ट्रोड सरणियों (~ 0.1 मिमी गहराई) को नीचे ले जाएं।
  2. जागृत माउस के सिर को हल्के से और सावधानी से पकड़ें। हेडस्टेज और माइक्रो-ड्राइव सिस्टम (चित्रा 3 ए, बी) के वजन को ऑफसेट करने के लिए एक धागे के साथ हेडस्टेज के केंद्र और हीलियम गुब्बारे (लगभग 0.02 एल हीलियम से भरा) को लिंक करें।
  3. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में 30 kHz पर नमूना लेकर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और मल्टीचैनल सिस्टम का उपयोग करके कच्चे संकेतों को कैप्चर करें, और फिर मल्टीचैनल सिस्टम से डिजिटल-एनालॉग (डीए) कनवर्टर का उपयोग करके डिजिटाइज़ करें।
  4. रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर में 10 kHz पर पुन: नमूना करण करके कच्चे डेटा से LFP सिग्नल निकालें, और फिर 50 Hz लाइन शोर को हटाने के लिए रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर से एक नॉच फ़िल्टर का उपयोग करें।
  5. कम से कम 60 सेकंड के लिए एक फ्री-मूविंग माउस से स्थिर स्थिति में कच्चे डेटा रिकॉर्ड करें। रिकॉर्डिंग खत्म करने के बाद, धीरे-धीरे हेडस्टेज और माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के बीच कनेक्शन को हटा दें और माउस को अपने घर के पिंजरे में वापस कर दें।
  6. रिकॉर्ड किए गए डेटा को कंप्यूटर में संग्रहीत करें और इसे ऑफ़लाइन विश्लेषण करें (चित्रा 4 और चित्रा 5)।
  7. प्रयोग समाप्त करने के बाद, संस्थान के दिशानिर्देशों के अनुसार इच्छामृत्यु करें और फिर 1 मिनट इलेक्ट्रोलाइटिक घाव करने के लिए 3 वी आउटपुट पर बिजली की आपूर्ति का उपयोग करके इलेक्ट्रोड के स्थानों की पुष्टि करें, इसके बाद हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करें। एक फ्रीजिंग माइक्रोटोम का उपयोग करके माउस के मस्तिष्क को 30 μm स्लाइस में काटें, एमसी अनुभागों को इकट्ठा करें, और फिर माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 सी, डी) के साथ छवियों को कैप्चर करें।

4. स्पाइक सॉर्टिंग और विश्लेषण

  1. 30 kHz (चित्रा 4एआई) पर नमूना किए गए स्पाइक डेटा को खोलने के लिए स्पाइक सॉर्टिंग सॉफ़्टवेयर में फ़ाइल > ओपन > नेव फ़ाइलों पर क्लिक करें।
  2. सॉर्ट चैनल का चयन करने के लिए जानकारी पर क्लिक करें, और तब सॉर्ट > सॉर्ट विधि बदलें > K-Means का उपयोग करें का चयन करें। क्रमबद्ध इकाइयों को प्राप्त करने के लिए वैली-सीकिंग सॉर्ट > के-मीन्स सॉर्टिंग बटन दबाएं (चित्रा 4एआईआई, iii)।
  3. फ़ाइल > इस रूप में सहेजें पर क्लिक करें, सॉर्ट किए गए स्पाइक डेटा को .nev फ़ाइल नाम एक्सटेंशन के साथ सहेजें, और .txt फ़ाइल नाम एक्सटेंशन (चित्रा 4Aiv) के साथ PCA परिणामों को निर्यात करने के लिए फ़ाइल > निर्यात प्रति-वेवफॉर्म डेटा का चयन करें।
  4. क्रमबद्ध स्पाइक फ़ाइल (चित्रा 4 बी) खोलने के लिए न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर में फ़ाइल > आयात डेटा > ब्लैकरॉक फ़ाइल पर क्लिक करें।
  5. चयनित इकाई के लिए ऑटोकोरिलोग्राम प्राप्त करने के लिए विश्लेषण > ऑटोकोरेलोग्राम पर क्लिक करें, और फिर पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: -0.05 एस पर एक्स न्यूनतम मान, 0.05 एस पर एक्स अधिकतम मान, और 0.001 पर बिन मान (चित्रा 4बीआई, iii)।
  6. सॉर्ट किए गए स्पाइक डेटा को लोड करें, इंटर-स्पाइक अंतराल हिस्टोग्राम प्राप्त करने के लिए विश्लेषण > इंटरस्पाइक अंतराल हिस्टोग्राम पर क्लिक करें, और फिर पैरामीटर को निम्नानुसार सेट करें: 0 एस पर न्यूनतम अंतराल मान, 0.1 एस पर अधिकतम अंतराल मान, और 0.001 पर बिन मान (चित्रा 4बीवी, वी)।
  7. दो क्रमबद्ध इकाई घटनाओं के बीच क्रॉस-कोरेलोग्राम प्राप्त करने के लिए विश्लेषण > क्रॉसकोरेलोग्राम पर क्लिक करें, और फिर संदर्भ घटनाओं और मापदंडों को निम्नानुसार सेट करें: एक्स न्यूनतम मान -0.1 एस पर, एक्स अधिकतम मान 0.1 एस पर, और बिन मान 0.001 पर (चित्रा 4बीवीआई, vii)।
  8. .xls फ़ाइल नाम एक्सटेंशन (चित्रा 4Bviii, ix) के साथ ऑटोकोरिलोग्राम, इंटर-स्पाइक इंटरवल हिस्टोग्राम और क्रॉस-कोरेलोग्राम के परिणामों को सहेजने के लिए परिणाम > संख्यात्मक परिणाम पर क्लिक करें। डेटा का विश्लेषण करें, और ग्राफ ़ खींचें।

