Summary
Das Protokoll beschreibt die Methodik der extrazellulären Aufzeichnung im motorischen Kortex (MC), um extrazelluläre elektrophysiologische Eigenschaften in frei beweglichen bewussten Mäusen aufzudecken, sowie die Datenanalyse von lokalen Feldpotentialen (LFPs) und Spikes, die für die Bewertung der neuronalen Netzwerkaktivität nützlich ist, die dem interessierenden Verhalten zugrunde liegt.
Abstract
Das Protokoll zielt darauf ab, die Eigenschaften des neuronalen Feuerns und der lokalen Feldpotentiale (LFPs) in sich verhaltenden Mäusen aufzudecken, die bestimmte Aufgaben ausführen, indem die elektrophysiologischen Signale mit spontanem und/oder spezifischem Verhalten korreliert werden. Diese Technik stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die neuronale Netzwerkaktivität zu untersuchen, die diesen Verhaltensweisen zugrunde liegt. Der Artikel bietet ein detailliertes und vollständiges Verfahren für die Elektrodenimplantation und die daraus resultierende extrazelluläre Aufzeichnung in frei beweglichen bewussten Mäusen. Die Studie umfasst eine detaillierte Methode zur Implantation der Mikroelektrodenarrays, die Erfassung der LFP- und neuronalen Spiking-Signale im motorischen Kortex (MC) mit einem Mehrkanalsystem und die anschließende Offline-Datenanalyse. Der Vorteil der Mehrkanalaufzeichnung bei bewussten Tieren besteht darin, dass eine größere Anzahl von Spiking-Neuronen und neuronalen Subtypen erhalten und verglichen werden kann, was die Bewertung des Zusammenhangs zwischen einem bestimmten Verhalten und den damit verbundenen elektrophysiologischen Signalen ermöglicht. Insbesondere die in der vorliegenden Studie beschriebene Mehrkanal-extrazelluläre Aufzeichnungstechnik und das Datenanalyseverfahren können bei der Durchführung von Experimenten an sich verhaltenden Mäusen auch auf andere Hirnareale angewendet werden.
Introduction
Das lokale Feldpotential (LFP), ein wichtiger Bestandteil extrazellulärer Signale, spiegelt die synaptische Aktivität großer Populationen von Neuronen wider, die den neuronalen Code für mehrere Verhaltensweisen bilden1. Spikes, die durch neuronale Aktivität erzeugt werden, tragen zum LFP bei und sind wichtig für die neuronale Kodierung2. Es wurde nachgewiesen, dass Veränderungen in Spikes und LFPs verschiedene Gehirnerkrankungen wie Alzheimer sowie Emotionen wie Angst usw. vermitteln.3,4. Es ist erwähnenswert, dass viele Studien gezeigt haben, dass sich die Spike-Aktivität bei Tieren signifikant zwischen wachem und anästhesiertem Zustand unterscheidet5. Obwohl Aufzeichnungen in anästhesierten Tieren die Möglichkeit bieten, LFPs mit minimalen Artefakten in hochdefinierten kortikalen Synchronisationszuständen zu beurteilen, unterscheiden sich die Ergebnisse bis zu einem gewissen Grad von dem, was bei wachen Probanden zu finden ist 6,7,8. Daher ist es sinnvoller, neuronale Aktivität über lange Zeitskalen und große räumliche Skalen bei verschiedenen Erkrankungen im Wachzustand des Gehirns mit Hilfe von Elektroden zu erfassen, die in das Gehirn implantiert werden. Dieses Manuskript enthält Informationen für Anfänger, wie man das Mikroantriebssystem herstellt und die Parameter mit gängiger Software einstellt, um die Spike- und LFP-Signale schnell und unkompliziert zu berechnen, um mit der Aufzeichnung und Analyse zu beginnen.
