Summary
该协议描述了运动皮层（MC）中细胞外记录的方法，以揭示自由移动的有意识小鼠的细胞外电生理特性，以及局部场电位（LFP）和尖峰的数据分析，这对于评估网络神经活动的潜在行为是有用的。
Abstract
该协议旨在通过将电生理信号与自发和/或特定行为相关联来揭示神经元放电和网络局部场电位（LFP）在执行特定任务的行为小鼠中的特性。该技术代表了研究这些行为背后的神经元网络活动的宝贵工具。本文提供了在自由移动的清醒小鼠中进行电极植入和随后的细胞外记录的详细而完整的程序。该研究包括植入微电极阵列的详细方法，使用多通道系统捕获运动皮层 （MC） 中的 LFP 和神经元脉冲信号，以及随后的离线数据分析。在有意识的动物中多通道记录的优点是可以获得和比较更多脉冲神经元和神经元亚型，从而可以评估特定行为与相关电生理信号之间的关系。值得注意的是，本研究中描述的多通道细胞外记录技术和数据分析程序在行为小鼠中进行实验时可以应用于其他大脑区域。
Introduction
局部场电位 （LFP） 是细胞外信号的重要组成部分，反映了大量神经元的突触活动，这些神经元构成了多种行为的神经代码1。神经元活动产生的尖峰被认为有助于 LFP，并且对神经编码很重要2.棘峰和 LFP 的改变已被证明可以介导多种脑部疾病，例如阿尔茨海默病，以及恐惧等情绪3,4。值得注意的是，许多研究都强调，动物清醒和麻醉状态之间的尖峰活性显着不同5.尽管麻醉动物的记录提供了一个机会，可以在高度定义的皮质同步状态下以最小的伪影评估 LFP，但结果在一定程度上与清醒受试者 6,7,8 中的结果不同。因此，使用植入大脑的电极在清醒的大脑状态下检测各种疾病在长时间尺度和大空间尺度上的神经活动更有意义。本手稿为初学者提供了有关如何制作微型驱动系统并使用通用软件设置参数的信息，以快速直接的方式计算尖峰和LFP信号，以便开始记录和分析。
尽管脑功能的非侵入性记录，例如使用脑电图 （EEG） 和从头皮记录的事件相关电位 （ERP），已广泛用于人类和啮齿动物研究，但 EEG 和 ERP 数据的空间和时间特性较低，因此无法检测特定大脑区域内附近树突突触活动产生的精确信号1.目前，通过利用有意识动物的多通道记录，可以通过在多次行为测试中将微驱动系统植入灵长类动物或啮齿动物的大脑中，长期和渐进地记录大脑深层的神经活动 1,2,3,4,5,6,7,8,9 .简而言之，研究人员可以构建一个微型驱动系统，该系统可用于电极或四极管的独立定位，以靶向大脑的不同部位10,11。例如，Chang等人描述了通过组装轻巧紧凑的微型驱动器12来记录小鼠尖峰和LFP的技术。此外，带有定制附件组件的微机械硅探针已上市，用于在行为任务期间记录啮齿动物的多个单个神经元和 LFP13。尽管已经使用了各种设计来组装微型驱动系统，但就整个微型驱动系统的复杂性和重量而言，这些设计仍然取得了有限的成功。例如，Lansink等人展示了一种具有复杂结构的多通道微驱动系统，用于从单个大脑区域14进行记录。Sato等人报道了一种多通道微型驱动系统，该系统具有自动液压定位功能15。这些微型驱动系统的主要缺点是它们太重，老鼠无法自由移动，并且对于初学者来说很难组装。尽管多通道细胞外记录已被证明是一种在行为测试中测量神经活动的合适且有效的技术，但对于初学者来说，记录和分析复杂的微驱动系统获得的信号并不容易。鉴于在自由移动的小鼠16,17中很难开始多通道细胞外记录和数据分析的整个操作过程，本文提出了简化的指南，以介绍使用常用组件和设置制作微驱动系统的详细过程;此外，还提供了通用软件中用于快速直接计算尖峰和LFP信号的参数。此外，在该协议中，由于使用了氦气球，鼠标可以自由移动，这有助于抵消头部和微型驱动系统的重量。总的来说，在本研究中，我们描述了如何轻松构建微驱动系统并优化记录和数据分析过程。
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Protocol
所有小鼠均在商业上获得，并在室温为22-25°C和相对湿度为50%-60%的情况下，在12小时光照/ 12小时黑暗循环（当地时间上午08：00点亮）中维持。小鼠可以获得持续的食物和水供应。所有实验均按照华南师范大学《实验动物护理与使用指南》进行，并经机构动物伦理委员会批准。以3-5月龄雄性C57BL/6J小鼠为研究对象。
