Summary
El protocolo describe la metodología de registro extracelular en la corteza motora (MC) para revelar propiedades electrofisiológicas extracelulares en ratones conscientes que se mueven libremente, así como el análisis de datos de potenciales de campo local (LFP) y picos, lo que es útil para evaluar la actividad neuronal de la red que subyace a los comportamientos de interés.
Abstract
El protocolo tiene como objetivo descubrir las propiedades de la activación neuronal y los potenciales de campo local (LFP) en ratones que se comportan y llevan a cabo tareas específicas mediante la correlación de las señales electrofisiológicas con el comportamiento espontáneo y/o específico. Esta técnica representa una herramienta valiosa para estudiar la actividad de la red neuronal que subyace a estos comportamientos. El artículo proporciona un procedimiento detallado y completo para la implantación de electrodos y el consiguiente registro extracelular en ratones conscientes que se mueven libremente. El estudio incluye un método detallado para implantar las matrices de microelectrodos, capturar las señales de LFP y pico neuronal en la corteza motora (MC) utilizando un sistema multicanal, y el posterior análisis de datos fuera de línea. La ventaja del registro multicanal en animales conscientes es que se puede obtener y comparar un mayor número de neuronas y subtipos neuronales spiking, lo que permite evaluar la relación entre un comportamiento específico y las señales electrofisiológicas asociadas. En particular, la técnica de registro extracelular multicanal y el procedimiento de análisis de datos descrito en el presente estudio se pueden aplicar a otras áreas del cerebro cuando se realizan experimentos en ratones que se comportan.
Introduction
El potencial de campo local (LFP), un componente importante de las señales extracelulares, refleja la actividad sináptica de grandes poblaciones de neuronas, que forman el código neuronal para múltiplescomportamientos. Se considera que los picos generados por la actividad neuronal contribuyen a la LFP y son importantes para la codificación neuronal2. Se ha demostrado que las alteraciones en los picos y los LFP median en varias enfermedades cerebrales, como la enfermedad de Alzheimer, así como en emociones como el miedo, etc.3,4. Vale la pena señalar que muchos estudios han destacado que la actividad de la espícula difiere significativamente entre los estados despiertos y anestesiados en animales5. A pesar de que los registros en animales anestesiados ofrecen la oportunidad de evaluar las LFP con artefactos mínimos en estados de sincronización cortical altamente definidos, los resultados difieren en cierta medida de lo que se puede encontrar en sujetos despiertos 6,7,8. Por lo tanto, es más significativo detectar la actividad neuronal en escalas de tiempo largas y grandes escalas espaciales en diversas enfermedades en un estado cerebral despierto utilizando electrodos implantados en el cerebro. Este manuscrito proporciona información para principiantes sobre cómo hacer el sistema de micro-accionamiento y configurar los parámetros utilizando un software común para calcular las señales de pico y LFP de una manera rápida y sencilla para comenzar el registro y el análisis.
Aunque el registro no invasivo de las funciones cerebrales, como el uso de electroencefalogramas (EEG) y potenciales relacionados con eventos (ERP) registrados en el cuero cabelludo, se ha utilizado ampliamente en estudios en humanos y roedores, los datos de EEG y ERP tienen propiedades espaciales y temporales bajas y, por lo tanto, no pueden detectar las señales precisas producidas por la actividad sináptica dendrítica cercana dentro de un área específica del cerebro1. En la actualidad, aprovechando la grabación multicanal en animales conscientes, la actividad neuronal en las capas más profundas del cerebro puede registrarse de forma crónica y progresiva mediante la implantación de un sistema de microaccionamiento en el cerebro de primates o roedores durante múltiples pruebas de comportamiento 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . En resumen, los investigadores pueden construir un sistema de microaccionamiento que se puede utilizar para el posicionamiento independiente de los electrodos o tetrodos para apuntar a diferentes partes del cerebro10,11. Por ejemplo, Chang et al. describieron técnicas para registrar picos y LFPs en ratones mediante el ensamblaje de un micro-drive ligero y compacto12. Además, las sondas de silicio micromecanizadas con componentes