5. एलएफपी विश्लेषण

  1. 10 kHz (चित्रा 5एआई) पर नमूना किए गए निरंतर सिग्नल डेटा को खोलने के लिए न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर में फ़ाइल आयात डेटा > ब्लैकरॉक फ़ाइल पर क्लिक करें।
  2. चयनित चैनल से एलएफपी > लिए पावर स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करने के लिए निरंतर स्पेक्ट्रम विश्लेषण पर क्लिक करें। पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: 8,192 पर आवृत्ति मानों की संख्या, 3-5 पर एकाधिक टेपर्स मान, कुल शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व (पीएसडी) के प्रतिशत का सामान्यीकरण, और आवृत्ति सीमा 1 हर्ट्ज से 100 हर्ट्ज (चित्रा 5एआईआई, iii)।
  3. एमसी के बाएं और दाएं किनारों से दो एलएफपी के लिए सुसंगतता का विश्लेषण करने के लिए निरंतर विश्लेषण > सुसंगतता पर क्लिक करें। संदर्भ चैनल और पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: सुसंगतता मानों पर गणना करें, आवृत्ति मानों की संख्या 8,192 पर, एकाधिक टेपर्स मान 3-5 पर, और आवृत्ति रेंज 1 हर्ट्ज से 100 हर्ट्ज तक (चित्रा 5एव, v)।
  4. एमसी > बाएं और दाएं किनारों से दो LFPs के बीच सहसंबंध का विश्लेषण करने के लिए Corr के साथ विश्लेषण पर क्लिक करें। संदर्भ चैनल (LFP डेटा) और पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: X न्यूनतम मान −0.1 s पर, X अधिकतम मान 0.1 s पर, और बिन मान 0.001 पर (चित्रा 5Avi, vii)।
  5. पीएसडी, सुसंगतता और .xls फ़ाइल नाम एक्सटेंशन के साथ सहसंबंध के परिणामों को सहेजने के लिए परिणाम > संख्यात्मक परिणाम पर क्लिक करें (चित्रा 5Aviii, ix)।
  6. उस चैनल का चयन करें जिसके लिए प्रत्येक आवृत्ति बैंड के लिए प्रतिनिधि निशान निकालने की आवश्यकता है, प्रत्येक आवृत्ति बैंड को प्राप्त करने के लिए निरंतर चर के संपादित करें > डिजिटल फ़िल्टरिंग पर क्लिक करें, और फिर पैरामीटर को निम्नानुसार सेट करें: फ़िल्टर Freq. Bandpass के रूप में प्रतिक्रिया, अनंत आवेग प्रतिक्रिया (IIR) बटरवर्थ पर फ़िल्टर कार्यान्वयन, और 2 पर फ़िल्टर ऑर्डर मान। अंत में, ब्याज की आवृत्ति सीमा निर्धारित करें (चित्रा 5बी-iv)।
    नोट: यहां उपयोग की जाने वाली आवृत्ति श्रेणियां निम्नानुसार थीं: डेल्टा (δ, 1-4 हर्ट्ज), थीटा (5-12 हर्ट्ज), बीटा (β, 13-30 हर्ट्ज), कम गामा (कम γ, 30-70 हर्ट्ज), और उच्च गामा (उच्च γ, 70-100 हर्ट्ज) दोलन।
  7. डेटा का विश्लेषण करें और ग्राफ ़ खींचें।

