Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En effektiv protokol til CUT&RUN-analyse af FACS-isolerede musesatellitceller

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret her er en effektiv protokol til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) isolering af muskelsatellitceller i muselemmer tilpasset undersøgelsen af transkriptionsregulering i muskelfibre ved spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT &RUN).

Abstract

Genomdækkende analyser med små cellepopulationer er en væsentlig begrænsning for undersøgelser, især inden for stamcelleområdet. Dette arbejde beskriver en effektiv protokol til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) isolering af satellitceller fra lemmernes muskel, et væv med et højt indhold af strukturelle proteiner. Dissekerede lemmer muskler fra voksne mus blev mekanisk forstyrret ved hakning i medium suppleret med dispase og type I collagenase. Efter fordøjelsen blev homogenatet filtreret gennem cellefiltre, og celler blev suspenderet i FACS-buffer. Levedygtighed blev bestemt med fikserbar levedygtighedsplet, og immunfarvede satellitceller blev isoleret af FACS. Celler blev lyseret med Triton X-100 og frigivne kerner blev bundet til concanavalin A magnetiske perler. Kerne-/perlekomplekser blev inkuberet med antistoffer mod transkriptionsfaktoren eller histonmodifikationer af interesse. Efter vask blev kerne-/perlekomplekser inkuberet med protein A-mikrokoknukylase, og kromatinspaltning blev initieret med CaCl2. Efter DNA-ekstraktion blev biblioteker genereret og sekventeret, og profilerne for genom-wide transkriptionsfaktorbinding og kovalente histonmodifikationer blev opnået ved bioinformatisk analyse. Toppene opnået for de forskellige histonmærker viste, at bindingsbegivenhederne var specifikke for satellitceller. Desuden afslørede kendt motivanalyse, at transkriptionsfaktoren var bundet til kromatin via dets beslægtede responselement. Denne protokol er derfor tilpasset til at studere genregulering i voksne mus lemmer muskel satellitceller.

Introduction

Skeletstribede muskler udgør i gennemsnit 40% af vægten af den samlede menneskelige krop1. Muskelfibre udviser en bemærkelsesværdig evne til regenerering ved skade, hvilket beskrives ved fusion af nydannede myocytter og generering af nye myofibre, der erstatter de beskadigede2. I 1961 rapporterede Alexander Mauro en population af mononukleære celler, som han betegnede som satellitceller3. Disse stamceller udtrykker transkriptionsfaktoren parret boks 7 (PAX7) og er placeret mellem basal lamina og sarcolemma af muskelfibre4. De blev rapporteret at udtrykke klyngen af differentiering 34 (CD34; en hæmatopoietisk stamcellemarkør, endotelstamfader og mesenkymal stamcellemarkør), integrin alfa 7 (ITGA7; en glat, hjerte- og skeletmuskelmarkør) samt C-X-C kemokinreceptor type 4 (CXCR4; en lymfocyt-, hæmatopoietisk og satellitcellemarkør)5. Under basale forhold befinder satellitceller sig i et bestemt mikromiljø, der holder dem i hvilende tilstand6. Ved muskelskader bliver de aktiveret, formerer sig og gennemgår myogenese7. Men da de kun bidrager til en mindre brøkdel af det samlede antal muskelceller, er deres genom-dækkende analyser særligt udfordrende, især under fysiologiske indstillinger (<1% af de samlede celler).

Forskellige metoder til kromatinisolering fra satellitceller er blevet beskrevet, som involverer kromatinimmunudfældning efterfulgt af massiv parallel sekventering (ChIP-seq) eller spaltning under mål og tagmentation (CUT &Tag) eksperimenter. Ikke desto mindre frembyder disse to teknikker nogle væsentlige begrænsninger, der forbliver ubestridte. Faktisk kræver ChIP-seq en stor mængde udgangsmateriale til at generere nok kromatin, hvoraf en stor del går tabt under sonikeringstrinnet. CUT&Tag er mere passende til lavt celleantal, men genererer flere spaltningssteder uden for målet end ChIP-seq på grund af Tn5-transposaseaktiviteten. Da dette enzym desuden har en høj affinitet for åbne kromatinregioner, kan CUT&Tag-tilgangen fortrinsvis anvendes til analyse af histonmodifikationer eller transkriptionsfaktorer forbundet med aktivt transkriberede regioner af genomet i stedet for tavs heterochromatin 8,9.

Præsenteret her er en detaljeret protokol, der tillader isolering af muselemmer muskel satellitceller ved FACS til spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT &RUN) 10,11 analyse. De forskellige trin involverer mekanisk forstyrrelse af væv, cellesortering og kerneisolering. Metodens effektivitet, hvad angår fremstilling af en levedygtig cellesuspension, blev demonstreret ved at udføre CUT&RUN-analyse for kovalente histonmodifikationer og transkriptionsfaktorer. Kvaliteten af isolerede celler gør den beskrevne metode særlig attraktiv til fremstilling af kromatin, der trofast fanger den oprindelige genomiske belægningstilstand og sandsynligvis er egnet til at fange kromosomkonformationen i kombination med high-throughput sekventering på specifikke loci (4C-seq) eller på genom-wide niveauer (Hi-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus blev holdt i et akkrediteret dyrehus i overensstemmelse med National Animal Care Guidelines (Europa-Kommissionens direktiv 86/609/CEE; Fransk dekret nr. 87-848) om anvendelse af forsøgsdyr til forskning. Tilsigtede manipulationer blev forelagt det etiske udvalg (Com'Eth, Strasbourg, Frankrig) og det franske forskningsministerium (MESR) til etisk evaluering og godkendelse i henhold til 2010/63/EU-direktivet under APAFIS-nummer #22281.