Obwohl die nicht-invasive Aufzeichnung von Gehirnfunktionen, wie z. B. durch die Verwendung von Elektroenzephalogrammen (EEGs) und ereigniskorrelierten Potentialen (ERPs), die von der Kopfhaut aufgezeichnet werden, in großem Umfang in Studien an Menschen und Nagetieren eingesetzt wurde, haben EEG- und ERP-Daten geringe räumliche und zeitliche Eigenschaften und können daher nicht die präzisen Signale erfassen, die durch die nahe gelegene dendritische synaptische Aktivität in einem bestimmten Hirnareal erzeugtwerden 1. Derzeit kann durch die Nutzung der Mehrkanalaufzeichnung bei bewussten Tieren die neuronale Aktivität in den tieferen Schichten des Gehirns chronisch und progressiv aufgezeichnet werden, indem ein Mikroantriebssystem während mehrerer Verhaltenstests in das Gehirn von Primaten oder Nagetieren implantiert wird 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Kurz gesagt, Forscher können ein Mikroantriebssystem konstruieren, das für die unabhängige Positionierung der Elektroden oder Tetroden verwendet werden kann, um verschiedene Teile des Gehirns anzusprechen10,11. Zum Beispiel beschrieben Chang et al. Techniken zur Aufzeichnung von Spikes und LFPs bei Mäusen durch Zusammenbau eines leichten und kompakten Mikroantriebs12. Darüber hinaus sind mikrobearbeitete Siliziumsonden mit kundenspezifischen Zubehörkomponenten für die Aufzeichnung mehrerer einzelner Neuronen und LFPs in Nagetieren während Verhaltensaufgaben13 kommerziell erhältlich. Obwohl verschiedene Konstruktionen für die Montage von Mikroantriebssystemen verwendet wurden, haben diese in Bezug auf die Komplexität und das Gewicht des gesamten Mikroantriebssystems immer noch begrenzten Erfolg. Zum Beispiel zeigten Lansink et al. ein mehrkanaliges Mikroantriebssystem mit einer komplexen Struktur für die Aufzeichnung aus einer einzelnen Gehirnregion14. Sato et al. berichteten über ein Mehrkanal-Mikroantriebssystem, das eine automatische hydraulische Positionierungsfunktion15 aufweist. Die Hauptnachteile dieser Mikroantriebssysteme sind, dass sie für Mäuse zu schwer sind, um sich frei zu bewegen, und für Anfänger schwer zu montieren sind. Obwohl sich die mehrkanalige extrazelluläre Aufzeichnung als geeignete und effiziente Technologie zur Messung der neuronalen Aktivität bei Verhaltenstests erwiesen hat, ist es für Anfänger nicht einfach, die von dem komplexen Mikroantriebssystem erfassten Signale aufzuzeichnen und zu analysieren. Angesichts der Tatsache, dass es schwierig ist, den gesamten Betriebsprozess der mehrkanaligen extrazellulären Aufzeichnung und Datenanalyse in frei beweglichen Mäusen in Gang zu bringen16,17, stellt dieser vorliegende Artikel vereinfachte Richtlinien vor, um den detaillierten Prozess der Herstellung des Mikroantriebssystems unter Verwendung allgemein verfügbarer Komponenten und Einstellungen vorzustellen; Die Parameter in der gängigen Software zur schnellen und unkomplizierten Berechnung der Spike- und LFP-Signale werden ebenfalls bereitgestellt. Darüber hinaus kann sich die Maus in diesem Protokoll durch die Verwendung eines Heliumballons frei bewegen, was dazu beiträgt, das Gewicht der Kopfbühne und des Mikroantriebssystems auszugleichen. Im Allgemeinen beschreiben wir in der vorliegenden Studie, wie man auf einfache Weise ein Mikroantriebssystem aufbauen und die Prozesse der Aufzeichnung und Datenanalyse optimieren kann.
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Protocol
Alle Mäuse wurden kommerziell gewonnen und in einem 12-stündigen Licht-/12-Stunden-Dunkelzyklus (Licht an um 08:00 Uhr Ortszeit) bei einer Raumtemperatur von 22-25 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50%-60% gehalten. Die Mäuse hatten Zugang zu einer kontinuierlichen Versorgung mit Nahrung und Wasser. Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der South China Normal University durchgeführt und von der institutionellen Tierethikkommission genehmigt. Für die Experimente wurden männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 3-5 Monaten verwendet.
1. Montage des Mikroantriebssystems
- Verbinden Sie zwei computerkonstruierte Platinen mit zwei Stulls und einer Schraube, die das bewegliche Mikrolaufwerk hält, und befestigen Sie den Steckverbinder an einer Platine (Abbildung 1A, Bi-iii). Treiben Sie den Mikroantrieb an, indem Sie eine Schraube (0,5 mm/Kreis) drehen.
- Stellen Sie sicher, dass der Mikroantrieb zwei Sätze von acht Führungsrohren (~3 cm lang, ~50 μm Innendurchmesser, ~125 μm Außendurchmesser) für jede Seite des MC-Bereichs tragen kann, und schneiden Sie ihn dann auf die gleiche Länge (mindestens 15 mm; Abbildung 1Biv, v).
- Schneiden Sie 16 Ni-Chrom-Drähte (~5 cm lang) mit einem Durchmesser von 35 μm ab und laden Sie sie dann nacheinander in die Führungsrohre, gefolgt von einem Klebstoff, um sie zu fixieren (Abbildung 1Bi, vi, vii).
- Isolieren Sie die Drahtisolierung, verflechten Sie nacheinander jeden freiliegenden Draht mit jedem Stift vom Steckverbinder gemäß der Kanalzuordnung sowie die Referenz- und Masseelektroden und tragen Sie dann langsam leitende Farbe auf jeden Stift auf (Abbildung 1Bviii-x).
- Decken Sie die Stifte mit Epoxidharz ab (Abbildung 1Axi, xii) und führen Sie dann eine Vergoldung mit einem Impedanztester durch, um die Impedanz der Elektrodenspitzen auf ~350 kOhm zu reduzieren (Abbildung 1Bxiii, xiv). Stellen Sie die Parameter des Impedanzprüfers wie folgt ein: −10,08 μA Gleichstrom für 1 s mit Vergoldungslösung, einschließlich 5 mM PtCl4.