accesorios hechos a medida están disponibles comercialmente para registrar múltiples neuronas individuales y LFP en roedores durante tareas de comportamiento13. Aunque se han utilizado varios diseños para ensamblar sistemas de microaccionamiento, estos todavía tienen un éxito limitado en términos de complejidad y peso de todo el sistema de microaccionamiento. Por ejemplo, Lansink et al. mostraron un sistema de microaccionamiento multicanal con una estructura compleja para la grabación de una sola región cerebral14. Sato et al. informaron de un sistema de microaccionamiento multicanal que mostraba una función de posicionamiento hidráulico automático15. Las principales desventajas de estos sistemas de microaccionamiento son que son demasiado pesados para que los ratones se muevan libremente y son difíciles de montar para los principiantes. Aunque se ha demostrado que el registro extracelular multicanal es una tecnología adecuada y eficiente para medir la actividad neuronal durante las pruebas de comportamiento, no es fácil para los principiantes registrar y analizar las señales adquiridas por el complejo sistema de microaccionamiento. Dado que es difícil iniciar todo el proceso de operación del registro extracelular multicanal y el análisis de datos en ratones que se mueven libremente16,17, en el presente artículo se presentan pautas simplificadas para introducir el proceso detallado de fabricación del sistema de microaccionamiento utilizando componentes y configuraciones comúnmente disponibles; también se proporcionan los parámetros del software común para calcular las señales de pico y LFP de una manera rápida y sencilla. Además, en este protocolo, el ratón puede moverse libremente gracias al uso de un globo de helio, lo que contribuye a compensar el peso de la cabecera y el sistema de micropropulsión. En general, en el presente estudio, describimos cómo construir fácilmente un sistema de micro-accionamiento y optimizar los procesos de registro y análisis de datos.
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Protocol
Todos los ratones se obtuvieron comercialmente y se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad (luz encendida a las 08:00 a.m. hora local) a una temperatura ambiente de 22-25 °C y una humedad relativa de 50%-60%. Los ratones tenían acceso a un suministro continuo de comida y agua. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Normal del Sur de China y aprobadas por el Comité Institucional de Ética Animal. Para los experimentos se utilizaron ratones machos C57BL/6J de entre 3 y 5 meses de edad.
1. Montaje del sistema de microaccionamiento
- Conecte dos placas diseñadas por computadora usando dos estupefactos y un tornillo que sujete el microaccionamiento móvil y conecte el conector a una placa (Figura 1A, Bi-iii). Accione el microaccionamiento girando un tornillo (0,5 mm/círculo).
- Asegúrese de que el microaccionamiento pueda transportar dos juegos de ocho tubos guía (~3 cm de largo, ~50 μm de diámetro interno, ~125 μm de diámetro externo) para cada lado de la región MC y, a continuación, córtelo a la misma longitud (al menos 15 mm; Figura 1Biv, v).
- Cortar 16 hilos de Nicromo (~5 cm de largo) con un diámetro de 35 μm, y luego cargarlos sucesivamente en los tubos guía, seguido de aplicar el pegamento para fijarlos (Figura 1Bi, vi, vii).
- Pele el aislamiento del cable, enrede sucesivamente cada cable expuesto a cada pin desde el conector siguiendo el mapa de canales, así como los electrodos de referencia y tierra, y luego aplique lentamente pintura conductora en cada pin (Figura 1Bviii-x).
- Cubra las clavijas con resina epoxi (Figura 1Axi, xii) y luego realice el chapado en oro a través de un probador de impedancia para reducir la impedancia de las puntas de los electrodos a ~ 350 kOhm (Figura 1Bxiii, xiv). Ajuste los parámetros del probador de impedancia de la siguiente manera: −10,08 μA de corriente continua durante 1 s con solución chapada en oro, incluidos 5 mM PtCl4.
- Finalmente, mueva el microaccionamiento hacia la parte superior girando un tornillo. Compruebe el tamaño total del sistema de microaccionamiento modificado como se muestra en la Figura 1A (aproximadamente 15 mm de largo, 10 mm de ancho, 20 mm de alto, ~1 g de peso). Verifique las especificaciones detalladas de la placa diseñada por computadora y el componente móvil en la Figura 1Ai, ii.
2. Implantación de la guía de electrodos
- Esterilice los kits de cirugía, use guantes estériles y póngase una bata blanca estéril de médico antes de que comience la operación.