1. Fremstilling af cellesuspension til isolering af satellitceller ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) (figur 1)

  1. Isolering af muskelvæv
    1. Dekontaminer værktøjerne til muskeldissektion, herunder tang, skalpeller og saks, ved hjælp af et rengøringsmiddel (tabel 1), og skyl grundigt med destilleret vand.
    2. Forbered to 2 ml rør (tabel 1), der hver indeholder 1 ml muskelisoleringsbuffer, og læg dem på is til opsamling af høstede muskler.
    3. Ofre to 10 uger gamle C57/Bl6J hanmus ved CO2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation. Spray 70% ethanol over hver hele mus. Skræl huden fra bagbenet ved hjælp af tang. Dissekere alle lemmernes muskler omkring lårbenet, skinnebenet og fibula (ca. 1 mg muskler pr. Mus).
      BEMÆRK: Antallet af satellitceller falder efter 15 ugers alderen.
    4. De høstede lemmer anbringes i 2 ml rør indeholdende 1 ml muskelisolationsbuffer fremstillet i trin 1.1.2. Saml musklerne fra den anden mus efter samme procedure. Hak de høstede muskler med en saks på is, indtil der opnås mindre end 1 mm3 fragmenter.
      BEMÆRK: Muskler blev indsamlet og hakket hovedsageligt som beskrevet12. Udfør vævsfordøjelse enten ved at følge trin 1.2 eller 1.3.
  2. Vævsfordøjelse med kollagenaseenzym
    1. Den hakkede muskelsuspension overføres fra de to mus ved at hælde dem i et 50 ml rør (tabel 1) indeholdende 18 ml muskelisolationsbuffer (suppleret med 5 ml [5 E/ml] dispase og 5 mg type I collagenase) (tabel 1).
    2. Luk røret tæt og forsegl det med laboratoriefilm (tabel 1). Den anbringes vandret i et rystevandbad (tabel 1) ved 37 °C ved 100 o/min i 30 minutter.
    3. Efter 30 minutter tilsættes 5 mg type I collagenase. Opbevar slangerne i yderligere 30 minutter under omrøring i et rystevandbad ved 37 °C ved 100 omdr./min.
    4. Efter fordøjelsen pipetteres muskelsuspensionen op og ned 10 gange med en 10 ml pipette for at forbedre effektiviteten af dissociation. Der centrifugeres ved 4 °C ved 400 x g i 5 min. En klar pellet vil være synlig i bunden af røret. Supernatanten kasseres med en 10 ml pipette, så der efterlades 5 ml medium i glasset.
      BEMÆRK: At forlade mediet hjælper med at undgå at stresse cellerne. Tilsæt 10 ml frisk muskelisoleringsbuffer og resuspender pelleten ved pipettering op og ned med en 10 ml pipette.
    5. 100 μm, 70 μm og 40 μm cellesier (en af hver slags) (tabel 1) anbringes på åbne 50 ml rør. Suspensionen pipetteres på de successive cellesier (100 μm, 70 μm, 40 μm), og gennemstrømningen opsamles i 50 ml rørene, der indeholder celler under 40 μm.
    6. Centrifuger suspensionen ved 4 °C ved 400 x g i 5 min. Supernatanten kasseres med en 10 ml pipette, indtil der er 2 ml tilbage, og brug derefter en 0,2-1 ml pipette, indtil der er 100-200 μL tilbage. Resuspender pellet i 2 ml røde blodlegemer lysisbuffer (tabel 2). Inkuber på is i 3 min.
    7. Supernatanten centrifugeres ved 4 °C ved 400 x g i 5 min, og supernatanten kasseres med en 20-200 μL pipette. Resuspender cellerne i 100 μL kold FACS-buffer (tabel 2). Placer på is.
  3. Alternativ metode til vævsfordøjelse med Liberase termolysin lavt (TL) enzym
    1. Følg beskrivelserne i trin 1.1. til vævsisolering.
    2. Til Liberase-medieret vævsdisaggregering høstes muskler i 2 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) isolationsbuffer (tabel 2) i stedet for muskelisolationsbuffer beskrevet i trin 1.1.2.
    3. Den hakkede muskelsuspension overføres fra de to mus ved at hælde dem i et 50 ml rør (tabel 1) indeholdende 18 ml RPMI-isolationsbuffer suppleret med 300 eller 600 μL Liberase TL ved 5 mg/ml (tabel 1) (dvs. henholdsvis 0,083 mg/ml og 0,167 mg/ml slutkoncentrationer)13.
    4. Luk røret tæt og forsegl det med laboratoriefilm (tabel 1). Den anbringes vandret i et rystevandbad (tabel 1) ved 37 °C ved 100 o/min i 30 minutter.
    5. Efter fordøjelsen pipetteres muskelsuspensionen op og ned 10 gange med en 10 ml pipette for at adskille og forbedre effektiviteten af dissociation.
    6. Der centrifugeres ved 4 °C ved 400 x g i 5 min. En klar pellet vil være synlig i bunden af røret. Supernatanten kasseres med en 10 ml pipette, så der efterlades 5 ml medium i glasset. At forlade mediet hjælper med at undgå at stresse cellerne. Tilsæt 10 ml frisk RPMI-isolationsbuffer, og opslæd pillen igen ved pipettering op og ned med en 10 ml pipette.
    7. 100 μm, 70 μm og 40 μm cellesier (en af hver slags) (tabel 1) anbringes på åbne 50 ml rør.
    8. Suspensionen pipetteres på successive cellesier (100 μm, 70 μm, 40 μm), og gennemstrømningen opsamles i 50 ml rørene, der indeholder celler under 40 μm.
    9. Centrifuger suspensionen ved 4 °C ved 400 x g i 5 min. Supernatanten kasseres med en 10 ml pipette, indtil der er 2 ml tilbage, og brug derefter en 0,2-1 ml pipette, indtil der er 100-200 μL tilbage.
    10. Resuspender pellet i 2 ml røde blodlegemer lysisbuffer (tabel 2). Inkuber på is i 3 min.
    11. Supernatanten centrifugeres ved 4 °C ved 400 x g i 5 min, og supernatanten kasseres med en 20-200 μL pipette.
    12. Resuspender cellerne i 100 μL kold FACS-buffer (tabel 2). Placer på is.
  4. Fremstilling af cellesuspension til FACS-isolering
    1. 10 μL af cellesuspensionen opnået i trin 1.2.12 overføres til et frisk 1,5 ml glas. Denne prøve udgør den ufarvede kontrol eller den negative kontrol (figur 2). Der tilsættes 190 μL FACS-buffer, overføres til et 5 ml rør (tabel 1), og opbevares på is.
    2. De resterende 90 μl af cellesuspensionen opnået i trin 1.2.12 centrifugeres ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter, og supernatanten kasseres med en pipette (volumen på 20-200 μL). Inkuber cellerne med 400 μL fikserbar levedygtighedsplet (tabel 3) fortyndet i serumfri Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
    3. Cellerne vaskes ved centrifugering ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter, og der tilsættes 100 μL FACS-buffer. Vend forsigtigt glassene tre gange og centrifuger igen ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter.
    4. Under centrifugeringstiden fremstilles 100 μL af en masterblanding af primære antistoffer koblet til fluoroforer og rettet mod CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 og CXCR4 (tabel 3), fortyndet i FACS-buffer.
    5. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, cellesupernatanten kasseres med en pipette (volumen på 20-200 μL), og der tilsættes 100 μL antistofblanding. Vend forsigtigt røret tre gange. Må ikke hvirvel. Inkuber i mørke på is i 30 min.
    6. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres med en 20-200 μl pipette, og der tilsættes 500 μL 1x fosfatbufret saltvand (PBS) for at vaske cellerne. Vend forsigtigt røret tre gange. Der centrifugeres igen ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres med en 20-200 μL pipette.
    7. Resuspender cellepillen i 500 μL FACS-buffer og overfør suspensionen til et 5 ml rør.
      BEMÆRK: cellesuspensionen opnået fra Liberase-fordøjelsen behandles på samme måde.
  5. Valg af satellitceller af FACS
    1. Rør kortvarigt cellesuspensionen (2-5 sek.) og behandl cellerne på et flowcytometer udstyret med en 100 μm dyse (tabel 1).
    2. Bestem de forskellige portstørrelser baseret på den ubejdsede prøve, der er opbevaret i trin 1.4.1 (figur 2).
    3. Overtræk et 5 ml rør med 1 ml rent føtalt kalveserum (FCS) for at forbedre celleopsamlingen og tilsæt 500 μL FACS-buffer.
    4. Udskift den ubejdte prøve med den antistofmærkede prøve.
    5. Vælg populationen af interesse i henhold til det fremadrettede spredningsområde (FSC-A) og sidespredningsområdet (SSC-A) (figur 3A), og fjern dubletceller med FSC-A og fremadrettet spredningshøjde (FSC-H) (figur 3B)14.
    6. Identificer levende celler med fikserbar levedygtighed pletnegativ farvning (figur 3C).
    7. Vælg negative celler for CD31, CD45, TER119 og CD11b (figur 3D).
    8. Hvis du vil identificere satellitceller, skal du først markere de celler, der er positive for CD34 og ITGA7 (figur 3E), og derefter vælge de CXCR4-positive celler i den CD34- og ITGA7-valgte population (figur 3F).
    9. De udvalgte celler (mellem 40.000 og 80.000 celler alt efter præparatets kvalitet) samles i det 5 ml belagte rør indeholdende 500 μL FACS-buffer.