1.微型驱动系统总成
- 使用两个支架和一个固定可移动微型驱动器的螺钉连接两块计算机设计的板，并将连接器连接到一块板上（图 1A，Bi-iii）。通过拧动螺钉（0.5 毫米/圈）驱动微型驱动器。
- 确保微型驱动器可以携带两组八根导管（~3 cm 长，~50 μm 内径，~125 μm 外径）用于 MC 区域的每一侧，然后将其切割成相同的长度（至少 15 mm;图1Biv，v）。
- 切割 16 根直径为 35 μm 的镍铬线（~5 cm 长），然后将它们依次装入导管中，然后涂上胶水固定它们（图 1Bi、vi、vii）。
- 剥去电线绝缘层，按照通道图将每根裸露的电线依次缠绕到连接器的每个引脚上，以及参考电极和接地电极，然后慢慢地在每个引脚上涂上导电漆（图 1Bviii-x）。
- 使用环氧树脂覆盖引脚（图1Axi，xii），然后通过阻抗测试仪进行镀金，将电极尖端的阻抗降低到~350 kOhm（图1Bxiii，xiv）。设置阻抗测试仪的参数如下：-10.08 μA 直流电，持续 1 秒，镀金溶液，包括 5 mM PtCl4。
- 最后，拧动螺丝将微型驱动器移至顶部。检查 如图 1A 所示修改的微型驱动系统的整体尺寸（约 15 mm 长、10 mm 宽、20 mm 高、~1 g 重量）。检查 图 1Ai、ii 中计算机设计的电路板和可移动组件的详细规格。
2. 电极阵列植入
- 在手术开始前对手术包进行消毒，戴上无菌手套并穿上医生的无菌白大褂。
- 为了控制疼痛，在诱导室中为小鼠使用皮下注射美洛昔康注射剂（5mg / kg）。然后通过在诱导室18,19中腹膜内（ip）注射戊巴比妥（80mg / kg）麻醉小鼠。如果脚趾捏反射仍然存在，则应用补充剂量的戊巴比妥 （20 mg/kg/h）。
- 将鼠标固定在立体定位装置中，并使用温度控制器将其直肠温度保持在37°C。
- 将四环素眼膏涂抹在小鼠的双眼上，并在手术前再次更换无菌手套。
- 剃掉小鼠的皮毛，并使用无菌棉签涂抹器以同心圆向外移动，用三轮交替的betadine磨砂膏和酒精对手术部位进行消毒（图2i，ii）。做一个小的中线切口（~15 毫米）以暴露其头骨。立即将 1% 利多卡因局部涂抹在颈部肌肉上以缓解疼痛。然后，用剪刀去除残留的组织，并使用涂有盐水的棉签清洁头骨（图2iii）。
- 使用充满墨水的玻璃微电极，标记双侧MC的所需位置以进行植入（图2iv，v）。根据先前的研究20，双侧 MC 的位置如下：前囟前方 0.74 mm，中线外侧 1.25 mm。
- 植入四个不锈钢螺钉（直径0.8毫米）以保护微驱动系统，然后将所有螺钉与参比电极和接地电极连接在一起，然后用混合牙科水泥覆盖以形成壁（图2vi-习）。
- 在MC区域的协调头骨的左右两侧用颅骨钻仔细钻两个小孔（~1.5mm2）（图2xii）。使用双侧 MC 的立体定位坐标：前囟前方 0.74 mm，中线外侧 1.25 mm，硬脑膜腹侧 0.5 mm。
- 用细镊子小心地从孔中取出硬脑膜（图2xiii）。
- 使用显微操纵器以 10 μm/s 的速度将微驱动系统插入孔的中心（图 2xiv-xvii）。
- 完成微型驱动系统的插入后，将凡士林填充到牙科水泥壁中（图2xviii）。
- 将微型驱动系统的底板和牙科水泥壁与混合牙科水泥连接起来（图2xix）
- 用生理盐水清洗切口，然后用含有盐酸林可霉素和盐酸利多卡因的凝胶进行局部治疗，以缓解术后疼痛。
- 将导电铜箔带缠绕在植入的微型驱动系统周围（图 2xx）。
- 将鼠标移入保持在31-33°C的笼子中，并监测鼠标从麻醉中恢复。
- 通过单独喂食让小鼠恢复1周。检查并用含有盐酸林可霉素和盐酸利多卡因的凝胶连续应用3天来治疗切口。
3. 自由移动小鼠双侧 MC 的多通道记录
- 轻轻小心地握住清醒的鼠标的头部。至少提前 0.1 天扭转微型驱动系统可移动部分上的螺钉（图 1Aii），向下移动电极阵列（~1 mm 深度）。
