Summary
O protocolo descreve a metodologia de registro extracelular no córtex motor (CM) para revelar propriedades eletrofisiológicas extracelulares em camundongos conscientes em movimento livre, bem como a análise de dados de potenciais de campo local (LFPs) e picos, o que é útil para avaliar a atividade neural da rede subjacente aos comportamentos de interesse.
Abstract
O protocolo visa desvendar as propriedades do disparo neuronal e dos potenciais de campo local (LFPs) em camundongos comportados realizando tarefas específicas, correlacionando os sinais eletrofisiológicos com o comportamento espontâneo e/ou específico. Esta técnica representa uma ferramenta valiosa no estudo da atividade da rede neuronal subjacente a esses comportamentos. O artigo fornece um procedimento detalhado e completo para o implante de eletrodos e consequente registro extracelular em camundongos conscientes em movimento livre. O estudo inclui um método detalhado para implantar os arranjos de microeletrodos, capturar os sinais de LFP e spiking neuronal no córtex motor (CM) usando um sistema multicanal, e a subsequente análise de dados off-line. A vantagem do registro multicanal em animais conscientes é que um maior número de neurônios de spiking e subtipos neuronais pode ser obtido e comparado, o que permite avaliar a relação entre um comportamento específico e os sinais eletrofisiológicos associados. Notavelmente, a técnica de registro extracelular multicanal e o procedimento de análise de dados descrito no presente estudo podem ser aplicados a outras áreas cerebrais ao realizar experimentos em camundongos com comportamento.
Introduction
O potencial de campo local (LFP), um importante componente dos sinais extracelulares, reflete a atividade sináptica de grandes populações de neurônios, que formam o código neural para múltiploscomportamentos1. Considera-se que as espículas geradas pela atividade neuronal contribuem para a LFP e são importantes para a codificação neural2. Alterações em spikes e LFPs comprovadamente mediam diversas doenças cerebrais, como a doença de Alzheimer, bem como emoções como medo, etc.3,4. Vale ressaltar que muitos estudos têm destacado que a atividade da espícula difere significativamente entre os estados acordado e anestesiado em animais5. Embora os registros em animais anestesiados ofereçam uma oportunidade de avaliar PBL com artefatos mínimos em estados de sincronização cortical altamente definidos, os resultados diferem em certa medida do que pode ser encontrado em indivíduos acordados 6,7,8. Assim, é mais significativo detectar atividade neural em longas escalas de tempo e grandes escalas espaciais em várias doenças em estado de vigília usando eletrodos implantados no cérebro. Este manuscrito fornece informações para iniciantes sobre como fazer o sistema de micro-drive e definir os parâmetros usando um software comum para calcular os sinais de pico e LFP de forma rápida e direta, a fim de iniciar a gravação e análise.
Embora o registro não invasivo de funções cerebrais, como o uso de eletroencefalogramas (EEGs) e potenciais relacionados a eventos (ERPs) registrados a partir do couro cabeludo, tenha sido amplamente utilizado em estudos com humanos e roedores, os dados de EEG e ERP têm baixas propriedades espaciais e temporais e, portanto, não conseguem detectar os sinais precisos produzidos pela atividade sináptica dendrítica próxima dentro deuma área específica do cérebro1. Atualmente, aproveitando o registro multicanal em animais conscientes, a atividade neural nas camadas mais profundas do cérebro pode ser registrada crônica e progressivamente pela implantação de um sistema de micro-drive no cérebro de primatas ou roedores durante múltiplos testes comportamentais 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Resumidamente, os pesquisadores podem construir um sistema de micro-drive que pode ser usado para o posicionamento independente dos eletrodos ou tetrodos para atingir diferentes partes do cérebro10,11. Por exemplo, Chang e col. descreveram técnicas para registrar spikes e LFPs em camundongos montando um micro-drive leve e compacto12. Além disso, sondas de silício microusinadas com componentes acessórios feitos sob medida estão comercialmente disponíveis para o registro de