Summary
Protokollet beskriver metodiken för extracellulär registrering i den motoriska cortex (MC) för att avslöja extracellulära elektrofysiologiska egenskaper hos fritt rörliga medvetna möss, samt dataanalys av lokala fältpotentialer (LFP) och spikar, vilket är användbart för att utvärdera nätverkets neurala aktivitet som ligger till grund för beteenden av intresse.
Abstract
Protokollet syftar till att avslöja egenskaperna hos neuronal avfyrning och nätverkslokala fältpotentialer (LFP) i möss som beter sig som utför specifika uppgifter genom att korrelera de elektrofysiologiska signalerna med spontant och/eller specifikt beteende. Denna teknik representerar ett värdefullt verktyg för att studera den neuronala nätverksaktivitet som ligger bakom dessa beteenden. Artikeln ger en detaljerad och komplett procedur för elektrodimplantation och därav följande extracellulär registrering i fritt rörliga medvetna möss. Studien inkluderar en detaljerad metod för att implantera mikroelektrodmatriserna, fånga LFP och neuronala spiksignaler i motorcortex (MC) med hjälp av ett flerkanalssystem och den efterföljande offline-dataanalysen. Fördelen med flerkanalsinspelning hos medvetna djur är att ett större antal spikande neuroner och neuronala subtyper kan erhållas och jämföras, vilket möjliggör utvärdering av förhållandet mellan ett specifikt beteende och de associerade elektrofysiologiska signalerna. Framför allt kan den flerkanaliga extracellulära inspelningstekniken och dataanalysproceduren som beskrivs i den aktuella studien tillämpas på andra hjärnområden när man utför experiment på möss som beter sig.
Introduction
Den lokala fältpotentialen (LFP), en viktig komponent i extracellulära signaler, återspeglar den synaptiska aktiviteten hos stora populationer av neuroner, som bildar den neurala koden för flera beteenden1. Spikar som genereras av neuronal aktivitet anses bidra till LFP och är viktiga för neural kodning2. Förändringar i spikar och LFP har visat sig förmedla flera hjärnsjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, såväl som känslor som rädsla, etc.3,4. Det är värt att notera att många studier har visat att spikaktiviteten skiljer sig avsevärt mellan vaket och bedövat tillstånd hos djur5. Även om inspelningar i sövda djur erbjuder en möjlighet att bedöma LFP med minimala artefakter i högt definierade kortikala synkroniseringstillstånd, skiljer sig resultaten till viss del från vad som kan hittas hos vakna försökspersoner 6,7,8. Således är det mer meningsfullt att detektera neural aktivitet över långa tidsskalor och stora rumsliga skalor vid olika sjukdomar i ett vaket hjärntillstånd med hjälp av elektroder implanterade i hjärnan. Detta manuskript ger information för nybörjare om hur man gör mikrodrivsystemet och ställer in parametrarna med hjälp av vanlig programvara för att beräkna spik- och LFP-signalerna på ett snabbt och enkelt sätt för att få igång inspelningen och analysen.