- 轻轻小心地握住清醒鼠标的头部。用螺纹连接头级的中心和氦气球（充满约 0.02 L 氦气），以抵消头级和微型驱动系统的重量（图 3A、B）。
- 通过在记录软件中以 30 kHz 采样，使用记录电极和多通道系统捕获原始信号，然后使用多通道系统中的数模 （DA） 转换器进行数字化。
- 通过在记录软件中以 10 kHz 重新采样，从原始数据中提取 LFP 信号，然后使用记录软件中的陷波滤波器去除 50 Hz 线路噪声。
- 从自由移动的鼠标中以稳定状态记录原始数据至少 60 秒。完成录制后，慢慢断开头戴式和微型驱动系统之间的连接，并将鼠标放回原位。
- 将记录的数据存储在计算机中并离线分析（图4 和 图5）。
- 完成实验后，按照研究所的指南进行安乐死，然后使用3V输出的电源确认电极的位置，进行1分钟的电解病变，然后进行组织学分析。使用冷冻切片机将小鼠的大脑切成30μm切片，收集MC切片，然后用显微镜捕获图像（图3C，D）。
4. 尖峰分选和分析
- 在尖峰排序软件 中单击“文件”>“打开> Nev文件 ”，打开以30 kHz采样的尖峰数据（图4Ai）。
- 单击“信息”以选择未排序的通道，然后选择 “排序”>“更改排序方法”>“使用 K-Means”。按下按钮 Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting 以获得排序单位（图 4Aii、iii）。
- 单击 “文件”>“另存为”，以.nev文件扩展名保存排序后的尖峰数据，然后选择 “文件”>“导出每个波形数据 ”，以.txt文件扩展名导出PCA结果（图4Aiv）。
- 单击 “文件”>“将数据导入>Blackrock文件 ”，进行神经生理学数据分析，打开排序后的尖峰文件（图4Bi）。
- 单击“分析>自相关图”以获取所选单元的自相关图，然后按如下方式设置参数：−0.05 s处的X最小值，0.05 s处的X最大值和0.001处的Bin值（图4Bii，iii）。
- 加载排序后的尖峰数据，单击 “分析>尖峰间间隔直方图 ”以获取尖峰间间隔直方图，然后设置如下参数：0 秒处的最小间隔值、0.1 秒处的最大间隔值和 0.001 处的 Bin 值（图 4Biv、v）。
- 单击“ 分析>交叉相关图 ”以获取两个排序单元事件之间的交叉相关图，然后按如下方式设置参考事件和参数：−0.1 s 处的 X 最小值、0.1 s 处的 X 最大值和 0.001 处的 Bin 值（图 4Bvi、vii）。
- 单击 “结果”>“数值结果 ”以保存具有.xls文件扩展名的自相关图、尖峰间间隔直方图和交叉相关图的结果（图 4Bviii、ix）。分析数据，并绘制图表。
5. LFP分析
- 在软件中单击 文件导入数据>Blackrock文件 进行神经生理学数据分析，以打开以10 kHz采样的连续信号数据（图5Ai）。
- 单击 Analysis > Spectrum for Continuous 以分析所选通道的 LFP 功率谱。按如下方式设置参数：频率值数为 8,192，多重锥度值为 3-5，归一化百分比占总功率谱密度 （PSD） 的百分比，频率范围为 1 Hz 至 100 Hz（图 5Aii、iii）。
- 单击“ 连续>相干分析”（Analysis Coherence for Continuous）， 分析 MC 左侧和右侧两个 LFP 的相干性。 按如下方式设置参考通道和参数： 在相干值、频率值数 8,192、多个锥度值在 3-5 和频率范围 1 Hz 至 100 Hz 处计算（图 5Aiv， v）。
- 单击“ Analysis > Corr. with Cont. Variables ”，分析 MC 左右两侧两个 LFP 之间的相关性。 设置参考通道（LFP 数据）和参数如下：−0.1 s 处的 X 最小值、0.1 s 处的 X 最大值和 0.001 处的 Bin 值（图 5Avi， vii）。
- 单击“结果”>“数值结果”，将PSD、一致性和相关性的结果与.xls文件扩展名一起保存（图5Aviii，ix）。