2. Validering af den isolerede population i vævskultur

  1. Glidebelægning med hydrogel
    1. 280 μL af en ren hydrogel human embryonal stamcelle (hESC) kvalificeret matrix (tabel 1) fortyndes i 12 ml serumfrit DMEM/F12-medium.
    2. Overtræk et kammerglas (tabel 1) med hydrogelopløsningen, og inkuber det natten over ved 4 °C.
    3. Den næste dag inkuberes kammerglasset ved 37 ° C og 5% CO2 i 1 time før cellesåning.
  2. Cellevækst og differentiering
    1. Plade ud ca. 20.000 celler, opnået fra trin 1.5.9, pr. Brønd, og dyrk dem i vækstmedium (tabel 2) i 5 dage. Tag fasekontrastbilleder ved hjælp af et brightfield-mikroskop (figur 4A), før du behandler dem til immunofluorescensanalyse for at sikre præparatets kvalitet (figur 4B).
    2. For at inducere myogenese dyrkes amplificerede satellitceller fra trin 2.2.1 i myogent medium (tabel 2) i yderligere 7 dage. Tag fasekontrastbilleder ved hjælp af brightfield-mikroskop (figur 4C), før du behandler dem til immunofluorescensanalyse for at sikre præparatets kvalitet (figur 4D).
  3. Immunocytofluorescens analyse
    1. Fjern forsigtigt mediet, vask cellerne, der blev dyrket på kammerglas med 100 μL 1x PBS to gange, og fastgør dem med 100 μL 4 % paraformaldehyd (PFA) ved RT i 1 time.
      BEMÆRK: Dette trin skal udføres med omhu. Et lille volumen medium skal altid opbevares i kammeret for at forhindre stress af cellerne, og PBS skal hældes gennem kammerets vægge.
    2. Cellerne vaskes tre gange med 100 μL 1x PBS, suppleret med 0,1% Tween 20 (PBST) for at permeabilisere cellemembranerne.
    3. Bloker uspecifikke signaler ved inkubation i 100 μL 1x PBST suppleret med 5% FCS (PBST-FCS) ved RT i 1 time.
    4. Cellerne inkuberes med 100 μL af en masterblanding af anti-PAX7 og antidystrophin (DMD) antistoffer (fortyndet i 1x PBST-FCS) ved 4 °C natten over for at detektere henholdsvis satellitceller og myofibre.
    5. Cellerne vaskes tre gange med 100 μL 1x PBST, og de inkuberes med 100 μL ged anti-mus Cy3 eller ged anti-kanin Alexa 488 sekundære antistoffer (tabel 3) fortyndet i 1x PBST-FCS ved RT i 1 time.
    6. Afbryd kammerhullerne fra objektglasset ved hjælp af det udstyr, leverandøren stiller til rådighed, tilsæt 20 μL vandigt monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og dæk objektglasset med en dæksel (tabel 1).
    7. Overhold og tag billedet af de farvede celler med et konfokalmikroskop.
    8. Behandl billederne ved hjælp af billedanalysesoftware (figur 4B, D).

