Summary
Protokollen beskriver metodikken for ekstracellulær registrering i motorbarken (MC) for å avsløre ekstracellulære elektrofysiologiske egenskaper i fritt bevegelige bevisste mus, samt dataanalysen av lokale feltpotensialer (LFP) og pigger, noe som er nyttig for å evaluere nettverksnevral aktivitet som ligger til grunn for atferd av interesse.
Abstract
Protokollen tar sikte på å avdekke egenskapene til nevronfyring og nettverkslokale feltpotensialer (LFP) i atferdsmus som utfører spesifikke oppgaver ved å korrelere de elektrofysiologiske signalene med spontan og / eller spesifikk oppførsel. Denne teknikken representerer et verdifullt verktøy for å studere den nevrale nettverksaktiviteten som ligger til grunn for disse atferdene. Artikkelen gir en detaljert og komplett prosedyre for elektrodeimplantasjon og påfølgende ekstracellulært opptak i frittbevegelige bevisste mus. Studien inkluderer en detaljert metode for implantering av mikroelektrodearrayene, fangst av LFP og neuronale spikingsignaler i motorbarken (MC) ved hjelp av et flerkanalssystem, og den påfølgende offline dataanalysen. Fordelen med flerkanalsopptak hos bevisste dyr er at et større antall spiking neuroner og neuronale subtyper kan oppnås og sammenlignes, noe som gjør det mulig å evaluere forholdet mellom en bestemt oppførsel og tilhørende elektrofysiologiske signaler. Spesielt kan den flerkanals ekstracellulære opptaksteknikken og dataanalyseprosedyren beskrevet i denne studien brukes på andre hjerneområder når man utfører eksperimenter med å oppføre mus.
Introduction
Det lokale feltpotensialet (LFP), en viktig komponent i ekstracellulære signaler, gjenspeiler den synaptiske aktiviteten til store populasjoner av nevroner, som danner nevralkoden for flere atferd1. Spikes generert av nevronaktivitet anses å bidra til LFP og er viktige for nevral koding2. Endringer i pigger og LFP har vist seg å formidle flere hjernesykdommer, som Alzheimers sykdom, samt følelser som frykt, etc.3,4. Det er verdt å merke seg at mange studier har fremhevet at piggaktivitet er betydelig forskjellig mellom våken og bedøvet tilstand hos dyr5. Selv om opptak i bedøvede dyr gir en mulighet til å vurdere LFP-er med minimale artefakter i høyt definerte kortikale synkroniseringstilstander, avviker resultatene til en viss grad fra det som finnes hos våkne personer 6,7,8. Dermed er det mer meningsfylt å oppdage nevral aktivitet over lange tidsskalaer og store romlige skalaer i ulike sykdommer i en våken hjernetilstand ved hjelp av elektroder implantert i hjernen. Dette manuskriptet gir informasjon til nybegynnere om hvordan man lager mikrostasjonssystemet og stiller inn parametrene ved hjelp av vanlig programvare for å beregne pigg- og LFP-signalene på en rask og grei måte for å få opptaket og analysen i gang.