- 选择每个频段需要提取代表性迹线的信道，点击“连续变量数字滤波编辑”>得到每个频带，然后设置参数如下：滤波器频率响应为带通，滤波器实现为无限脉冲响应（IIR）巴特沃斯，滤波器阶数值为2。最后，设置感兴趣的频率范围（图5Bi-iv）。
注意：此处使用的频率范围如下：δ（δ，1-4 Hz）、θ（θ，5-12 Hz）、β（β，13-30 Hz）、低伽马（低γ，30-70 Hz）和高伽马（高γ，70-100 Hz）振荡。 - 分析数据并绘制图表。
6. 尖峰与LFP之间的相关性
- 在软件中点击 “文件”>“导入数据>贝莱德文件 ”进行神经生理学数据分析，打开连续信号数据和尖峰数据。
- 单击 “分析”>“相干分析 ”以分析所选通道的尖峰和 LFP 之间的相干性。设置参考变量（尖峰时序）和参数，如下所示：在相干值、频率值数 512、多重锥度值 3-5 以及频率范围为 1 Hz 至 100 Hz 处计算（图 5Ci、ii）。
- 单击“结果”>“数值结果”，以.xls文件扩展名保存尖峰场相干性的结果（图5Ciii，iv）。
- 分析数据并绘制图表。
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Representative Results
应用高通（250 Hz）滤波器从原始信号中提取多单元尖峰（图6A）。此外，验证了通过PCA排序的正常小鼠MC的记录单位（图7A-D），并记录了小鼠MC中单位的谷值宽度和波形持续时间。结果表明，小鼠MC推定锥体神经元（Pyn）的谷宽和波形持续时间均高于推定中间神经元（IN）（图7E，F;两个样本Mann-Whitney检验;对于谷宽，推定Pyn：0.636 ms ± 0.004 ms，推定IN：0.614 ms ± 0.001 ms，p = 0.002; 对于波形持续时间， 推定 Pyn：0.095 ms ± 0.004 ms，推定 IN：0.054 ms ± 0.002 ms，p = 1.402 x 10−16），对应于先前研究中 Pyn 和 IN 的特征21.我们还通过将假定的 Pyn 尖峰设置为参考来计算假定的 Pyn 和 IN 之间的交叉相关图，并在 ~18 ms 处发现一个正峰值（图 7G），表明假定的 Pyn 尖峰发生在假定的 IN 尖峰之前，窗口为 ~18 ms。
通过软件中的IIR滤波器从LFP中滤除每个频段的代表性迹线，用于神经生理学数据分析（图6A）。在LFP分析中，正常小鼠中左右MC的LFP在功率谱上相似，表明左右MC之间的活动同步（图8A，B;两个样本Mann-Whitney检验;对于δ，左MC：50.71±1.136，右MC：50.47±1.213，p = 0.70;对于θ，左MC：2.197±0.187，右MC： 2.068 ± 0.193，p = 0.40;对于β，左 MC：0.222 ± 0.058，右 MC：0.206 ± 0.055，p = 0.70;对于低γ，左 MC：0.114 ± 0.034，右 MC：0.093 ± 0.018，p = 0.70;对于高γ，左 MC：0.054 ± 0.027，右 MC：0.04 ± 0.015，p = 0.40）。然后，我们计算了左MC和右MC之间的相干性和相关性（图8C，D;左MC LFP在右MC LFP之后~1.2 ms的窗口内，-1.167 ms±0.667 ms）并计算了与LFP（1-100 Hz）同步的假定Pyn或IN尖峰的大小在正常小鼠的左MC中（图8E）。与 Pyn 相比，这显示了推定 IN 的低γ相干性更强。
图 1：电极和多通道记录 系统示意图。 （A） 微型驱动系统示意图。 我。 计算机设计电路板的图纸和规格。 ii. 可移动微型驱动器示意图。（B）微驱动系统和多通道可移动单电极步骤。 我。 镍铬线; ii. 电极的组成部分; iii. 组装计算机设计的电路板; iv. 电极的初步组装，包括连接器和八个导管; 五. 微型驱动器的另一侧; 六，七。 将镍铬焊丝依次装入导管中; 八-十。 每根裸露的导线依次缠绕到每个引脚上，然后在每个引脚上涂上导电涂料; 习，十二。 引脚用环氧树脂覆盖; 十三，十四。 镀金。（C）自由移动小鼠MC细胞外记录的实验设计。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：分步外科手术。 一，二. 剃掉小鼠的皮毛，并用三轮交替的betadine磨砂膏和酒精对手术部位进行消毒。 iii. 清洁老鼠的头骨。 iv. 调平。 五. 标记大脑位置。 vi. 标记不锈钢螺钉的位置。 vii. 插入不锈钢螺钉。 viii. 将螺钉与参比电极和接地电极连接在一起。 九，十。混合牙科水泥。 习 。 用牙科水泥砌墙。 十二，十三。在双侧 MC 上方钻两个小孔，然后移除硬脑膜。 xiv. 准备微型驱动系统。 十五至十九。 植入微驱动系统，然后用含有盐酸林可霉素和盐酸利多卡因的凝胶进行局部治疗，以缓解术后疼痛。 xx. 用导电铜箔带保护微驱动系统。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：有意识的鼠标中头部固定记录的图示。 （A） 自由移动记录示意图。（B） 自由移动记录的图像细节。我。植入式微型驱动系统的平面;ii. Headstage;三，四。微型驱动系统与头级连接;五.氦气球用于抵消顶台和微型驱动系统的重量。（C） 使用电解病灶验证记录部位位置的图示。（D）小鼠MC中电解病变标记的记录位点。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：尖峰排序和分析图示。 （A） 用于对尖峰数据进行聚类和导出结果的参数。 我。导入尖峰数据;ii. 选择排序方法;iii. 使用κ-means算法对峰值数据进行排序;iv. 从排序单元中导出结果。（B） 分析排序单元的尖峰间间隔直方图、自相关图和交叉相关图的过程。我。导入排序后的尖峰数据;ii. 进行自相关分析;iii. 设置自相关图的参数;iv. 获取尖峰间间隔直方图;v. 设置尖峰间间隔直方图的参数;vi. 计算排序单位中尖峰之间的互相关性;vii. 设置交叉相关图的参数;八、九。导出结果。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：连续数据分析的图示。 （A） 使用LFP的功率谱、相干性和两个LFP之间的相关性计算的LFP信号分析过程和参数。 i. 导入LFP数据;ii. 从双边MC计算LFP的功率谱密度;答：计算LFP的功率谱密度;iv，v. 计算LFP之间的一致性;六，七。计算两个 LFP 之间的相关性。导出结果。（B） 从LFP信号中滤波每个频率范围的过程。i. 从LFP数据中提取不同的频段;二，三。查看过滤后的 LFP;iv. 将过滤后的 LFP 另存为增强的图元文件。（C）分析神经元尖峰和LFP之间相干性的过程。 一，二。计算LFP和排序尖峰之间的相干性;三，四。导出结果。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：记录信号的代表性迹线。 尖峰以250 Hz从30 kHz采样的原始数据中高通滤波。LFP是在10 kHz下采样的原始数据。δ是从LFP以1-4 Hz滤波的三角频带带通。θ 是从 LFP 滤波到 5-12 Hz 的 θ 频带。β是从LFP以13-30 Hz滤波的β频段。低γ是从LFP滤波到30-70 Hz的低伽马频带。高γ是LFP以70-100 Hz滤波的高伽马频带。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：排序单元的特征及其点火模式。 （A，B）使用来自同一电极的主成分分析（PCA）对分选单元进行聚类。（C，D）推定的兴奋性神经元 （Pyn） 和推定的抑制性神经元 （IN） 的自相关（顶部）和尖峰间间直方图（底部）。（E）推定Pyn的谷宽显著高于推定IN（推定Pyn：n = 1,055个尖峰，推定IN：n = 1,985个尖峰）。（F）推定Pyn的波形持续时间强于推定IN的波形持续时间（推定Pyn：n = 1,005个尖峰，推定IN：n = 1,059个尖峰）。（G） 假定的 Pyn 和 IN 之间的互相关。使用 Mann-Whitney 检验进行统计分析。所有数据均以平均值±均值的标准误差表示，**p < 0.01，***p < 0.001。