6. स्पाइक और एलएफपी के बीच सहसंबंध

  1. निरंतर सिग्नल डेटा और स्पाइक डेटा खोलने के लिए न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर में फ़ाइल > आयात डेटा > ब्लैकरॉक फ़ाइल पर क्लिक करें।
  2. चयनित चैनल से स्पाइक्स और एलएफपी के बीच सामंजस्य का विश्लेषण करने के लिए विश्लेषण > सुसंगतता विश्लेषण पर क्लिक करें। संदर्भ चर (स्पाइक टाइमिंग) और पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: सुसंगतता मानों पर गणना करें, आवृत्ति मानों की संख्या 512 पर, एकाधिक टेपर्स मान 3-5 पर, और आवृत्ति सीमा 1 हर्ट्ज से 100 हर्ट्ज तक (चित्रा 5सीआई, ii)।
  3. .xls फ़ाइल नाम एक्सटेंशन (चित्रा 5Ciii, iv) के साथ स्पाइक फ़ील्ड सुसंगतता के परिणाम को सहेजने के लिए परिणाम > संख्यात्मक परिणाम पर क्लिक करें।
  4. डेटा का विश्लेषण करें और ग्राफ ़ खींचें।

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Representative Results

कच्चे संकेतों से बहु-इकाई स्पाइक्स निकालने के लिए एक उच्च-पास (250 हर्ट्ज) फ़िल्टर लागू किया गया था (चित्रा 6 ए)। इसके अलावा, पीसीए द्वारा क्रमबद्ध एक सामान्य माउस के एमसी से रिकॉर्ड की गई इकाइयों को सत्यापित किया गया (चित्रा 7 ए-डी), और माउस के एमसी में इकाइयों की घाटी की चौड़ाई और तरंग अवधि दर्ज की गई। परिणामों से पता चला है कि चूहों में एमसी कथित पिरामिड न्यूरॉन्स (पीवाईएन) की घाटी की चौड़ाई और तरंग अवधि दोनों कथित इंटरन्यूरॉन (आईएन) (चित्रा 7 ई, एफ; दो नमूना मैन-व्हिटनी परीक्षण) की तुलना में अधिक हैं; घाटी की चौड़ाई के लिए, कथित पाइन: 0.636 एमएस ± 0.004 एमएस, कथित आईएन: 0.614 एमएस ± 0.001 एमएस, पी = 0.002; तरंग अवधि के लिए, कथित Pyn: 0.095 ms ± 0.004 ms, कथित IN: 0.054 ms ± 0.002 ms, p = 1.402 x 10−16, पिछले अध्ययनों में Pyn और IN की विशेषताओं के अनुरूप21. हमने कथित पिन स्पाइक्स को संदर्भ के रूप में सेट करके कथित पिन और आईएन के बीच क्रॉस-कोरेलोग्राम की गणना भी की और ~ 18 एमएस (चित्रा 7 जी) पर एक सकारात्मक शिखर पाया, यह दर्शाता है कि ~ 18 एमएस की खिड़की के साथ कथित आईएन स्पाइकिंग से पहले कथित पिन स्पाइकिंग होती है।

न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल डेटा विश्लेषण (चित्रा 6 ए) के लिए सॉफ्टवेयर में आईआईआर फ़िल्टर द्वारा प्रत्येक आवृत्ति बैंड के प्रतिनिधि निशान एलएफपी से फ़िल्टर किए गए थे। एलएफपी विश्लेषण में, सामान्य चूहों में बाएं और दाएं एमसी के एलएफपी पावर स्पेक्ट्रम में समान थे, जो बाएं और दाएं एमसी के बीच सिंक्रनाइज़ गतिविधियों का सुझाव देते हैं (चित्रा 8 ए, बी; दो नमूना मान-व्हिटनी परीक्षण; δ के लिए, बाएं एमसी: 50.71 ± 1.136, दाएं एमसी: 50.47 ± 1.213, पी = 0.70±; 2.068 ± 0.193, पी = 0.40; β के लिए, बाएं एमसी: 0.222 ± 0.058, दाएं एमसी: 0.206 ± 0.055, पी = 0.70; कम γ के लिए, बाएं एमसी: 0.114 ± 0.034, दाएं एमसी: 0.093 ± 0.018, पी = 0.70; उच्च γ के लिए, बाएं एमसी: 0.054 ± 0.027, दाएं एमसी: 0.04 ± 0.015, पी = 0.40)। फिर हमने बाएं और दाएं एमसी के बीच सुसंगतता और सहसंबंध की गणना की (चित्रा 8 सी, डी; बाएं एमसी एलएफपी दाएं एमसी एलएफपी के बाद ~ 1.2 एमएस की खिड़की के भीतर अनुसरण करता है, -1.167 एमएस ± 0.667 एमएस) और एक सामान्य माउस के बाएं एमसी में एलएफपी (1-100 हर्ट्ज) के साथ सिंक्रनाइज़ किए गए कथित पिन या आईएन स्पाइकिंग के परिमाण की गणना की (चित्रा 8 ई)। इसने पिन की तुलना में कथित आईएन के लिए एक मजबूत कम γ सुसंगतता दिखाई।