- Para controlar el dolor, utilice una inyección subcutánea (s.c.) de meloxicam inyectable (5 mg/kg) para el ratón en una cámara de inducción. A continuación, anestesiar al ratón mediante una inyección intraperitoneal (i.p.) de pentobarbital (80 mg/kg) en una cámara de inducción18,19. Aplique una dosis suplementaria de pentobarbital (20 mg/kg/h) si el reflejo de pellizco del dedo del pie aún está presente.
- Fije el ratón en un aparato estereotáxico y mantenga su temperatura rectal a 37 °C utilizando un controlador de temperatura.
- Aplique el ungüento ocular de tetraciclina en ambos ojos del ratón y vuelva a cambiar los guantes estériles antes de la cirugía.
- Afeitar el pelaje del ratón y desinfectar el sitio quirúrgico con tres rondas alternas de exfoliante betadine y alcohol usando un aplicador estéril con punta de algodón en círculos concéntricos comenzando en el centro y moviéndose hacia afuera (Figura 2i, ii). Haz una pequeña incisión en la línea media (~15 mm) para exponer su cráneo. Inmediatamente, aplique la lidocaína al 1% localmente en los músculos del cuello para aliviar el dolor. Luego, retire el tejido residual con unas tijeras y limpie el cráneo con bastoncillos de algodón recubiertos de solución salina (Figura 2iii).
- Con un microelectrodo de vidrio lleno de tinta, marque las ubicaciones deseadas de la MC bilateral para la implantación (Figura 2iv, v). Con base en un estudio previo 20, las localizaciones de la CM bilateral son las siguientes: 0,74 mm anterior al bregma y1,25 mm lateral a la línea media.
- Implante cuatro tornillos de acero inoxidable (0,8 mm de diámetro) para proteger el sistema de microaccionamiento, y luego vincule todos los tornillos con los electrodos de referencia y rectificados, seguido de una cubierta con cemento dental mixto para formar paredes (Figura 2vi-xi).
- Taladre con cuidado dos agujeros pequeños (~1,5 mm2) con un taladro de cráneo en los lados izquierdo y derecho del cráneo coordinado en las regiones MC (Figura 2xii). Utilizar las coordenadas estereotáxicas de la MC bilateral: 0,74 mm anterior a la bregma, 1,25 mm lateral a la línea media y 0,5 mm ventral a la duramadre.
- Retire la duramadre de los orificios con cuidado con pinzas finas (Figura 2xiii).
- Inserte el sistema de microaccionamiento en el centro de los orificios utilizando un micromanipulador a 10 μm/s (Figura 2xiv-xvii).
- Llene la vaselina en las paredes de cemento dental después de terminar la inserción del sistema de microaccionamiento (Figura 2xviii).
- Unir la placa inferior del sistema de microaccionamiento y las paredes de cemento dental con el cemento dental mezclado (Figura 2xix)
- Lave la incisión con solución salina seguida de un tratamiento local con un gel que contenga clorhidrato de lincomicina y clorhidrato de lidocaína para aliviar el dolor postquirúrgico.
- Enrolle la cinta conductora de lámina de cobre alrededor del sistema de microaccionamiento implantado (Figura 2xx).
- Mueva el ratón a una jaula mantenida a 31-33 °C y controle la recuperación del ratón de la anestesia.
- Deje que los ratones se recuperen durante 1 semana con una alimentación separada. Revise y trate la incisión con 3 días de aplicación continua de un gel que contenga clorhidrato de lincomicina y clorhidrato de lidocaína.
3. Grabación multicanal en el MC bilateral en ratones que se mueven libremente
- Sostén la cabeza de un ratón despierto con ligereza y cuidado. Mueva hacia abajo las guías de electrodos (~0,1 mm de profundidad) girando el tornillo de la parte móvil del sistema de microaccionamiento (Figura 1Aii) con al menos 1 día de anticipación.
- Sostenga la cabeza del ratón despierto con suavidad y cuidado. Conecte el centro de la cabecera y un globo de helio (lleno con aproximadamente 0,02 L de helio) con una rosca para compensar el peso de la cabecera y el sistema de microaccionamiento (Figura 3A, B).