Selv om ikke-invasiv registrering av hjernefunksjoner, for eksempel ved bruk av elektroencefalogrammer (EEG) og hendelsesrelaterte potensialer (ERP) registrert fra hodebunnen, har blitt brukt mye i humane og gnagerstudier, har EEG- og ERP-data lave romlige og tidsmessige egenskaper og kan derfor ikke oppdage de nøyaktige signalene som produseres av nærliggende dendritisk synaptisk aktivitet innenfor et bestemt hjerneområde1. For tiden, ved å dra nytte av flerkanalsopptak hos bevisste dyr, kan nevral aktivitet i de dypere lagene i hjernen registreres kronisk og gradvis ved å implantere et mikrodrivsystem i hjernen til primater eller gnagere under flere atferdstester 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Kort fortalt kan forskere konstruere et mikrodrivsystem som kan brukes til uavhengig posisjonering av elektrodene eller tetrodene for å målrette mot forskjellige deler av hjernen10,11. For eksempel beskrev Chang et al. teknikker for å registrere pigger og LFP-er i mus ved å montere en lett og kompakt mikrostasjon12. I tillegg er mikromaskinerte silisiumprober med skreddersydde tilbehørskomponenter kommersielt tilgjengelige for registrering av flere enkeltnevroner og LFP-er hos gnagere under atferdsoppgaver13. Selv om ulike design har blitt brukt til å sette sammen mikrodrivsystemer, har disse fortsatt begrenset suksess når det gjelder kompleksiteten og vekten til hele mikrodrivsystemet. For eksempel viste Lansink et al. et flerkanals mikrodrivsystem med en kompleks struktur for opptak fra en enkelt hjernegruppe14. Sato et al. rapporterte et flerkanals mikrodrivsystem som viser en automatisk hydraulisk posisjoneringsfunksjon15. De viktigste ulempene med disse mikrodrivsystemene er at de er for tunge til at mus kan bevege seg fritt og er vanskelige å montere for nybegynnere. Selv om flerkanals ekstracellulært opptak har vist seg å være en egnet og effektiv teknologi for måling av nevral aktivitet under atferdstester, er det ikke lett for nybegynnere å registrere og analysere signalene som er oppnådd av det komplekse mikrodrivsystemet. Gitt at det er vanskelig å få hele operasjonsprosessen til flerkanals ekstracellulær registrering og dataanalyse startet i fritt bevegelige mus16,17, presenterer denne denne artikkelen forenklede retningslinjer for å introdusere den detaljerte prosessen med å lage mikrodrivsystemet ved hjelp av allment tilgjengelige komponenter og innstillinger; Parametrene i den vanlige programvaren for å beregne pigg- og LFP-signalene på en rask og grei måte er også gitt. I tillegg, i denne protokollen, kan musen bevege seg fritt på grunn av bruk av en heliumballong, noe som bidrar til å utligne vekten av headstage og mikrodrivsystem. Generelt, i denne studien, beskriver vi hvordan du enkelt kan bygge et mikrodrivsystem og optimalisere prosessene for registrering og dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle musene ble oppnådd kommersielt og vedlikeholdt i en 12 timers lys / 12 timer mørk syklus (lys på kl. 08:00 lokal tid) ved en romtemperatur på 22-25 ° C og en relativ fuktighet på 50% -60%. Musene hadde tilgang til kontinuerlig tilførsel av mat og vann. Alle forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr ved South China Normal University og godkjent av Institutional Animal Ethics Committee. Hannmus C57BL/6J i alderen 3-5 måneder ble brukt til forsøkene.
1. Montering av mikrodrivsystem
- Koble til to datamaskindesignede kort ved hjelp av to smattere og en skrue som holder den bevegelige mikrostasjonen og fest kontakten til ett kort (figur 1A, Bi-iii). Driv mikrostasjonen ved å vri en skrue (0,5 mm/sirkel).
- Forsikre deg om at mikrostasjonen kan bære to sett med åtte styrerør (~ 3 cm lang, ~ 50 μm indre diameter, ~ 125 μm utvendig diameter) for hver side av MC-regionen, og kutt den deretter til samme lengde (minst 15 mm; Figur 1Biv, v).
- Klipp 16 Ni-krom ledninger (~ 5 cm lang) med en diameter på 35 μm, og legg dem deretter suksessivt inn i styrerørene, etterfulgt av å påføre limet for å fikse dem (figur 1Bi, vi, vii).
- Strip ledningsisolasjonen, slyng suksessivt hver eksponerte ledning til hver pinne fra kontakten etter kanalkartet, samt referanse- og jordelektrodene, og belegg deretter sakte maling på hver pinne (figur 1Bviii-x).
- Dekk pinnene med epoksyharpiks (figur 1Axi, xii), og utfør deretter gullbelegg via en impedanstester for å redusere impedansen til elektrodespissene til ~ 350 kOhm (figur 1Bxiii, xiv). Still inn parametrene til impedanstesteren som følger: -10,08 μA likestrøm i 1 s med forgylningsløsning, inkludert 5 mM PtCl4.
- Til slutt flytter du mikrostasjonen til toppen ved å vri en skrue. Kontroller den totale størrelsen på mikrodrivsystemet modifisert som vist i figur 1A (ca. 15 mm lang, 10 mm bredde, 20 mm høyde, ~1 g vekt). Sjekk de detaljerte spesifikasjonene til det datamaskindesignede kortet og den bevegelige komponenten i figur 1Ai, ii.
2. Implantasjon av elektrodearray
- Steriliser operasjonssettene, bruk sterile hansker og sett på en leges sterile hvite frakk før operasjonen starter.
- For å håndtere smerten, bruk subkutan (s.c.) injeksjon av meloksikam injiserbar (5 mg / kg) for musen i et induksjonskammer. Deretter bedøves musen ved en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av pentobarbital (80 mg / kg) i et induksjonskammer18,19. Påfør en tilleggsdose pentobarbital (20 mg/kg/time) hvis tåklemmerefleksen fortsatt er til stede.
- Fest musen i et stereotaktisk apparat og hold rektaltemperaturen ved 37 °C ved hjelp av en temperaturregulator.
- Påfør tetracyklin øyesalve på begge øynene til musen og bytt sterile hansker igjen før operasjonen.
- Barber musens pels og desinfiser operasjonsstedet med tre alternerende runder med betadinskrubb og alkohol ved hjelp av en steril bomullstippet applikator i konsentriske sirkler som starter i midten og beveger seg utover (figur 2i, ii). Lag et lite midtlinjesnitt (~ 15 mm) for å avsløre skallen. Påfør umiddelbart 1% lidokain lokalt på nakke muskler for smertelindring. Fjern deretter restvevet med en saks, og rengjør skallen med saltvannsbelagte bomullsknopper (figur 2iii).
- Bruk en glassmikroelektrode fylt med blekk til å markere de ønskede stedene for bilateral MC for implantasjon (figur 2iv, v). Basert på en tidligere studie20 er lokalisasjonen av bilateral MC som følger: 0,74 mm foran bregma og 1,25 mm lateralt for midtlinjen.
- Implanter fire skruer i rustfritt stål (0,8 mm diameter) for å beskytte mikrodrivsystemet, og koble deretter alle skruene sammen med referanse- og jordelektrodene, etterfulgt av å dekke med blandet tannsement for å danne vegger (figur 2vi-xi).
- Bor forsiktig to små hull (~ 1,5 mm2) med et skallebor på både venstre og høyre side av den koordinerte skallen i MC-regionene (figur 2xii). Bruk de stereotaktiske koordinatene til bilateral MC: 0,74 mm foran bregma, 1,25 mm lateralt for midtlinjen og 0,5 mm ventralt for dura.
- Fjern dura materen forsiktig fra hullene med fin tang (figur 2xiii).
- Sett mikrodrivsystemet inn i midten av hullene ved hjelp av en mikromanipulator ved 10 μm / s (figur 2xiv-xvii).
- Fyll vaselinen i tannsementveggene etter at mikrodrivsystemet er satt inn (figur 2xviii).
- Bli med bunnplaten på mikrodrivsystemet og tannsementveggene med blandet dental sement (figur 2xix)
- Vask snittet med saltvann etterfulgt av lokal behandling med en gel som inneholder lincomycinhydroklorid og lidokainhydroklorid for å lindre postkirurgisk smerte.
- Vikle den ledende kobberfolietapen rundt det implanterte mikrodrivsystemet (figur 2xx).
- Flytt musen inn i et bur som holdes ved 31-33 ° C og overvåk musen for utvinning fra anestesien.
- La musene komme seg i 1 uke med separat fôring. Kontroller og behandle snittet med 3 dagers kontinuerlig påføring av en gel som inneholder lincomycinhydroklorid og lidokainhydroklorid.
3. Flerkanalsopptak i bilateral MC i frittgående mus
- Hold hodet til en våken mus lett og forsiktig. Flytt elektroderadene (~0,1 mm dybde) ved å vri skruen på den bevegelige delen av mikrodrivsystemet (figur 1Aii) minst 1 dag i forveien.
- Hold hodet til den våkne musen lett og forsiktig. Koble midten av headstage og en heliumballong (fylt med ca. 0,02 liter helium) med en tråd for å kompensere for vekten av headstage og mikrodrivsystemet (figur 3A, B).
- Ta rå signaler ved hjelp av opptakselektrodene og flerkanalssystemene ved sampling ved 30 kHz i opptaksprogramvaren, og digitaliser deretter ved hjelp av en digital-analog (DA) omformer fra flerkanalssystemene.
- Trekk ut LFP-signalene fra rådataene ved å omsample ved 10 kHz i opptaksprogramvaren, og bruk deretter et hakkfilter fra opptaksprogramvaren for å fjerne 50 Hz linjestøy.
- Ta opp rådata i stabil tilstand fra en frittgående mus i minst 60 sekunder. Når du er ferdig med opptaket, fjerner du sakte forbindelsen mellom hovedscenen og mikrodrivsystemet og returnerer musen tilbake til hjemmeburet.
- Lagre de registrerte dataene på datamaskinen og analyser dem offline (figur 4 og figur 5).
- Etter å ha fullført forsøket, utfør eutanasi i henhold til instituttets retningslinjer og bekreft deretter plasseringen av elektrodene ved å bruke strømforsyningen ved 3 V-utgang for å utføre en 1 min elektrolytisk lesjon, etterfulgt av å utføre histologisk analyse. Klipp musens hjerne i 30 μm skiver ved hjelp av en frysende mikrotom, samle MC-seksjonene, og ta deretter bildene med et mikroskop (figur 3C, D).
4. Spike sortering og analyse
- Klikk på Fil > Åpne > Nev-filer i piggsorteringsprogramvaren for å åpne piggdataene samplet ved 30 kHz (figur 4Ai).
- Klikk på Info for å velge den usorterte kanalen, og velg deretter Sorter > Endre sorteringsmetode > Bruk K-midler. Trykk på knappen Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting for å få de sorterte enhetene (figur 4Aii, iii).
- Klikk på File > Save as, lagre de sorterte piggdataene med filtypen .nev, og velg File > Export Per-Waveform Data for å eksportere PCA-resultatene med filtypen .txt (figur 4Aiv).
- Klikk på Fil > Importer data > Blackrock-fil i programvaren for nevrofysiologisk dataanalyse for å åpne den sorterte piggfilen (figur 4Bi).
- Klikk på Analyse > autokorrelogrammer for å få autokorrelogrammet for den valgte enheten, og angi deretter parametrene som følger: X Minimum-verdien ved -0,05 s, X-maksimumsverdien ved 0,05 s og Bin-verdien ved 0,001 (figur 4Bii, iii).
- Last inn de sorterte piggdataene, klikk på Analyse > Interspikeintervallhistogrammer for å få histogrammet mellom piggintervallet , og angi deretter parametrene som følger: Min.-intervallverdien ved 0 s, Maks. intervallverdi ved 0,1 s og Bin-verdien ved 0,001 (figur 4Biv, v).
- Klikk på Analyse > krysskorrelogrammer for å få krysskorrelogrammet mellom to sorterte enhetshendelser, og angi deretter referansehendelsene og parameterne som følger: X Minimum-verdien ved -0,1 s, X-maksimumsverdien ved 0,1 s og Bin-verdien ved 0,001 (figur 4Bvi, vii).
- Klikk på Resultater > numeriske resultater for å lagre resultatene av autokorrelogrammet, interspikeintervallhistogrammet og krysskorrelogrammet med filtypene .xls (figur 4Bviii, ix). Analyser dataene, og tegn grafen.
5. LFP-analyse
- Klikk på File Import Data > Blackrock File i programvaren for nevrofysiologisk dataanalyse for å åpne de kontinuerlige signaldataene samplet ved 10 kHz (figur 5Ai).
- Klikk på Analyse > spektrum for kontinuerlig for å analysere effektspekteret for LFP fra den valgte kanalen. Still inn parametrene som følger: Antall frekvensverdier ved 8 192, Multiple Tapers-verdien ved 3-5, Normalisering av prosentandelen av den totale effektspektraltettheten (PSD) og frekvensområdet fra 1 Hz til 100 Hz (figur 5Aii, iii).
- Klikk på Analyse > koherens for kontinuerlig for å analysere koherensen for to LFP-er fra venstre og høyre side av MC. Angi referansekanalen og parametrene som følger: Beregn ved koherensverdier, antall frekvensverdier ved 8 192, verdien for flere koniske enheter ved 3-5 og frekvensområdet fra 1 Hz til 100 Hz (figur 5Aiv, v).
- Klikk på Analyse > Corr. med forts. Variabler for å analysere korrelasjonen mellom to LFP-er fra venstre og høyre side av MC. Angi referansekanalen (LFP-data) og parametere som følger: X-minimumsverdien ved -0,1 s, X-maksimumsverdien ved 0,1 s og bin-verdien ved 0,001 (figur 5Avi, VII).
- Klikk på Resultater > numeriske resultater for å lagre resultatene av PSD, koherens og korrelasjon med en .xls filtype (figur 5Aviii, ix).
- Velg kanalen som de representative sporene må trekkes ut for hvert frekvensbånd, klikk på Rediger > digital filtrering av kontinuerlige variabler for å få hvert frekvensbånd, og angi deretter parametrene som følger: Filter Freq. Response as Bandpass, filterimplementeringen ved uendelig impulsrespons (IIR) Butterworth og filterrekkefølgeverdien ved 2. Til slutt angir du frekvensområdet for interesse (figur 5Bi-iv).
MERK: Frekvensområdene som ble brukt her var som følger: delta (δ, 1-4 Hz), theta (θ, 5-12 Hz), beta (β, 13-30 Hz), lav gamma (lav γ, 30-70 Hz) og høy gamma (høy γ, 70-100 Hz) svingninger. - Analyser dataene og tegn grafen.
6. Korrelasjoner mellom piggen og LFP
- Klikk på Fil > Importer data > Blackrock-fil i programvaren for nevrofysiologisk dataanalysefor å åpne kontinuerlige signaldata og piggdata.
- Klikk på Analyse > koherensanalyse for å analysere sammenhengen mellom piggene og LFP fra den valgte kanalen. Still inn referansevariabelen (spike timing) og parametere som følger: Beregn ved koherensverdier, antall frekvensverdier ved 512, Multiple Tapers-verdien ved 3-5 og frekvensområdet fra 1 Hz til 100 Hz (figur 5Ci, ii).
- Klikk på Resultater > numeriske resultater for å lagre resultatet av piggfeltkoherensen med en .xls filtype (figur 5Ciii, iv).
- Analyser dataene og tegn grafen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et høypassfilter (250 Hz) ble brukt for å trekke ut multienhetspiggene fra råsignalene (figur 6A). Videre ble de registrerte enhetene fra MC til en normal mus sortert etter PCA verifisert (figur 7A-D), og dalbredden og bølgeformvarigheten til enhetene i musens MC ble registrert. Resultatene viste at både dalbredden og bølgeformvarigheten til MC-antatte pyramidale nevroner (Pyn) hos mus er høyere enn de antatte internevronene (IN) (figur 7E, F; to utvalg Mann-Whitney-test; for dalbredde, antatt Pyn: 0,636 ms ± 0,004 ms, antatt IN: 0,614 ms ± 0,001 ms, p = 0,002; for bølgeformvarighet, antatt Pyn: 0,095 ms ± 0,004 ms, antatt IN: 0,054 ms ± 0,002 ms, p = 1,402 x 10−16), tilsvarende egenskapene til Pyn og IN i tidligere studier21. Vi beregnet også krysskorrelogrammet mellom antatt Pyn og IN ved å sette de antatte Pyn-piggene som referanse og fant en positiv topp ved ~ 18 ms (figur 7G), noe som indikerer at den antatte Pyn-piggen oppstår før den antatte IN-piggen med et vindu på ~ 18 ms.
Representative spor av hvert frekvensbånd ble filtrert fra LFP av IIR-filteret i programvaren for nevrofysiologisk dataanalyse (figur 6A). I LFP-analysen var LFP-ene til venstre og høyre MC hos normale mus like i effektspekteret, noe som tyder på synkroniserte aktiviteter mellom venstre og høyre MC (figur 8A, B; to utvalg Mann-Whitney-test; for δ, venstre MC: 50,71 ± 1,136, høyre MC: 50,47 ± 1,213, p = 0,70; for θ, venstre MC: 2,197 ± 0,187, høyre MC: 2,068 ± 0,193, p = 0,40; for β, venstre MC: 0,222 ± 0,058, høyre MC: 0,206 ± 0,055, p = 0,70; for lav γ, venstre MC: 0,114 ± 0,034, høyre MC: 0,093 ± 0,018, p = 0,70; for høy γ, venstre MC: 0,054 ± 0,027, høyre MC: 0,04 ± 0,015, p = 0,40). Vi beregnet deretter koherensen og korrelasjonen mellom venstre og høyre MC (figur 8C,D; venstre MC LFP følger innenfor et vindu på ~1,2 ms etter høyre MC LFP, −1,167 ms ± 0,667 ms) og beregnet størrelsen på den antatte Pyn- eller IN-piggen synkronisert med LFP (1-100 Hz) i venstre MC på en vanlig mus (figur 8E). Dette viste en sterkere lav γ sammenheng for den antatte IN sammenlignet med Pyn.
Figur 1: Diagram over elektrodene og flerkanals opptakssystem. (A) Illustrasjon av mikrodrivsystemet. jeg. Tegning og spesifikasjon av det datamaskindesignede kortet. ii. Skjematisk diagram over den bevegelige mikrostasjonen. (B) Mikrodrivsystem og flerkanals bevegelige enkeltelektrodetrinn. jeg. Ni-chrome-ledningene; ii. De bestanddeler av elektroden; iii. Montering av de datamaskindesignede kortene; iv. Foreløpig montering av elektrodene, inkludert kontaktene og åtte styrerør; v. Den andre siden av mikrostasjonen; vi,vii. Ni-chrome-ledningene lastes suksessivt inn i styrerørene; VIII-x. Hver eksponert ledning er suksessivt tvinnet til hver pinne, etterfulgt av beleggledende maling på hver pinne; xi, xii. Pinnene er dekket med epoksyharpiks; XIII,XIV. Gullbelegg. (C) Eksperimentell design av det ekstracellulære opptaket i MC av en frittbevegelig mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnvise kirurgiske inngrep. i,ii. Barber musens pels og desinfiser operasjonsstedet med tre vekslende runder med betadinskrubb og alkohol. iii. Rengjør skallen til musen. iv. Utjevning. v. Merk hjernens plassering. vi. Merk posisjonene til skruer i rustfritt stål. vii. Sett inn skruer i rustfritt stål. viii. Koble skruene sammen med referanse- og jordelektrodene. ix,x. Bland dental sement. xi. Bygg en vegg med dental sement. XII,XIII. Bor to små hull over den bilaterale MC, etterfulgt av å fjerne dura materen. xiv. Forbered mikrodrivsystemet. XV-XIX. Implanter mikrodrivsystemet etterfulgt av lokal behandling med en gel som inneholder lincomycinhydroklorid og lidokainhydroklorid for å lindre smerter etter operasjonen. xx. Beskytt mikrodrivsystemet med ledende kobberfolietape. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Illustrasjon av et hodefiksert opptak i en bevisst mus. (A) Skjematisk diagram for fritt bevegelige opptak. (B) Detaljer om bildene fra det fritt bevegelige opptaket. jeg. Planform av det implanterte mikrodrivsystemet; ii. Hovedscenen; iii,iv. Mikrodrivsystemet og headstage er koblet sammen; v. Heliumballongen påføres for å kompensere for vekten av headstage- og mikrodrivsystemet. (C) Illustrasjon av verifisering av plasseringen av opptaksstedet ved hjelp av en elektrolytisk lesjon. (D) Opptaksstedene merket med elektrolytiske lesjoner i MC av en mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Illustrasjon av piggsortering og analyse. (A) Parametrene for gruppering av piggdata og eksport av resultatene. jeg. Importer piggdataene; ii. Velg sorteringsmetode; iii. Sorter piggdataene ved hjelp av κ-middelalgoritmen; iv. Eksporter resultatene fra den sorterte enheten. (B) Prosessen for å analysere histogrammet, autokorrelogrammet og krysskorregogrammet til den sorterte enheten. jeg. Importer de sorterte piggdataene; ii. Gjennomføre autokorrelasjonsanalysen; iii. Angi parametrene for autokorrelogrammet; iv. Hent inter-spike intervallhistogrammet; v. Angi parametrene for inter-spike intervallhistogrammet; vi. Beregn krysskorrelasjonen mellom piggene fra de sorterte enhetene; vii. Angi parametrene for krysskorrelogrammet; VIII,IX. Eksporter resultatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Illustrasjon av kontinuerlig dataanalyse. (A) Prosessen og parametrene for å analysere LFP-signalene som ble beregnet ved hjelp av effektspekteret til LFP-ene, koherens og korrelasjon mellom to LFP-er. i. Importer LFP-dataene; ii. Beregne effektspektraltettheten for LFP-ene fra den bilaterale MC; Aiii. Beregne effektspektral tetthet for LFP; iv,v. beregne sammenhengen mellom LFP-er; vi,vii. Beregn korrelasjonen mellom to LFP-er. viii,ix. Eksporter resultatene. (B) Prosessen for å filtrere hvert frekvensområde fra LFP-signalet. i. Trekk ut de forskjellige frekvensbåndene fra LFP-dataene; II,III. Se de filtrerte LFP-ene; iv. Lagre de filtrerte LFP-ene som en forbedret metafil. (C) Prosessen for å analysere sammenhengen mellom nevronpiggene og LFP. i,ii. Beregn sammenhengen mellom LFP og sorterte pigger; iii,iv. Eksporter resultatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative spor av registrerte signaler. Piggen ble høypassfiltrert ved 250 Hz fra rådataene samplet ved 30 kHz. LFP var rådataene samplet ved 10 kHz. δ var deltafrekvensbåndet båndpass-filtrert ved 1-4 Hz fra LFP. θ var theta-frekvensbåndet filtrert ved 5-12 Hz fra LFP. β var beta-frekvensbåndet filtrert ved 13-30 Hz fra LFP. Lav γ var det lave gammafrekvensbåndet filtrert ved 30-70 Hz fra LFP. High γ var det høye gammafrekvensbåndet filtrert ved 70-100 Hz fra LFP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Karakteristikker av de sorterte enhetene og deres avfyringsmønster. (A,B) De sorterte enhetene ble gruppert ved hjelp av hovedkomponentanalyse (PCA) fra samme elektrode. (C,D) Autokorrelasjoner (øverst) og interspike intervallhistogrammer (nederst) for et antatt eksitatorisk nevron (Pyn) og et antatt hemmende nevron (IN). (E) Dalbredden til den antatte Pyn var signifikant høyere enn den antatte IN (antatt Pyn: n = 1 055 pigger, antatt IN: n = 1 985 pigger). (F) Bølgeformvarigheten til den antatte Pyn var sterkere enn den antatte IN (antatt Pyn: n = 1 005 pigger, antatt IN: n = 1 059 pigger). (G) Krysskorrelasjonen mellom den antatte Pyn og IN. Statistisk analyse med Mann-Whitney-test. Alle dataene presenteres som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Analyse av to LFP-er fra bilateral MC og sammenhengen mellom pigghendelser og LFP hos mus. (A,B) Normaliserte effektspektrum for bilateral MC ved hvert frekvensbånd hos mus (n = 3). (C) Kurven for koherensen av to LFP-er mellom venstre og høyre MC (n = 3). (D) Krysskorrelasjonskurven for to LFP-er som viser en korrelasjon mellom venstre og høyre MC ved ±100 ms tidsforsinkelser (n = 3). (E) Kurven for piggfeltkoherens i MC til en mus. Statistisk analyse med Mann-Whitney-test. Alle dataene presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flerkanalsopptak i frittgående mus har blitt ansett for å være en nyttig teknologi i nevrovitenskapsstudier, men det er fortsatt ganske utfordrende for nybegynnere å registrere og analysere signalene. I denne studien gir vi forenklede retningslinjer for å lage mikrodrivsystemer og utføre elektrodeimplantasjon, samt forenklede prosedyrer for å fange og analysere de elektriske signalene via piggsorteringsprogramvare og programvare for nevrofysiologisk dataanalyse.
Gitt at kvaliteten på et skreddersydd mikrodrivsystem i stor grad bidrar til oppkjøpet av stabile og kvalitative signaler i frittgående mus14,15,16,17, designet og brukte vi en mer solid og lett struktur for mikrodrivsystemet i denne studien, og nybegynnere kan enkelt og tydelig følge produksjonstrinnene for å konstruere mikrodrivsystemet. I tillegg innebærer strukturen til det designede mikrodrivsystemet billige materialer som er lett tilgjengelige i maskinvareforretninger, i motsetning til de større, tyngre mikrodrivsystemene som er brukt i tidligere studier14,15. Dette mikrodrivsystemet kan redusere ubehag og tåle støt fra mus i fritt bevegelige forhold under opptak. I mellomtiden forbedret vi størrelsen og formen på mikrodrivsystemet, noe som kan være nyttig for nybegynnere ved å la dem observere, sette inn og dermed flytte elektrodespissene inn i hjernen under operasjonen. Videre blir den enkle lysbildestrukturen som brukes i mikrodrivsystemet, nøyaktig utviklet i hjernen ved hjelp av en høy presisjonsskrue, noe som betyr at dette systemet gir presis kontroll ved måling av flere lag av det målrettede hjerneområdet; Faktisk er dette ekstremt viktig for å fange ekstracellulære signaler i et fritt bevegelig dyr over en langsiktig eksperimentell periode. Fremfor alt er fordelene med dette mikrodrivsystemet dets enkelhet og fleksibilitet; Imidlertid bør det mindre antall kanaler og bruken av en rekke enkeltelektroder forbedres ytterligere i en ny versjon.
Det er flere forbedringer i denne studien verdt å merke seg også. På grunn av mikrodrivsystemets mindre størrelse og modifiserte form sammenlignet med tidligere systemer, ble det levert en bredere visjon og bredere arbeidsområde for operasjonen. Videre var veggene på musens skalle laget av dental sement og rustfritt stålskruer, noe som gjorde at mikrodrivsystemet kunne festes sterkt til musens hode. I tillegg tillot tannsementveggene lasting av petroleumjell for å dekke hullene i musens skalle før helling av tannsementen, som hadde beskyttende effekter på hjerneoverflaten uten dura og den bevegelige delen av mikrodrivsystemet. Sammen er disse forbedringene nyttige, da de tillater nybegynnere å implantere mikrodrivsystemet enkelt og trygt inn i musehjernen.
I flerkanals ekstracellulære opptak er det allment antatt at en annen vanskelighet ligger i å analysere de innspilte signalene ved hjelp av et matematisk komplekst programmeringsspråk17. Dermed gir vi klare retningslinjer for nybegynnere, spesielt når det gjelder piggsortering, LFP-dataanalyse og beregning av forholdet mellom dem ved hjelp av en vanlig brukt programvare i elektrofysiologi. I tillegg anbefaler vi sterkt at den registrerte enheten fra en enkeltelektrodeanalyse gruppert av PCA-metoder bør ha et høyt antall funksjoner for analyse, for eksempel de sorterte nevrale interspikeintervallene og bredden mellom dalen og toppen, da disse verdiene er nyttige for nybegynnere for å redusere skjevhet når enhetene grupperes automatisk med offline sorteringsprogramvare. Det er viktig at forholdet mellom signaler som inkluderer pigger og LFP er avgjørende for å formidle flere atferd. Vi tilbyr også en rekke enkle illustrasjoner for måling av spike-spike, LFP-LFP og spike-LFP-korrelasjoner ved hjelp av troverdige skript i programvaren for nevrofysiologisk dataanalyse; Disse illustrasjonene vil tillate nybegynnere å begynne å behandle og analysere de innspilte signalene raskt i frittgående mus. Videre kan resultatene og dataene som behandles med denne proprietære programvaren, brukes sammen med en åpen kildekode-verktøykasse som Fieldtrip for ytterligere analyse på forhånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (31871170, 32170950 og 31970915), Natural Science Foundation of Guangdong Province (2021A1515010804 og 2023A1515010899), Guangdong Natural Science Foundation for Major Cultivation Project (2018B030336001) og Guangdong Grant: Key Technologies for Treatment of Brain Disorders (2018B030332001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
