Summary
Protokollen beskriver metoden til ekstracellulær optagelse i motorcortex (MC) for at afsløre ekstracellulære elektrofysiologiske egenskaber hos frit bevægelige bevidste mus samt dataanalyse af lokale feltpotentialer (LFP'er) og pigge, hvilket er nyttigt til evaluering af netværkets neurale aktivitet, der ligger til grund for adfærd af interesse.
Abstract
Protokollen har til formål at afdække egenskaberne ved neuronal fyring og netværkslokale feltpotentialer (LFP'er) i at opføre mus, der udfører specifikke opgaver ved at korrelere de elektrofysiologiske signaler med spontan og / eller specifik adfærd. Denne teknik repræsenterer et værdifuldt redskab til at studere den neuronale netværksaktivitet, der ligger til grund for denne adfærd. Artiklen giver en detaljeret og komplet procedure for elektrodeimplantation og deraf følgende ekstracellulær optagelse i frie bevægelige bevidste mus. Undersøgelsen inkluderer en detaljeret metode til implantering af mikroelektrodearrayerne, optagelse af LFP og neuronale spiking-signaler i motorcortex (MC) ved hjælp af et multikanalsystem og den efterfølgende offline dataanalyse. Fordelen ved multikanaloptagelse hos bevidste dyr er, at et større antal spiking neuroner og neuronale undertyper kan opnås og sammenlignes, hvilket muliggør evaluering af forholdet mellem en specifik adfærd og de tilhørende elektrofysiologiske signaler. Især kan multikanals ekstracellulær optagelsesteknik og dataanalyseproceduren beskrevet i denne undersøgelse anvendes på andre hjerneområder, når der udføres eksperimenter med mus, der opfører sig.
Introduction
Det lokale feltpotentiale (LFP), en vigtig komponent i ekstracellulære signaler, afspejler den synaptiske aktivitet af store populationer af neuroner, som danner den neurale kode for flere adfærd1. Spikes genereret af neuronal aktivitet anses for at bidrage til LFP og er vigtige for neural kodning2. Ændringer i pigge og LFP'er har vist sig at formidle flere hjernesygdomme, såsom Alzheimers sygdom, såvel som følelser som frygt osv.3,4. Det er værd at bemærke, at mange undersøgelser har fremhævet, at spikeaktivitet adskiller sig væsentligt mellem vågen og bedøvet tilstand hos dyr5. Selvom optagelser i bedøvede dyr giver mulighed for at vurdere LFP'er med minimale artefakter i højt definerede kortikale synkroniseringstilstande, adskiller resultaterne sig til en vis grad fra, hvad der kan findes hos vågne forsøgspersoner 6,7,8. Således er det mere meningsfuldt at detektere neural aktivitet over lange tidsskalaer og store rumlige skalaer i forskellige sygdomme i en vågen hjernetilstand ved hjælp af elektroder implanteret i hjernen. Dette manuskript giver information til begyndere om, hvordan man laver mikrodrevsystemet og indstiller parametrene ved hjælp af almindelig software til beregning af spike- og LFP-signalerne på en hurtig og ligetil måde for at få optagelsen og analysen startet.