Även om den icke-invasiva registreringen av hjärnfunktioner, t.ex. genom att använda elektroencefalogram (EEG) och händelserelaterade potentialer (ERP) som registreras från skalpen, har använts i stor utsträckning i studier på människor och gnagare, har EEG- och ERP-data låga rumsliga och tidsmässiga egenskaper och kan därför inte detektera de exakta signalerna som produceras av närliggande dendritisk synaptisk aktivitet inom ett specifikt hjärnområde1. För närvarande, genom att dra nytta av flerkanalsregistrering hos medvetna djur, kan neural aktivitet i de djupare lagren av hjärnan registreras kroniskt och progressivt genom att implantera ett mikrodrivsystem i hjärnan på primater eller gnagare under flera beteendetester 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . I korthet kan forskare konstruera ett mikrodrivsystem som kan användas för oberoende positionering av elektroder eller tetroder för att rikta in sig på olika delar av hjärnan10,11. Till exempel beskrev Chang et al. tekniker för att registrera spikar och LFP:er i möss genom att sätta ihop en lätt och kompakt mikroenhet12. Dessutom finns mikrobearbetade kiselsonder med specialtillverkade tillbehörskomponenter kommersiellt tillgängliga för registrering av flera enskilda neuroner och LFP:er hos gnagare under beteendeuppgifter13. Även om olika konstruktioner har använts för att montera mikrodrivsystem, har dessa fortfarande begränsad framgång när det gäller komplexiteten och vikten hos hela mikrodrivsystemet. Till exempel visade Lansink et al. ett flerkanaligt mikrodrivsystem med en komplex struktur för inspelning från en enda hjärnregion14. Sato et al. rapporterade om ett flerkanaligt mikrodrivsystem som visade en automatisk hydraulisk positioneringsfunktion15. De största nackdelarna med dessa mikrodrivsystem är att de är för tunga för att möss ska kunna röra sig fritt och är svåra att montera för nybörjare. Även om flerkanalig extracellulär inspelning har visat sig vara en lämplig och effektiv teknik för att mäta neural aktivitet under beteendetester, är det inte lätt för nybörjare att spela in och analysera signalerna som förvärvas av det komplexa mikrodrivsystemet. Med tanke på att det är svårt att få igång hela driftprocessen för flerkanalig extracellulär inspelning och dataanalys i fritt rörliga möss16,17, presenterar denna artikel förenklade riktlinjer för att introducera den detaljerade processen för att göra mikrodrivsystemet med hjälp av allmänt tillgängliga komponenter och inställningar; parametrarna i den vanliga programvaran för att beräkna spik- och LFP-signalerna på ett snabbt och enkelt sätt tillhandahålls också. Dessutom, i detta protokoll, kan musen röra sig fritt på grund av användningen av en heliumballong, vilket bidrar till att kompensera vikten av huvudstage och mikrodrivsystem. Generellt beskriver vi i denna studie hur man enkelt bygger ett mikrodrivsystem och optimerar processerna för registrering och dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss erhölls kommersiellt och hölls i en 12 timmars ljus/12 timmars mörkercykel (ljuset tändes kl. 08:00 lokal tid) vid en rumstemperatur på 22-25 °C och en relativ luftfuktighet på 50%-60%. Mössen hade tillgång till kontinuerlig tillförsel av mat och vatten. Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur vid South China Normal University och godkändes av Institutional Animal Ethics Committee. C57BL/6J-hanmöss i åldern 3-5 månader användes för experimenten.
1. Montering av mikrodrivsystem
- Anslut två datordesignade kort med två stullar och en skruv som håller den rörliga mikroenheten och fäst kontakten på ett kort (Figur 1A, Bi-iii). Driv mikroenheten genom att vrida en skruv (0.5 mm/cirkel).
- Se till att mikroenheten kan bära två uppsättningar med åtta styrrör (~3 cm långa, ~50 μm innerdiameter, ~125 μm ytterdiameter) för varje sida av MC-området och skär den sedan till samma längd (minst 15 mm; Figur 1Biv, v).
- Klipp 16 Ni-kromtrådar (~5 cm långa) med en diameter på 35 μm och ladda dem sedan successivt i styrrören, följt av att applicera limmet för att fixera dem (Figur 1Bi, vi, vii).
- Skala av trådisoleringen, tvinna successivt varje exponerad tråd till varje stift från kontakten enligt kanalkartan, såväl som referens- och jordelektroderna, och täck sedan långsamt ledande färg på varje stift (Figur 1Bviii-x).
- Täck stiften med epoxiharts (Figur 1Axi, xii) och utför sedan guldplätering via en impedanstestare för att minska impedansen på elektrodspetsarna till ~350 kOhm (Figur 1Bxiii, xiv). Ställ in parametrarna för impedanstestaren enligt följande: −10.08 μA likström i 1 s med guldpläteringslösning, inklusive 5 mM PtCl4.
- Flytta slutligen mikroenheten till toppen genom att vrida på en skruv. Kontrollera den totala storleken på mikrodrivsystemet modifierat enligt figur 1A (cirka 15 mm lång, 10 mm bredd, 20 mm höjd, ~1 g vikt). Kontrollera de detaljerade specifikationerna för det datorkonstruerade kortet och den rörliga komponenten i figur 1Ai, ii.