- Capture señales en bruto utilizando los electrodos de grabación y los sistemas multicanal mediante muestreo a 30 kHz en el software de grabación y, a continuación, digitalice utilizando un convertidor digital-analógico (DA) de los sistemas multicanal.
- Extraiga las señales LFP de los datos sin procesar remuestreando a 10 kHz en el software de grabación y, a continuación, utilice un filtro de muesca del software de grabación para eliminar el ruido de línea de 50 Hz.
- Registre datos sin procesar en un estado estable desde un mouse que se mueve libremente durante al menos 60 s. Después de terminar la grabación, retire lentamente la conexión entre el headstage y el sistema de microunidad y devuelva el mouse a su jaula de inicio.
- Almacene los datos registrados en la computadora y analícelos fuera de línea (Figura 4 y Figura 5).
- Después de terminar el experimento, realice la eutanasia según las pautas del instituto y luego confirme la ubicación de los electrodos utilizando la fuente de alimentación a una salida de 3 V para realizar una lesión electrolítica de 1 minuto, seguido de realizar un análisis histológico. Corte el cerebro del ratón en rodajas de 30 μm con un micrótomo de congelación, recoja las secciones de MC y luego capture las imágenes con un microscopio (Figura 3C, D).
4. Clasificación y análisis de picos
- Haga clic en Archivo > Abrir archivos > Nev en el software de clasificación de picos para abrir los datos de picos muestreados a 30 kHz (Figura 4Ai).
- Haga clic en Información para seleccionar el canal sin ordenar y, a continuación, seleccione Ordenar > Cambiar método de ordenación > Usar K-Means. Presione el botón Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting para obtener las unidades ordenadas (Figura 4Aii, iii).
- Haga clic en Archivo > Guardar como, guarde los datos de picos ordenados con una extensión de nombre de archivo .nev y seleccione Archivo > exportar datos por forma de onda para exportar los resultados de PCA con una extensión de nombre de archivo .txt (Figura 4Aiv).
- Haga clic en Archivo > Importar datos > archivo Blackrock en el software para el análisis de datos neurofisiológicos para abrir el archivo de picos ordenado (Figura 4Bi).
- Haga clic en Análisis > Autocorrelogramas para obtener el autocorrelograma de la unidad seleccionada y, a continuación, establezca los parámetros de la siguiente manera: el valor de X Mínimo a −0,05 s, el valor X Máximo a 0,05 s y el valor de Bin a 0,001 (Figura 4Bii, iii).
- Cargue los datos de picos ordenados, haga clic en Análisis > histogramas de intervalo entre picos para obtener el histograma de intervalo entre picos y, a continuación, establezca los parámetros de la siguiente manera: el valor del intervalo mínimo en 0 s, el valor del intervalo máximo en 0,1 s y el valor Bin en 0,001 (Figura 4Biv, v).
- Haga clic en Análisis > Correlatos cruzados para obtener el correlograma cruzado entre dos eventos unitarios ordenados y, a continuación, establezca los eventos y parámetros de referencia de la siguiente manera: el valor mínimo de X en −0,1 s, el valor máximo de X en 0,1 s y el valor de Bin en 0,001 (Figura 4Bvi, vii).
- Haga clic en Resultados > Resultados numéricos para guardar los resultados del autocorrelograma, el histograma de intervalo entre picos y el correlograma cruzado con .xls extensiones de nombre de archivo (Figura 4Bviii, ix). Analice los datos y dibuje el gráfico.
5. Análisis de LFP
- Haga clic en File Import Data > Blackrock File en el software para el análisis de datos neurofisiológicos para abrir los datos de señal continua muestreados a 10 kHz (Figura 5Ai).
- Haga clic en Análisis > espectro para continuo para analizar el espectro de potencia para el LFP del canal seleccionado. Establezca los parámetros de la siguiente manera: el número de valores de frecuencia en 8.192, el valor de los conos múltiples en 3-5, la normalización del porcentaje de la densidad espectral de potencia total (PSD) y el rango de frecuencia de 1 Hz a 100 Hz (Figura 5Aii, iii).
- Haga clic en Análisis > coherencia para continuo para analizar la coherencia de dos LFP desde los lados izquierdo y derecho del MC. Establezca el canal de referencia y los parámetros de la siguiente manera: Calcule los valores de coherencia, el número de valores de frecuencia en 8.192, el valor de los conos múltiples en 3-5 y el rango de frecuencia de 1 Hz a 100 Hz (Figura 5Aiv, v).