3. CUT&RUN-analyse

  1. Prøveforberedelse til CUT&RUN-analyse på FACS-isolerede satellitceller
    BEMÆRK: CUT&RUN blev udført stort set som beskrevet10,15. Buffersammensætningen præsenteres i Tabel 2.
    1. Til CUT&RUN-analysen anvendes ca. 40.000 af cellerne opnået i metode 1, trin 1.5.9, pr. prøve/antistof, der skal testes.
    2. De FACS-isolerede satellitceller centrifugeres ved RT ved 500 x g i 10 minutter, og supernatanten kasseres derefter med en pipette (20-200 μL spidsvolumen).
    3. Cellerne vaskes med 1 ml 1x PBS, centrifugeres ved RT ved 500 x g i 5 minutter, supernatanten kasseres med en pipette (0,2-1 ml spidsvolumen), og de resuspenderes i 1 ml kold nuklear ekstraktionsbuffer (tabel 2). Inkuber på is i 20 min.
    4. Under inkubationen fremstilles et 1,5 ml glas indeholdende 850 μL koldbindingsbuffer (tabel 2), og der tilsættes 20 μL concanavalin A-coatede magnetperler pr. prøve (tabel 1).
    5. Puds perlerne to gange med 1 ml koldbindingsbuffer ved hjælp af et magnetstativ (tabel 1). For hver vask eller bufferændring under hele proceduren skal perlerne samle sig ved siden af røret på magnetstativet i 5 minutter, før den rensede supernatant fjernes med en pipette (0,2-1 ml spidsvolumen). Derefter resuspenderes forsigtigt i 300 μL koldbindingsbuffer.
    6. Kernerne centrifugeres ved 4 °C ved 600 x g i 5 minutter og resuspenderes forsigtigt i 600 μL nuklear ekstraktionsbuffer. De 600 μL ekstraherede kerner blandes forsigtigt med 300 μL concanavalin A-perleopslæmning, og de inkuberes ved 4 °C i 10 minutter.
    7. Supernatanten fjernes ved hjælp af en magnetrist som beskrevet i trin 3.1.4, og de perlebundne kerner resuspenderes forsigtigt med 1 ml koldblokerende buffer (tabel 2). Inkuber ved RT i 5 min.
    8. Supernatanten fjernes ved hjælp af en magnetrist, og de perlebundne kerner vaskes to gange med 1 ml buffer til kold vask (tabel 2). Under den anden vask opdeles de perlebundne kerner ligeligt i 1,5 ml rør. Hvert rør vil blive behandlet med et specifikt antistof i det følgende trin.
      BEMÆRK: I dette eksempel blev 250 μL perlebundne kerner opdelt i fire 1,5 ml rør.
    9. Supernatanten adskilles ved hjælp af et magnetstativ som beskrevet i trin 3.1.4, og der suges til med en pipette. Kerne-/perlekomplekserne resuspenderes forsigtigt med et specifikt primært antistof (tabel 3) eller en IgG af en anden art (her kanin) fortyndet i 250 μL koldvaskebuffer. Der inkuberes ved 4 °C natten over med let omrystning.
      BEMÆRK: De antistoffer, der anvendes her, er rettet mod AR, H3K4me2 og H3K27ac.
    10. Supernatanten fjernes med en magnetrist som beskrevet i trin 3.1.4, de perlebundne kerner vaskes to gange med 1 ml koldvaskebuffer, og der resuspenderes i 100 μl buffer til koldvask.
    11. Fortyndet protein A-mikrokoknuklease ved 1,4 ng/μL i 100 μL pr. prøve af koldvaskbuffer.
    12. Der tilsættes 100 μL protein A-mikrokoknuklease til 100 μl prøve opnået i 3.1.11 og inkuberes ved 4 °C i 1 time med omrystning.
    13. Supernatanten fjernes med en magnetrist som beskrevet i trin 3.1.4, vaskes to gange med 1 ml buffer til koldvask, og de perlebundne kerner resuspenderes i 150 μl buffer til koldvask.
    14. For at starte DNA-spaltning tilsættes 3 μL 100 mMCaCl2 til prøven på 150 μL, blandes hurtigt ved at svirpe og inkuberes på is i 30 minutter. Reaktionen standses ved tilsætning af 150 μL stopbuffer og inkuberes ved 37 °C i 20 minutter for at fordøje RNA'et og frigive DNA-fragmenterne.
    15. Til DNA-ekstraktion centrifugeres prøverne ved 16.000 x g ved 4 °C i 5 minutter.
    16. Supernatanten overføres til et nyt mikrofugerør, og pellets og perler kasseres.
    17. Der tilsættes 3 μL 10% natriumdodecylsulfat (SDS) og 2,5 μL 20 mg/ml proteinase K. Bland ved invertering. Der inkuberes i 10 minutter ved 70 °C (ingen omrystning).
    18. Der tilsættes 300 μL phenol/chloroform/isoamylalkohol, hvirvelstrøm, overføres til 2 ml faselåsrør (forspindet i 5 minutter ved 16.000 x g), og centrifugeres i 5 minutter ved 16.000 x g ved 4 °C.
    19. Der tilsættes 300 μL chloroform til samme glas og centrifugeres i 5 minutter ved 16 000 x g ved 4 °C. Supernatanten (~300 μL) opsamles med en pipette (0,2-1 ml spidsvolumen) og overføres til et nyt 1,5 ml glas.
    20. Tilsæt 1 μL glykogen (20 mg/ml koncentration).
    21. Der tilsættes 750 μL 100 % ethanol og bundfældes natten over ved -20 °C.
    22. Pellet DNA'et ved centrifugering i 15 minutter ved 16.000 x g ved 4 °C. Pelleten vaskes med 1 ml 100% ethanol, centrifugeres i 5 minutter ved 16.000 x g, supernatanten kasseres, centrifugeres i 30 s ved 16.000 x g, og væsken fjernes med en pipette (20-200 μL spidsvolumen).
    23. Lufttør pillen i ~5 min. Resuspenderes i 25 μL 1 mM Tris-HCl (pH 8) og 0,1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA; pH 8).
  2. Bioinformatik analyse
    1. Forbered biblioteker fra immunspaltet DNA og sekventer dem som parrede ende 100 bp læsninger ved hjælp af den genomiske platform som beskrevet16.
    2. Fjern læsninger, der overlapper ENCODE-sortlisteområdet (V2), og adskil de resterende læsninger i to grupper: fragmentstørrelse <120 bp (uden nukleosom, generelt for transkriptionsfaktorer) og fragmentstørrelse >150 bp (med nukleosomer, normalt for histonmærker). Tilknytning til mm10-referencegenomet ved hjælp af Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Generer bigwig-filer med bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Bevar entydigt kortlagte læsninger til yderligere analyse.
    5. Generer rå bedgraph-filer med genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Brug SEACR 1.3-algoritmen (streng mulighed) til spidsbelastningsopkald. Indlæs måldata-bedgraph-filen i UCSC-bedgraph-format, der udelader områder, der indeholder nulsignal, og kontroller (IgG) data-bedgraph-fil for at generere en empirisk tærskel for peak calling18.
    7. Udfør en Pearson-korrelationsanalyse med deeptools for at bestemme ligheden mellem prøverne19. Brug kommandolinjen multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, efterfulgt af plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualiser intensitetsprofilerne for hele genomet med IGV20 ved hjælp af bedgraph-filer og bed-filtoppene opnået fra SEACR.
    9. Brug HOMER til topannotation og motivsøgning21.
    10. Endelig skal du sammenligne datasættene med tidligere offentliggjorte datasæt med ChIP-Atlas Peak-browseren for at visualisere dem på IGV og/eller berigelsesanalyse ved hjælp af de SEACR-genererede bed-filer som inputdatasæt22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Satellitceller fra museskeletmuskler blev isoleret ved at kombinere protokollerne fra Günther et al. (i det følgende benævnt protokol 1)12 og Liu et al.23 (i det følgende benævnt protokol 2). Da ikke-fordøjede muskelfibre blev observeret efter fordøjelsen ved anvendelse af koncentrationen af kollagenase og dispase foreslået i protokol 1, blev mængden af enzymer øget for at forbedre muskelfiberdissociationen, som beskrevet i trin 1.2.1 og 1.2.3. Som angivet i protokol 2 blev prøverne udsat for en mild omrøring i et vandbad for at opretholde cellelevedygtigheden. Vi udførte filtrering gennem cellesi, som nævnt i protokol 1, og inkubation med røde blodlegemer lysisbuffer (se trin 1.2.7 til 1.2.10). I protokol 1 blev celler indlæst på en Percoll-densitetsgradient på 30% / 70% for at isolere mononukleerede celler i interfasen, hvilket kan have ført til tab af celler af interesse. Dette trin blev således udeladt som foreslået i protokol nr. 2.