Selvom den ikke-invasive registrering af hjernefunktioner, såsom ved hjælp af elektroencefalogram (EEG'er) og begivenhedsrelaterede potentialer (ERP'er) registreret fra hovedbunden, er blevet brugt i vid udstrækning i humane og gnaverundersøgelser, har EEG- og ERP-data lave rumlige og tidsmæssige egenskaber og kan derfor ikke detektere de præcise signaler, der produceres af nærliggende dendritisk synaptisk aktivitet inden for et specifikt hjerneområde1. Ved at udnytte multikanaloptagelse i bevidste dyr kan neural aktivitet i de dybere lag af hjernen i øjeblikket registreres kronisk og progressivt ved at implantere et mikrodrevsystem i hjernen hos primater eller gnavere under flere adfærdstest 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Kort fortalt kan forskere konstruere et mikrodrevsystem, der kan bruges til uafhængig positionering af elektroderne eller tetroderne til at målrette forskellige dele af hjernen10,11. For eksempel beskrev Chang et al. teknikker til at registrere pigge og LFP'er i mus ved at samle et let og kompakt mikrodrev12. Derudover er mikrobearbejdede siliciumsonder med specialfremstillede tilbehørskomponenter kommercielt tilgængelige til optagelse af flere enkeltneuroner og LFP'er hos gnavere under adfærdsmæssige opgaver13. Selvom forskellige designs er blevet brugt til samling af mikrodrevsystemer, har disse stadig begrænset succes med hensyn til kompleksiteten og vægten af hele mikrodrevsystemet. For eksempel viste Lansink et al. et multikanals mikrodrevsystem med en kompleks struktur til optagelse fra et enkelt hjerneområde14. Sato et al. rapporterede om et multikanals mikrodrevsystem, der viste en automatisk hydraulisk positioneringsfunktion15. De største ulemper ved disse mikrodrevsystemer er, at de er for tunge til, at mus kan bevæge sig frit og er vanskelige at samle for begyndere. Selvom multikanals ekstracellulær optagelse har vist sig at være en passende og effektiv teknologi til måling af neural aktivitet under adfærdstests, er det ikke let for begyndere at optage og analysere de signaler, der er erhvervet af det komplekse mikrodrevsystem. I betragtning af at det er vanskeligt at få hele driftsprocessen for multikanals ekstracellulær optagelse og dataanalyse startet i frit bevægelige mus16,17, præsenterer denne artikel forenklede retningslinjer for at introducere den detaljerede proces med at fremstille mikrodrevsystemet ved hjælp af almindeligt tilgængelige komponenter og indstillinger; parametrene i den fælles software til beregning af spike- og LFP-signalerne på en hurtig og ligetil måde leveres også. Derudover kan musen i denne protokol bevæge sig frit på grund af brugen af en heliumballon, hvilket bidrager til at udligne vægten af headstage og mikrodrevsystem. Generelt beskriver vi i denne undersøgelse, hvordan man nemt kan opbygge et mikrodrevsystem og optimere processerne til registrering og dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle musene blev anskaffet kommercielt og vedligeholdt i en 12 timers lys/12 timers mørk cyklus (lys tændt kl. 08:00 lokal tid) ved en stuetemperatur på 22-25 °C og en relativ luftfugtighed på 50%-60%. Musene havde adgang til en kontinuerlig forsyning af mad og vand. Alle forsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr fra South China Normal University og godkendt af Institutional Animal Ethics Committee. C57BL/6J-hanmus i alderen 3-5 måneder blev brugt til forsøgene.
1. Mikrodrevsystemsamling
- Tilslut to computerdesignede kort ved hjælp af to stulls og en skrue, der holder det bevægelige mikrodrev, og fastgør stikket til et kort (figur 1A, Bi-iii). Kør mikrodrevet ved at dreje en skrue (0,5 mm/cirkel).
- Sørg for, at mikrodrevet kan bære to sæt med otte styrerør (~ 3 cm lange, ~ 50 μm indvendig diameter, ~ 125 μm udvendig diameter) til hver side af MC-regionen, og skær det derefter til samme længde (mindst 15 mm; Figur 1Biv, v).
- Skær 16 Ni-kromtråde (~ 5 cm lange) med en diameter på 35 μm, og læg dem derefter successivt i styrerørene, efterfulgt af lim for at fastgøre dem (figur 1Bi, vi, vii).
- Strip trådisoleringen, fletning successivt hver eksponeret ledning til hver stift fra stikket efter kanalkortet samt reference- og jordelektroderne, og belæg derefter langsomt ledende maling på hver stift (figur 1Bviii-x).
- Dæk stifterne ved hjælp af epoxyharpiks (figur 1Axi, xii), og udfør derefter forgyldning via en impedanstester for at reducere impedansen af elektrodespidserne til ~ 350 kOhm (figur 1Bxiii, xiv). Indstil parametrene for impedanstesteren som følger: -10,08 μA jævnstrøm i 1 s med forgyldningsopløsning, inklusive 5 mMPtCl4.
- Til sidst skal du flytte mikrodrevet til toppen ved at dreje en skrue. Kontroller den samlede størrelse af mikrodrevsystemet, der er ændret som vist i figur 1A (ca. 15 mm lang, 10 mm bredde, 20 mm højde, ~1 g vægt). Kontroller de detaljerede specifikationer for det computerdesignede kort og den bevægelige komponent i figur 1Ai, ii.