- Haga clic en Análisis > Corr. con Variables Cont. para analizar la correlación entre dos LFP de los lados izquierdo y derecho del MC. Establezca el canal de referencia (datos LFP) y los parámetros de la siguiente manera: el valor mínimo X a −0,1 s, el valor máximo X a 0,1 s y el valor Bin a 0,001 (Figura 5Avi, vii).
- Haga clic en Resultados > Resultados numéricos para guardar los resultados de la PSD, la coherencia y la correlación con una extensión de nombre de archivo .xls (Figura 5Aviii, ix).
- Seleccione el canal para el que se deben extraer las trazas representativas para cada banda de frecuencia, haga clic en Editar > Filtrado Digital de Variables Continuas para obtener cada banda de frecuencia y, a continuación, configure los parámetros de la siguiente manera: la Respuesta de Frecuencia del Filtro como Paso de Banda, la Implementación del Filtro en la respuesta de impulso infinito (IIR) Butterworth, y el valor de Orden de Filtro en 2. Por último, establezca el rango de frecuencia de interés (Figura 5Bi-iv).
NOTA: Los rangos de frecuencia utilizados aquí fueron los siguientes: oscilaciones delta (δ, 1-4 Hz), theta (θ, 5-12 Hz), beta (β, 13-30 Hz), gamma baja (γ baja, 30-70 Hz) y gamma alta (γ alta, 70-100 Hz). - Analiza los datos y dibuja el gráfico.
6. Correlaciones entre el pico y la LFP
- Haga clic en Archivo > Importar datos > archivo Blackrock en el software para el análisis de datos neurofisiológicos para abrir los datos de señal continua y los datos de pico.
- Haga clic en Análisis > Análisis de coherencia para analizar la coherencia entre los picos y el LFP del canal seleccionado. Establezca la variable de referencia (sincronización de picos) y los parámetros de la siguiente manera: Calcule los valores de coherencia, el número de valores de frecuencia en 512, el valor de los conos múltiples en 3-5 y el rango de frecuencia de 1 Hz a 100 Hz (Figura 5Ci, ii).
- Haga clic en Resultados > Resultados numéricos para guardar el resultado de la coherencia del campo de pico con una extensión de nombre de archivo .xls (Figura 5Ciii, iv).
- Analiza los datos y dibuja el gráfico.
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Representative Results
Se aplicó un filtro de paso alto (250 Hz) para extraer los picos de varias unidades de las señales sin procesar (Figura 6A). Además, se verificaron las unidades registradas del MC de un ratón normal ordenado por PCA (Figura 7A-D), y se registraron el ancho del valle y la duración de la forma de onda de las unidades en el MC del ratón. Los resultados mostraron que tanto la anchura del valle como la duración de la forma de onda de las neuronas piramidales putativas MC (Pyn) en ratones son mayores que las de las interneuronas putativas (IN) (Figura 7E, F; prueba de Mann-Whitney de dos muestras; para la anchura del valle, Pyn putativa: 0,636 ms ± 0,004 ms, putativo IN: 0,614 ms ± 0,001 ms, p = 0,002; para la duración de la forma de onda, Pyn putativo: 0,095 ms ± 0,004 ms, PIN putativo: 0,054 ms ± 0,002 ms, p = 1,402 x 10−16), correspondientes a las características de Pyn e IN en estudios previos21. También calculamos el correlograma cruzado entre Pyn putativo e IN estableciendo los picos putativos de Pyn como referencia y encontramos un pico positivo a ~18 ms (Figura 7G), lo que indica que el pico putativo de Pyn ocurre antes del pico putativo de IN con una ventana de ~18 ms.