2. Implantation av elektrodmatris
- Sterilisera operationskiten, använd sterila handskar och ta på dig en läkares sterila vita rock innan operationen börjar.
- För att hantera smärtan, använd subkutan injektion av meloxikam injicerbart (5 mg/kg) för musen i en induktionskammare. Bedöva sedan musen genom en intraperitoneal (i.p.) injektion av pentobarbital (80 mg/kg) i en induktionskammare18,19. Applicera en extra dos pentobarbital (20 mg/kg/timme) om tåklämningsreflexen fortfarande är närvarande.
- Fixera musen i en stereotaktisk apparat och håll dess rektala temperatur på 37 °C med hjälp av en temperaturregulator.
- Applicera tetracyklin ögonsalva i musens båda ögon och byt sterila handskar igen före operationen.
- Raka musens päls och desinficera operationsområdet med tre omväxlande omgångar betadinskrubb och alkohol med hjälp av en steril applikator med bomullsspets i koncentriska cirklar som börjar i mitten och rör sig utåt (Figur 2i, ii). Gör ett litet snitt i mittlinjen (~15 mm) för att exponera skallen. Applicera omedelbart 1% lidokain lokalt på nackmusklerna för smärtlindring. Ta sedan bort den kvarvarande vävnaden med en sax och rengör skallen med saltlösning belagda bomullspinnar (Figur 2iii).
- Använd en glasmikroelektrod fylld med bläck och markera de önskade platserna för den bilaterala MC för implantation (Figur 2iv, v). Baserat på en tidigare studie20 är placeringen av den bilaterala MC följande: 0,74 mm framför bregma och 1,25 mm lateralt till mittlinjen.
- Implantera fyra skruvar av rostfritt stål (0,8 mm i diameter) för att skydda mikrodrivsystemet och koppla sedan ihop alla skruvar med referens- och jordelektroderna, följt av täckning med blandad tandcement för att bilda väggar (Figur 2vi-xi).
- Borra försiktigt två små hål (~1,5 mm2) med en skallborr på både vänster och höger sida av den koordinerade skallen i MC-regionerna (Figur 2xii). Använd de stereotaktiska koordinaterna för den bilaterala MC: 0,74 mm framför bregma, 1,25 mm lateralt om mittlinjen och 0,5 mm ventralt till dura.
- Ta försiktigt bort dura mater från hålen med en fin pincett (Figur 2xiii).
- Sätt in mikrodrivsystemet i mitten av hålen med hjälp av en mikromanipulator vid 10 μm/s (Figur 2xiv-xvii).
- Fyll vaselinen i dentalcementväggarna efter att ha avslutat införandet av mikrodrivsystemet (Figur 2xviii).
- Sammanfoga mikrodrivsystemets bottenplatta och dentalcementväggarna med den blandade tandcementen (Figur 2xix)
- Tvätta snittet med koksaltlösning följt av lokal behandling med en gel som innehåller linkomycinhydroklorid och lidokainhydroklorid för att lindra postoperativ smärta.
- Linda den ledande kopparfolietejpen runt det implanterade mikrodrivsystemet (Figur 2xx).
- Flytta musen till en bur som hålls vid 31-33 °C och övervaka musens återhämtning från anestesin.
- Låt mössen återhämta sig i 1 vecka med separat utfodring. Kontrollera och behandla snittet med 3 dagars kontinuerlig applicering av en gel som innehåller linkomycinhydroklorid och lidokainhydroklorid.
3. Flerkanalig inspelning i den bilaterala MC hos möss som rör sig fritt
- Håll huvudet på en vaken mus lätt och försiktigt. Flytta ner elektrodmatriserna (~0,1 mm djup) genom att vrida skruven på den rörliga delen av mikrodrivsystemet (Figur 1Aii) minst 1 dag i förväg.
- Håll huvudet på den vakna musen lätt och försiktigt. Länka mitten av huvudsteget och en heliumballong (fylld med cirka 0,02 liter helium) med en tråd för att kompensera vikten av huvudsteget och mikrodrivsystemet (figur 3A, B).
- Fånga råa signaler med hjälp av inspelningselektroderna och flerkanalssystemen genom att sampla vid 30 kHz i inspelningsprogramvaran och digitalisera sedan med hjälp av en digital-analog (DA) omvandlare från flerkanalssystemen.
- Extrahera LFP-signalerna från rådata genom att sampla om vid 10 kHz i inspelningsprogramvaran och använd sedan ett notchfilter från inspelningsprogramvaran för att ta bort 50 Hz linjebruset.
- Spela in rådata i stabilt tillstånd från en mus som rör sig fritt i minst 60 sekunder. När du är klar med inspelningen, ta långsamt bort anslutningen mellan headstage och mikrodrivsystemet och sätt tillbaka musen till sin hembur.
- Lagra inspelade data i datorn och analysera dem offline (figur 4 och figur 5).
- Efter avslutat experiment, utför eutanasi enligt institutets riktlinjer och bekräfta sedan elektrodernas placering genom att använda strömförsörjningen vid 3 V-utgång för att utföra en elektrolytisk lesion på 1 minut, följt av att utföra histologisk analys. Skär musens hjärna i 30 μm skivor med hjälp av en frysmikrotom, samla MC-sektionerna och ta sedan bilderna med ett mikroskop (figur 3C, D).
4. Spiksortering och analys
- Klicka på Arkiv > Öppna > Nev-filer i spiksorteringsprogrammet för att öppna toppdata som samplas vid 30 kHz (figur 4Ai).
- Klicka på Info för att välja den osorterade kanalen och välj sedan Sortera > Ändra sorteringsmetod > Använd K-Means. Tryck på knappen Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting för att få fram de sorterade enheterna (Figur 4Aii, iii).
- Klicka på Arkiv > Spara som, spara sorterade spikdata med filnamnstillägget .nev och välj Arkiv > exportera data per vågform för att exportera PCA-resultaten med ett .txt filnamnstillägg (Figur 4Aiv).
- Klicka på Arkiv > Importera data > Blackrock-fil i programvaran för neurofysiologisk dataanalys för att öppna den sorterade spikfilen (Figur 4Bi).
- Klicka på Analys > Autokorrelogram för att få autokorrelogram för den valda enheten och ställ sedan in parametrarna enligt följande: X-minimivärdet vid −0.05 s, X-maximumvärdet vid 0.05 s och Bin-värdet vid 0.001 (Figur 4Bii, iii).
- Ladda de sorterade toppdata, klicka på Analys > Interspike Interval Histogram för att hämta histogrammet mellan toppintervall och ställ sedan in parametrarna enligt följande: Min. intervallvärde vid 0 s, Max. intervallvärde vid 0.1 s och Bin-värde vid 0.001 (Figur 4Biv, v).
- Klicka på Analys > Crosscorrelograms för att få korskorrelogram mellan två sorterade enhetshändelser och ställ sedan in referenshändelserna och parametrarna enligt följande: X-minimivärdet vid −0,1 s, X-maximumvärdet vid 0,1 s och Bin-värdet vid 0,001 (Figur 4Bvi, vii).
- Klicka på Results > Numerical Results för att spara resultaten av autocorrelogram, inter-spike inter-range histogram och cross-correlogram med .xls filnamnstillägg (Figur 4Bviii, ix). Analysera data och rita grafen.
5. Analys av LFP
- Klicka på File Import Data > Blackrock File i programvaran för den neurofysiologiska dataanalysen för att öppna kontinuerliga signaldata som samplas vid 10 kHz (Figur 5Ai).
- Klicka på Analysis > Spectrum for Continuous för att analysera effektspektrumet för LFP från den valda kanalen. Ställ in parametrarna enligt följande: antalet frekvensvärden vid 8,192, värdet för flera avsmalningar vid 3-5, normaliseringen av procententage av den totala effektspektraltätheten (PSD) och frekvensområdet från 1 Hz till 100 Hz (figur 5Aii, iii).