FSC-A versus SSC-A gating blev brugt til at identificere mononukleerede celler baseret på størrelse (FSC) og granularitet (SSC) (figur 3A). Affald blev udelukket ved at ignorere begivenheder under 40 K på FSC-A-aksen, og 38,8% ± 3,6% af cellerne blev valgt. FSC-A versus fremadrettet spredningshøjde (FSC-H) gatingtæthedsplots blev brugt til dobbeltudelukkelse (figur 3B). Efter udvælgelse af cellerne negative for den fikserbare levedygtighedspletmarkør blev der opnået et gennemsnit på 34,3% ± 7,7% af levende celler (figur 3C).

Procentdelen vist i prikplottet i figur 3C, 75,4%, svarer til procentdelen af enkeltlevende celler, beregnet ud fra modercellepopulationen, som i dette tilfælde er singlerne. 95.7% af enkeltceller opnås fra livebegivenhederne, der udgør 35% af de samlede begivenheder. Således beregnes procentdelen 34,3% opnået i gennemsnit ud fra de samlede begivenheder og ikke forældrepopulationerne.

Ca. 3% af enkeltlevende celler var negative for leukocyt- (CD45), monocyt- (CD11b), endotel- (CD31) og erythroidspecifikke (TER119) markører (figur 3D). CD11b / CD45 / CD31 / TER119 negative celler blev derefter udvalgt i henhold til deres ekspression af CD34 (hæmatopoietiske endotelprogenitorer og mesenkymale stamceller) og ITGA7 (hjerte-, glatte og skeletmuskelceller) markører (figur 3E). En endelig gating for CXCR4 (lymfocytter, hæmatopoietiske og satellitceller) blev udført for at vælge formodede satellitceller (figur 3F). Fra CD34+/ITGA7+ cellerne viste ~80% sig at være positive for CXCR4, hvilket repræsenterer et gennemsnit på 1% ± 0,15% af de samlede enkeltlevende celler og et absolut antal på 60.000 ± 14.000 formodede satellitceller pr. muselemmuskler blandt 14 uafhængige eksperimenter. En yderligere vurdering af CXCR4+-cellefraktionen afslørede, at ca. 80 % af de levende celler blev opnået efter eftersortering, hvoraf næsten 70 % var CXCR4+ (figur S1), hvilket viser den høje levedygtighed og renhed af denne FACS-isolerede cellepopulation.

Siden forskellige undersøgelser sammenlignede effektiviteten af kollagenase og Liberase TL-enzymer til celleisolering24,25, er disse to fordøjelsesmetoder blevet behandlet parallelt. Med 300 μL Liberase TL var fordøjelsen mindre effektiv end med collagenase, da ufordøjede fibre forblev. Derudover blev der observeret mere celleaffald og store begivenheder (figur S2A, B), og kun 17,3% af enkeltlevende celler blev i gennemsnit opnået efter FVS 780-udvælgelse (figur S2C). En yderligere bekymring med Liberase-fordøjelsen var det lave antal CD34+/ITGA7+-celler sammenlignet med collagenase (figur S2D-S2E), selvom CXCR4-gating var ens (figur S2F). Med 600 μL Liberase TL var fordøjelsen mere effektiv. Imidlertid forblev mængden af celleaffald forhøjet og cellelevedygtigheden substandard (16,3%) (figur S3). Således var fordøjelsen med Liberase TL mindre effektiv til satellitcelleisolering.

Ved podning udtrykte mere end 70% af CD34+/ITGA7+/CXCR4+-cellerne (figur 4A) PAX7 (figur 4B) i modsætning til CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler, der var PAX7-negative (figur 4C). CD34+/ITGA7+/CXCR4+ celler var i stand til at differentiere sig til myofibre, når de blev dyrket i et myogent medium i yderligere 7 dage, som vist ved dystrofinfarvning (DMD) (figur 4D), hvilket bekræfter deres myogene potentiale. Således viste kombinerede vævskultur- og immunofluorescensanalyser, at FACS-isolerede CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler er satellitceller.

For at afgøre, om isolerede satellitceller er egnede til CUT&RUN-analyse, blev den genomiske profil af acetyleret lysin 27 (H3K27ac) og dimethyleret lysin 4 (H3K4me2) af histon H3, to histonmodifikationer fundet i aktive promotor- og forstærkerregioner, bestemt. Vores data afdækkede 68.694 og 13.514 toppe for henholdsvis H3K4me2 og H3K27ac med en lignende genomisk repartition mellem de to histonmærker (figur S4A). I detaljer fandt vi, at en fjerdedel af toppene var placeret ± 2 kb fra transkriptionsstartstedet (TSS) for det nærmeste gen, hvor størstedelen var placeret enten -100 kb til -10 kb eller 10 kb til 100 kb fra TSS (figur S4B). Bemærk, at Pearson-analysen viste en 80% korrelation mellem H3K27ac og H3K4me2 læseprofiler (figur S4C). For at vurdere, om kromatinet fremstillet ud fra ovennævnte protokol blev isoleret fra satellitceller, blev tilstedeværelsen af H3K27ac og H3K4me2 ved promotoren af satellitcellespecifikke gener bestemt. H3K4me2 blev beriget omkring TSS af Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 og Vcam1 (figur 5A), men ikke hos Itgam (CD11b) og Ptprc (CD45) (immunceller), Pecam (CD31; endotelceller) (figur 5B), Ckm (udvikling af muskelfibre) eller Myh3 (myosin tungkædede hurtige embryonale myofibre) (figur 5C). Lignende resultater blev opnået med H3K27ac (figur 5). Næsten intet signal blev opnået med IgG-prøven (figur 5). Desuden viste sammenligning af H3K27ac-toppe opnået fra SEACR med dem, der var resultatet af MACS2-spidsbelastningsopkald fra offentliggjorte ChIP-seq-datasæt, en høj korrelation, som bemærket under hvert panel (ChIP-Atlas-spor; Figur 5). Tilsammen indikerer disse resultater, at aflæsningerne opnået efter bioinformatikanalysen stammer fra kromatin af FACS-isolerede satellitceller og korrelerer med dem, der tidligere er identificeret ved ChIP-seq-analyser.