Las trazas representativas de cada banda de frecuencia se filtraron de la LFP mediante el filtro IIR en el software para el análisis de datos neurofisiológicos (Figura 6A). En el análisis de LFP, las LFP de los MC izquierdo y derecho en ratones normales fueron similares en el espectro de potencia, lo que sugiere actividades sincronizadas entre el MC izquierdo y el derecho (Figura 8A, B; prueba de Mann-Whitney de dos muestras; para δ, MC izquierda: 50.71 ± 1.136, MC derecha: 50.47 ± 1.213, p = 0.70; para θ, MC izquierda: 2.197 ± 0.187, MC derecha: 2,068 ± 0,193, p = 0,40; para β, MC izquierda: 0,222 ± 0,058, MC derecha: 0,206 ± 0,055, p = 0,70; para γ baja, MC izquierda: 0,114 ± 0,034, MC derecha: 0,093 ± 0,018, p = 0,70; para γ alta, MC izquierda: 0,054 ± 0,027, MC derecha: 0,04 ± 0,015, p = 0,40). A continuación, calculamos la coherencia y la correlación entre el MC izquierdo y el derecho (Figura 8C,D; el LFP MC izquierdo sigue dentro de una ventana de ~1,2 ms después del MC LFP derecho, −1,167 ms ± 0,667 ms) y calculamos la magnitud del pico putativo de Pyn o IN sincronizado con el LFP (1-100 Hz) en el MC izquierdo de un ratón normal (Figura 8E). Esto mostró una coherencia de γ más baja para el IN putativo en comparación con el Pyn.
Figura 1: Diagrama de los electrodos y del sistema de registro multicanal. (A) Ilustración del sistema de microaccionamiento. Yo. Dibujo y especificación de la placa diseñada por ordenador. ii. Diagrama esquemático del microaccionamiento móvil. (B) Sistema de microaccionamiento y pasos de electrodo único móviles multicanal. Yo. Los alambres de Ni-cromo; ii. Las partes constituyentes del electrodo; iii. Montaje de las placas diseñadas por computadora; iv. Montaje preliminar de los electrodos, incluidos los conectores y los ocho tubos guía; v. El otro lado del micro-drive; vi,vii. Los hilos de Nicromo se cargan sucesivamente en los tubos guía; VIII-X. Cada cable expuesto se entrelaza sucesivamente a cada pasador, seguido de una capa de pintura conductora en cada pasador; XI,XII. Los pasadores están cubiertos con resina epoxi; xiii,xiv. Chapado en oro. (C) Diseño experimental del registro extracelular en el MC de un ratón que se mueve libremente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento quirúrgico paso a paso. i,ii. Afeita el pelaje del ratón y desinfecta el sitio quirúrgico con tres rondas alternas de exfoliante betadine y alcohol. iii. Limpiar el cráneo del ratón. iv. Nivelación. v. Marca la ubicación del cerebro. vi. Marque las posiciones de los tornillos de acero inoxidable. vii. Inserte tornillos de acero inoxidable. viii. Conecte los tornillos con los electrodos de referencia y tierra. ix,x. Mezcla el cemento dental. xi. Construir una pared con cemento dental. XII, XIII. Taladre dos pequeños agujeros por encima del MC bilateral, seguido de la extracción de la duramadre. xiv. Preparar el sistema de microaccionamiento. XV-XIX. Implantar el sistema de microaccionamiento seguido de un tratamiento local con un gel que contenga clorhidrato de lincomicina y clorhidrato de lidocaína para aliviar el dolor postquirúrgico. xx. Proteja el sistema de microaccionamiento con cinta conductora de lámina de cobre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ilustración de una grabación fijada a la cabeza en un ratón consciente . (A) Diagrama esquemático para la grabación en movimiento libre. (B) Detalles de las imágenes de la grabación en movimiento libre. Yo. Forma en planta del sistema de microaccionamiento implantado; ii. Cabecera; III, IV. El sistema de microaccionamiento y el escenario de la cabeza están conectados; v. El globo de helio se aplica para compensar el peso de la cabecera y el sistema de microaccionamiento. (C) Ilustración de la verificación de la ubicación del sitio de registro utilizando una lesión electrolítica. (D) Los sitios de registro marcados por lesiones electrolíticas en el MC de un ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ilustración de la clasificación y el análisis de picos. (A) Los parámetros para agrupar los datos de picos y exportar los resultados. Yo. Importe los datos de picos; ii. Elija el método de clasificación; iii. Ordene los datos de los picos utilizando el algoritmo de κ-medias; iv. Exporte los resultados de la unidad ordenada. (B) El proceso para