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：来自双侧 MC 的两种 LFP 的分析以及小鼠中尖峰事件与 LFP 之间的一致性。 （A，B） 小鼠每个频段双侧 MC 的归一化功率谱 （n = 3）。（C） 左右 MC 之间两个 LFP 的相干曲线 （n = 3）。（D） 两个 LFP 的互相关曲线显示左右 MC 在 ±100 ms 时滞 （n = 3） 下的相关性。（E） 小鼠MC中的尖峰场相干曲线。使用 Mann-Whitney 检验进行统计分析。所有数据均以均值±均值的标准误差表示。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在自由移动的小鼠中，多通道记录被认为是神经科学研究中的一项有用技术，但对于初学者来说，记录和分析信号仍然相当具有挑战性。在本研究中，我们提供了制造微驱动系统和进行电极植入的简化指南，以及 通过 尖峰分选软件和神经生理学数据分析软件捕获和分析电信号的简化程序。
鉴于定制微驱动系统的质量极大地有助于在自由移动的小鼠 14、15、16、17 中获取稳定和定性的信号，我们在这项研究中为微驱动系统设计并使用了更坚固、更轻便的结构，初学者可以轻松清晰地遵循构建微驱动系统的制造步骤。此外，所设计的微型驱动系统的结构涉及廉价的材料，这些材料在五金店很容易买到，这与先前研究中使用的更大、更重的微型驱动系统不同14,15。这种微型驱动系统可以减少录音过程中的不适感并承受自由移动的鼠标的冲击。同时，我们进一步改进了微型驱动系统的尺寸和形状，这可能对初学者有所帮助，因为他们可以在手术过程中观察、插入并因此将电极尖端移动到大脑中。此外，微驱动系统中应用的简单滑动结构使用高精度螺杆在大脑中精确推进，这意味着该系统在测量目标大脑区域的多层时提供精确控制;事实上，这对于在长期实验期间捕获自由移动动物的细胞外信号极为重要。最重要的是，这种微型驱动系统的优点是其简单性和灵活性;然而，在新版本中，应进一步改进较少的通道数量和单电极阵列的使用。
本研究还有几项改进值得注意。与以前的系统相比，由于微型驱动系统的尺寸更小，形状更灵活，因此为操作提供了更广阔的视野和更宽的工作空间。此外，小鼠头骨上的壁由牙科水泥和不锈钢螺钉制成，这使得微型驱动系统能够牢固地连接到鼠标的头部。此外，牙科水泥壁允许在倒入牙科水泥之前装载凡士林以覆盖小鼠头骨上的孔，这对没有硬脑膜和微型驱动系统的可移动部分的大脑表面具有保护作用。总之，这些改进是有用的，因为它们允许初学者轻松自信地将微型驱动系统植入小鼠大脑。
在多通道细胞外记录中，人们普遍认为另一个困难在于使用数学上复杂的编程语言17分析记录的信号。因此，我们为初学者提供了明确的指南，特别是在尖峰分选、LFP 数据分析以及使用电生理学中常用软件计算它们之间的关系方面。此外，我们强烈建议通过PCA方法聚类的单电极测定记录的单元应具有大量用于分析的特征，例如排序的神经元尖峰间间隔及其谷值和峰值之间的宽度，因为这些值对于初学者在使用离线分选机软件自动聚类单元时减少偏差很有用。重要的是，包含尖峰的信号与LFP之间的关系对于介导多种行为至关重要。我们还提供了一系列简单的插图，用于使用软件中的可靠脚本测量尖峰-尖峰、LFP-LFP 和尖峰-LFP 相关性，用于神经生理学数据分析;这些插图将使初学者能够开始在自由移动的小鼠中快速处理和分析记录的信号。此外，使用该专有软件处理的结果和数据可以与开源工具箱（如 Fieldtrip）结合使用，以便提前进行额外分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（31871170、32170950和31970915）、广东省自然科学基金（2021A1515010804和2023A1515010899）、广东省自然科学基金重大培育项目（2018B030336001）和广东省资助：脑疾病治疗关键技术（2018B030332001）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