2. Implantation af elektrodearray
- Steriliser operationssættene, brug sterile handsker og tag en læges sterile hvide frakke på, før operationen starter.
- For at håndtere smerten skal du bruge subkutan (s.c.) injektion af meloxicam injicerbar (5 mg / kg) til musen i et induktionskammer. Derefter bedøves musen ved en intraperitoneal injektion (i.p.) af pentobarbital (80 mg/kg) i et induktionskammer18,19. Påfør en supplerende dosis pentobarbital (20 mg/kg/time), hvis tåklemmerefleksen stadig er til stede.
- Fastgør musen i et stereotaksisk apparat, og hold dens rektaltemperatur på 37 °C ved hjælp af en temperaturregulator.
- Påfør tetracyclin øjensalve på begge øjne af musen og skift sterile handsker igen før operationen.
- Barber musens pels og desinficer det kirurgiske sted med tre skiftevis runder betadinskrubbe og alkohol ved hjælp af en steril applikator med bomuldsspids i koncentriske cirkler, der starter i midten og bevæger sig udad (figur 2i, ii). Lav et lille midterlinjesnit (~ 15 mm) for at afsløre kraniet. Anvend straks 1% lidokain lokalt på nakkemusklerne for smertelindring. Fjern derefter det resterende væv ved hjælp af en saks, og rengør kraniet ved hjælp af saltvandsbelagte vatpinde (figur 2iii).
- Brug en glasmikroelektrode fyldt med blæk til at markere de ønskede placeringer af den bilaterale MC til implantation (figur 2iv, v). Baseret på en tidligere undersøgelse20 er placeringen af den bilaterale MC som følger: 0,74 mm foran bregma og 1,25 mm lateral til midterlinjen.
- Der implanteres fire skruer i rustfrit stål (diameter 0,8 mm) for at beskytte mikrodrevsystemet, og sammenføj derefter alle skruerne sammen med reference- og jordelektroderne efterfulgt af dækning med blandet tandcement for at danne vægge (figur 2vi-xi).
- Bor forsigtigt to små huller (~ 1,5 mm2) med et kraniebor på både venstre og højre side af det koordinerede kranium i MC-regionerne (figur 2xii). Brug de stereotaksiske koordinater for den bilaterale MC: 0,74 mm foran bregma, 1,25 mm lateral til midterlinjen og 0,5 mm ventral til duraen.
- Fjern dura mater forsigtigt fra hullerne med fine pincet (figur 2xiii).
- Indsæt mikrodrevsystemet i midten af hullerne ved hjælp af en mikromanipulator ved 10 μm/s (figur 2xiv-xvii).
- Fyld vaselinen ind i tandcementvæggene, når indsættelsen af mikrodrevsystemet er afsluttet (figur 2xviii).
- Forbind bundpladen på mikrodrevsystemet og tandcementvæggene med den blandede tandcement (figur 2xix)
- Vask snittet med saltvand efterfulgt af lokal behandling med en gel indeholdende lincomycinhydrochlorid og lidokainhydrochlorid for at lindre postkirurgisk smerte.
- Vind det ledende kobberfoliebånd rundt om det implanterede mikrodrevsystem (figur 2xx).
- Flyt musen ind i et bur, der holdes ved 31-33 °C, og overvåg musen for genopretning efter anæstesi.
- Lad musene komme sig i 1 uge med separat fodring. Kontroller og behandl snittet med 3 dages kontinuerlig påføring af en gel indeholdende lincomycinhydrochlorid og lidokainhydrochlorid.
3. Multikanaloptagelse i den bilaterale MC i mus i fri bevægelse
- Hold hovedet på en vågen mus let og forsigtigt. Flyt elektrodearrayerne ned (~0,1 mm dybde) ved at dreje skruen på den bevægelige del af mikrodrevsystemet (figur 1Aii) mindst 1 dag i forvejen.
- Hold hovedet på den vågne mus let og forsigtigt. Forbind midten af hovedscenen og en heliumballon (fyldt med ca. 0,02 L helium) med en tråd for at udligne vægten af headstage og mikrodrevsystemet (figur 3A, B).