- Zum Schluss schieben Sie das Mikrolaufwerk durch Drehen einer Schraube nach oben. Überprüfen Sie die Gesamtgröße des Mikroantriebssystems, das wie in Abbildung 1A dargestellt modifiziert wurde (ca. 15 mm lang, 10 mm breit, 20 mm hoch, ~1 g Gewicht). Überprüfen Sie die detaillierten Spezifikationen der computerentworfenen Platine und der beweglichen Komponente in Abbildung 1Ai, ii.
2. Implantation des Elektrodenarrays
- Sterilisieren Sie die OP-Kits, tragen Sie sterile Handschuhe und ziehen Sie vor Beginn der Operation den sterilen weißen Kittel eines Arztes an.
- Um die Schmerzen zu lindern, verwenden Sie eine subkutane (s.c.) Injektion von Meloxicam injizierbar (5 mg/kg) für die Maus in einer Induktionskammer. Anschließend wird die Maus durch eine intraperitoneale (i.p.) Injektion von Pentobarbital (80 mg/kg) in eine Induktionskammer anästhesiert18,19. Wenden Sie eine zusätzliche Dosis Pentobarbital (20 mg/kg/h) an, wenn der Zehenklemmreflex noch vorhanden ist.
- Befestigen Sie die Maus in einem stereotaktischen Gerät und halten Sie ihre Rektaltemperatur mit Hilfe eines Temperaturreglers bei 37 °C.
- Tragen Sie die Tetracyclin-Augensalbe auf beide Augen der Maus auf und wechseln Sie die sterilen Handschuhe vor der Operation erneut.
- Rasieren Sie das Fell der Maus und desinfizieren Sie die Operationsstelle mit drei abwechselnden Runden Betadin-Peeling und Alkohol mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze in konzentrischen Kreisen, beginnend in der Mitte und nach außen (Abbildung 2i, ii). Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Mittellinie (~15 mm), um den Schädel freizulegen. Tragen Sie das 1%ige Lidocain sofort lokal auf die Nackenmuskulatur auf, um Schmerzen zu lindern. Entfernen Sie dann das restliche Gewebe mit einer Schere und reinigen Sie den Schädel mit mit Kochsalzlösung beschichteten Wattestäbchen (Abbildung 2iii).
- Markieren Sie mit einer mit Tinte gefüllten Glasmikroelektrode die gewünschten Stellen des bilateralen MC für die Implantation (Abbildung 2iv, v). Basierend auf einer früheren Studie20 sind die Lokalisationen des bilateralen MC wie folgt: 0,74 mm vor dem Bregma und 1,25 mm lateral der Mittellinie.
- Implantieren Sie vier Edelstahlschrauben (0,8 mm Durchmesser), um das Mikroantriebssystem zu schützen, und verbinden Sie dann alle Schrauben mit den Referenz- und Erdungselektroden, gefolgt von der Abdeckung mit gemischtem Dentalzement, um Wände zu bilden (Abbildung 2vi-xi).
- Bohren Sie vorsichtig zwei kleine Löcher (~1,5 mm2) mit einem Schädelbohrer sowohl auf der linken als auch auf der rechten Seite des koordinierten Schädels in den MC-Regionen (Abbildung 2xii). Verwenden Sie die stereotaktischen Koordinaten des bilateralen MC: 0,74 mm vor dem Bregma, 1,25 mm lateral zur Mittellinie und 0,5 mm ventral zur Dura.
- Entfernen Sie die Dura mater vorsichtig mit einer feinen Pinzette aus den Löchern (Abbildung 2xiii).
- Setzen Sie das Mikroantriebssystem mit einem Mikromanipulator bei 10 μm/s in die Mitte der Bohrungen ein (Abbildung 2xiv-xvii).
- Füllen Sie die Vaseline in die Dentalzementwände, nachdem Sie das Einsetzen des Mikroantriebssystems abgeschlossen haben (Abbildung 2xviii).
- Verbinden Sie die Bodenplatte des Mikroantriebssystems und die Dentalzementwände mit dem gemischten Dentalzement (Abbildung 2xix)
- Waschen Sie den Einschnitt mit Kochsalzlösung, gefolgt von einer lokalen Behandlung mit einem Gel, das Lincomycinhydrochlorid und Lidocainhydrochlorid enthält, um die postoperativen Schmerzen zu lindern.
- Wickeln Sie das leitfähige Kupferfolienband um das implantierte Mikroantriebssystem (Abbildung 2xx).
- Bringen Sie die Maus in einen Käfig, der bei 31-33 °C gehalten wird, und überwachen Sie die Erholung der Maus von der Narkose.
- Lassen Sie die Mäuse 1 Woche lang mit separater Fütterung erholen. Kontrollieren und behandeln Sie den Einschnitt mit 3 Tagen kontinuierlicher Anwendung eines Gels, das Lincomycinhydrochlorid und Lidocainhydrochlorid enthält.
3. Mehrkanal-Aufzeichnung im bilateralen MC bei frei beweglichen Mäusen
- Halten Sie den Kopf einer wachen Maus leicht und vorsichtig. Bewegen Sie die Elektrodenarrays (~0,1 mm Tiefe) nach unten, indem Sie die Schraube am beweglichen Teil des Mikroantriebssystems (Abbildung 1Aii) mindestens 1 Tag im Voraus drehen.