analizar el histograma del intervalo entre picos, el autocorrelograma y el correlograma cruzado de la unidad ordenada. Yo. Importe los datos de picos ordenados; ii. Realizar el análisis de autocorrelación; iii. Establecer los parámetros para el autocorrelograma; iv. Obtener el histograma del intervalo entre picos; v. Establezca los parámetros para el histograma del intervalo entre picos; vi. Calcular la correlación cruzada entre los picos de las unidades ordenadas; vii. Establecer los parámetros para el correlograma cruzado; VIII,IX. Exporte los resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ilustración del análisis continuo de datos. (A) El proceso y los parámetros para analizar las señales de LFP que se calcularon utilizando el espectro de potencia de los LFP, la coherencia y la correlación entre dos LFP. i. Importar los datos de LFP; ii. Calcular la densidad espectral de potencia para los LFP a partir del MC bilateral; Aiii. Calcular la densidad espectral de potencia para el LFP; iv,v. Calcular la coherencia entre las LFP; vi,vii. Calcule la correlación entre dos LFP. viii,ix. Exporte los resultados. (B) El proceso para filtrar cada rango de frecuencia de la señal LFP. i. Extraer las diferentes bandas de frecuencias de los datos de la LFP; II,III. Ver las LFP filtradas; iv. Guarde los LFP filtrados como un metarchivo mejorado. (C) El proceso de análisis de la coherencia entre los picos neuronales y la LFP. I,ii. Calcular la coherencia entre el LFP y los picos ordenados; III, IV. Exporte los resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Trazas representativas de las señales registradas. El pico se filtró de paso alto a 250 Hz a partir de los datos brutos muestreados a 30 kHz. El LFP fueron los datos brutos muestreados a 10 kHz. δ fue el paso de banda de frecuencia delta filtrado a 1-4 Hz desde el LFP. θ era la banda de frecuencia theta filtrada a 5-12 Hz desde el LFP. β fue la banda de frecuencia beta filtrada a 13-30 Hz desde el LFP. La γ baja fue la banda de baja frecuencia gamma filtrada a 30-70 Hz desde el LFP. La γ alta fue la banda de alta frecuencia gamma filtrada a 70-100 Hz desde el LFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Características de las unidades clasificadas y su patrón de disparo. (A,B) Las unidades clasificadas se agruparon mediante análisis de componentes principales (PCA) del mismo electrodo. (C,D) Autocorrelaciones (arriba) e histogramas de intervalo entre picos (abajo) para una neurona excitadora putativa (Pyn) y una neurona inhibidora putativa (IN). (E) La anchura del valle del Pyn putativo fue significativamente mayor que la del IN putativo (Pyn putativo: n = 1.055 espigas, putativo IN: n = 1.985 espigas). (F) La duración de la forma de onda del Pyn putativo fue más fuerte que la del IN putativo (Pyn putativo: n = 1.005 picos, IN putativo: n = 1.059 picos). (G) La correlación cruzada entre el supuesto Pyn e IN. Análisis estadístico con la prueba de Mann-Whitney. Todos los datos se presentan como media ± error estándar de la media, **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Análisis de dos LFPs del MC bilateral y la coherencia entre los eventos de pico y el LFP en ratones. (A,B) Espectros de potencia normalizados del MC bilateral en cada banda de frecuencia en ratones (n = 3). (C) La curva de la coherencia de dos LFP entre el MC izquierdo y el derecho (n = 3). (D) La curva de correlación cruzada de dos LFP que muestra una correlación entre el MC izquierdo y derecho a ±100 ms de desfases de tiempo (n = 3). (E) La curva de coherencia del campo de picos en el MC de un ratón. Análisis estadístico con la prueba de Mann-Whitney. Todos los datos se presentan como media ± error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La grabación multicanal en ratones que se mueven libremente se ha considerado una tecnología útil en los estudios de neurociencia, pero sigue siendo bastante difícil para los principiantes registrar y analizar las señales. En el presente estudio, proporcionamos pautas simplificadas para la fabricación de sistemas de microaccionamiento y la implantación de electrodos, así como procedimientos simplificados para capturar y analizar las señales eléctricas a través del software de clasificación de picos y el software para el análisis de datos neurofisiológicos.