- Optag rå signaler ved hjælp af optageelektroderne og multikanalsystemerne ved at samplingere ved 30 kHz i optagesoftwaren, og digitaliser derefter ved hjælp af en digital-analog (DA) konverter fra multikanalsystemerne.
- Udtræk LFP-signalerne fra de rå data ved at gensample ved 10 kHz i optagesoftwaren, og brug derefter et hakfilter fra optagesoftwaren til at fjerne 50 Hz linjestøj.
- Optag rådata i stabil tilstand fra en frit bevægelig mus i mindst 60 s. Når du er færdig med optagelsen, skal du langsomt fjerne forbindelsen mellem headstage og mikrodrevsystemet og returnere musen tilbage til sit hjemmebur.
- Gem de registrerede data på computeren, og analysér dem offline (figur 4 og figur 5).
- Efter afslutningen af eksperimentet skal du udføre eutanasi i henhold til instituttets retningslinjer og derefter bekræfte placeringen af elektroderne ved at bruge strømforsyningen ved 3 V udgang til at udføre en 1 min elektrolytisk læsion efterfulgt af at udføre histologisk analyse. Skær musens hjerne i skiver på 30 μm ved hjælp af et frysemikrotom, saml MC-sektionerne, og tag derefter billederne med et mikroskop (figur 3C, D).
4. Spike sortering og analyse
- Klik på Filer > Åbn > Nev-filer i spike-sorteringssoftwaren for at åbne spike-data, der er samplet ved 30 kHz (figur 4Ai).
- Klik på Info for at vælge den usorterede kanal, og vælg derefter Sorter > Skift sorteringsmetode > Brug K-midler. Tryk på knappen Dalsøgende sortering > K-betyder sortering for at få de sorterede enheder (figur 4Aii, iii).
- Klik på Filer > Gem som, gem de sorterede spidsdata med filtypenavnet .nev, og vælg Filer > Eksporter per-bølgeformdata for at eksportere PCA-resultaterne med filtypenavnet .txt (figur 4Aiv).
- Klik på File > Import Data > Blackrock File i softwaren til neurofysiologisk dataanalyse for at åbne den sorterede spike-fil (Figur 4Bi).
- Klik på Analyse > Autokorrelogrammer for at få autokorrelogrammet for den valgte enhed, og indstil derefter parametrene som følger: X-minimumsværdien ved -0,05 s, X-maksimumværdien ved 0,05 s og Bin-værdien ved 0,001 (figur 4Bii, iii).
- Indlæs de sorterede spidsdata, klik på Analyse > Interspike Interval Histograms for at få inter-spike intervalhistogrammet, og indstil derefter parametrene som følger: Min. intervalværdien ved 0 s, Max. intervalværdien ved 0,1 s og Bin-værdien ved 0,001 (figur 4Biv, v).
- Klik på Analyse > krydskorrelogrammer for at få krydskorrelogrammet mellem to sorterede enhedshændelser, og indstil derefter referencehændelserne og parametrene som følger: X-minimumsværdien ved -0,1 s, X-maksimumværdien ved 0,1 s og Bin-værdien ved 0,001 (figur 4Bvi, vii).
- Klik på Resultater > numeriske resultater for at gemme resultaterne af autocorrelogram, inter-spike interval histogram og cross-correlogram med .xls filtypenavne (figur 4Bviii, ix). Analysér dataene, og tegn grafen.
5. LFP-analyse
- Klik på File Import Data > Blackrock File i softwaren til neurofysiologisk dataanalyse for at åbne de kontinuerlige signaldata, der er samplet ved 10 kHz (figur 5Ai).
- Klik på Analyse > spektrum for kontinuerlig for at analysere effektspektret for LFP fra den valgte kanal. Indstil parametrene som følger: Antallet af frekvensværdier ved 8,192, Multiple Tapers-værdien ved 3-5, normaliseringen af procentdelen af den samlede effektspektraltæthed (PSD) og frekvensområdet fra 1 Hz til 100 Hz (figur 5Aii, iii).