- Halten Sie den Kopf der wachen Maus leicht und vorsichtig. Verbinden Sie die Mitte der Kopfstufe mit einem Heliumballon (gefüllt mit ca. 0,02 l Helium) mit einem Gewinde, um das Gewicht der Kopfstufe und des Mikroantriebssystems auszugleichen (Abbildung 3A, B).
- Erfassen Sie Rohsignale mit den Aufzeichnungselektroden und Mehrkanalsystemen durch Abtastung bei 30 kHz in der Aufzeichnungssoftware und digitalisieren Sie dann mit einem Digital-Analog-Wandler (DA) von den Mehrkanalsystemen.
- Extrahieren Sie die LFP-Signale aus den Rohdaten, indem Sie in der Aufnahmesoftware bei 10 kHz neu abtasten, und verwenden Sie dann einen Notch-Filter aus der Aufnahmesoftware, um das 50-Hz-Zeilenrauschen zu entfernen.
- Zeichnen Sie Rohdaten in einem stabilen Zustand von einer frei beweglichen Maus für mindestens 60 Sekunden auf. Entfernen Sie nach Beendigung der Aufnahme langsam die Verbindung zwischen der Kopfbühne und dem Mikrolaufwerk und setzen Sie die Maus wieder in ihren Ausgangskäfig ein.
- Speichern Sie die aufgezeichneten Daten im Computer und analysieren Sie sie offline (Abbildung 4 und Abbildung 5).
- Nach Beendigung des Experiments führen Sie die Euthanasie gemäß den Richtlinien des Instituts durch und bestätigen Sie dann die Positionen der Elektroden, indem Sie das Netzteil am 3-V-Ausgang verwenden, um eine 1-minütige elektrolytische Läsion durchzuführen, gefolgt von einer histologischen Analyse. Schneiden Sie das Gehirn der Maus mit einem Gefriermikrotom in 30-μm-Schichten, sammeln Sie die MC-Abschnitte und nehmen Sie dann die Bilder mit einem Mikroskop auf (Abbildung 3C, D).
4. Sortierung und Analyse von Spikes
- Klicken Sie in der Spike-Sortiersoftware auf Datei > > Nev-Dateien öffnen, um die mit 30 kHz abgetasteten Spike-Daten zu öffnen (Abbildung 4Ai).
- Klicken Sie auf Info, um den unsortierten Kanal auszuwählen, und wählen Sie dann Sortieren > Sortiermethode ändern > K-Mittel verwenden. Drücken Sie die Taste Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting , um die sortierten Einheiten zu erhalten (Abbildung 4Aii, iii).
- Klicken Sie auf Datei > Speichern unter, speichern Sie die sortierten Spitzendaten mit der Dateinamenerweiterung .nev, und wählen Sie Datei > Export Pro-Waveform Data aus, um die PCA-Ergebnisse mit der Dateinamenerweiterung .txt zu exportieren (Abbildung 4Aiv).
- Klicken Sie in der Software für die neurophysiologische Datenanalyse auf Datei > Daten > Blackrock-Datei importieren , um die sortierte Spike-Datei zu öffnen (Abbildung 4Bi).
- Klicken Sie auf Analyse > Autokorrelogramme, um das Autokorrelogram für die ausgewählte Einheit zu erhalten, und stellen Sie dann die Parameter wie folgt ein: den X-Minimalwert bei −0,05 s, den X-Maximalwert bei 0,05 s und den Bin-Wert bei 0,001 (Abbildung 4Bii, iii).
- Laden Sie die sortierten Spike-Daten, klicken Sie auf Analyse > Interspike-Intervall-Histogramme, um das Inter-Spike-Intervall-Histogramm zu erhalten, und legen Sie dann die Parameter wie folgt fest: den Min.-Intervallwert bei 0 s, den Max.-Intervallwert bei 0,1 s und den Bin-Wert bei 0,001 (Abbildung 4Biv, v).
- Klicken Sie auf Analyse > Kreuzkorrelogramme, um das Kreuzkorrelogramm zwischen zwei sortierten Einheitsereignissen zu erhalten, und stellen Sie dann die Referenzereignisse und Parameter wie folgt ein: den X-Minimalwert bei −0,1 s, den X-Maximalwert bei 0,1 s und den Bin-Wert bei 0,001 (Abbildung 4Bvi, vii).
- Klicken Sie auf Ergebnisse > Numerische Ergebnisse, um die Ergebnisse des Autokorrelogramms, des Histogramms zwischen den Spitzenintervallen und des Kreuzkorrelogramms mit .xls Dateinamenerweiterungen zu speichern (Abbildung 4Bviii, ix). Analysieren Sie die Daten, und zeichnen Sie das Diagramm.
5. LFP-Analyse
- Klicken Sie in der Software für die neurophysiologische Datenanalyse auf File Import Data > Blackrock File , um die kontinuierlichen Signaldaten zu öffnen, die bei 10 kHz abgetastet wurden (Abbildung 5Ai).
- Klicken Sie auf Analysis > Spectrum for Continuous , um das Leistungsspektrum für den LFP des ausgewählten Kanals zu analysieren. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: die Anzahl der Frequenzwerte auf 8.192, den Wert für die Mehrfachverjüngung auf 3-5, die Normalisierung des Prozentsatzes der spektralen Gesamtleistungsdichte (PSD) und den Frequenzbereich von 1 Hz bis 100 Hz (Abbildung 5Aii, iii).