- Klicka på Analys > koherens för kontinuerlig för att analysera koherensen för två LFP:er från vänster och höger sida av MC. Ställ in referenskanalen och parametrarna enligt följande: Beräkna vid koherensvärden, antalet frekvensvärden vid 8,192, värdet för multipla avsmalnande vid 3-5 och frekvensområdet från 1 Hz till 100 Hz (figur 5Aiv, v).
- Klicka på Analys > korr. med forts. variabler för att analysera korrelationen mellan två LFP:er från vänster och höger sida av MC. Ställ in referenskanalen (LFP-data) och parametrar enligt följande: X-minimivärdet vid −0,1 s, X-maximumvärdet vid 0,1 s och Bin-värdet vid 0,001 (Figur 5Avi, vii).
- Klicka på Results > Numerical Results för att spara resultaten av PSD, koherens och korrelation med ett .xls filnamnstillägg (Figur 5Aviii, ix).
- Välj den kanal som de representativa spåren behöver extraheras för varje frekvensband, klicka på Redigera > digital filtrering av kontinuerliga variabler för att få varje frekvensband och ställ sedan in parametrarna enligt följande: Filterfrekvenssvar som bandpass, filterimplementering vid oändligt impulssvar (IIR) Butterworth och filterordervärdet vid 2. Ställ slutligen in frekvensområdet av intresse (Figur 5Bi-iv).
OBS: Frekvensområdena som användes här var följande: delta (δ, 1-4 Hz), theta (θ, 5-12 Hz), beta (β, 13-30 Hz), låg gamma (låg γ, 30-70 Hz) och hög gamma (hög γ, 70-100 Hz) svängningar. - Analysera data och rita grafen.
6. Korrelationer mellan spiken och LFP
- Klicka på Arkiv > importera data > Blackrock-fil i programvaran för den neurofysiologiska dataanalysenför att öppna kontinuerliga signaldata och spikdata.
- Klicka på Analys > Koherensanalys för att analysera koherensen mellan topparna och LFP från den valda kanalen. Ställ in referensvariabeln (spiktiming) och parametrar enligt följande: Beräkna vid koherensvärden, antalet frekvensvärden vid 512, värdet för multipla avsmalningar vid 3-5 och frekvensområdet från 1 Hz till 100 Hz (figur 5Ci, ii).
- Klicka på Results > Numerical Results för att spara resultatet av spikfältets koherens med ett .xls filnamnstillägg (figur 5Ciii, iv).
- Analysera data och rita grafen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett högpassfilter (250 Hz) användes för att extrahera spikarna med flera enheter från råsignalerna (figur 6A). Vidare verifierades de registrerade enheterna från MC för en normal mus sorterade efter PCA (Figur 7A-D), och dalbredden och vågformsvaraktigheten för enheterna i MC för musen registrerades. Resultaten visade att både dalbredden och vågformsvaraktigheten för MC:s förmodade pyramidala neuroner (Pyn) hos möss är högre än de för de förmodade interneuronerna (IN) (Figur 7E,F; två Mann-Whitney-test; för dalbredd, förmodad Pyn: 0,636 ms ± 0,004 ms, förmodad IN: 0,614 ms ± 0,001 ms, p = 0,002; för vågformsvaraktighet, förmodad Pyn: 0,095 ms ± 0,004 ms, förmodad IN: 0,054 ms ± 0,002 ms, p = 1,402 x 10−16), motsvarande egenskaperna hos Pyn och IN i tidigare studier21. Vi beräknade också korskorrelogramet mellan förmodade Pyn och IN genom att ställa in de förmodade Pyn-spikarna som referens och fann en positiv topp vid ~18 ms (Figur 7G), vilket indikerar att den förmodade Pyn-spikningen inträffar före den förmodade IN-spikningen med ett fönster på ~18 ms.