- Klik på Analyse > sammenhæng for kontinuerlig for at analysere sammenhængen for to LFP'er fra venstre og højre side af MC. Indstil referencekanalen og parametrene som følger: Beregn ved kohærensværdier, antallet af frekvensværdier ved 8.192, værdien for flere nedtrapninger ved 3-5 og frekvensområdet fra 1 Hz til 100 Hz (figur 5Aiv, v).
- Klik på Analyse > Korr. med Cont. Variabler for at analysere korrelationen mellem to LFP'er fra venstre og højre side af MC. Indstil referencekanalen (LFP-data) og parametre som følger: X-minimumsværdien ved -0,1 s, X-maksimumværdien ved 0,1 s og Bin-værdien ved 0,001 (figur 5Avi, VII).
- Klik på Resultater > numeriske resultater for at gemme resultaterne af PSD, sammenhæng og korrelation med en .xls filendelse (figur 5Aviii, ix).
- Vælg den kanal, som de repræsentative spor skal ekstraheres for hvert frekvensbånd, klik på Rediger > digital filtrering af kontinuerlige variabler for at få hvert frekvensbånd, og indstil derefter parametrene som følger: Filter Freq. Response as Bandpass, Filter Implementation at infinite impulse response (IIR) Butterworth og Filter Order value på 2. Til sidst skal du indstille frekvensområdet af interesse (figur 5Bi-iv).
BEMÆRK: De frekvensområder, der blev brugt her, var som følger: delta (δ, 1-4 Hz), theta (θ, 5-12 Hz), beta (β, 13-30 Hz), lav gamma (lav γ, 30-70 Hz) og høj gamma (høj γ, 70-100 Hz) svingninger. - Analyser dataene og tegn grafen.
6. Korrelationer mellem spidsen og LFP
- Klik på File > Import Data > Blackrock File i softwaren til neurofysiologisk dataanalysefor at åbne de kontinuerlige signaldata og spike-data.
- Klik på Analyse > kohærensanalyse for at analysere sammenhængen mellem piggene og LFP fra den valgte kanal. Indstil referencevariablen (spike timing) og parametre som følger: Beregn ved kohærensværdier, antallet af frekvensværdier ved 512, værdien for flere nedtrapninger ved 3-5 og frekvensområdet fra 1 Hz til 100 Hz (figur 5Ci, ii).
- Klik på Resultater > numeriske resultater for at gemme resultatet af spike-feltets sammenhæng med filtypenavnet .xls filnavn (figur 5Ciii, iv).
- Analyser dataene og tegn grafen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et højpasfilter (250 Hz) blev anvendt til at udtrække spidserne med flere enheder fra de rå signaler (figur 6A). Endvidere blev de registrerede enheder fra MC for en normal mus sorteret efter PCA verificeret (figur 7A-D), og dalbredden og bølgeformvarigheden af enhederne i musens MC blev registreret. Resultaterne viste, at både dalbredden og bølgeformvarigheden af MC putative pyramidale neuroner (Pyn) i mus er højere end de formodede interneuroner (IN) (figur 7E, F; to prøver Mann-Whitney test; for dalbredde, formodet Pyn: 0,636 ms ± 0,004 ms, formodet IN: 0,614 ms ± 0,001 ms, p = 0,002; for bølgeformvarighed, formodet Pyn: 0,095 ms ± 0,004 ms, formodet IN: 0,054 ms ± 0,002 ms, p = 1,402 x 10-16), svarende til egenskaberne ved Pyn og IN i tidligere undersøgelser21. Vi beregnede også krydskorrelogrammet mellem formodet Pyn og IN ved at indstille de formodede Pyn-pigge som reference og fandt en positiv top ved ~ 18 ms (figur 7G), hvilket indikerer, at den formodede Pyn-spiking forekommer før den formodede IN-spiking med et vindue på ~ 18 ms.