- Klicken Sie auf Analysis > Coherence for Continuous , um die Kohärenz für zwei LFPs von der linken und rechten Seite des MCs zu analysieren. Stellen Sie den Referenzkanal und die Parameter wie folgt ein: Berechnen Sie die Anzahl der Frequenzwerte bei 8.192, den Mehrfachverjüngungswert bei 3-5 und den Frequenzbereich von 1 Hz bis 100 Hz (Abbildung 5Aiv, v).
- Klicken Sie auf Analyse > Korr. mit Forts. Variablen , um die Korrelation zwischen zwei LFPs von der linken und rechten Seite des MC zu analysieren. Stellen Sie den Referenzkanal (LFP-Daten) und die Parameter wie folgt ein: den X-Minimalwert bei −0,1 s, den X-Maximalwert bei 0,1 s und den Bin-Wert bei 0,001 (Abbildung 5Avi, vii).
- Klicken Sie auf Ergebnisse > Numerische Ergebnisse, um die Ergebnisse der PSD, Kohärenz und Korrelation mit einer .xls Dateinamenerweiterung zu speichern (Abbildung 5Aviii, ix).
- Wählen Sie den Kanal aus, für den die repräsentativen Kurven für jedes Frequenzband extrahiert werden müssen, klicken Sie auf Bearbeiten > digitale Filterung kontinuierlicher Variablen, um jedes Frequenzband zu erhalten, und stellen Sie dann die Parameter wie folgt ein: die Filterfrequenzantwort als Bandpass, die Filterimplementierung bei unendlicher Impulsantwort (IIR) Butterworth und den Wert für die Filterreihenfolge bei 2. Legen Sie abschließend den interessierenden Frequenzbereich fest (Abbildung 5Bi-iv).
HINWEIS: Die hier verwendeten Frequenzbereiche waren wie folgt: Delta (δ, 1-4 Hz), Theta (θ, 5-12 Hz), Beta (β, 13-30 Hz), niedrige Gamma (niedrige γ, 30-70 Hz) und hohe Gamma (hohe γ, 70-100 Hz) Oszillationen. - Analysieren Sie die Daten und zeichnen Sie das Diagramm.
6. Korrelationen zwischen dem Spike und LFP
- Klicken Sie in der Software für die neurophysiologische Datenanalyse auf Datei > Daten importieren > Blackrock-Datei , um die kontinuierlichen Signaldaten und Spike-Daten zu öffnen.
- Klicken Sie auf Analyse > Kohärenzanalyse, um die Kohärenz zwischen den Spikes und LFP aus dem ausgewählten Kanal zu analysieren. Stellen Sie die Referenzvariable (Spike-Timing) und die Parameter wie folgt ein: Berechnen Sie die Kohärenzwerte, die Anzahl der Frequenzwerte bei 512, den Mehrfachverjüngungswert bei 3-5 und den Frequenzbereich von 1 Hz bis 100 Hz (Abbildung 5Ci, ii).
- Klicken Sie auf Ergebnisse > Numerische Ergebnisse , um das Ergebnis der Spike-Feldkohärenz mit einer .xls Dateinamenerweiterung zu speichern (Abbildung 5Ciii, iv).
- Analysieren Sie die Daten und zeichnen Sie das Diagramm.
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Representative Results
Ein Hochpassfilter (250 Hz) wurde angewendet, um die Multi-Unit-Spikes aus den Rohsignalen zu extrahieren (Abbildung 6A). Des Weiteren wurden die aufgezeichneten Einheiten aus dem MC einer normalen Maus, sortiert nach PCA, verifiziert (Abbildung 7A-D), und die Talbreite und Wellenformdauer der Einheiten im MC der Maus wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Talbreite als auch die Wellenformdauer der mutmaßlichen MC-Pyramidenneuronen (Pyn) bei Mäusen höher sind als die der mutmaßlichen Interneurone (IN) (Abbildung 7E,F; Mann-Whitney-Test mit zwei Stichproben; für die Breite, mutmaßlicher Pyn: 0,636 ms ± 0,004 ms, mutmaßlicher IN: 0,614 ms ± 0,001 ms, p = 0,002; für die Wellenformdauer, mutmaßlicher Pyn: 0,095 ms ± 0,004 ms, mutmaßlicher IN: 0,054 ms ± 0,002 ms, p = 1,402 x 10−16), entsprechend den Charakteristika von Pyn und IN in früheren Studien21. Wir berechneten auch das Kreuzkorrelogramm zwischen putativem Pyn und IN, indem wir die putativen Pyn-Spikes als Referenz festlegten, und fanden einen positiven Peak bei ~18 ms (Abbildung 7G), was darauf hindeutet, dass das putative Pyn-Spiking vor dem putativen IN-Spiking mit einem Fenster von ~18 ms auftritt.