Representativa spår av varje frekvensband filtrerades från LFP med IIR-filtret i programvaran för den neurofysiologiska dataanalysen (Figur 6A). I LFP-analysen var LFP:erna för vänster och höger MC hos normala möss likartade i effektspektrumet, vilket tyder på synkroniserade aktiviteter mellan vänster och höger MC (Figur 8A,B; två Mann-Whitney-test; för δ, vänster MC: 50,71 ± 1,136, höger MC: 50,47 ± 1,213, p = 0,70; för θ, vänster MC: 2,197 ± 0,187, höger MC: 2,068 ± 0,193, p = 0,40; för β, vänster MC: 0,222 ± 0,058, höger MC: 0,206 ± 0,055, p = 0,70; för låg γ, vänster MC: 0,114 ± 0,034, höger MC: 0,093 ± 0,018, p = 0,70; för hög γ, vänster MC: 0,054 ± 0,027, höger MC: 0,04 ± 0,015, p = 0,40). Vi beräknade sedan koherensen och korrelationen mellan vänster och höger MC (Figur 8C,D; vänster MC LFP följer inom ett fönster på ~1,2 ms efter höger MC LFP, −1,167 ms ± 0,667 ms) och beräknade storleken på den förmodade Pyn- eller IN-spikningen synkroniserad med LFP (1-100 Hz) i vänster MC på en normal mus (Figur 8E). Detta visade en starkare låg γ koherens för det förmodade IN jämfört med Pyn.
Figur 1: Diagram över elektroderna och det flerkanaliga inspelningssystemet. (A) Illustration av mikrodrivsystemet. jag. Ritning och specifikation av den datordesignade brädan. ii. Schematisk bild av den rörliga mikroenheten. (B) Mikrodrivsystem och flerkanaliga rörliga steg med en elektrod. jag. Ni-kromtrådarna; ii. Elektrodens beståndsdelar. iii. Montering av de datorkonstruerade kretskorten. iv. Preliminär montering av elektroderna, inklusive kontaktdonen och åtta styrrör; v. Den andra sidan av mikroenheten; VI,VII. Ni-kromtrådarna laddas successivt in i styrrören; VIII-X. Varje exponerad tråd är successivt tvinnad till varje stift, följt av beläggning av ledande färg på varje stift; xi,xii. Stiften är täckta med epoxiharts; XIII, XIV. Guldplätering. (C) Experimentell design av den extracellulära inspelningen i MC av en mus som rör sig fritt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kirurgiskt ingrepp steg för steg. i,ii. Raka musens päls och desinficera operationsområdet med tre omväxlande omgångar betadinskrubb och alkohol. iii. Rengör skallen på musen. iv. Nivellering. v. Markera hjärnans placering. vi. Markera positionerna för skruvar av rostfritt stål. vii. Sätt i skruvar av rostfritt stål. viii. Koppla ihop skruvarna med referens- och jordelektroderna. ix,x. Blanda tandcementen. xi. Bygg en vägg med tandcement. XII, XIII. Borra två små hål ovanför den bilaterala MC:n, följt av att ta bort dura mater. xiv. Förbered mikrodrivsystemet. XV-XIX. Implantera mikrodrivsystemet följt av lokal behandling med en gel som innehåller linkomycinhydroklorid och lidokainhydroklorid för att lindra postoperativ smärta. xx. Skydda mikrodrivsystemet med ledande kopparfolietejp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Illustration av en huvudfixerad inspelning i en medveten mus . (A) Schematisk bild för fri inspelning. (B) Uppgifter om bilderna från den fritt rörliga inspelningen. jag. Planform för det implanterade mikrodrivsystemet; ii. Headstage; III, IV. Mikrodrivsystemet och huvudsteget är anslutna; v. Heliumballongen appliceras för att kompensera vikten av huvudsteget och mikrodrivsystemet. C) Illustration av kontroll av inspelningsplatsens läge med hjälp av en elektrolytisk lesion. (D) Inspelningsplatser som är märkta med elektrolytiska lesioner i MC hos en mus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Illustration av toppsortering och analys . (A) Parametrarna för klustring av toppdata och export av resultaten. jag. Importera toppdata; ii. Välj sorteringsmetod; iii. Sortera spikdata med hjälp av κ-medelvärdesalgoritmen; iv . Exportera resultaten från den sorterade enheten. (B) Processen för analys av histogrammet mellan spikintervallen, autokorrelogram och korskorrelogram för den sorterade enheten. jag. Importera sorterade toppdata. ii . Genomföra autokorrelationsanalysen. iii . Ställ in parametrarna för autocorrelogram. iv . Erhåll histogrammet mellan spikintervallen. v. Ställ in parametrarna för histogrammet mellan toppintervallen. vi . Beräkna korskorrelationen mellan topparna från de sorterade enheterna. vii . Ställ in parametrarna för korskorrelogramen. VIII, IX. Exportera resultaten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Illustration av kontinuerlig dataanalys. (A) Processen och parametrarna för analys av LFP-signalerna som beräknades med hjälp av effektspektrumet för LFP:erna, koherens och korrelation mellan två LFP:er. i. Importera LFP-data. ii. Beräkna effektspektraltätheten för LFP:erna från den bilaterala MC. Aiii. Beräkna effektspektraltätheten för LFP; iv,v. Beräkna koherensen mellan LFP. VI,VII. Beräkna korrelationen mellan två LFP:er. viii,ix. Exportera resultaten. (B) Processen för filtrering av varje frekvensområde från LFP-signalen. i) Extrahera de olika frekvensbanden från LFP-data. II, III. Visa de filtrerade LFP:erna; iv. Spara de filtrerade LFP:erna som en förbättrad metafil. (C) Processen för att analysera koherensen mellan de neuronala spikarna och LFP. i, ii. Beräkna koherensen mellan LFP och sorterade toppar; III, IV. Exportera resultaten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Representativa spår av inspelade signaler. Spiken högpassfiltrerades vid 250 Hz från rådata som samplades vid 30 kHz. LFP var rådata som samplades vid 10 kHz. δ var deltafrekvensbandets bandpassfiltrerat vid 1-4 Hz från LFP. θ var theta-frekvensbandet filtrerat vid 5-12 Hz från LFP. β var betafrekvensbandet filtrerat vid 13-30 Hz från LFP. Låg γ var det låga gammafrekvensbandet filtrerat vid 30-70 Hz från LFP. Hög γ var det höga gammafrekvensbandet filtrerat vid 70-100 Hz från LFP. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Egenskaper hos de sorterade enheterna och deras avfyrningsmönster. (A,B) De sorterade enheterna grupperades med hjälp av principalkomponentanalys (PCA) från samma elektrod. (C,D) Autokorrelationer (överst) och histogram mellan spikintervall (nederst) för en förmodad excitatorisk neuron (Pyn) och en förmodad hämmande neuron (IN). (E) Dalbredden för den förmodade Pyn var signifikant högre än den för den förmodade IN (förmodade Pyn: n = 1 055 spikar, förmodade IN: n = 1 985 spikar). (F) Vågformsvaraktigheten för den förmodade Pyn var starkare än för den förmodade IN (förmodad Pyn: n = 1 005 spikar, förmodad IN: n = 1 059 spikar). (G) Korskorrelationen mellan den förmodade Pyn och IN. Statistisk analys med ett Mann-Whitney-test. Alla data presenteras som medelvärde ± medelfel av medelvärdet, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Analys av två LFP från den bilaterala MC och koherensen mellan spikhändelser och LFP hos möss. (A,B) Normaliserade effektspektrum för den bilaterala MC vid varje frekvensband hos möss (n = 3). (C) Kurvan för koherensen mellan två LFP mellan vänster och höger MC (n = 3). (D) Korskorkorrelationskurvan för två LFP:er som visar en korrelation mellan vänster och höger MC vid ±100 ms tidsfördröjningar (n = 3). (E) Kurvan för spikfältets koherens i MC hos en mus. Statistisk analys med ett Mann-Whitney-test. Alla data presenteras som medelvärde ± medelfel för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flerkanalsinspelning i möss som rör sig fritt har ansetts vara en användbar teknik inom neurovetenskapliga studier, men det är fortfarande ganska utmanande för nybörjare att spela in och analysera signalerna. I den aktuella studien ger vi förenklade riktlinjer för att göra mikrodrivsystem och utföra elektrodimplantation, samt förenklade procedurer för att fånga och analysera de elektriska signalerna via spiksorteringsprogramvara och programvara för neurofysiologisk dataanalys.
Med tanke på att kvaliteten på ett skräddarsytt mikrodrivsystem i hög grad bidrar till insamlingen av stabila och kvalitativa signaler i fritt rörliga möss14,15,16,17, designade och använde vi en mer robust och lätt struktur för mikrodrivsystemet i denna studie, och nybörjare kan enkelt och tydligt följa tillverkningsstegen för att konstruera mikrodrivsystemet. Dessutom innehåller strukturen hos det designade mikrodrivsystemet billiga material som är lätt tillgängliga i järnaffärer, till skillnad från de större, tyngre mikrodrivsystem som använts i tidigare studier14,15. Detta mikrodrivsystem kan minska obehag och motstå stötar från möss som rör sig fritt under inspelningar. Under tiden förbättrade vi storleken och formen på mikrodrivsystemet ytterligare, vilket kan vara till hjälp för nybörjare genom att låta dem observera, föra in och därmed flytta elektrodspetsarna in i hjärnan under operationen. Vidare utvecklas den enkla glidstrukturen som appliceras i mikrodrivsystemet exakt i hjärnan med hjälp av en högprecisionsskruv, vilket innebär att detta system ger exakt kontroll vid mätning av flera lager av det riktade hjärnområdet; Detta är faktiskt extremt viktigt för att fånga extracellulära signaler i ett djur som rör sig fritt under en långvarig experimentperiod. Fördelarna med detta mikrodrivsystem är framför allt dess enkelhet och flexibilitet; Det mindre antalet kanaler och användningen av en rad enstaka elektroder bör dock förbättras ytterligare i en ny version.
Det finns också flera förbättringar i den aktuella studien som är värda att notera. På grund av den mindre storleken och den modifierade formen på mikrodrivsystemet jämfört med tidigare system, tillhandahölls en bredare vision och ett bredare arbetsutrymme för verksamheten. Dessutom var väggarna på musens skalle gjorda av tandcement och skruvar av rostfritt stål, vilket gjorde att mikrodrivsystemet kunde fästas starkt på mushuvudet. Dessutom gjorde tandcementväggarna det möjligt att ladda vaselin för att täcka hålen i musens skalle innan tandcementet hälldes, vilket hade skyddande effekter på hjärnytan utan dura och den rörliga delen av mikrodrivsystemet. Tillsammans är dessa förbättringar användbara, eftersom de gör det möjligt för nybörjare att enkelt och säkert implantera mikrodrivsystemet i mushjärnan.
I flerkanaliga extracellulära inspelningar anses det allmänt att en annan svårighet ligger i att analysera de inspelade signalerna med hjälp av ett matematiskt komplext programmeringsspråk17. Således ger vi tydliga riktlinjer för nybörjare, särskilt när det gäller spiksortering, LFP-dataanalys och beräkning av förhållandet mellan dem med hjälp av en vanlig programvara inom elektrofysiologi. Dessutom rekommenderar vi starkt att den inspelade enheten från en analys med en elektrod som klustrats med PCA-metoder bör ha ett stort antal funktioner för analys, såsom de sorterade neuronala inter-spikintervallen och bredden mellan dess dal och topp, eftersom dessa värden är användbara för nybörjare för att minska bias när enheterna klustras automatiskt med offline-sorteringsprogramvara. Det är viktigt att förhållandet mellan signaler som inkluderar toppar och LFP är avgörande för att förmedla flera beteenden. Vi tillhandahåller också en serie enkla illustrationer för att mäta spike-spike-, LFP-LFP- och spike-LFP-korrelationer med hjälp av trovärdiga skript i programvaran för neurofysiologisk dataanalys; Dessa illustrationer gör det möjligt för nybörjare att snabbt börja bearbeta och analysera de inspelade signalerna i fritt rörliga möss. Vidare kan resultaten och data som behandlas med denna proprietära programvara användas tillsammans med en verktygslåda med öppen källkod som Fieldtrip för ytterligare analys i förväg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (31871170, 32170950 och 31970915), Natural Science Foundation of Guangdong Province (2021A1515010804 och 2023A1515010899), Guangdong Natural Science Foundation for Major Cultivation Project (2018B030336001) och Guangdong Grant: Key Technologies for Treatment of Brain Disorders (2018B030332001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