Repræsentative spor af hvert frekvensbånd blev filtreret fra LFP af IIR-filteret i softwaren til den neurofysiologiske dataanalyse (figur 6A). I LFP-analysen var LFP'erne for venstre og højre MC i normale mus ens i effektspektret, hvilket tyder på synkroniserede aktiviteter mellem venstre og højre MC (figur 8A, B; to prøver Mann-Whitney-test; for δ, venstre MC: 50,71 ± 1,136, højre MC: 50,47 ± 1,213, p = 0,70; for θ, venstre MC: 2,197 ± 0,187, højre MC: 2, 068 ± 0, 193, p = 0, 40; for β, venstre MC: 0,222 ± 0,058, højre MC: 0,206 ± 0,055, p = 0,70; for lav γ, venstre MC: 0,114 ± 0,034, højre MC: 0,093 ± 0,018, p = 0,70; for høj γ, venstre MC: 0,054 ± 0,027, højre MC: 0,04 ± 0,015, p = 0,40). Vi beregnede derefter sammenhængen og korrelationen mellem venstre og højre MC (figur 8C, D; venstre MC LFP følger inden for et vindue på ~ 1,2 ms efter højre MC LFP, -1,167 ms ± 0,667 ms) og beregnede størrelsen af den formodede Pyn- eller IN-spiking synkroniseret med LFP (1-100 Hz) i venstre MC på en normal mus (figur 8E). Dette viste en stærkere lav γ sammenhæng for den formodede IN sammenlignet med Pyn.
Figur 1: Diagram over elektroderne og multikanaloptagelsessystemet. (A) Illustration af mikrodrevsystemet. Jeg. Tegning og specifikation af det computerdesignede kort. ii. Skematisk diagram over det bevægelige mikrodrev. (B) Mikrodrevsystem og bevægelige multikanaltrin med enkelt elektrode. Jeg. Ni-kromledningerne; ii. Elektrodens bestanddele; iii. Samling af de computerdesignede tavler; iv. Indledende samling af elektroderne, herunder konnektorer og otte styrerør; v. Den anden side af mikrodrevet; VI,VII. Ni-kromtrådene lægges successivt i styrerørene; VIII-X. Hver eksponeret ledning er successivt sammenflettet til hver stift, efterfulgt af belægning, der leder maling på hver stift; XI,XII. Stifterne er dækket ved hjælp af epoxyharpiks; XIII XIV. Forgyldning. (C) Eksperimentelt design af den ekstracellulære optagelse i MC af en mus i fri bevægelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trin-for-trin kirurgisk procedure. i,ii. Barber musens pels og desinficer det kirurgiske sted med tre skiftevis runder betadinskrubbe og alkohol. iii. Rens musens kranium. iv. Nivellering. v. Marker hjernens placering. vi. Marker positionerne for skruer i rustfrit stål. vii. Indsæt skruer i rustfrit stål. viii. Forbind skruerne med referenceelektroderne og jordelektroderne. ix,x. Bland tandcementen. xi. Byg en mur med tandcement. XII,XIII. Bor to små huller over den bilaterale MC, efterfulgt af fjernelse af dura mater. xiv. Forbered mikrodrevsystemet. XV-XIX. Implanter mikrodrevsystemet efterfulgt af lokal behandling med en gel indeholdende lincomycinhydrochlorid og lidokainhydrochlorid for at lindre postkirurgisk smerte. xx. Beskyt mikrodrevsystemet med ledende kobberfolietape. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Illustration af en hovedfast optagelse i en bevidst mus. (A) Skematisk diagram til optagelse i frit bevægeligt rum. (B) Nærmere oplysninger om billederne fra optagelsen i frit forløb. Jeg. Planform af det implanterede mikrodrevsystem; ii. Hovedkvarter; III,IV. Mikrodrevsystemet og headstage er forbundet; v. Heliumballonen anvendes til at kompensere for vægten af headstage og mikrodrevsystemet. C) Illustration af kontrol af registreringsstedets placering ved hjælp af en elektrolytisk læsion. (D) Registreringssteder, der er mærket med elektrolytiske læsioner i MC på en mus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Illustration af spidssortering og -analyse. (A) Parametrene for gruppering af spike-data og eksport af resultaterne. Jeg. Importer spidsdataene; ii. Vælg sorteringsmetode; iii. Sorter spike-dataene ved hjælp af κ-middelalgoritmen; iv. Eksporter resultaterne fra den sorterede enhed. (B) Processen til analyse af histogrammet mellem spikeintervallet, autocorrelogram