Repräsentative Spuren jedes Frequenzbandes wurden durch den IIR-Filter in der Software für die neurophysiologische Datenanalyse aus dem LFP gefiltert (Abbildung 6A). In der LFP-Analyse waren die LFPs des linken und rechten MC bei normalen Mäusen im Leistungsspektrum ähnlich, was auf synchronisierte Aktivitäten zwischen linkem und rechtem MC hindeutet (Abbildung 8A,B; Mann-Whitney-Test mit zwei Stichproben; für δ MC: 50,71 ± 1,136, rechts MC: 50,47 ± 1,213, p = 0,70; für θ, links MC: 2,197 ± 0,187, rechts MC: 2,068 ± 0,193, p = 0,40; für β, links MC: 0,222 ± 0,058, rechts MC: 0,206 ± 0,055, p = 0,70; für niedrige γ, links MC: 0,114 ± 0,034, rechts MC: 0,093 ± 0,018, p = 0,70; für hohe γ, links MC: 0,054 ± 0,027, rechts MC: 0,04 ± 0,015, p = 0,40). Wir berechneten dann die Kohärenz und Korrelation zwischen dem linken und rechten MC (Abbildung 8C,D; der linke MC-LFP folgt innerhalb eines Fensters von ~1,2 ms nach dem rechten MC-LFP, −1,167 ms ± 0,667 ms) und berechneten die Stärke des mutmaßlichen Pyn- oder IN-Spikes, der mit dem LFP (1-100 Hz) im linken MC einer normalen Maus synchronisiert ist (Abbildung 8E). Dies zeigte eine stärkere niedrige γ Kohärenz für den mutmaßlichen IN im Vergleich zum Pyn.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Elektroden und des Mehrkanal-Aufzeichnungssystems. (A) Darstellung des Mikroantriebssystems. Ich. Zeichnung und Spezifikation der computergestalteten Tafel. ii. Schematische Darstellung des beweglichen Mikroantriebs. (B) Mikroantriebssystem und mehrkanalige bewegliche Einzelelektrodenschritte. Ich. Die Ni-Chrom-Drähte; ii. die Bestandteile der Elektrode; iii. Montage der computergestalteten Platinen; iv. Vormontage der Elektroden, einschließlich der Anschlüsse und acht Führungsrohre; v. Die andere Seite des Mikroantriebs; vi,vii. Die Ni-Chrom-Drähte werden sukzessive in die Führungsrohre geladen; viii-x. Jeder freiliegende Draht wird nacheinander mit jedem Stift verflochten, gefolgt von einer Beschichtung leitender Farbe auf jedem Stift; xi,xii. Die Stifte sind mit Epoxidharz überzogen; xiii,xiv. Goldplattierung. (C) Experimentelles Design der extrazellulären Aufzeichnung im MC einer sich frei bewegenden Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schritt-für-Schritt-Operationsverfahren. i,ii. Rasieren Sie das Fell der Maus und desinfizieren Sie die Operationsstelle mit drei abwechselnden Runden Betadin-Peeling und Alkohol. iii. Reinigen Sie den Schädel der Maus. iv. Nivellierung. v. Markieren Sie die Position des Gehirns. vi. Markieren Sie die Positionen der Edelstahlschrauben. vii. Setzen Sie Edelstahlschrauben ein. viii. Verbinden Sie die Schrauben mit den Referenz- und Erdungselektroden. ix,x. Mischen Sie den Zahnzement. xi. Baue eine Mauer mit Zahnzement. XII,XIII. Bohren Sie zwei kleine Löcher oberhalb des beidseitigen MC und entfernen Sie anschließend die Dura mater. xiv. Bereiten Sie das Mikroantriebssystem vor. XV-XIX. Implantieren Sie das Mikroantriebssystem, gefolgt von einer lokalen Behandlung mit einem Gel, das Lincomycinhydrochlorid und Lidocainhydrochlorid enthält, um postoperative Schmerzen zu lindern. xx. Schützen Sie das Mikroantriebssystem mit leitfähigem Kupferfolienband. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Illustration einer kopffixierten Aufnahme in einer bewussten Maus. (A) Schematische Darstellung für eine frei bewegliche Aufnahme. (B) Details zu den Bildern aus der frei beweglichen Aufzeichnung. Ich. Grundform des implantierten Mikroantriebssystems; ii. Kopfbühne; iii,iv. Das Mikroantriebssystem und die Kopfstufe sind miteinander verbunden; v. Der Heliumballon wird eingesetzt, um das Gewicht der Kopfstufe und des Mikroantriebssystems auszugleichen. (C) Veranschaulichung der Verifizierung des Standorts der Aufzeichnungsstelle anhand einer elektrolytischen Läsion. (D) Die Aufzeichnungsstellen, die durch elektrolytische Läsionen im MC einer Maus markiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Illustration der Spike-Sortierung und -Analyse. (A) Die Parameter für das Clustern der Spike-Daten und das Exportieren der Ergebnisse. Ich. Importieren Sie die Spike-Daten. ii. Wählen Sie die Sortiermethode; iii. Sortieren Sie die Spike-Daten mithilfe des κ-Means-Algorithmus. iv. Exportieren Sie die Ergebnisse aus der sortierten Einheit. (B) Das Verfahren zur Analyse des Histogramms zwischen den Spitzenintervallen, des Autokorrelogramms und des Kreuzkorrelogramms der sortierten Einheit. Ich. Importieren Sie die sortierten Spike-Daten. ii. Durchführung der Autokorrelationsanalyse; iii. Legen Sie die Parameter für das Autokorrelogramm fest. iv. Ermitteln Sie das Histogramm zwischen den Spikes; v. Legen Sie die Parameter für das Histogramm zwischen den Spitzenintervallen fest. vi. Berechnen Sie die Kreuzkorrelation zwischen den Spitzen aus den sortierten Einheiten. vii. Setzen Sie die Parameter für das Kreuzkorrelogramm; VIII,IX. Exportieren Sie die Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Darstellung der kontinuierlichen Datenanalyse. (A) Das Verfahren und die Parameter für die Analyse der LFP-Signale, die unter Verwendung des Leistungsspektrums der LFPs, der Kohärenz und der Korrelation zwischen zwei LFPs berechnet wurden. i. Importieren der LFP-Daten; ii. Berechnung der spektralen Leistungsdichte für die LFPs aus dem bilateralen MC; Aiii. Berechnen Sie die spektrale Leistungsdichte für den LFP; iv,v. Berechnung der Kohärenz zwischen LFPs; vi,vii. Berechnen Sie die Korrelation zwischen zwei LFPs. viii,ix. Exportieren Sie die Ergebnisse. (B) Verfahren zum Filtern jedes Frequenzbereichs aus dem LFP-Signal. i. Extrahieren der verschiedenen Frequenzbänder aus den LFP-Daten; ii,iii. Zeigen Sie die gefilterten LFPs an; iv. Speichern Sie die gefilterten LFPs als erweiterte Metadatei. (C) Das Verfahren zur Analyse der Kohärenz zwischen den neuronalen Spikes und LFP. i,ii. Berechnen Sie die Kohärenz zwischen dem LFP und den sortierten Spitzen. iii,iv. Exportieren Sie die Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Spuren der aufgezeichneten Signale. Der Spike wurde bei 250 Hz aus den bei 30 kHz abgetasteten Rohdaten hochpassgefiltert. Bei der LFP handelte es sich um die Rohdaten, die bei 10 kHz abgetastet wurden. δ war das Delta-Frequenzband, das mit 1-4 Hz vom LFP bandpassgefiltert wurde. θ war das Theta-Frequenzband, das bei 5-12 Hz aus dem LFP gefiltert wurde. β war das Beta-Frequenzband, das bei 13-30 Hz vom LFP gefiltert wurde. Low γ war das niedrige Gamma-Frequenzband, das bei 30-70 Hz vom LFP gefiltert wurde. High γ war das hohe Gamma-Frequenzband, das bei 70-100 Hz vom LFP gefiltert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Eigenschaften der sortierten Einheiten und ihr Brennmuster. (A,B) Die sortierten Einheiten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) derselben Elektrode geclustert. (C,D) Autokorrelationen (oben) und Histogramme zwischen den Spike-Intervallen (unten) für ein putatives exzitatorisches Neuron (Pyn) und ein putatives inhibitorisches Neuron (IN). (E) Die Talbreite des mutmaßlichen Pyn war signifikant höher als die des mutmaßlichen IN (putativer Pyn: n = 1.055 Spikes, putativer IN: n = 1.985 Spikes). (F) Die Wellenformdauer des mutmaßlichen Pyn war stärker als die des mutmaßlichen IN (putativer Pyn: n = 1.005 Spikes, putativer IN: n = 1.059 Spikes). (G) Die Kreuzkorrelation zwischen dem mutmaßlichen Pyn und IN. Statistische Analyse mit einem Mann-Whitney-Test. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts **p < 0,01, ***p < 0,001 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Analyse von zwei LFPs aus dem bilateralen MC und die Kohärenz zwischen Spike-Ereignissen und LFP in Mäusen. (A,B) Normalisierte Leistungsspektren des bilateralen MC in jedem Frequenzband bei Mäusen (n = 3). (C) Die Kurve der Kohärenz zweier LFPs zwischen dem linken und dem rechten MC (n = 3). (D) Die Kreuzkorrelationskurve zweier LFPs, die eine Korrelation zwischen dem linken und rechten MC bei einer Zeitverzögerung von ±100 ms (n = 3) zeigt. (E) Die Kurve der Spike-Field-Kohärenz im MC einer Maus. Statistische Analyse mit einem Mann-Whitney-Test. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Mehrkanalaufzeichnung in frei beweglichen Mäusen wurde in neurowissenschaftlichen Studien als nützliche Technologie angesehen, aber für Anfänger ist es immer noch eine ziemliche Herausforderung, die Signale aufzuzeichnen und zu analysieren. In der vorliegenden Studie stellen wir vereinfachte Richtlinien für die Herstellung von Mikroantriebssystemen und die Durchführung von Elektrodenimplantationen sowie vereinfachte Verfahren zur Erfassung und Analyse der elektrischen Signale mittels Spike-Sortiersoftware und Software zur neurophysiologischen Datenanalyse zur Verfügung.
Angesichts der Tatsache, dass die Qualität eines maßgeschneiderten Mikroantriebssystems wesentlich zur Erfassung stabiler und qualitativer Signale in frei beweglichen Mäusen beiträgt14,15,16,17, haben wir in dieser Studie eine robustere und leichtere Struktur für das Mikroantriebssystem entworfen und verwendet, und Anfänger können die Herstellungsschritte für den Aufbau des Mikroantriebssystems einfach und klar nachvollziehen. Darüber hinaus besteht die Struktur des entworfenen Mikroantriebssystems aus kostengünstigen Materialien, die im Baumarkt leicht erhältlich sind, im Gegensatz zu den größeren, schwereren Mikroantriebssystemen, die in früheren Studien verwendet wurden14,15. Dieses Mikroantriebssystem kann die Beschwerden verringern und den Stößen von sich frei bewegenden Mäusen während der Aufnahmen standhalten. In der Zwischenzeit haben wir die Größe und Form des Mikroantriebssystems weiter verbessert, was für Anfänger hilfreich sein könnte, indem es ihnen ermöglicht, die Spitzen der Elektroden während der Operation zu beobachten, einzuführen und so in das Gehirn zu bewegen. Darüber hinaus wird die einfache Schieberstruktur, die im Mikroantriebssystem angewendet wird, im Gehirn mit einer hochpräzisen Schraube genau vorangetrieben, was bedeutet, dass dieses System eine präzise Steuerung bei der Messung mehrerer Schichten des Zielhirnbereichs ermöglicht. In der Tat ist dies äußerst wichtig, um extrazelluläre Signale in einem sich frei bewegenden Tier über einen langfristigen Versuchszeitraum zu erfassen. Die Vorteile dieses Mikroantriebssystems liegen vor allem in seiner Einfachheit und Flexibilität; Die geringere Anzahl von Kanälen und die Verwendung eines Arrays von Einzelelektroden sollen jedoch in einer neuen Version weiter verbessert werden.
Es gibt auch einige Verbesserungen in der vorliegenden Studie, die es wert sind, erwähnt zu werden. Aufgrund der geringeren Größe und der geänderten Form des Mikroantriebssystems im Vergleich zu früheren Systemen wurde eine breitere Sicht und ein größerer Arbeitsraum für den Betrieb bereitgestellt. Darüber hinaus bestanden die Wände auf dem Schädel der Maus aus Zahnzement und Edelstahlschrauben, wodurch das Mikroantriebssystem fest am Kopf der Maus befestigt werden konnte. Darüber hinaus ermöglichten die Zahnzementwände die Beladung mit Vaseline, um die Löcher im Schädel der Maus vor dem Gießen des Zahnzements zu bedecken, was eine schützende Wirkung auf die Gehirnoberfläche ohne die Dura und den beweglichen Teil des Mikroantriebssystems hatte. Zusammen sind diese Verbesserungen nützlich, da sie es Anfängern ermöglichen, das Mikroantriebssystem einfach und sicher in das Gehirn der Maus zu implantieren.
Bei mehrkanaligen extrazellulären Aufzeichnungen wird allgemein angenommen, dass eine weitere Schwierigkeit in der Analyse der aufgezeichneten Signale mit einer mathematisch komplexen Programmiersprache17 liegt. Daher bieten wir klare Richtlinien für Anfänger, insbesondere in Bezug auf die Sortierung von Spikes, die LFP-Datenanalyse und die Berechnung der Beziehung zwischen ihnen mit einer in der Elektrophysiologie häufig verwendeten Software. Darüber hinaus empfehlen wir dringend, dass die aufgezeichnete Einheit aus einem Einzelelektroden-Assay, der mit PCA-Methoden geclustert wurde, eine hohe Anzahl von Merkmalen für die Analyse aufweisen sollte, wie z. B. die sortierten neuronalen Inter-Spike-Intervalle und die Breite zwischen Tal und Peak, da diese Werte für Anfänger nützlich sind, um Verzerrungen zu reduzieren, wenn die Einheiten automatisch mit Offline-Sortiersoftware geclustert werden. Wichtig ist, dass die Beziehung zwischen Signalen, die Spitzen enthalten, und dem LFP entscheidend für die Vermittlung mehrerer Verhaltensweisen ist. Wir bieten auch eine Reihe von einfachen Illustrationen zur Messung von Spike-Spike-, LFP-LFP- und Spike-LFP-Korrelationen unter Verwendung glaubwürdiger Skripte in der Software für die neurophysiologische Datenanalyse. Diese Illustrationen ermöglichen es Anfängern, schnell mit der Verarbeitung und Analyse der aufgezeichneten Signale in sich frei bewegenden Mäusen zu beginnen. Darüber hinaus können die Ergebnisse und Daten, die mit dieser proprietären Software verarbeitet werden, in Verbindung mit einer Open-Source-Toolbox wie Fieldtrip für zusätzliche Analysen im Voraus verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (31871170, 32170950 und 31970915), der Natural Science Foundation of Guangdong Province (2021A1515010804 und 2023A1515010899), der Guangdong Natural Science Foundation for Major Cultivation Project (2018B030336001) und des Guangdong Grant: Key Technologies for Treatment of Brain Disorders (2018B030332001) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
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