Mens enkeltcelle RNA-sekventeringsundersøgelser i musesatellitceller viste et slående stressrespons forårsaget af isolationsproceduren26, blev tilstedeværelsen af H3K4me2 eller H3K27ac bestemt ved stressresponsgener, som eksemplificeret med Atf3, Azin1, Gls og Elf2. Resultaterne giver bevis for, at H3K27ac-mærket ikke er deponeret hos promotoren af sådanne gener, og at niveauerne af H3K4me2 forbliver lave sammenlignet med dem, der opnås for satellitcellespecifikke gener (figur S5). Disse data fremhæver således, hvor mild isolationsproceduren er.

Dernæst blev egnetheden af vores isolationsmetode til transkriptionsfaktorer undersøgt. CUT &RUN-analyse for androgenreceptoren (AR), en transkriptionsfaktor, der tilhører superfamilien af nukleare receptorer, og som spiller en vigtig rolle i myogen differentiering27, optrevlede 7.840 toppe. Disse toppe var hovedsageligt placeret ved intron og intergene regioner (figur S4A), enten -100 kb til -10 kb eller 10 kb til 100 kb fra TSS (figur S4B). Fylogenetiske analyser afslørede, at AR sammen med glukokortikoidet (GR / Nr3c1), mineralkortikoidet (MR / Nr3c2) og progesteron (PR / Nr3c3) receptorer er medlem af oxosteroidkernereceptorerne underfamilie 28, der binder som homodimerer til DNA-segmenter, der består af to 5′-RGAACA-3′ palindromiske halvsteder adskilt af tre basepar 29. Søgning efter et kendt motiv ved hjælp af hypergeometrisk optimering af motivberigelse (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) afslørede, at AR er bundet til 5′-RGRNCA-3′ AR halvstedsmotivet, til det typiske 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ oxosteroidmotiv (omtalt i figuren som PR) og til 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR-konsensusmotivet i >32%, 17% og 2% af de målrettede regioner, henholdsvis (figur 6A). Det skal bemærkes, at lignende proportioner tidligere blev opnået for glukokortikoidreceptoren i skeletmuskulatur16.

SEACR analyse afslørede næsten 500 toppe med en top score >50, med mere end 200 af dem med en score >100; hvoraf nogle er eksemplificeret i figur 6B. Vores analyse afslørede også en beskeden berigelse af AR på de tidligere beskrevne bindingssteder for gener, der er involveret i polyaminbiosyntese (Amd1, havre og smox) og i prostatacancer (Acox1, Fkbp5 og Tmprss2) (figur S6). Interessant nok blev AR fundet på stedet for gener involveret i satellitcellestammen (Pax7, Cxcr4 og Cd34) (figur S7). Det skal bemærkes, at oxosteroidresponselementet blev fundet i hver af disse AR-berigede regioner (figur S6 og figur S7), hvilket viser, at AR-signalet, der ses i CUT &RUN-dataene, er meget specifikt.