og krydskorrelogrammet for den sorterede enhed. Jeg. Importer de sorterede spidsdata; ii. Udfør autokorrelationsanalysen; iii. Indstil parametrene for autocorrelogram; iv. Få histogrammet mellem spidsintervallet; v. Indstil parametrene for histogrammet mellem spike-intervallet; vi. Beregn krydskorrelationen mellem piggene fra de sorterede enheder; vii. Indstil parametrene for cross-correlogram; VIII,IX. Eksportér resultaterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Illustration af kontinuerlig dataanalyse. (A) Processen og parametrene til analyse af LFP-signaler, der blev beregnet ved hjælp af LFP'ernes effektspektrum, sammenhæng og korrelation mellem to LFP'er. i. Importere LFP-data; ii. Beregn effektspektraltætheden for LFP'erne ud fra den bilaterale MC; Aiii. Beregn effektspektraltætheden for LFP; iv,v. Beregn sammenhængen mellem LFP'er; VI,VII. Beregn korrelationen mellem to LFP'er. viii,ix. Eksportér resultaterne. (B) Processen til filtrering af hvert frekvensområde fra LFP-signalet. i. Uddrag de forskellige frekvensbånd fra LFP-dataene; II,III. Se de filtrerede LFP'er; iv. Gem de filtrerede LFP'er som en forbedret metafil. (C) Processen til analyse af sammenhængen mellem neuronale pigge og LFP. I,II. Beregn sammenhængen mellem LFP og sorterede pigge; III,IV. Eksportér resultaterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Repræsentative spor af optagede signaler. Spidsen blev højpassfiltreret ved 250 Hz fra de rå data, der blev samplet ved 30 kHz. LFP var de rå data, der blev samplet ved 10 kHz. δ var deltafrekvensbåndet båndpassfiltreret ved 1-4 Hz fra LFP. θ var theta-frekvensbåndet filtreret ved 5-12 Hz fra LFP. β var betafrekvensbåndet filtreret ved 13-30 Hz fra LFP. Lav γ var lavgammafrekvensbåndet filtreret ved 30-70 Hz fra LFP. Høj γ var det høje gammafrekvensbånd filtreret ved 70-100 Hz fra LFP. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Karakteristika for de sorterede enheder og deres fyringsmønster. (A,B) De sorterede enheder blev grupperet ved hjælp af principal component analysis (PCA) fra den samme elektrode. (C,D) Autokorrelationer (øverst) og inter-spike interval histogrammer (nederst) for en formodet excitatorisk neuron (Pyn) og en formodet hæmmende neuron (IN). (E) Dalbredden af den formodede Pyn var signifikant højere end den formodede IN (formodet Pyn: n = 1.055 pigge, formodet IN: n = 1.985 pigge). (F) Bølgeformvarigheden af den formodede Pyn var stærkere end den formodede IN (formodet Pyn: n = 1.005 pigge, formodet IN: n = 1.059 pigge). (G) Krydskorrelationen mellem den formodede Pyn og IN. Statistisk analyse med en Mann-Whitney test. Alle data præsenteres som middelværdien ± standardfejl for middelværdien, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Analyse af to LFP'er fra den bilaterale MC og sammenhængen mellem spike-hændelser og LFP i mus. (A,B) Normaliserede effektspektrum for den bilaterale MC ved hvert frekvensbånd i mus (n = 3). C) Kurven for sammenhængen mellem to LFP'er mellem venstre og højre MC (n = 3). (D) Krydskorrelationskurven for to LFP'er, der viser en korrelation mellem venstre og højre MC ved tidsforskydninger på ±100 ms (n = 3). (E) Kurven for spike-field kohærens i MC af en mus. Statistisk analyse med en Mann-Whitney test. Alle data præsenteres som middelværdi ± standardfejl i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multikanaloptagelse i mus i fri bevægelse er blevet anset for at være en nyttig teknologi i neurovidenskabelige studier, men det er stadig ret udfordrende for begyndere at optage og analysere signalerne. I denne undersøgelse giver vi forenklede retningslinjer for fremstilling af mikrodrevsystemer og udførelse af elektrodeimplantation samt forenklede procedurer for optagelse og analyse af de elektriske signaler via spike-sorteringssoftware og software til neurofysiologisk dataanalyse.
I betragtning af at kvaliteten af et specialfremstillet mikrodrevsystem i høj grad bidrager til erhvervelsen af stabile og kvalitative signaler i frit bevægelige mus14,15,16,17, designede og brugte vi en mere robust og let struktur til mikrodrevsystemet i denne undersøgelse, og begyndere kan nemt og tydeligt følge fremstillingstrinnene til konstruktion af mikrodrevsystemet. Derudover involverer strukturen af det designede mikrodrevsystem billige materialer, der er let tilgængelige i isenkræmmere, i modsætning til de større, tungere mikrodrevsystemer, der blev brugt i tidligere undersøgelser14,15. Dette mikrodrevsystem kan mindske ubehag og modstå stød fra mus i fri bevægelse under optagelser. I mellemtiden forbedrede vi yderligere størrelsen og formen på mikrodrevsystemet, hvilket kan være nyttigt for begyndere ved at give dem mulighed for at observere, indsætte og dermed flytte spidserne af elektroder ind i hjernen under operationen. Endvidere skrider den enkle glidestruktur, der anvendes i mikrodrevsystemet, nøjagtigt frem i hjernen ved hjælp af en højpræcisionsskrue, hvilket betyder, at dette system giver præcis kontrol ved måling af flere lag af det målrettede hjerneområde; Faktisk er dette ekstremt vigtigt for at fange ekstracellulære signaler i et frit bevægende dyr over en langsigtet forsøgsperiode. Frem for alt er fordelene ved dette mikrodrevsystem dets enkelhed og fleksibilitet; Det mindre antal kanaler og brugen af en række enkeltelektroder bør dog forbedres yderligere i en ny version.
Der er også flere forbedringer i denne undersøgelse, der er værd at bemærke. På grund af mikrodrevsystemets mindre størrelse og modificerede form sammenlignet med tidligere systemer blev der leveret et bredere udsyn og bredere arbejdsområde til driften. Desuden var væggene på musens kranium lavet af tandcement og skruer i rustfrit stål, hvilket gjorde det muligt at fastgøre mikrodrevsystemet stærkt til musens hoved. Derudover tillod tandcementvæggene lastning af vaselin at dække hullerne i musens kranium, før tandcementen blev hældt, hvilket havde beskyttende virkninger på hjerneoverfladen uden dura og den bevægelige del af mikrodrevsystemet. Sammen er disse forbedringer nyttige, da de giver begyndere mulighed for nemt og trygt at implantere mikrodrevsystemet i musehjernen.
I multikanals ekstracellulære optagelser antages det bredt, at en anden vanskelighed ligger i at analysere de optagede signaler ved hjælp af et matematisk komplekst programmeringssprog17. Således giver vi klare retningslinjer for begyndere, især med hensyn til spike-sortering, LFP-dataanalyse og beregning af forholdet mellem dem ved hjælp af en almindeligt anvendt software inden for elektrofysiologi. Derudover anbefaler vi kraftigt, at den registrerede enhed fra et enkeltelektrodeassay grupperet ved PCA-metoder skal have et stort antal funktioner til analyse, såsom de sorterede neuronale inter-spike-intervaller og bredden mellem dens dal og top, da disse værdier er nyttige for begyndere til at reducere bias, når enhederne grupperes automatisk med offline sorteringssoftware. Det er vigtigt, at forholdet mellem signaler, der inkluderer pigge og LFP, er afgørende for at formidle flere adfærd. Vi leverer også en række enkle illustrationer til måling af spike-spike, LFP-LFP og spike-LFP-korrelationer ved hjælp af troværdige scripts i softwaren til neurofysiologisk dataanalyse; Disse illustrationer giver begyndere mulighed for hurtigt at begynde at behandle og analysere de optagede signaler i frie mus. Desuden kan resultaterne og dataene, der behandles med denne proprietære software, bruges sammen med en open source-værktøjskasse som Fieldtrip til yderligere analyse på forhånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31871170, 32170950 og 31970915), Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen (2021A1515010804 og 2023A1515010899), Guangdong Natural Science Foundation for Major Cultivation Project (2018B030336001) og Guangdong Grant: Key Technologies for Treatment of Brain Disorders (2018B030332001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