múltiplos neurônios individuais e LFPs em roedores durante tarefas comportamentais13. Embora vários projetos tenham sido usados para montar sistemas de micro-acionamento, estes ainda têm sucesso limitado em termos de complexidade e peso de todo o sistema de micro-acionamento. Por exemplo, Lansink e col. mostraram um sistema de micro-drive multicanal com uma estrutura complexa para gravação a partir de uma única região cerebral14. relataram um sistema de microacionamento multicanal exibindo uma função de posicionamento hidráulico automático15. As principais desvantagens desses sistemas de micro-acionamento são que eles são muito pesados para os ratos se moverem livremente e são difíceis de montar para iniciantes. Embora a gravação extracelular multicanal tenha se mostrado uma tecnologia adequada e eficiente para medir a atividade neural durante testes comportamentais, não é fácil para iniciantes registrar e analisar os sinais adquiridos pelo complexo sistema de micro-drive. Dado que é difícil iniciar todo o processo de operação da gravação extracelular multicanal e análise de dados em camundongos que se movem livremente16,17, este artigo apresenta diretrizes simplificadas para introduzir o processo detalhado de fabricação do sistema de micro-drive usando componentes e configurações comumente disponíveis; os parâmetros no software comum para calcular os sinais spike e LFP de forma rápida e direta também são fornecidos. Além disso, neste protocolo, o mouse pode se mover livremente devido ao uso de um balão de hélio, o que contribui para compensar o peso do headstage e do sistema de micro-acionamento. De modo geral, no presente estudo, descrevemos como construir facilmente um sistema de micro-drive e otimizar os processos de registro e análise de dados.
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Protocol
Todos os camundongos foram obtidos comercialmente e mantidos em um ciclo claro/12 h escuro de 12 h (luz acesa às 08:00 horas locais) a uma temperatura ambiente de 22-25 °C e umidade relativa de 50%-60%. Os ratos tiveram acesso a um suprimento contínuo de comida e água. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório da South China Normal University e aprovados pelo Comitê Institucional de Ética em Animais. Camundongos C57BL/6J machos com idade entre 3-5 meses de idade foram utilizados para os experimentos.
1. Montagem do sistema de micro-acionamento
- Conecte duas placas projetadas por computador usando dois stulls e um parafuso que prende o micro-drive móvel e conecte o conector a uma placa (Figura 1A, Bi-iii). Acione o micro-drive torcendo um parafuso (0,5 mm/círculo).
- Certifique-se de que o micro-drive possa transportar dois conjuntos de oito tubos guia (~3 cm de comprimento, ~50 μm de diâmetro interno, ~125 μm de diâmetro externo) para cada lado da região MC e, em seguida, corte-o com o mesmo comprimento (pelo menos 15 mm; Figura 1Biv, v).
- Cortar 16 fios de cromo Ni (~5 cm de comprimento) com diâmetro de 35 μm e, em seguida, carregá-los sucessivamente nos tubos guia, seguido da aplicação da cola para fixá-los (Figura 1Bi, vi, vii).
- Retire o isolamento do fio, amarre sucessivamente cada fio exposto a cada pino do conector seguindo o mapa do canal, bem como os eletrodos de referência e terra, e então rebata lentamente a tinta condutora em cada pino (Figura 1Bviii-x).
- Cubra os pinos com resina epóxi (Figura 1Axi, xii) e, em seguida, realize o revestimento a ouro através de um testador de impedância para reduzir a impedância das pontas dos eletrodos para ~350 kOhm (Figura 1Bxiii, xiv). Defina os parâmetros do testador de impedância da seguinte forma: −10,08 μA de corrente contínua para 1 s com solução de revestimento de ouro, incluindo 5 mM PtCl4.
- Finalmente, mova o micro-drive para o topo torcendo um parafuso. Verifique o tamanho total do sistema de microacionamento modificado conforme mostrado na Figura 1A (aproximadamente 15 mm de comprimento, 10 mm de largura, 20 mm de altura, ~1 g de peso). Verifique as especificações detalhadas da placa projetada por computador e do componente móvel na Figura 1Ai, ii.
2. Implantação de arranjo de eletrodos
- Esterilize os kits de cirurgia, use luvas estéreis e coloque um jaleco branco estéril do médico antes do início da operação.