Figure 1
चित्र 1: इलेक्ट्रोड और मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग सिस्टम का आरेख । (ए) माइक्रो-ड्राइव सिस्टम का चित्रण। मैं। कंप्यूटर-डिज़ाइन किए गए बोर्ड के ड्राइंग और विनिर्देश। 2. मूवेबल माइक्रो-ड्राइव का योजनाबद्ध आरेख। (बी) माइक्रो-ड्राइव सिस्टम और मल्टीचैनल मूवेबल सिंगल इलेक्ट्रोड स्टेप्स। मैं। नी-क्रोम तार; ii. इलेक्ट्रोड के घटक भाग; कंप्यूटर डिजाइन किए गए बोर्डों की असेंबली; इलेक्ट्रोड की प्रारंभिक असेंबली, जिसमें कनेक्टर और आठ गाइड ट्यूब शामिल हैं; बहुत। माइक्रो-ड्राइव का दूसरा पक्ष; vi, vii. नी-क्रोम तारों को क्रमिक रूप से गाइड ट्यूबों में लोड किया जाता है; VIII-x। प्रत्येक उजागर तार को क्रमिक रूप से प्रत्येक पिन से जोड़ा जाता है, इसके बाद प्रत्येक पिन पर पेंट का संचालन करने वाली कोटिंग; xi, xii. पिन को एपॉक्सी राल का उपयोग करके कवर किया जाता है; xiii, xiv. सोने की चढ़ाना। (सी) एक मुक्त चलती माउस के एमसी में बाह्य रिकॉर्डिंग का प्रयोगात्मक डिजाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: चरण-दर-चरण शल्य चिकित्सा प्रक्रिया। i, ii. माउस के फर को शेव करें और बीटाडीन स्क्रब और अल्कोहल के तीन वैकल्पिक राउंड के साथ सर्जिकल साइट को कीटाणुरहित करें। माउस की खोपड़ी को साफ करें। iv. लेवलिंग। बहुत। मस्तिष्क के स्थान को चिह्नित करें। स्टेनलेस स्टील स्क्रू की स्थिति को चिह्नित करें। 7. स्टेनलेस स्टील स्क्रू डालें। viii. पेंच को संदर्भ और ग्राउंड इलेक्ट्रोड के साथ लिंक करें। ix, x. दंत सीमेंट मिलाएं। xi. दंत सीमेंट के साथ एक दीवार का निर्माण। XII, xiii. द्विपक्षीय एमसी के ऊपर दो छोटे छेद ड्रिल करें, इसके बाद ड्यूरा मैटर को हटा दें। माइक्रो-ड्राइव सिस्टम तैयार करें। xv-xix. सर्जिकल के बाद के दर्द से राहत पाने के लिए लिनकोमाइसिन हाइड्रोक्लोराइड और लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड युक्त जेल के साथ स्थानीय उपचार के बाद माइक्रो-ड्राइव सिस्टम को प्रत्यारोपित करें। xx. प्रवाहकीय तांबा पन्नी टेप के साथ माइक्रो-ड्राइव सिस्टम की रक्षा करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एक सचेत माउस में एक सिर-निश्चित रिकॉर्डिंग का चित्रण । (ए) फ्री-मूविंग रिकॉर्डिंग के लिए योजनाबद्ध आरेख। (बी) फ्री-मूविंग रिकॉर्डिंग से छवियों का विवरण। मैं। प्रत्यारोपित माइक्रो-ड्राइव सिस्टम का प्लानफॉर्म; ii. हेडस्टेज; iii, iv. माइक्रो-ड्राइव सिस्टम और हेडस्टेज जुड़े हुए हैं; बहुत। हीलियम गुब्बारे को हेडस्टेज और माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के वजन को ऑफसेट करने के लिए लगाया जाता है। (सी) इलेक्ट्रोलाइटिक घाव का उपयोग करके रिकॉर्डिंग साइट के स्थान को सत्यापित करने का चित्रण। (डी) एक माउस के एमसी में इलेक्ट्रोलाइटिक घावों द्वारा लेबल की गई रिकॉर्डिंग साइटें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: स्पाइक सॉर्टिंग और विश्लेषण का चित्रण। (ए) स्पाइक डेटा को क्लस्टरिंग करने और परिणामों को निर्यात करने के लिए पैरामीटर। मैं। स्पाइक डेटा आयात करें; छंटाई विधि चुनें; iii. स्पाइक डेटा को ú-means एल्गोरिथ्म का उपयोग करके क्रमबद्ध करें; iv. क्रमबद्ध इकाई से परिणाम निर्यात करें। (बी) क्रमबद्ध इकाई के अंतर-स्पाइक अंतराल हिस्टोग्राम, ऑटोकोरिलोग्राम और क्रॉस-कोरिलोग्राम का विश्लेषण करने की प्रक्रिया। मैं। सॉर्ट किए गए स्पाइक डेटा को आयात करें; 2. ऑटोकोरिलेशन विश्लेषण का संचालन करना; 3. ऑटोकोरिलोग्राम के लिए पैरामीटर सेट करें; अंतर-स्पाइक अंतराल हिस्टोग्राम प्राप्त करें; v. इंटर-स्पाइक अंतराल हिस्टोग्राम के लिए पैरामीटर सेट करें; छ. क्रमबद्ध इकाइयों से स्पाइक्स के बीच क्रॉस-सहसंबंध की गणना करें; क्रॉस-कोरेलोग्राम के लिए पैरामीटर सेट करें; viii, ix। परिणाम निर्यात करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: निरंतर डेटा विश्लेषण का चित्रण। (ए) एलएफपी संकेतों का विश्लेषण करने की प्रक्रिया और पैरामीटर जिनकी गणना एलएफपी के पावर स्पेक्ट्रम, सुसंगतता और दो एलएफपी के बीच सहसंबंध का उपयोग करके की गई थी। द्विपक्षीय एमसी से एलएफपी के लिए पावर स्पेक्ट्रल घनत्व की गणना करें; Aiii. एलएफपी के लिए शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व की गणना करें; एलएफपी के बीच सुसंगतता की गणना करें; vi, vii. दो LFPs के बीच सहसंबंध की गणना कीजिए। VIII, ix। परिणाम निर्यात करें. (बी) प्रत्येक आवृत्ति को फ़िल्टर करने की प्रक्रिया एलएफपी सिग्नल से होती है। एलएफपी डेटा से विभिन्न आवृत्ति बैंड निकालें; ii, iii. फ़िल्टर किए गए LFPs देखें; फ़िल्टर किए गए LFPs को एक एन्हांस्ड मेटाफ़ाइल के रूप में सहेजें। (सी) न्यूरोनल स्पाइक्स और एलएफपी के बीच सुसंगतता का विश्लेषण करने की प्रक्रिया। i, ii. एलएफपी और क्रमबद्ध स्पाइक्स के बीच सामंजस्य की गणना करें; iii, iv. परिणाम निर्यात करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: रिकॉर्ड किए गए संकेतों के प्रतिनिधि निशान। स्पाइक को 30 kHz पर नमूना किए गए कच्चे डेटा से 250 Hz पर उच्च-पास-फ़िल्टर किया गया था। एलएफपी 10 kHz पर नमूना लिया गया कच्चा डेटा था। δ डेल्टा आवृत्ति बैंड बैंडपास-एलएफपी से 1-4 हर्ट्ज पर फ़िल्टर किया गया था। एलएफपी से 5-12 हर्ट्ज पर फ़िल्टर किया गया थीटा आवृत्ति बैंड था। β बीटा आवृत्ति बैंड एलएफपी से 13-30 हर्ट्ज पर फ़िल्टर किया गया था। कम γ कम गामा आवृत्ति बैंड एलएफपी से 30-70 हर्ट्ज पर फ़िल्टर किया गया था। उच्च γ उच्च गामा आवृत्ति बैंड एलएफपी से 70-100 हर्ट्ज पर फ़िल्टर किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: क्रमबद्ध इकाइयों की विशेषताएं और उनके फायरिंग पैटर्न। (ए, बी) क्रमबद्ध इकाइयों को एक ही इलेक्ट्रोड से प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग करके क्लस्टर किया गया था। (C, D) एक कथित उत्तेजक न्यूरॉन (पीवाईएन) और एक कथित निरोधात्मक न्यूरॉन (आईएन) के लिए ऑटोकोरिलेशंस (ऊपर) और इंटर-स्पाइक अंतराल हिस्टोग्राम (नीचे)। (E) कथित पिन की घाटी की चौड़ाई कथित IN की तुलना में काफी अधिक थी (कथित Pyn: n = 1,055 स्पाइक्स, कथित IN: n = 1,985 स्पाइक्स)। (एफ) कथित पिन की तरंग अवधि कथित आईएन की तुलना में अधिक मजबूत थी (कथित पाइन: एन = 1,005 स्पाइक्स, कथित आईएन: एन = 1,059 स्पाइक्स)। (जी) कथित पिन और आईएन के बीच क्रॉस-सहसंबंध। मान-व्हिटनी परीक्षण के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण। सभी डेटा को माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, **p < 0.01, ***p < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: द्विपक्षीय एमसी से दो एलएफपी का विश्लेषण और चूहों में स्पाइक घटनाओं और एलएफपी के बीच सुसंगतता। (ए, बी) चूहों में प्रत्येक आवृत्ति बैंड पर द्विपक्षीय एमसी के सामान्यीकृत पावर स्पेक्ट्रम (एन = 3)। (C) बाएं और दाएं MC (n = 3) के बीच दो LFPs के सामंजस्य का वक्र। (डी) दो एलएफपी का क्रॉस-सहसंबंध वक्र बाएं और दाएं एमसी के बीच ±100 एमएस टाइम अंतराल (एन = 3) पर सहसंबंध दर्शाता है। (ई) माउस के एमसी में स्पाइक-फील्ड सुसंगतता का वक्र। मान-व्हिटनी परीक्षण के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण। सभी डेटा माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फ्री-मूविंग चूहों में मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग को तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन में एक उपयोगी तकनीक माना गया है, लेकिन शुरुआती लोगों के लिए संकेतों को रिकॉर्ड करना और विश्लेषण करना अभी भी काफी चुनौतीपूर्ण है। वर्तमान अध्ययन में, हम माइक्रो-ड्राइव सिस्टम बनाने और इलेक्ट्रोड आरोपण करने के लिए सरलीकृत दिशानिर्देश प्रदान करते हैं, साथ ही न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल डेटा विश्लेषण के लिए स्पाइक सॉर्टिंग सॉफ्टवेयर और सॉफ्टवेयर के माध्यम से विद्युत संकेतों को पकड़ने और विश्लेषण करने के लिए सरलीकृत प्रक्रियाएं प्रदान करते हैं।

यह देखते हुए कि कस्टम-निर्मित माइक्रो-ड्राइव सिस्टम की गुणवत्ता फ्री-मूविंग चूहों 14,15,16,17 में स्थिर और गुणात्मक संकेतों के अधिग्रहण में बहुत योगदान देती है, हमने इस अध्ययन में माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के लिए एक अधिक मजबूत और हल्के संरचना को डिजाइन और उपयोग किया, और शुरुआती लोग आसानी से और स्पष्ट रूप से माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के निर्माण के लिए विनिर्माण चरणों का पालन कर सकते हैं। इसके अलावा, डिज़ाइन किए गए माइक्रो-ड्राइव सिस्टम की संरचना में सस्ती सामग्री शामिल है जो हार्डवेयर स्टोर में आसानी से उपलब्ध है, पिछले अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले बड़े, भारी माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के विपरीत14,15। यह माइक्रो-ड्राइव सिस्टम असुविधा को कम कर सकता है और रिकॉर्डिंग के दौरान मुक्त-चलती चूहों से प्रभाव का सामना कर सकता है। इस बीच, हमने माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के आकार और आकार में और सुधार किया, जो शुरुआती लोगों के लिए सहायक हो सकता है, जिससे उन्हें सर्जरी के दौरान मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड की युक्तियों का निरीक्षण करने, सम्मिलित करने और इस प्रकार, स्थानांतरित करने की अनुमति मिल सकती है। इसके अलावा, माइक्रो-ड्राइव सिस्टम में लागू सरल स्लाइड संरचना को उच्च-सटीक पेंच का उपयोग करके मस्तिष्क में सटीक रूप से प्रगति की जाती है, जिसका अर्थ है कि यह प्रणाली लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र की कई परतों को मापने में सटीक नियंत्रण प्रदान करती है; दरअसल, यह दीर्घकालिक प्रयोगात्मक अवधि में एक मुक्त चलती जानवर में बाह्य संकेतों को पकड़ने के लिए बेहद महत्वपूर्ण है। इन सबसे ऊपर, इस माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के फायदे इसकी सादगी और लचीलापन है; हालांकि, चैनलों की छोटी संख्या और एकल इलेक्ट्रोड की एक सरणी के उपयोग को एक नए संस्करण में और बेहतर बनाया जाना चाहिए।