Dado que la calidad de un sistema de microaccionamiento hecho a medida contribuye en gran medida a la adquisición de señales estables y cualitativas en ratones de movimiento libre14,15,16,17, diseñamos y utilizamos una estructura más robusta y liviana para el sistema de microaccionamiento en este estudio, y los principiantes pueden seguir fácil y claramente los pasos de fabricación para construir el sistema de microaccionamiento. Además, la estructura del sistema de microaccionamiento diseñado involucra materiales de bajo costo que están fácilmente disponibles en ferreterías, a diferencia de los sistemas de microaccionamiento más grandes y pesados utilizados en estudios previos14,15. Este sistema de microaccionamiento puede disminuir las molestias y resistir el impacto de los ratones que se mueven libremente durante las grabaciones. Mientras tanto, mejoramos aún más el tamaño y la forma del sistema de microaccionamiento, lo que podría ser útil para los principiantes al permitirles observar, insertar y, por lo tanto, mover las puntas de los electrodos hacia el cerebro durante la cirugía. Además, la estructura de portaobjetos simple aplicada en el sistema de microaccionamiento se progresa con precisión en el cerebro utilizando un tornillo de alta precisión, lo que significa que este sistema proporciona un control preciso en la medición de múltiples capas del área cerebral objetivo; De hecho, esto es extremadamente importante para capturar señales extracelulares en un animal que se mueve libremente durante un período experimental a largo plazo. Sobre todo, las ventajas de este sistema de microaccionamiento son su simplicidad y flexibilidad; Sin embargo, el menor número de canales y el uso de una matriz de electrodos individuales deberían mejorarse aún más en una nueva versión.
También hay varias mejoras en el presente estudio que vale la pena señalar. Debido al tamaño más pequeño y a la forma modificada del sistema de microaccionamiento en comparación con los sistemas anteriores, se proporcionó una visión más amplia y un espacio de trabajo más amplio para la operación. Además, las paredes del cráneo del ratón estaban hechas de cemento dental y tornillos de acero inoxidable, lo que permitía que el sistema de microaccionamiento se fijara fuertemente a la cabeza del ratón. Además, las paredes de cemento dental permitían la carga de vaselina para cubrir los agujeros en el cráneo del ratón antes de verter el cemento dental, lo que tenía efectos protectores sobre la superficie del cerebro sin la duramadre y la parte móvil del sistema de microaccionamiento. Juntas, estas mejoras son útiles, ya que permiten a los principiantes implantar el sistema de microaccionamiento de forma fácil y segura en el cerebro del ratón.
En las grabaciones extracelulares multicanal, se cree ampliamente que otra dificultad radica en el análisis de las señales grabadas utilizando un lenguaje de programación matemáticamente complejo17. Por lo tanto, proporcionamos pautas claras para los principiantes, particularmente en términos de clasificación de picos, análisis de datos LFP y cálculo de la relación entre ellos utilizando un software de uso común en electrofisiología. Además, sugerimos encarecidamente que la unidad registrada de un ensayo de un solo electrodo agrupada por métodos de PCA debe tener un alto número de características para el análisis, como los intervalos neuronales entre picos ordenados y el ancho entre su valle y pico, ya que estos valores son útiles para que los principiantes reduzcan el sesgo cuando las unidades se agrupan automáticamente con un software de clasificación fuera de línea. Es importante destacar que la relación entre las señales que incluyen picos y el LFP es fundamental para mediar múltiples comportamientos. También proporcionamos una serie de ilustraciones sencillas para medir las correlaciones espiga-espiga, LFP-LFP y espiga-LFP utilizando scripts creíbles en el software para el análisis de datos neurofisiológicos; Estas ilustraciones permitirán a los principiantes comenzar a procesar y analizar las señales grabadas rápidamente en ratones que se mueven libremente. Además, los resultados y los datos tratados con este software patentado se pueden utilizar junto con una caja de herramientas de código abierto como Fieldtrip para realizar análisis adicionales por adelantado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31871170, 32170950 y 31970915), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (2021A1515010804 y 2023A1515010899), la Fundación de Ciencias Naturales de Guangdong para el Proyecto de Cultivo Mayor (2018B030336001) y la Subvención de Guangdong: Tecnologías clave para el tratamiento de trastornos cerebrales (2018B030332001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