- Para controlar a dor, use injeção subcutânea (s.c.) de meloxicam injetável (5 mg/kg) para o camundongo em uma câmara de indução. Em seguida, anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de pentobarbital (80 mg/kg) em câmara de indução18,19. Aplicar uma dose suplementar de pentobarbital (20 mg/kg/h) se o reflexo de pinça do dedo ainda estiver presente.
- Fixe o rato num aparelho estereotáxico e mantenha a sua temperatura rectal a 37 °C utilizando um controlador de temperatura.
- Aplique pomada ocular de tetraciclina em ambos os olhos do rato e troque as luvas estéreis novamente antes da cirurgia.
- Raspar a pele do camundongo e desinfetar o sítio cirúrgico com três rodadas alternadas de betadina e álcool usando um aplicador estéril com ponta de algodão em círculos concêntricos, começando no centro e movendo-se para fora (Figura 2i, ii). Faça uma pequena incisão na linha média (~15 mm) para expor seu crânio. Imediatamente, aplique a lidocaína a 1% localmente nos músculos do pescoço para alívio da dor. Em seguida, remova o tecido residual com tesoura e limpe o crânio com cotonetes revestidos com soro fisiológico (Figura 2iii).
- Com um microeletrodo de vidro preenchido com tinta, marque os locais desejados do CM bilateral para implantação (Figura 2iv, v). Com base em estudoprévio20, as localizações das CM bilaterais são as seguintes: 0,74 mm anterior ao bregma e 1,25 mm lateral à linha média.
- Implantar quatro parafusos de aço inoxidável (0,8 mm de diâmetro) para proteger o sistema de micro-acionamento e, em seguida, unir todos os parafusos com os eletrodos de referência e terra, seguido de cobertura com cimento dentário misto para formar paredes (Figura 2vi-xi).
- Faça cuidadosamente dois pequenos orifícios (~1,5mm2) com uma broca de crânio nos lados esquerdo e direito do crânio coordenado nas regiões do CM (Figura 2xii). Utilizar as coordenadas estereotáxicas do CM bilateral: 0,74 mm anterior ao bregma, 1,25 mm lateral à linha média e 0,5 mm ventral à dura-máter.
- Retire cuidadosamente a dura-máter dos orifícios com pinça fina (Figura 2xiii).
- Insira o sistema de micro-acionamento no centro dos orifícios usando um micromanipulador a 10 μm/s (Figura 2xiv-xvii).
- Preencher a vaselina nas paredes de cimento dental após finalizar a inserção do sistema de micro-acionamento (Figura 2xviii).
- Unir a placa inferior do sistema de micro-acionamento e as paredes de cimento dental com o cimento dental misto (Figura 2xix)
- Lavar a incisão com soro fisiológico seguido de tratamento local com gel contendo cloridrato de lincomicina e cloridrato de lidocaína para alívio da dor pós-cirúrgica.
- Enrole a fita condutora de folha de cobre ao redor do sistema de microacionamento implantado (Figura 2xx).
- Mova o rato para uma gaiola mantida a 31-33 °C e monitorize o rato para recuperação da anestesia.
- Permita que os ratos se recuperem por 1 semana com alimentação separada. Verificar e tratar a incisão com 3 dias de aplicação contínua de um gel contendo cloridrato de lincomicina e cloridrato de lidocaína.
3. Gravação multicanal no CM bilateral em camundongos em movimento livre
- Segure a cabeça de um rato acordado com leveza e cuidado. Desça as matrizes de eletrodos (~0,1 mm de profundidade) torcendo o parafuso na parte móvel do sistema de microacionamento (Figura 1Aii) com pelo menos 1 dia de antecedência.
- Segure a cabeça do rato acordado com leveza e cuidado. Conecte o centro do headstage e um balão de hélio (preenchido com aproximadamente 0,02 L de hélio) com uma rosca para compensar o peso do headstage e do sistema de micro-acionamento (Figura 3A, B).
- Capture sinais brutos usando os eletrodos de gravação e sistemas multicanal por amostragem a 30 kHz no software de gravação e, em seguida, digitalize usando um conversor analógico-digital (DA) dos sistemas multicanal.
- Extraia os sinais LFP dos dados brutos reamostrando a 10 kHz no software de gravação e, em seguida, use um filtro de entalhe do software de gravação para remover o ruído da linha de 50 Hz.
- Registre dados brutos em um estado estável a partir de um mouse em movimento livre por pelo menos 60 s. Depois de terminar a gravação, remova lentamente a conexão entre o headstage e o sistema de micro-drive e retorne o mouse de volta à sua gaiola inicial.
- Armazene os dados gravados no computador e analise-os offline (Figura 4 e Figura 5).
- Após o término do experimento, realizar a eutanásia de acordo com as orientações do instituto e, em seguida, confirmar a localização dos eletrodos usando a fonte de alimentação na saída de 3 V para realizar uma lesão eletrolítica de 1 min, seguido de análise histológica. Cortar o cérebro do camundongo em fatias de 30 μm usando um micrótomo de congelamento, coletar as seções MC e, em seguida, capturar as imagens com um microscópio (Figura 3C, D).
4. Classificação e análise de spikes
- Clique em Arquivo > Abrir arquivos > Nev no software de classificação de spike para abrir os dados de spike amostrados em 30 kHz (Figura 4Ai).
- Clique em Informações para selecionar o canal não classificado e, em seguida, selecione Classificar > Alterar Método de Classificação > Usar K-Means. Pressione o botão Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting para obter as unidades classificadas (Figura 4Aii, iii).
- Clique em Arquivo > Salvar como, salve os dados de pico classificados com uma extensão de nome de arquivo .nev e selecione Arquivo > Exportar dados por forma de onda para exportar os resultados da PCA com uma extensão de nome de arquivo .txt (Figura 4Aiv).
- Clique em File > Import Data > Blackrock File no software para análise de dados neurofisiológicos para abrir o arquivo spike classificado (Figura 4Bi).
- Clique em Análise > Autocorrelogramas para obter o autocorrelograma para a unidade selecionada e, em seguida, defina os parâmetros da seguinte forma: o valor X Mínimo em −0,05 s, o valor X Máximo em 0,05 s e o valor Bin em 0,001 (Figura 4Bii, iii).
- Carregue os dados de spike classificados, clique em Analysis > Interspike Interval Histograms para obter o histograma de intervalo inter-spike e, em seguida, defina os parâmetros da seguinte maneira: o valor do intervalo mínimo em 0 s, o valor do intervalo máximo em 0,1 s e o valor do Bin em 0,001 (Figura 4Biv, v).
- Clique em Análise > Correlogramas Cruzados para obter o correlograma cruzado entre dois eventos unitários classificados e, em seguida, defina os eventos e parâmetros de referência da seguinte forma: o valor X Mínimo em −0,1 s, o valor X Máximo em 0,1 s e o valor Bin em 0,001 (Figura 4Bvi, vii).
- Clique em Resultados > Resultados Numéricos para salvar os resultados do autocorrelograma, histograma de intervalo entre espículas e correlação cruzada com .xls extensões de nome de arquivo (Figura 4Bviii, ix). Analise os dados e desenhe o gráfico.
5. Análise LFP
- Clique em File Import Data > Blackrock File no software para análise dos dados neurofisiológicos para abrir os dados de sinal contínuo amostrados a 10 kHz (Figura 5Ai).
- Clique em Analysis > Spectrum for Continuous para analisar o espectro de potência para o LFP a partir do canal selecionado. Defina os parâmetros da seguinte forma: o Número de Valores de Frequência em 8.192, o valor de Múltiplas Faixas em 3-5, a Normalização da porcentagem da densidade espectral de potência total (PSD) e a Faixa de Frequência de 1 Hz a 100 Hz (Figura 5Aii, iii).
- Clique em Análise > Coerência para Contínuo para analisar a coerência de dois LFPs dos lados esquerdo e direito do CM. Defina o canal de referência e os parâmetros da seguinte maneira: Calcule em valores de coerência, o número de valores de frequência em 8.192, o valor de Multiple Tapers em 3-5 e a faixa de frequência de 1 Hz a 100 Hz (Figura 5Aiv, v).
- Clique em Análise > Corr. com Variáveis Contínuas para analisar a correlação entre dois LFPs dos lados esquerdo e direito do MC. Defina o canal de referência (dados LFP) e os parâmetros da seguinte maneira: o valor X Mínimo em −0,1 s, o valor X Máximo em 0,1 s e o valor Bin em 0,001 (Figura 5Avi, vii).
- Clique em Resultados > Resultados Numéricos para salvar os resultados do PSD, coerência e correlação com uma extensão de nome de arquivo .xls (Figura 5Aviii, ix).
- Selecione o canal para o qual os traços representativos precisam ser extraídos para cada faixa de frequência, clique em Editar > Filtragem Digital de Variáveis Contínuas para obter cada faixa de frequência e, em seguida, defina os parâmetros da seguinte forma: a Resposta de Frequência de Filtro como Passa-Banda, a Implementação de Filtro em Resposta de Impulso Infinito (IIR) Butterworth e o valor de Ordem de Filtro em 2. Por fim, defina a faixa de frequência de interesse (Figura 5Bi-iv).
NOTA: As faixas de frequência utilizadas aqui foram: oscilações delta (δ, 1-4 Hz), (θ, 5-12 Hz), beta (β, 13-30 Hz), gama baixa (baixa γ, 30-70 Hz) e gama alta (alta γ, 70-100 Hz). - Analise os dados e desenhe o gráfico.
6. Correlações entre a espícula e a LFP
- Clique em Arquivo > Importar Dados > Arquivo Blackrock no software para a análise de dados neurofisiológicos para abrir os dados de sinal contínuo e dados de pico.
- Clique em Análise > Análise de Coerência para analisar a coerência entre os picos e LFP do canal selecionado. Defina a variável de referência (tempo de pico) e os parâmetros da seguinte forma: Calcule em Valores de Coerência, o Número de Valores de Frequência em 512, o valor de Múltiplas Tapers em 3-5 e a faixa de frequência de 1 Hz a 100 Hz (Figura 5Ci, ii).
- Clique em Resultados > Resultados Numéricos para salvar o resultado da coerência do campo spike com uma extensão de nome de arquivo .xls (Figura 5Ciii, iv).
- Analise os dados e desenhe o gráfico.
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Representative Results
Um filtro passa-alta (250 Hz) foi aplicado para extrair os picos multiunidades dos sinais brutos (Figura 6A). Além disso, as unidades registradas do MC de um camundongo normal classificado por PCA foram verificadas (Figura 7A-D), e a largura do vale e a duração da forma de onda das unidades no MC do camundongo foram registradas. Os resultados mostraram que tanto a largura do vale quanto a duração da forma de onda dos neurônios piramidais putativos (Pyn) MC em camundongos são maiores do que os dos interneurônios putativos (IN) (Figura 7E,F; duas amostras teste de Mann-Whitney; para largura de vale, putativo Pyn: 0,636 ms ± 0,004 ms, IN putativo: 0,614 ms ± 0,001 ms, p = 0,002; para a duração da forma de onda, Pyn putativo: 0,095 ms ± 0,004 ms, IN putativo: 0,054 ms ± 0,002 ms, p = 1,402 x 10−16), correspondendo às características de Pyn e IN em estudos anteriores21. Também calculamos o coronograma cruzado entre Pyn putativo e IN definindo as picas putativas de Pyn como referência e encontramos um pico positivo em ~18 ms (Figura 7G), indicando que o pico putativo de Pyn ocorre antes do pico putativo de IN com uma janela de ~18 ms.
Traços representativos de cada banda de frequência foram filtrados do LFP pelo filtro IIR no software para análise dos dados neurofisiológicos (Figura 6A). Na análise LFP, os LFPs do CM esquerdo e direito em camundongos normais foram semelhantes no espectro de potência, sugerindo atividades sincronizadas entre o CM esquerdo e direito (Figura 8A,B; duas amostras do teste de Mann-Whitney; para δ, CM esquerdo: 50,71 ± 1,136, CM direito: 50,47 ± 1,213, p = 0,70; para θ, CM esquerdo: 2,197 ± 0,187, CM direito: 2,068 ± 0,193, p = 0,40; para β, CM esquerda: 0,222 ± 0,058, CM direita: 0,206 ± 0,055, p = 0,70; para γ baixo, CM esquerda: 0,114 ± 0,034, CM direita: 0,093 ± 0,018, p = 0,70; para γ alto, CM esquerda: 0,054 ± 0,027, CM direita: 0,04 ± 0,015, p = 0,40). Calculamos então a coerência e a correlação entre o CM esquerdo e o direito (Figura 8C,D; o MC LFP esquerdo segue dentro de uma janela de ~1,2 ms após o MC LFP direito, −1,167 ms ± 0,667 ms) e calculamos a magnitude do pico putativo de Pyn ou IN sincronizado com o LFP (1-100 Hz) no MC esquerdo de um camundongo normal (Figura 8E). Isso mostrou uma menor coerência de γ para o suposto IN em comparação com o Pyn.
Figura 1: Diagrama dos eletrodos e sistema de gravação multicanal. (A) Ilustração do sistema de micro-acionamento. eu. Desenho e especificação da placa projetada por computador. ii. Diagrama esquemático da micro-unidade móvel. (B) Sistema de micro-acionamento e degraus móveis multicanal de eletrodo único. eu. Os fios Ni-cromados; ii. As partes constituintes do eletrodo; iii. Montagem das placas projetadas por computador; iv. Montagem preliminar dos eletrodos, incluindo os conectores e oito tubos guia; v. O outro lado do micro-drive; VI,VII. Os fios de Ni-cromo são sucessivamente carregados nos tubos guia; viii-x. Cada fio exposto é sucessivamente entrelaçado a cada pino, seguido de revestimento conduzindo tinta em cada pino; XI,XII. Os pinos são revestidos com resina epóxi; xiii,xiv. Revestimento a ouro. (C) Desenho experimental da gravação extracelular no CM de um camundongo em movimento livre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Passo a passo do procedimento cirúrgico. Faça a barba do pelo do rato e desinfete o local cirúrgico com três rodadas alternadas de esfoliação de betadina e álcool. iii. Limpe o crânio do rato. iv. Nivelamento. v. Marque a localização do cérebro. vi. Marque as posições dos parafusos de aço inoxidável. vii. Inserir parafusos de aço inoxidável. viii. Articular os parafusos com os eletrodos de referência e terra. IX,X. Misture o cimento dental. xi. Construa uma parede com cimento dental. XII,XIII. Fazer dois pequenos orifícios acima do MC bilateral, seguindo-se a remoção da dura-máter. xiv. Preparar o sistema de micro-acionamento. xv-xix. Implantar o sistema de micro-drive seguido de tratamento local com gel contendo cloridrato de lincomicina e cloridrato de lidocaína para alívio da dor pós-cirúrgica. xx. Proteja o sistema de micro-acionamento com fita de folha de cobre condutora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ilustração de uma gravação fixada na cabeça em um mouse consciente. (A) Diagrama esquemático para gravação em movimento livre. (B) Detalhes das imagens da gravação em movimento livre. eu. Planform do sistema de micro-acionamento implantado; ii. Headstage; III,IV. O sistema de micro-acionamento e o headstage estão conectados; v. O balão de hélio é aplicado para compensar o peso do headstage e do sistema de micro-acionamento. (C) Ilustração da verificação da localização do local de registro por meio de lesão eletrolítica. (D) Os locais de registro marcados por lesões eletrolíticas no CM de um camundongo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ilustração da classificação e análise de spikes. (A) Os parâmetros para agrupar os dados de spike e exportar os resultados. eu. Importar os dados de pico; ii. Escolha o método de classificação; iii. Ordenar os dados de pico usando o algoritmo κ-means; iv. Exportar os resultados da unidade classificada. (B) O processo de análise do histograma de intervalo inter-spike, autocorrelograma e correlograma cruzado da unidade classificada. eu. Importar os dados de pico classificados; ii. Realizar a análise de autocorrelação; iii. Definir os parâmetros para o autocorrelograma; iv. Obter o histograma de intervalo inter-espícula; v. Definir os parâmetros para o histograma de intervalo entre pontas; vi. Calcular a correlação cruzada entre os picos das unidades classificadas; vii. Definir os parâmetros para o correlograma cruzado; viii,ix. Exporte os resultados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ilustração da análise contínua dos dados. (A) O processo e os parâmetros para análise dos sinais LFP que foram calculados usando o espectro de potência dos LFPs, coerência e correlação entre dois LFPs. i. Importar os dados LFP; ii. Calcular a densidade espectral de potência para os LFPs a partir do MC bilateral; Aiii. Calcular a densidade espectral de potência para o LFP; iv,v. Calcular a coerência entre os LFPs; VI,VII. Calcular a correlação entre dois LFPs. viii,ix. Exporte os resultados. (B) O processo de filtragem de cada faixa de frequência do sinal LFP. i. Extrair as diferentes bandas de frequência dos dados LFP; II,III. Visualizar os LFPs filtrados; iv. Salve os LFPs filtrados como um metarquivo avançado. (C) O processo de análise da coerência entre as pontas neuronais e a LFP. i,ii. Calcular a coerência entre o LFP e os picos classificados; III,IV. Exporte os resultados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Vestígios representativos dos sinais gravados. O pico foi filtrado passa-alta a 250 Hz a partir dos dados brutos amostrados a 30 kHz. O LFP foi o dado bruto amostrado a 10 kHz. δ foi a banda de frequência delta filtrada em 1-4 Hz a partir do LFP. θ foi a banda de frequência filtrada em 5-12 Hz a partir do LFP. β foi a banda de frequência beta filtrada a 13-30 Hz a partir do LFP. Baixa γ foi a banda de baixa frequência gama filtrada a 30-70 Hz a partir da LFP. A alta γ foi a banda de alta frequência gama filtrada a 70-100 Hz a partir do LFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Características das unidades classificadas e seu padrão de disparo. (A,B) As unidades classificadas foram agrupadas usando análise de componentes principais (ACP) do mesmo eletrodo. (C,D) Autocorrelações (superior) e histogramas de intervalo inter-spike (inferior) para um neurônio excitatório putativo (Pyn) e um neurônio inibitório putativo (IN). (E) A largura do vale do Pyn putativo foi significativamente maior do que a do IN putativo (Pyn putativo: n = 1.055 espículas, IN putativo: n = 1.985 espigas). (F) A duração da forma de onda do Pyn putativo foi mais forte do que a do IN putativo (Pyn putativo: n = 1.005 picos, IN putativo: n = 1.059 picos). (G) A correlação cruzada entre o Pyn putativo e IN. Análise estatística com teste de Mann-Whitney. Todos os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, **p < 0,01, ***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise de dois LFPs do MC bilateral e a coerência entre os eventos spike e o LFP em camundongos. (A,B) Espectros de potência normalizados do CM bilateral em cada banda de frequência em camundongos (n = 3). (C) A curva de coerência de dois PBF entre o CM esquerdo e direito (n = 3). (D) A curva de correlação cruzada de dois LFPs mostrando uma correlação entre o CM esquerdo e direito em intervalos de tempo de ±100 ms (n = 3). (E) A curva de coerência do campo de espícula no CM de um rato. Análise estatística com teste de Mann-Whitney. Todos os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A gravação multicanal em camundongos em movimento livre tem sido considerada uma tecnologia útil em estudos de neurociência, mas ainda é bastante desafiadora para iniciantes gravar e analisar os sinais. No presente estudo, fornecemos diretrizes simplificadas para a confecção de sistemas de microacionamento e implantação de eletrodos, bem como procedimentos simplificados para captura e análise de sinais elétricos via software de classificação spike e software para análise de dados neurofisiológicos.
Dado que a qualidade de um sistema de micro-drive feito sob medida contribui grandemente para a aquisição de sinais estáveis e qualitativos em camundongos em movimento livre14,15,16,17, projetamos e usamos uma estrutura mais resistente e leve para o sistema de micro-drive neste estudo, e os iniciantes podem facilmente e claramente seguir as etapas de fabricação para construir o sistema de micro-acionamento. Além disso, a estrutura do sistema de microacionamento projetado envolve materiais de baixo custo e facilmente disponíveis em lojas de hardware, ao contrário dos sistemas de microacionamento maiores e mais pesados usados em estudos anteriores14,15. Este sistema de micro-acionamento pode diminuir o desconforto e suportar o impacto de mouses em movimento livre durante as gravações. Enquanto isso, melhoramos ainda mais o tamanho e a forma do sistema de micro-acionamento, o que pode ser útil para iniciantes, permitindo que eles observem, insiram e, assim, movam as pontas dos eletrodos para o cérebro durante a cirurgia. Além disso, a estrutura de deslizamento simples aplicada no sistema de micro-acionamento é progredida com precisão no cérebro usando um parafuso de alta precisão, o que significa que este sistema fornece controle preciso na medição de várias camadas da área cerebral alvo; De fato, isso é extremamente importante para a captura de sinais extracelulares em um animal em movimento livre durante um período experimental de longo prazo. Acima de tudo, as vantagens deste sistema de micro-acionamento são a sua simplicidade e flexibilidade; no entanto, o menor número de canais e o uso de uma matriz de eletrodos simples devem ser melhorados em uma nova versão.
Há várias melhorias no presente estudo que também merecem ser observadas. Devido ao tamanho menor e forma modificada do sistema de micro-acionamento em comparação com os sistemas anteriores, uma visão mais ampla e um espaço de trabalho mais amplo foram fornecidos para a operação. Além disso, as paredes do crânio do rato eram feitas de cimento dentário e parafusos de aço inoxidável, o que permitia que o sistema de micro-acionamento fosse fortemente fixado à cabeça do rato. Além disso, as paredes de cimento dental permitiam o carregamento de vaselina para cobrir os orifícios no crânio do camundongo antes de derramar o cimento dental, o que tinha efeitos protetores na superfície do cérebro sem a dura-máter e a parte móvel do sistema de micro-acionamento. Juntas, essas melhorias são úteis, pois permitem que os iniciantes implantem o sistema de micro-acionamento com facilidade e confiança no cérebro do mouse.
Em gravações extracelulares multicanais, acredita-se que outra dificuldade esteja na análise dos sinais gravados utilizando uma linguagem de programação matematicamentecomplexa17. Assim, fornecemos diretrizes claras para iniciantes, particularmente em termos de classificação de picos, análise de dados LFP e computação da relação entre eles usando um software comumente usado em eletrofisiologia. Além disso, sugerimos fortemente que a unidade registrada de um ensaio de eletrodo único agrupado por métodos de PCA deve ter um alto número de recursos para análise, como os intervalos inter-spike neuronais ordenados e a largura entre seu vale e pico, pois esses valores são úteis para iniciantes para reduzir o viés quando as unidades são agrupadas automaticamente com software classificador offline. É importante ressaltar que a relação entre os sinais que incluem picos e o LFP é crítica para mediar múltiplos comportamentos. Também fornecemos uma série de ilustrações diretas para medir correlações spike-spike, LFP-LFP e spike-LFP usando scripts confiáveis no software para análise de dados neurofisiológicos; Essas ilustrações permitirão que os iniciantes comecem a processar e analisar os sinais gravados rapidamente em camundongos em movimento livre. Além disso, os resultados e dados tratados com este software proprietário podem ser usados em conjunto com uma caixa de ferramentas de código aberto, como o Fieldtrip, para análise adicional com antecedência.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31871170, 32170950 e 31970915), da Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (2021A1515010804 e 2023A1515010899), da Fundação de Ciências Naturais de Guangdong para o Projeto de Cultivo Principal (2018B030336001) e da Concessão Guangdong: Tecnologias-Chave para o Tratamento de Distúrbios Cerebrais (2018B030332001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
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