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af den protokol, der anvendes til satellitcelleisolering fra muselemmernes muskler. Protokollen består af fire hovedtrin. Kort sagt ofres mus, og bagbenets muskler høstes (trin 1.1.1-1.1.3) og hakkes mekanisk ved hjælp af en saks (trin 1.4-1.5). Dette efterfølges af trin 1.2.1-1.2.4, hvor musklerne dissocieres i et vandbad ved hjælp af kollagenase og dispase. I trin 1.2.5-1.2.8 filtreres cellesuspensionen gennem 100, 70 og 40 μm cellesier fortløbende, og erytrocytter elimineres under anvendelse af røde blodlegemer lysebuffer (trin 1.2.9-1.2.12). De resterende cellepopulationer er mærket i trin 1.3 med antistoffer koblet til fluoroforer, som er rettet mod specifikke cellulære fænotypiske markører. Trin 1.4 omfatter prøver, der passerer gennem FACS for at indsamle satellitceller til videre anvendelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Flowcytometrianalyse af et ufarvet cellepræparat. (A) Udvælgelse af populationen af interesse baseret på FSC-A og SSC-A parametre. B) Identifikation af en enkelt celle baseret på FSC-A og FSC-H. (C) Karakterisering af autofluorescenstærsklen for indsamlede celler for APC-Cy7 konjugeret med den fikserbare levedygtighedsplet (FVS 780), der markerer døde celler. (D-F). Autofluorescensmåling for PE-Cy7 konjugeret til CD11b-antistof og PE-konjugeret til TER119/CD45/CD31-markører (D) samt for Alexa-fluor 488 konjugeret til ITGA7, Alexa-fluor 405 konjugeret til CD34 (E) og APC-fluorochrom konjugeret til CXCR4 (F). Porte er repræsenteret som sorte bokse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Flowcytometer-gating-strategi til satellitcellesortering. (A) Udvælgelse af den relevante population baseret på FSC-A- og SSC-A-parametre. B) Identifikation af en enkelt celle baseret på FSC-A og FSC-H. C) Identifikation af levende celler med FVS 780. (D) Negativ celleselektion baseret på CD11b-, CD31-, CD45- og TER119-antigener. (E-F) Positiv celleudvælgelse baseret på CD34 og ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Porte er repræsenteret som sorte bokse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Analyse af FACS-isolerede CD34+/ITGA7+/CXCR4+ og CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler. (A) Fasekontrastbilleder af CD34+/ITGA7+/CXCR4+ og CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler dyrket i vækstmedium. (B) Immunofluorescensanalyse af CD34+/ITGA7+/CXCR4+ og CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler dyrket i vækstmedium ved hjælp af antistoffer rettet mod PAX7 (rød) og dystrofin (DMD, grøn). Kerner blev farvet med DAPI (blå). Magenta pile angiver PAX7-positive celler. (C) Fasekontrastbilleder af CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler, der er dyrket i 5 dage i vækstmedium (venstre panel) og i yderligere 7 dage i myogent medium (højre panel). (D) Immunofluorescensanalysebilleder af CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler dyrket i 5 dage i vækstmedium (venstre panel) og i yderligere 7 dage i myogent medium (højre panel) ved hjælp af antistoffer rettet mod PAX7 (rød) og dystrofin (DMD, grøn). Kerner blev farvet med DAPI (blå). Magenta pile angiver PAX7-positive celler. Grønne pile angiver DMD-positive celler. Skalastænger: brightfield-paneler = 25 μm; Immunofluorescenspaneler = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Genomiske profiler af satellitcellekromatin. Lokalisering af H3K4me2 og H3K27ac ved satellitcellespecifikke gener (A), immun- og endotelcellespecifikke gener (B) og myofiberspecifikke gener (C) på kromatin af satellitceller ved CUT&RUN. Aktive promotorer er bokset i grønt, mens inaktive promotorer er bokset i brunt. CUT&RUN udført med IgG blev brugt som en negativ kontrol. H3K27ac-berigelsesanalyse for histonmærker er præsenteret under hvert spor. Berigelsesscore, der viser konfidensniveauerne for publicerede datasæt, er afbildet som et varmekort. Brune stjerner (*) henviser til H3K27ac ChIP-seq-toppe udført i muskelsatellitceller, blå stjerner til H3K4me3 og den lyserøde til H4K16me1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: AR-genomisk fordeling på satellitcellekromatin . (A) HOMER-kendt motivanalyse af AR-toppe i satellitceller. PR: progesteronreceptor. Nb-mål henviser til antallet af toppe, der præsenterer et bestemt motiv. (B) Lokalisering af H3K4me2 og AR ved angivne gener på kromatin af satellitceller bestemt ved CUT&RUN. CUT&RUN udført med IgG blev brugt som en negativ kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Liste over materialer, reagenser og software. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Buffersammensætninger. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Antistofreferencer og koncentrationer. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur 1: Flowcytometrianalyse af cellepræparatet efter sortering. (A) Udvælgelse af den relevante population baseret på FSC-A og SSC-A parametre. B) Identifikation af en enkelt celle baseret på FSC-A og FSC-H. C) Identifikation af levende celler med fikserbar levedygtighedsplet (FVS 780). (D) Negativ celleselektion baseret på CD11b-, CD31-, CD45- og TER119-antigener. (E-F) Positiv celleselektion baseret på CD34 og ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Porte er repræsenteret som sorte bokse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Flowcytometer-gatingstrategi til satellitcellesortering efter fordøjelse med 300 μL Liberase TL. (A) Udvælgelse af den relevante population baseret på FSC-A og SSC-A parametre. B) Identifikation af en enkelt celle baseret på FSC-A og FSC-H. C) Identifikation af levende celler med FVS 780. (D) Negativ celleselektion baseret på CD11b-, CD31-, CD45- og TER119-antigener. (E-F) Positiv celleselektion baseret på CD34 og ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Porte er repræsenteret som sorte bokse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Flowcytometer-gatingstrategi til satellitcellesortering efter fordøjelse med 600 μL Liberase TL. (A) Udvælgelse af den relevante population baseret på FSC-A og SSC-A parametre. B) Identifikation af en enkelt celle baseret på FSC-A og FSC-H. C) Identifikation af levende celler med FVS 780. (D) Negativ celleselektion baseret på CD11b-, CD31-, CD45- og TER119-antigener. (E-F) Positiv celleselektion baseret på CD34 og ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Porte er repræsenteret som sorte bokse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Karakterisering af H3K4me2, H3K27ac og AR genomiske placeringer. (A) Cirkeldiagrammer, der viser topfordelingen af H3K4me2, H3K27ac og AR i henhold til genomegenskaber i satellitceller. (B) Cirkeldiagrammer, der viser topfordelingen af H3K4me2, H3K27ac og AR i henhold til deres afstand til nærmeste TSS i satellitceller. (C) Heatmap, der viser Pearson-korrelationen mellem H3K4me2, H3K27ac og IgG-kontrol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Genomiske profiler af satellitcellekromatin ved stress-respons-inducerede gener. Lokalisering af H3K4me2 og H3K27ac ved angivne gener på kromatin af satellitceller. Immunudfældning med IgG blev anvendt som en negativ kontrol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: Genomiske profiler af satellitcellekromatin ved kendte AR-målgener. Lokalisering af H3K4me2, H3K27ac og AR ved angivne gener på kromatin af satellitceller bestemt af CUT&RUN. AR-toppe er bokset i blåt, og tilsvarende AR-responsive elementer præsenteres nedenfor. CUT&RUN udført med IgG blev brugt som en negativ kontrol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7: Genomiske profiler af satellitcellekromatin ved deres selektivt udtrykte gener. Lokalisering af H3K4me2, H3K27ac og AR ved angivne gener på kromatin af satellitceller bestemt af CUT&RUN. AR-toppe er bokset i blåt, og tilsvarende AR-responsive elementer præsenteres nedenfor. CUT&RUN udført med IgG blev brugt som en negativ kontrol. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne undersøgelse rapporterer en standardiseret, pålidelig og let at udføre metode til isolering og dyrkning af musesatellitceller samt vurdering af transkriptionsregulering ved hjælp af CUT &RUN-metoden.

Denne protokol involverer flere kritiske trin. Den første er muskelforstyrrelser og fiberfordøjelse for at sikre et stort antal indsamlede celler. På trods af den øgede enzymkoncentration blev der opnået flere levende celler end ved anvendelse af protokol 1. Satellitceller udtrykker et specifikt mønster af forskellige membranproteiner. For at øge stringensen af vores sortering brugte vi en kombination af tidligere beskrevne negative (CD31, TER119, CD45 og CD11b) og positive (CD34, ITGA7 og CXCR4) satellitcellemarkører30,31. Ved hjælp af denne strategi blev der opnået et gennemsnit på 1% af levende formodede satellitceller. Dette resultat ligger i størrelsesordenen forventet, da satellitceller udgør 2%-7% af muskelcellepopulationen i voksenalderen hos mus32. Som kontrol af satellitcellemarkeringsmarkørerne blev CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler isoleret. Immunofluorescerende farvning viste, at mens CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler ikke udtrykte PAX7, var 70 % af CD34+/ITGA7+/CXCR4+ sorterede celler positive for denne satellitcellespecifikke markør, hvilket viste, at den FACS-isolerede population svarer til satellitceller. Derudover var 70% af satellitcellerne dyrket i myogent medium i 7 dage PAX7-/DMD+, som vist ved immunfarvning, og dannede en langstrakt multinucleated myofiber, hvilket viste, at isolerede satellitceller bevarede deres stammepotentiale.