वर्तमान अध्ययन में कई सुधार भी ध्यान देने योग्य हैं। पिछले सिस्टम की तुलना में माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के छोटे आकार और संशोधित आकार के कारण, ऑपरेशन के लिए एक व्यापक दृष्टि और व्यापक कार्य स्थान की आपूर्ति की गई थी। इसके अलावा, माउस की खोपड़ी पर दीवारें दंत सीमेंट और स्टेनलेस-स्टील स्क्रू से बनी थीं, जिसने माइक्रो-ड्राइव सिस्टम को माउस के सिर से दृढ़ता से जुड़ा होने की अनुमति दी। इसके अलावा, डेंटल सीमेंट की दीवारों ने डेंटल सीमेंट डालने से पहले माउस की खोपड़ी में छेद को कवर करने के लिए पेट्रोलियम जेली के लोडिंग की अनुमति दी, जिसका ड्यूरा और माइक्रो-ड्राइव सिस्टम के जंगम हिस्से के बिना मस्तिष्क की सतह पर सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ा। साथ में, ये सुधार उपयोगी हैं, क्योंकि वे शुरुआती लोगों को माउस मस्तिष्क में आसानी से और आत्मविश्वास से माइक्रो-ड्राइव सिस्टम को प्रत्यारोपित करने की अनुमति देते हैं।

मल्टीचैनल एक्स्ट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग में, यह व्यापक रूप से माना जाता है कि गणितीय रूप से जटिल प्रोग्रामिंग भाषा17 का उपयोग करके रिकॉर्ड किए गए संकेतों का विश्लेषण करने में एक और कठिनाई निहित है। इस प्रकार, हम शुरुआती लोगों के लिए स्पष्ट दिशानिर्देश प्रदान करते हैं, विशेष रूप से स्पाइक सॉर्टिंग, एलएफपी डेटा विश्लेषण और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उनके बीच संबंधों की गणना के संदर्भ में। इसके अलावा, हम दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि पीसीए विधियों द्वारा क्लस्टर किए गए एकल-इलेक्ट्रोड परख से रिकॉर्ड की गई इकाई में विश्लेषण के लिए उच्च संख्या में विशेषताएं होनी चाहिए, जैसे कि क्रमबद्ध न्यूरोनल इंटर-स्पाइक अंतराल और इसकी घाटी और चोटी के बीच की चौड़ाई, क्योंकि ये मान शुरुआती लोगों के लिए पूर्वाग्रह को कम करने के लिए उपयोगी होते हैं जब इकाइयों को ऑफ़लाइन सॉर्टर सॉफ़्टवेयर के साथ स्वचालित रूप से क्लस्टर किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, स्पाइक्स और एलएफपी सहित संकेतों के बीच संबंध कई व्यवहारों की मध्यस्थता के लिए महत्वपूर्ण है। हम न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर में विश्वसनीय स्क्रिप्ट का उपयोग करके स्पाइक-स्पाइक, एलएफपी-एलएफपी और स्पाइक-एलएफपी सहसंबंधों को मापने के लिए सरल चित्रों की एक श्रृंखला भी प्रदान करते हैं; ये चित्र शुरुआती लोगों को मुक्त रूप से चलने वाले चूहों में दर्ज संकेतों को जल्दी से संसाधित और विश्लेषण करने की अनुमति देंगे। इसके अलावा, इस मालिकाना सॉफ्टवेयर के साथ इलाज किए गए परिणामों और डेटा का उपयोग अग्रिम में अतिरिक्त विश्लेषण के लिए फील्डट्रिप जैसे ओपन-सोर्स टूलबॉक्स के साथ किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31871170, 32170950 और 31970915), गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2021 ए 1515010804 और 2023 ए 1515010899), गुआंग्डोंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन फॉर मेजर कल्टीवेशन प्रोजेक्ट (2018बी030336001) और गुआंग्डोंग ग्रांट: मस्तिष्क विकारों के उपचार के लिए प्रमुख प्रौद्योगिकियों (2018 बी030303001) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.54 mm pin header YOUXIN Electronic Co., Ltd. 1 x 5 Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls.
Adobe Illustrator CC 2017 Adobe N/A To optimize images from GraphPad.
BlackRock Microsystems Blackrock Neurotech Cerebus This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer.
Brass nut Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. M0.8 brass nut The nut fixes the position of screw.
Brass screw Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. M0.8 x 11 mm brass screw A screw that hold the movable micro-drive.
C57BL/6J Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. N/A 12 weeks of age.
Centrifuge tube Biosharp 15 mL; BS-150-M To store mice brain with sucrose sulutions.
Conducting paint Structure Probe, Inc. 7440-22-4 To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires.
Conductive copper foil tape 3M 1181 To reduce interferenc.
Connector YOUXIN Electronic Co., Ltd. 2 x 10P To connect the headtage to micro-drive system.
DC Power supply Maisheng MS-305D A power device for  electrolytic lesion.
Dental cement Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. N/A To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation.
Digital analog converter Blackrock 128-Channel A device that converts digital data into analog signals.
Epoxy resin Alteco N/A To cover pins.
Excel Microsoft N/A To summarize data after analysis.
Eye scissors JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. N/A For surgery or cutting the Ni-chrome wire.
Fine forceps JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. N/A For surgery.
Forceps JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. N/A For surgery or assembling the mirco-drive system.
Freezing microtome Leica CM3050 S  Cut the mouse’s brain into slices
Fused silica capillary tubing Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. TSP050125 To  serve as the guide tubes for Ni-chrome wires.
Glass microelectrode Sutter Instrument Company BF100-50-10 To mark the desired locations for implantation using the filled ink.
GraphPad Prism 7 GraphPad Software N/A To analyze and visualize the results.
Guide-tube Polymicro technologies 1068150020 To load Ni-chrome wires.
Headstage Blackrock N/A A tool of transmitting signals.
Helium balloon Yili Festive products Co., Ltd. 24 inch To offset the weight of headstage and micro-drive system.
Ink Sailor Pen Co.,LTD. 13-2001 To mark the desired locations for implantation.
Iodine tincture Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. N/A To disinfect mouse's scalp.
Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine  hydrochloride gel Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. 10g A drug used to reduce inflammation.
Meloxicam Vicki Biotechnology Co., Ltd. 71125-38-7 To reduce postoperative pain in mice.
Micromanipulators Scientifica Scientifica IVM Triple For electrode arrays implantation.
Microscope  Nikon ECLIPSE Ni-E  Capture the images of brain sections
nanoZ impedance tester Plexon nanoZ To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays.
NeuroExplorer Plexon NeuroExplorer A tool for analyzing the electrophysiological data.
NeuroExplorer  Plexon, USA N/A A software.
Ni-chrome wire California Fine Wire Co. M472490 35 μm Ni-chrome wire.
Offline Sorter Plexon Offline Sorter A tool for sorting the recorded multi-units.
PCB board Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. N/A Computer designed board.
Pentobarbital Sigma P3761 To anesthetize mice.
Pentobarbital sodium Sigma 57-33-0 To anesthetize the mouse.
Peristaltic pump Longer BT100-1F A device used for perfusion
Polyformaldehyde  Sangon Biotech A500684-0500 The main component of fixative solution for fixation of mouse brains 
PtCl4 Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. 13454-96-1 Preparation for gold plating liquid.
Saline Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. N/A To clean the mouse's skull.
Silver wire Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. 2 mm diameter Applying for ground and reference electrodes.
Skull drill RWD Life Science 78001 To drill carefully two small holes on mouse's skull.
Stainless steel screws YOUXIN Electronic Co., Ltd. M0.8 x 2 To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes.
Stereotaxic apparatus RWD Life Science 68513 To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex.
Sucrose Damao 57-50-1 To dehydrate the mouse brains  after perfusion.
Super glue Henkel AG & Co. PSK5C To fix the guide tube and Ni-chrome wire.
Temperature controller Harvard Apparatus TCAT-2 To maintain mouse's rectal temperature at 37°C
Tetracycline eye ointment Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. N/A To protect the mouse's eyes during surgery.
Thread Rapala N/A To link ballon and headstage.
Vaseline Unilever plc N/A To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull.

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References

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मल्टीचैनल एक्स्ट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहे न्यूरोनल फायरिंग नेटवर्क लोकल फील्ड पोटेंशियल (एलएफपी) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिग्नल विशिष्ट व्यवहार इलेक्ट्रोड आरोपण माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी मोटर कॉर्टेक्स (एमसी) ऑफलाइन डेटा विश्लेषण जागरूक जानवर स्पाइकिंग न्यूरॉन्स न्यूरोनल उपप्रकार व्यवहार और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिग्नल के बीच संबंध
स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में मल्टीचैनल एक्स्ट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग
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Ghouse, M., Li, M., Long, C., Jiang, … More

Ghouse, M., Li, M., Long, C., Jiang, J. Multichannel Extracellular Recording in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (195), e65245, doi:10.3791/65245 (2023).

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