Den største begrænsning i prøveforberedelse kan være brugen af en høj koncentration af enzymer, hvilket resulterer i en stor mængde dissocieret biologisk materiale, men kan bidrage til øget celledød. For at løse dette problem blev et assay, der krævede lavere enzymmængde, testet. I denne sammenhæng blev Liberase TL, en oprenset form af den traditionelle collagenase33, testet. Selvom fordøjelsen tilsyneladende var mere effektiv med dette enzym, forblev mængden af cellerester forhøjet, og cellelevedygtigheden blev lidt sænket. Disse observationer er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der sammenlignede Liberase-medieret vævsfordøjelse med dette med rekombinant collagenase eller brugerdefineret collagenase24,25. Selvom andelen af endotel- og immunceller var ens mellem kollagenase og Liberase-fordøjelse, var procentdelen af satellitceller lavere i den Liberase-behandlede prøve, hvilket samlet set viser, at Liberase ikke anbefales til satellitcelleisolering. Anvendelsen af dette enzym er egnet til fænotypisk og kvantitativ analyse af immunceller og kan i sidste ende anbefales i forbindelse med muskelvæv og/eller andet væv. Dette er i overensstemmelse med, hvad der er blevet rapporteret om Liberase TL som den bedst egnede til effektivt at isolere levedygtige immunceller34,35,36.

Et andet potentielt problem er stress forårsaget af både dissociering og sortering af satellitceller. Fraværet af H3K27ac og de lave H3K4me2-niveauer i promotorregionen af stressresponsgener identificeret ved enkeltcelle-RNA-sekventering i musesatellitceller26 viser imidlertid, at proceduren er mild nok til ikke at inducere stressresponstranskriptionsrepertoiret. Andre begrænsninger, der skal bemærkes, er de udvalgte antigener, der forbliver empiriske. Undersøgelser viser imidlertid en høj overlapning mellem unikke overflademarkørkombinationer, der er beriget til skeletmuskelsatellitceller30,31.

Et yderligere kritisk trin er oprensning af kerner fra sorterede celler. Til dette holdes sorteringshastigheden lav for ikke at beskadige cellerne, men hurtigt nok til, at de ikke opbevares for længe i FACS-buffer. Faktisk er CUT&RUN-kerner ikke faste, og en længere inkubationstid kan påvirke læsningen opnået fra protokollen. Et typisk præparat fra de to bagben af en mus tillader CUT&RUN med et antistof og en IgG-kontrol med en mængde på 2,5 ng kromatin for hver.

CUT&RUN-eksperimenter, designet til at vurdere transkriptionsfaktorbinding og epigenetiske modifikationer, gav stærke og robuste læsesignaler for H3K4me2 og H3K27ac. De høje læseniveauer af H3K4me2 og H3K27ac på gener, der vides at blive udtrykt i satellitceller, sammenlignet med gener udtrykt i immun- eller endotelceller såvel som i myofibre, viste, at signalet overvejende blev forstærket fra satellitcellernes kerner. Derudover muliggjorde denne protokol identifikation af AR's cistrome i muskelstamceller, hvilket til dato stadig er et teknisk problem, der er forbundet med den dårlige kvalitet af mus AR-antistoffer og de lave AR-ekspressionsniveauer i celler, der ikke er meget androgenfølsomme, såsom epitelprostataceller. De data, der præsenteres her, afslørede AR-bundne regioner med høj konfidenstopscore. Da der oprindeligt kun blev vurderet én replikat pr. antistof, forbedres robustheden af vores datasæt ved at tilføje mindst to yderligere biologiske replikater pr. tilstand. Imidlertid præsenterer AR-kendte målgener og respektive histonmærker, der oprindeligt blev beskrevet som stærkt udtrykte og / eller let påviselige i andre vævssammenhænge såsom prostata, lavere ekspressionsniveauer og er meget udfordrende at detektere i satellitceller.

En begrænsning ved CUT&RUN-tilgangen er, at den udføres i ikke-fikserede celler. Således kunne vi have savnet nogle AR-mål på grund af den labile karakter af interaktionerne mellem transkriptionsfaktorer og deres bindingssted. På samme måde kan nogle posttranslationelle modifikationer, såsom acetylering, også være ret labil. Derfor kan det overvejes at inkludere et lysfikseringstrin med formaldehyd eller paraformaldehyd efter FACS-sortering og før isolering af kernerne for at stabilisere protein/DNA-interaktionerne og histonmodifikationerne.

Selvom dette papir viser, at CUT &RUN-assays kan udføres på FACS-isolerede satellitceller, kan andre analyser, der bruger ikke-fikseret kromatin, såsom ATAC-seq, også udføres. Derudover, selvom musklerne her blev høstet under basale fysiologiske forhold, kan denne protokol anvendes på patologiske sammenhænge som skade eller aldring. Alle disse protokolanvendelser vil muliggøre en detaljeret forståelse af genreguleringsmekanismer i satellitceller og kan hjælpe med at forstå, hvordan disse mekanismer kan ændres af patofysiologiske tilstande.

Sammenfattende giver denne billige og tidseffektive protokol en effektiv eksperimentel indstilling til at studere transkriptionsfaktorrekruttering og kromatinlandskab i skeletmuskelforløberceller. Kromatin fremstillet ved denne protokol har givet den første genom-dækkende analyse af AR-cistrome i satellitceller og vil lette fremtidige undersøgelser af genregulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Anastasia Bannwarth for at yde fremragende teknisk bistand. Vi takker IGBMC-dyrehusfaciliteten, cellekulturen, Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrig), billeddannelsen, elektronmikroskopien, flowcytometrien og GenomEast-platformen, medlem af konsortiet 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

Dette arbejde fra det tværfaglige tematiske institut IMCBio, som en del af ITI 2021-2028-programmet ved universitetet i Strasbourg, CNRS og Inserm, blev støttet af IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) og af SFRI-STRAT'US-projektet (ANR 20-SFRI-0012) og EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) inden for rammerne af det franske investeringsprogram for fremtiden. Yderligere finansiering blev leveret af INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategisk program 24376 (til D.D.), INSERM young researcher grant (til D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, og en fransk statsfond forvaltet af ANR under rammeprogrammet Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. blev støttet af programmet CDFA-07-22 fra Université franco-allemande og Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation og K.G. af Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Tags

CUT&RUN-analyse FACS-isolerede musesatellitceller stamcellefelt småcellepopulationer effektiv protokol fluorescensaktiveret cellesortering lemmuskel strukturelle proteiner hakning medium dispase type I-collagenase cellesi FACS-buffer levedygtighedsplet immunfarvede satellitceller Triton X-100 Concanavalin A magnetiske perler transkriptionsfaktor histonmodifikationer protein A-mikrokoknuklease kromatinspaltning CaCl2 DNA-ekstraktion Biblioteker Bioinformatisk analyse
En effektiv protokol til CUT&amp;RUN-analyse af FACS-isolerede musesatellitceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter