Summary
ここでは、マウス四肢筋サテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)単離のための効率的なプロトコルを、標的下での切断とヌクレアーゼを用いた放出による筋線維の転写制御の研究に適合させます(CUT&RUN)。
Abstract
小細胞集団を用いたゲノムワイド解析は、特に幹細胞分野における研究にとって大きな制約となります。この研究は、構造タンパク質を多く含む組織である四肢筋からのサテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)分離のための効率的なプロトコルについて説明しています。成体マウスの四肢の筋肉を解剖し、ディスパーゼおよびI型コラゲナーゼを添加した培地でミンチすることにより機械的に破壊した。消化後、ホモジネートをセルストレーナーでろ過し、細胞をFACSバッファーに懸濁しました。生存率は固定可能な生存率染色で決定し、免疫染色したサテライト細胞をFACSで単離しました。細胞をTriton X-100で溶解し、放出した核をコンカナバリンA磁気ビーズに結合させました。核/ビーズ複合体を、目的の転写因子またはヒストン修飾に対する抗体とインキュベートしました。洗浄後、核/ビーズ複合体をプロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼとインキュベートし、CaCl2でクロマチン切断を開始しました。DNA抽出後、ライブラリーを作製・配列決定し、ゲノムワイドな転写因子結合と共有結合ヒストン修飾のプロファイルをバイオインフォマティクス解析により取得しました。さまざまなヒストンマークについて得られたピークは、結合イベントがサテライト細胞に特異的であることを示しています。さらに、既知のモチーフ解析により、転写因子が同族の応答要素 を介して クロマチンに結合していることが明らかになりました。従ってこのプロトコルは大人のマウスの四肢筋肉衛星細胞の遺伝子の規則を調査するために合わせられる。
Introduction
骨格横紋筋は、平均して人体全体の重量の40%を占めています1。筋線維は、新たに形成された筋細胞の融合と、損傷した筋線維を置き換える新しい筋線維の生成によって説明される、損傷時に驚くべき再生能力を示す2。1961年、アレクサンダー・マウロは単核細胞の集団を報告し、これをサテライト細胞3と名付けた。これらの幹細胞は、転写因子ペアボックス7(PAX7)を発現し、筋線維4の基底層と筋膜の間に位置する。分化クラスター34(CD34;造血、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞マーカー)、インテグリンα7(ITGA7;平滑心筋マーカー、骨格筋マーカー)、C-X-Cケモカイン受容体4型(CXCR4;リンパ球、造血、サテライト細胞マーカー)5を発現していることが報告されています。基底状態では、サテライト細胞は静止状態を維持する特定の微小環境に存在します6。筋肉が損傷すると、それらは活性化され、増殖し、筋形成を受けます7。しかし、筋肉細胞の総数のごく一部にしか寄与していないため、ゲノムワイドな解析は、特に生理学的設定(全細胞の<1%)では特に困難です。
サテライト細胞からクロマチンを単離するには、クロマチン免疫沈降とそれに続くマッシブパラレルシーケンシング(ChIP-seq)や、ターゲットおよびタグメンテーション下での切断(CUT&Tag)実験など、さまざまな方法が報告されています。それにもかかわらず、これら 2 つの手法には、未解決のままであるいくつかの重大な制限があります。実際、ChIP-seqは、十分なクロマチンを生成するために大量の出発物質を必要とし、その大部分は超音波処理ステップ中に失われます。CUT&Tagは細胞数が少ない場合に適していますが、Tn5トランスポザーゼ活性により、ChIP-seqよりも多くのオフターゲット切断部位を生成します。さらに、この酵素はオープンクロマチン領域に対する親和性が高いため、ゲノムの活発に転写領域に関連するヒストン修飾や転写因子の解析には、サイレンシングされたヘテロクロマチンではなく、CUT&Tagアプローチが優先的に用いられる可能性があります8,9。
ここでは、FACSによるマウス四肢筋サテライト細胞の単離を可能にし、ヌクレアーゼ(CUT&RUN)10,11分析を用いて、ターゲット下での切断と放出を可能にする詳細なプロトコルを示します。さまざまなステップには、組織の機械的破壊、細胞の選別、および核の分離が含まれます。生細胞懸濁液の調製に関するこの分析法の効率は、共有結合ヒストン修飾および転写因子のCUT&RUN解析を実施することで実証されました。単離された細胞の品質により、記載された方法は、天然のゲノム占有状態を忠実に捕捉するクロマチンを調製するのに特に魅力的であり、特定の遺伝子座(4C-seq)またはゲノムワイドレベル(Hi-C)でのハイスループットシーケンシングと組み合わせて染色体コンフォメーションを捕捉するのに適している可能性があります。
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Protocol
マウスは、国家動物管理ガイドライン(欧州委員会指令86/609 / CEE;研究のための実験動物の使用に関するフランス政令第87-848号。意図された操作は、APAFIS 番号 #22281 に基づく 2010/63/EU 指令に従って倫理的評価と承認を受けるために、倫理委員会 (Com'Eth、ストラスブール、フランス) およびフランス研究省 (MESR) に提出されました。
1. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)によるサテライト細胞単離用細胞懸濁液の調製(図1)
- 筋肉組織の分離
- 鉗子、メス、ハサミなどの筋肉解剖用器具を洗浄剤(表1)で除染し、蒸留水で十分にすすいでください。
- それぞれ1 mLの筋肉分離バッファーを含む2 mLのチューブを2本用意し(表1)、それらを氷上に置いて、採取した筋肉を採取します。
- 生後10週齢のC57/Bl6J雄マウス2匹をCO2 窒息とそれに続く子宮頸部脱臼で犠牲にする。70%エタノールを各マウス全体にスプレーします。鉗子を使って後肢の皮膚をはがします。大腿骨、脛骨、腓骨を取り巻くすべての四肢の筋肉を解剖します(マウス1匹あたり約1mgの筋肉)。
注:サテライト細胞数は、生後15週以降に減少します。 - 採取した四肢の筋肉を、ステップ1.1.2で調製した1 mLの筋肉分離バッファーを含む2 mLのチューブに入れます。同じ手順に従って、2匹目のマウスから筋肉を収集します。採取した筋肉を氷の上でハサミで1mm未満 3個の破片が得られるまでみじん切りにします。
注:筋肉は、主に12に記載されているように収集され、ミンチされました。ステップ1.2または1.3のいずれかに従って組織消化を実行します。
- コラゲナーゼ酵素による組織消化
- 2匹のマウスからミンチにした筋肉懸濁液を、18 mLの筋分離バッファー(5 mL [5 U/mL]のディスパーゼと5 mgのI型コラゲナーゼを添加したもの)を含む50 mLのチューブ(表1)に注ぎ、移します(表1)。
- チューブをしっかりと閉じ、実験用フィルムで密封します(表1)。37°C、100rpmで30分間、振とう水浴(表1)に水平に置きます。
- 30分後、5mgのI型コラゲナーゼを添加します。チューブを37°C、100rpmの振とう水浴中でさらに30分間撹拌します。
- 消化後、10 mLのピペットで筋肉懸濁液を上下に10回ピペットで移動し、解離効率を向上させます。4°C、400 x g で5分間遠心分離します。チューブの底に透明なペレットが見えます。10 mLのピペットを使用して上清を廃棄し、5 mLの培地をチューブに残します。
注:培地を離れることで、細胞にストレスがかかるのを防ぐことができます。10 mLの新鮮な筋肉分離バッファーを添加し、10 mLピペットでピペッティングしてペレットを再懸濁します。 - 100 μm、70 μm、および40 μmのセルストレーナー(各種類1つ)(表1)を開いた50 mLチューブに置きます。懸濁液を連続したセルストレーナー(100 μm、70 μm、40 μm)にピペットで移し、40 μm未満の細胞を含む50 mLチューブにフロースルーを回収します。
- 懸濁液を4°C、400 x g で5分間遠心分離します。10 mLのピペットを使用して2 mLが残るまで上清を廃棄し、次に100〜200 μLが残るまで0.2〜1 mLのピペットを使用します。ペレットを2 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁します(表2)。氷上で3分間インキュベートします。
- 4°C、400 x g で5分間遠心分離し、20〜200μLのピペットを使用して上清を廃棄します。細胞を100 μLの低温FACSバッファーに再懸濁します(表2)。氷の上に置きます。
- リベラーゼサーモリシン低(TL)酵素による組織消化の代替法
- 手順 1.1 の説明に従います。組織分離用。
- リベラーゼを介した組織解離では、ステップ 1.1.2 で説明した筋肉分離バッファーではなく、2 mL の Roswell Park Memorial Institute(RPMI)単離バッファー(表 2)で筋肉を採取します。
- 2匹のマウスからミンチにした筋肉懸濁液を、18 mLのRPMI分離バッファーを含む50 mLのチューブ(表1)に注ぎ、300または600 μLのリベラーゼTLを5 mg/mL(表1)(すなわち、最終濃度はそれぞれ0.083 mg/mLおよび0.167 mg/mL)で移します13。
- チューブをしっかりと閉じ、実験用フィルムで密封します(表1)。37°C、100rpmで30分間、振とう水浴(表1)に水平に置きます。
- 消化後、10 mLのピペットで筋肉懸濁液を上下に10回ピペットで移動させて解離させ、解離効率を改善します。
- 4°C、400 x g で5分間遠心分離します。チューブの底に透明なペレットが見えます。10 mLのピペットを使用して上清を廃棄し、5 mLの培地をチューブに残します。培地を離れることで、細胞にストレスがかかるのを防ぐことができます。10 mLの新鮮なRPMI分離バッファーを添加し、10 mLのピペットでピペッティングしてペレットを再懸濁します。
- 100 μm、70 μm、および40 μmのセルストレーナー(各種類1つ)(表1)を開いた50 mLチューブに置きます。
- 懸濁液を連続したセルストレーナー(100 μm、70 μm、40 μm)にピペットで移し、40 μm未満の細胞を含む50 mLチューブにフロースルーを回収します。
- 懸濁液を4°C、400 x g で5分間遠心分離します。10 mLのピペットを使用して2 mLが残るまで上清を廃棄し、次に100〜200 μLが残るまで0.2〜1 mLのピペットを使用します。
- ペレットを2 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁します(表2)。氷上で3分間インキュベートします。
- 4°C、400 x g で5分間遠心分離し、20〜200μLのピペットを使用して上清を廃棄します。
- 細胞を100 μLの低温FACSバッファーに再懸濁します(表2)。氷の上に置きます。
- FACS単離のための細胞懸濁液の調製
- ステップ1.2.12で得られた細胞懸濁液10 μLを新しい1.5 mLチューブに移します。このサンプルは、未染色対照またはネガティブコントロールを構成します(図2)。190 μL の FACS バッファーを添加し、5 mL チューブ(表 1)に移し、氷上に保存します。
- ステップ1.2.12で得られた細胞懸濁液の残りの90μLを4°C、400× g で5分間遠心分離し、ピペット(チップ容量20〜200μL)を使用して上清を廃棄します。無血清ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)で希釈した400 μLの固定生存率染色剤(表3)と細胞を室温(RT)で15分間インキュベートします。
- 4°C、400 x g 、5分間遠心分離して細胞を洗浄し、100 μLのFACSバッファーを加えます。チューブを静かに3回反転させ、再び4°C、400 x g で5分間遠心分離します。
- 遠心分離中に、蛍光色素に結合し、CD11b、CD31、CD45、TER119、CD34、ITGA7、CXCR4(表3)に対する一次抗体のマスターミックスを100 μL調製し、FACSバッファーで希釈します。
- 4°Cで400 x g で5分間遠心分離し、ピペット(チップ容量20-200 μL)を使用して細胞上清を廃棄し、100 μLの抗体混合物を加えます。チューブを3回静かに反転させます。ボルテックスしないでください。氷の上で暗所で30分間インキュベートします。
- 400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 20〜200μLのピペットを使用して上清を廃棄し、500μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて細胞を洗浄します。チューブを3回静かに反転させます。4°Cで400 x g で5分間再遠心分離し、20〜200 μLのピペットを使用して上清を廃棄します。
- 細胞ペレットを500 μLのFACSバッファーに再懸濁し、懸濁液を5 mLチューブに移します。
注:リベラーゼ消化から得られた細胞懸濁液も同様の方法で処理されます。
- FACSによるサテライトセルの選定
- 細胞懸濁液を短時間ボルテックス(2〜5秒)し、100μmノズルを備えたフローサイトメーターで細胞を処理します(表1)。
- ステップ 1.4.1 で保存した未染色サンプルに基づいて、さまざまなゲートサイズを決定します(図 2)。
- 5 mL チューブに 1 mL の純粋なウシ胎児血清(FCS)をコーティングして細胞収集を改善し、500 μL の FACS バッファーを追加します。
- 未染色のサンプルを抗体標識サンプルと交換します。
- 前方散乱領域(FSC-A)と側方散乱領域(SSC-A)に従って目的の母集団を選択し(図3A)、FSC-Aと前方散乱高さ(FSC-H)でダブレット細胞を除去します(図3B)14。
- 生存率の固定可能な染色陰性染色で生細胞を同定します(図3C)。
- CD31、CD45、TER119、およびCD11bの陰性細胞を選択します(図3D)。
- サテライト細胞を同定するには、まずCD34およびITGA7陽性の細胞を選択し(図3E)、次にCD34およびITGA7を選択した集団のCXCR4陽性細胞を選択します(図3F)。
- 選択した細胞(調製物の品質に応じて40,000〜80,000個の細胞)を、500 μLのFACSバッファーを含む5 mLコーティングチューブに集めます。
2. 組織培養における単離集団のバリデーション
- ハイドロゲルによるスライドコーティング
- 280 μLの純粋なハイドロゲルヒト胚性幹細胞(hESC)修飾マトリックス(表1)を12 mLの無血清DMEM/F12培地で希釈します。
- チャンバースライド(表1)をハイドロゲル溶液でコーティングし、4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、細胞播種前にチャンバースライドを37°C、5%CO2 で1時間インキュベートします。
- 細胞の増殖と分化
- ステップ1.5.9で得られた約20,000個の細胞を1ウェルあたりプレーティングし、増殖培地(表2)中で5日間増殖させます。明視野顕微鏡(図4A)を使用して位相差画像を撮影し、免疫蛍光分析用に処理して、調製物の品質を確保します(図4B)。
- 筋形成を誘導するには、ステップ2.2.1の増幅サテライト細胞を筋原性培地(表2)中でさらに7日間増殖させます。免疫蛍光分析用に処理する前に明視野顕微鏡(図4C)を使用して位相差画像を撮影し、調製の品質を確保します(図4D)。
- 免疫細胞蛍光分析
- 培地を静かに取り出し、チャンバースライドで培養した細胞を100 μLの1x PBSで2回洗浄し、100 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で1時間固定します。
注意: この手順は注意して実行する必要があります。細胞にストレスがかからないように、常に少量の培地をチャンバー内に保管し、PBSをチャンバーの壁から注ぐ必要があります。 - 細胞膜を透過させるために、0.1% Tween 20(PBST)を添加した1x PBS100 μLで細胞を3回洗浄します。
- 100 μL の 1x PBST に 5% FCS(PBST-FCS)を添加した 1 時間室温でインキュベーションすることにより、非特異的なシグナルをブロックします。
- 100 μLの抗PAX7抗体および抗ジストロフィン(DMD)抗体(1x PBST-FCSで希釈)のマスターミックスと4°Cで一晩インキュベートし、サテライト細胞および筋線維をそれぞれ検出します。
- 細胞を100 μLの1x PBSTで3回洗浄し、1x PBST-FCSで希釈した100 μLのヤギ抗マウスCy3またはヤギ抗ウサギAlexa 488二次抗体(表3)と室温で1時間インキュベートします。
- サプライヤーが提供する装置を使用してチャンバーウェルをスライドから分離し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む20 μLの水性封入剤を添加し、スライドをカバーガラスで覆います(表1)。
- 共焦点顕微鏡で染色された細胞を観察し、画像を撮影します。
- 画像解析ソフトウェアを使用して画像を処理します(図4B、D)。
- 培地を静かに取り出し、チャンバースライドで培養した細胞を100 μLの1x PBSで2回洗浄し、100 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で1時間固定します。
3. CUT&RUN解析
- FACS単離サテライトセルのCUT&RUN解析用サンプル調製
注: CUT&RUNは、基本的に説明どおりに実行されました10,15.バッファー組成は、 表 2.- CUT&RUNアッセイでは、試験が必要なサンプル/抗体1個につき、メソッド1のステップ1.5.9で得られた細胞を約40,000個使用します。
- FACSで単離したサテライトセルを室温で500 x g で10分間遠心分離し、ピペット(チップ容量20-200 μL)を使用して上清を廃棄します。
- 細胞を1 mLの1x PBSで洗浄し、室温で500 x g で5分間遠心分離し、ピペット(チップ容量0.2〜1 mL)を使用して上清を廃棄し、1 mLの低温核抽出バッファーに再懸濁します(表2)。氷上で20分間インキュベートします。
- インキュベーション中に、850 μL の常温結合バッファー(表 2)を含む 1.5 mL チューブを 1 本調製し、サンプルあたり 20 μL のコンカナバリン A コーティング磁気ビーズを添加します(表 1)。
- 磁気ラックを使用して、ビーズを1 mLの常温結合緩衝液で2回洗浄します(表1)。手順全体を通して洗浄またはバッファーを交換するたびに、ビーズを磁気ラックのチューブの側面に5分間蓄積させてから、透明化した上清をピペット(チップ容量0.2〜1 mL)で除去します。その後、300 μLの低温結合バッファーに静かに再懸濁します。
- 核を4°C、600 x g で5分間遠心分離し、600 μLの核抽出バッファーに静かに再懸濁します。抽出した核 600 μL と 300 μL のコンカナバリン A ビーズスラリーを穏やかに混合し、4 °C で 10 分間インキュベートします。
- ステップ 3.1.4 で説明したように磁気ラックを使用して上清を除去し、ビーズ結合核を 1 mL のコールドブロッキングバッファーで穏やかに再懸濁します(表 2)。室温で5分間インキュベートします。
- 磁気ラックを使用して上清を除去し、ビーズ結合核を1 mLのコールドウォッシュバッファーで2回洗浄します(表2)。2回目の洗浄では、ビーズ結合核を1.5 mLチューブに均等に分割します。各チューブは、次のステップで特定の抗体で処理されます。
注:この例では、250 μL のビーズ結合核を 4 本の 1.5 mL チューブに分割しました。 - ステップ3.1.4で説明したように、磁気ラックを使用して上清を分離し、ピペットで吸引します。核/ビーズ複合体を、特異的一次抗体(表3)、または250 μLのコールドウォッシュバッファーで希釈した別の動物種(ここではウサギ)のIgGで静かに再懸濁します。穏やかに撹拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。
注:ここで使用する抗体は、AR、H3K4me2、およびH3K27acに対するものです。 - ステップ3.1.4で説明したように、磁気ラックで上清を取り除き、ビーズ結合核を1 mLのコールドウォッシュバッファーで2回洗浄し、100 μLのコールドウォッシュバッファーに再懸濁します。
- プロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼを1.4 ng/μLで希釈し、100 μLのコールドウォッシュバッファーサンプルに含みます。
- 3.1.11で得られたサンプル100 μLにプロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼ100 μLを加え、4°Cで1時間撹拌しながらインキュベートします。
- ステップ3.1.4で説明したように、磁気ラックで上清を除去し、1 mLのコールドウォッシュバッファーで2回洗浄し、ビーズ結合核を150 μLのコールドウォッシュバッファーに再懸濁します。
- DNA切断を開始するには、150 μLのサンプルに100 mMのCaCl2 3 μLを加え、フリックしてすばやく混合し、氷上で30分間インキュベートします。150 μLの停止バッファーを添加して反応を停止し、37°Cで20分間インキュベートしてRNAを消化し、DNA断片を遊離させます。
- DNA抽出の場合は、サンプルを16,000 x g 、4°C、5分間遠心分離します。
- 上清を新しいマイクロチューブに移し、ペレットとビーズを廃棄します。
- 10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)3 μLと20 mg/mLプロテイナーゼK2.5 μLを加え、反転させて混合します。70°Cで10分間インキュベートします(振とうなし)。
- 300 μL のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを加え、ボルテックスし、2 mL フェーズロックチューブ(16,000 x g で 5 分間スピン済み)に移し、16,000 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
- 同じチューブに300 μLのクロロホルムを加え、4°C、16,000 x g で5分間遠心分離します。 上清(~300 μL)をピペット(チップ容量0.2-1 mL)で回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。
- グリコーゲン1μL(濃度20mg/mL)を添加します。
- 750μLの100%エタノールを加え、-20°Cで一晩沈殿させます。
- 4°C、16,000 x gで15分間遠心分離してDNAをペレット化します。 ペレットを1mLの100%エタノールで洗浄し、16,000 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、16,000 x gで30秒間遠心分離し、ピペット(チップ容量20〜200μL)で液体を除去します。
- ペレットを~5分間風乾します。25 μL の 1 mM Tris-HCl(pH 8)と 0.1 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA;pH 8)に再懸濁します。
- バイオインフォマティクス解析
- 免疫切断されたDNAからライブラリを調製し、16に記載されているように、ゲノムプラットフォームの助けを借りて、ペアエンド100 bpリードとして配列決定します。
- ENCODEブラックリスト領域(V2)と重複するリードを除去し、残りのリードを2つのグループに分けます:フラグメントサイズ<120 bp(ヌクレオソームなし、通常は転写因子用)とフラグメントサイズ>150 bp(ヌクレオソームあり、通常はヒストンマーク用)です。Bowtie 2 (v2.3.4.3)17 を使用して mm10 参照ゲノムにマッピングします。
- bamCoverage で bigwig ファイルを生成します (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20)。
- 一意にマッピングされたリードを保持し、さらに分析します。
- genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0) を使用して生のベッドグラフ ファイルを生成します。
- ピークコールには SEACR 1.3 アルゴリズム(strictent オプション)を使用します。ゼロシグナルを含む領域を省略したUCSCベッドグラフ形式のターゲットデータベッドグラフファイルと、ピークコール18の経験的しきい値を生成するコントロール(IgG)データベッドグラフファイルをロードします。
- ディープツールを用いてピアソン相関分析を行い、標本間の類似性を判定する19。コマンドライン multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz を使用し、その後に plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab を使用します。
- ベッドグラフファイルとSEACRから得られたベッドファイルピークを使用して、IGV20 でゲノムワイドな強度プロファイルを可視化します。
- ピークアノテーションとモチーフ検索にHOMERを使用21.
- 最後に、データセットをChIP-Atlas Peakブラウザで以前に公開したものと比較し、IGVで可視化したり、SEACRで生成したベッドファイルを入力データセットとして使用して濃縮分析を行ったりします22。
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Representative Results
マウス骨格筋からのサテライト細胞は、Gunther et al.(以下、プロトコル1)12 およびLiuら23 (以下、プロトコル2)のプロトコルを組み合わせて単離した。プロトコル1で提案された濃度のコラゲナーゼとディスパーゼを使用すると、消化後に未消化の筋線維が観察されたため、ステップ1.2.1および1.2.3に記載されているように、酵素の量を増やして筋線維の解離を改善しました。プロトコル2に示されているように、サンプルは、細胞の生存率を維持するために、水浴中で穏やかに攪拌されました。プロトコル1で述べたように、細胞ストレーナーによるろ過、および赤血球溶解バッファーによるインキュベーションを実施しました(ステップ1.2.7〜1.2.10を参照)。プロトコル 1 では、細胞を 30%/70% のパーコール密度勾配にロードして、中間期に単核細胞を単離したため、目的の細胞が失われた可能性があります。したがって、このステップは、議定書2で提案されているように、省略されました。
FSC-AゲーティングとSSC-Aゲーティングを使用して、サイズ(FSC)と粒度(SSC)に基づいて単核細胞を同定しました(図3A)。FSC-A軸上の40K未満の事象を無視してデブリスを除外し、細胞の38.8%±3.6%を選択した。FSC-A 対前方散乱光高さ(FSC-H)のゲーティング密度プロットをダブレット排除に使用しました(図 3B)。固定可能な生存率染色マーカーで陰性の細胞を選択した後、生細胞の平均34.3%±7.7%が得られました(図3C)。
図3Cのドットプロットに示されているパーセンテージ(75.4%)は、親細胞集団(この場合はシングル細胞)から計算された単一の生細胞の割合に対応しています。単一細胞の95.7%は、イベント全体の35%を占めるライブイベントから得られます。したがって、平均で得られたパーセンテージ34.3%は、親母集団ではなく、イベント全体から計算されます。
単一生細胞の約3%が、白血球マーカー(CD45)、単球マーカー(CD11b)、内皮マーカー(CD31)、および赤血球特異的マーカー(TER119)に対して陰性でした(図3D)。次に、CD34(造血系、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞)およびITGA7(心臓、平滑筋、骨格筋細胞)マーカーの発現に従って、CD11b/CD45/CD31/TER119陰性細胞を選択しました(図3E)。CXCR4(リンパ球、造血細胞、サテライト細胞)の最終ゲーティングを行い、推定サテライト細胞を選択しました(図3F)。CD34+/ITGA7+細胞から、~80%がCXCR4陽性であることが判明し、これは全単一生細胞の平均1%±0.15%に相当し、14の独立した実験において、マウス四肢筋あたり60,000±14,000の推定衛星細胞の絶対数に相当します。CXCR4+細胞分画に関する追加のリゾート評価により、生細胞の約80%がポストソーティング後に得られ、そのうち約70%がCXCR4+であることが明らかになり(図S1)、このFACS単離細胞集団の高い生存率と純度が示されました。
さまざまな研究で、細胞単離のためのコラゲナーゼとリベラーゼTL酵素の効率が比較されたため24,25、これら2つの消化法は並行して処理されてきました。300 μL のリベラーゼ TL では、未消化の繊維が残っていたため、コラゲナーゼよりも消化効率が低下しました。さらに、より多くの細胞破片と大きなイベントが観察され(図S2A、B)、FVS 780選択後に得られた単一の生細胞の平均はわずか17.3%でした(図S2C)。リベラーゼ消化に関するさらなる懸念は、CXCR4ゲーティングが類似しているにもかかわらず(図S2F)、コラゲナーゼと比較してCD34+/ITGA7+細胞の数が少ないことでした(図S2D-S2E)。600 μL のリベラーゼ TL では、消化がより効率的でした。しかし、細胞破片の量は高いままであり、細胞生存率は標準以下(16.3%)でした(図S3)。したがって、リベラーゼTLによる消化は、サテライト細胞の単離では効率が悪かった。
播種すると、CD34+/ITGA7+/CXCR4+細胞(図4A)の70%以上がPAX7を発現し(図4B)、PAX7陰性のCD34+/ITGA7-/CXCR4-細胞(図4C)とは対照的でした。ジストロフィン(DMD)染色(図4D)が示すように、CD34+/ITGA7+/CXCR4+細胞は、筋原性培地でさらに7日間増殖させると筋線維に分化することができ、筋原性が確認されました。したがって、組織培養と免疫蛍光を組み合わせた分析により、FACSで単離されたCD34+/ITGA7+/CXCR4+細胞がサテライト細胞であることが示されました。
単離されたサテライト細胞がCUT&RUN解析に適しているかどうかを判断するために、活性プロモーター領域とエンハンサー領域に見られる2つのヒストン修飾であるヒストンH3のアセチル化リジン27(H3K27ac)とジメチル化リジン4(H3K4me2)のゲノムプロファイルを決定しました。我々のデータでは、H3K4me2とH3K27acについてそれぞれ68,694個と13,514個のピークが明らかになり、2つのヒストンマーク間で同様のゲノム再分割が見られました(図S4A)。詳細に見ると、ピークの4分の1は最も近い遺伝子の転写開始部位(TSS)から2kb±位置しており、その大部分はTSSから-100kbから-10kb、または10kbから100kbの位置にあることがわかりました(図S4B)。注目すべきは、Pearsonの解析で、H3K27acとH3K4me2のリードプロファイルの間に80%の相関があることが示されたことです(図S4C)。上記のプロトコルから調製されたクロマチンがサテライト細胞から単離されたことを評価するために、サテライト細胞特異的遺伝子のプロモーターにおけるH3K27acおよびH3K4me2の存在を決定した。H3K4me2は、Pax7、Itga7、Lamb2、Cxcr4、およびVcam1のTSSの周囲に濃縮されましたが(図5A)、Itgam(CD11b)およびPtprc(CD45)(免疫細胞)、Pecam(CD31;内皮細胞)(図5B)、Ckm(発達中の筋線維)、またはMyh3(ミオシン重鎖高速胚性筋線維)(図5C)では濃縮されませんでした。H3K27acでも同様の結果が得られました(図5)。IgGサンプルでは、ほとんどシグナルが得られませんでした(図5)。さらに、SEACRから得られたH3K27acピークと、公開されているChIP-seqデータセットからのMACS2ピークコールから得られたピークを比較したところ、各パネル(ChIP-Atlasトラック;図5)。これらの結果を総合すると、バイオインフォマティクス解析後に得られたリードは、FACSで単離されたサテライト細胞のクロマチンに由来し、ChIP-seq解析によって以前に同定されたリードと相関していることを示しています。
マウスサテライト細胞における単一細胞RNA配列決定研究は、単離手順26によって引き起こされる顕著なストレス応答を示したが、H3K4me2またはH3K27acの存在は、 Atf3、 Azin1、 Gls、および Elf2に例示されるように、ストレス応答遺伝子において決定された。この結果は、H3K27acマークがそのような遺伝子のプロモーターに沈着しておらず、H3K4me2のレベルが衛星細胞特異的遺伝子で得られたものと比較して低いままであるという証拠を提供します(図S5)。したがって、これらのデータは、分離手順がいかに穏やかであるかを強調しています。
次に、転写因子の単離法の適合性を検討した。核内受容体スーパーファミリーに属し、筋原性分化に重要な役割を果たす転写因子であるアンドロゲン受容体(AR)のCUT&RUN解析27により、7,840のピークが解明されました。これらのピークは、主にイントロン領域および遺伝子間領域(図S4A)にあり、TSSから-100 kb〜-10 kb、または10 kb〜100 kbのいずれかでした(図S4B)。系統解析により、ARは、グルココルチコイド(GR/Nr3c1)、ミネラルコルチコイド(MR/Nr3c2)、およびプロゲステロン(PR/Nr3c3)受容体と並んで、オキソステロイド核内受容体サブファミリー28のメンバーであり、3つの塩基対で区切られた2つの5′-RGAACA-3′回文ハーフサイトで構成されるDNAセグメントにホモ二量体として結合することが明らかになりました29。.モチーフ濃縮の超幾何学的最適化(HOMER、http://homer.ucsd.edu/homer/)によって既知のモチーフを探索したところ、ARは、標的領域の>32%、17%、および2%の5'-RGNACAnnnTGTNCY-3'ARコンセンサスモチーフに結合していることを明らかにした5'-RGNACAnnnTGTNCY-3'ARコンセンサスモチーフ、 それぞれ(図6A)。骨格筋16のグルココルチコイド受容体についても同様の割合が以前に得られたことに留意すべきである。
SEACRの分析では、ピークスコアが>50の約500のピークが明らかになり、そのうち200以上がスコア>100でした。その一部を 図6Bに例示する。また、ポリアミン生合成に関与する遺伝子(Amd1、 Oat、 Smox)および前立腺がん(Acox1、 Fkbp5、 Tmprss2)に関与する遺伝子の結合部位において、ARがわずかに濃縮されていることも明らかになりました(図S6)。興味深いことに、ARはサテライト細胞の幹細胞性に関与する遺伝子座(Pax7、 Cxcr4、 およびCd34)で見つかりました(図S7)。注目すべきは、オキソステロイド応答要素がこれらのAR濃縮領域のそれぞれで見られ(図S6 および 図S7)、CUT&RUNデータで見られるARシグナルが非常に特異的であることを示しています。
図1:マウス四肢の筋肉からサテライト細胞を単離するために使用されるプロトコルの概略図。プロトコルは4つのメインステップで構成されています。簡単に言うと、マウスを生贄に捧げ、後肢の筋肉を採取し(ステップ1.1.1-1.1.3)、ハサミを使って機械的にミンチにします(ステップ1.4-1.5)。これに続いて、ステップ1.2.1-1.2.4が続き、その間にコラゲナーゼとディスパーゼを使用して水浴で筋肉を解離します。ステップ1.2.5-1.2.8では、細胞懸濁液を100、70、および40μmのセルストレーナーで連続的に濾過し、赤血球溶解バッファーを使用して赤血球を除去します(ステップ1.2.9-1.2.12)。残りの細胞集団は、ステップ1.3で、特定の細胞表現型マーカーに対する蛍光色素に結合した抗体で標識されます。ステップ1.4には、FACSを通過するサンプルが含まれており、さらなるアプリケーションのためにサテライトセルを収集します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:未染色細胞調製のフローサイトメトリー解析。 (A)FSC-AおよびSSC-Aパラメータに基づく対象集団の選択。(B)FSC-AおよびFSC-Hに基づく単一細胞の同定。(C)死細胞をマーキングする固定生存率染色(FVS 780)に結合したAPC-Cy7について採取した細胞の自家蛍光閾値の特性評価。(D-F)です。CD11b抗体に結合したPE-Cy7およびTER119/CD45/CD31マーカーに結合したPE-Cy7およびITGA7に結合したAlexa fluor 488、CD34に結合したAlexa fluor 405(E)、CXCR4に結合したAPC蛍光色素(F)の自家蛍光測定。ゲートはブラックボックスとして表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:サテライトセルソーティングのためのフローサイトメーターゲーティング戦略。 (A)FSC-AおよびSSC-Aパラメータに基づく対象集団の選択。(B)FSC-AおよびFSC-Hに基づく単一細胞の同定。(C)FVS 780による生細胞の同定。(D)CD11b、CD31、CD45、およびTER119抗原に基づく陰性細胞選択。(E-F)CD34およびITGA7(E)、ならびにCXCR4(F)抗原に基づく陽性細胞選択。ゲートはブラックボックスとして表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:FACSで単離したCD34+/ITGA7+/CXCR4+およびCD34+/ITGA7-/CXCR4-細胞の解析。 (A)増殖培地で培養したCD34+/ITGA7+/CXCR4+およびCD34+/ITGA7-/CXCR4-細胞の位相差画像。(B)PAX7(赤)およびジストロフィン(DMD、緑)に対する抗体を用いて増殖培地で培養したCD34+/ITGA7+/CXCR4+およびCD34+/ITGA7-/CXCR4-細胞の免疫蛍光分析。核をDAPI(青色)で染色した。マゼンタの矢印はPAX7陽性細胞を示します。(C)増殖培地で5日間増殖させたCD34+/ITGA7+/CXCR4+細胞(左パネル)と筋原性培地でさらに7日間増殖させた細胞(右パネル)の位相差画像。(D)PAX7(赤)およびジストロフィン(DMD、緑)に対する抗体を用いて、増殖培地で5日間増殖させたCD34+/ITGA7+/CXCR4+細胞の免疫蛍光分析画像(左パネル)および筋原性培地でさらに7日間増殖させたもの(右パネル)。核をDAPI(青色)で染色した。マゼンタの矢印はPAX7陽性細胞を示します。緑色の矢印はDMD陽性細胞を示します。スケールバー:明視野パネル = 25 μm;免疫蛍光パネル = 50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:サテライト細胞クロマチンのゲノムプロファイル。 衛星細胞特異的遺伝子(A)、免疫細胞特異的遺伝子(B)、筋線維特異的遺伝子(C)のサテライト細胞クロマチンへのH3K4me2およびH3K27acのCUT&RUNによる局在。活性プロモーターは緑色で囲まれ、不活性プロモーターは茶色で囲まれています。IgGを用いたCUT&RUNをネガティブコントロールとして使用しました。ヒストンマークのH3K27ac濃縮分析は、各トラックの下に表示されます。公開されたデータセットの信頼度を示すエンリッチメント スコアは、ヒートマップとして表されます。褐色の星(*)は筋サテライト細胞で発生したH3K27ac ChIP-seqピーク、青い星はH3K4me3、ピンク色の星はH4K16me1です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:サテライト細胞クロマチン上のARゲノム分布 。 (A)衛星細胞におけるARピークのHOMER既知のモチーフ解析。PR:プロゲステロン受容体。Nbターゲットとは、特定のモチーフを呈するピークの数を指す。(B) CUT&RUNで測定したサテライト細胞のクロマチン上のH3K4me2およびARの示された遺伝子への局在。IgGを用いたCUT&RUNをネガティブコントロールとして使用しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:材料、試薬、およびソフトウェアのリスト。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:緩衝液の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:抗体の参照と濃度。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:ソーティング後の細胞調製物のフローサイトメトリー解析。(A)FSC-AおよびSSC-Aパラメータに基づく対象集団の選択。(B)FSC-AおよびFSC-Hに基づく単一細胞の同定。(C)固定可能な生存染色(FVS 780)を有する生細胞の同定。(D)CD11b、CD31、CD45、およびTER119抗原に基づく陰性細胞選択。(E-F)CD34およびITGA7(E)およびCXCR4(F)抗原に基づく陽性細胞選択。ゲートはブラックボックスとして表されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:300 μLのリベラーゼTLによる消化後のサテライト細胞ソーティングのためのフローサイトメーターゲーティング戦略。(A)FSC-AおよびSSC-Aパラメータに基づく対象集団の選択。(B)FSC-AおよびFSC-Hに基づく単一細胞の同定。(C)FVS 780による生細胞の同定。(D)CD11b、CD31、CD45、およびTER119抗原に基づく陰性細胞選択。(E-F)CD34およびITGA7(E)およびCXCR4(F)抗原に基づく陽性細胞選択。ゲートはブラックボックスとして表されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:600 μLのリベラーゼTLによる消化後のサテライト細胞ソーティングのためのフローサイトメーターゲーティング戦略。(A)FSC-AおよびSSC-Aパラメータに基づく対象集団の選択。(B)FSC-AおよびFSC-Hに基づく単一細胞の同定。(C)FVS 780による生細胞の同定。(D)CD11b、CD31、CD45、およびTER119抗原に基づく陰性細胞選択。(E-F)CD34およびITGA7(E)およびCXCR4(F)抗原に基づく陽性細胞選択。ゲートはブラックボックスとして表されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:H3K4me2、H3K27ac、およびARゲノム位置の特性評価。 (A)H3K4me2、H3K27ac、ARのピーク分布をサテライト細胞のゲノム特徴別に描いた円グラフ。(B)H3K4me2、H3K27ac、ARのピーク分布を、衛星セル内の最も近いTSSまでの距離で示した円グラフ。(C)H3K4me2、H3K27ac、およびIgGコントロール間のピアソン相関を示すヒートマップ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:ストレス応答誘導遺伝子におけるサテライト細胞クロマチンのゲノムプロファイル。 H3K4me2およびH3K27acのサテライト細胞クロマチン上の指示遺伝子への局在。IgGによる免疫沈降をネガティブコントロールとして使用しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:既知のAR標的遺伝子におけるサテライト細胞クロマチンのゲノムプロファイル。 H3K4me2、H3K27ac、およびARのサテライト細胞のクロマチン上の指示遺伝子への局在をCUT&RUNで決定。ARピークは青色で囲まれており、対応するARレスポンシブ要素を以下に示します。IgGを用いたCUT&RUNをネガティブコントロールとして使用しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図7:サテライト細胞クロマチンの選択発現遺伝子のゲノムプロファイル。 H3K4me2、H3K27ac、およびARのサテライト細胞のクロマチン上の指示遺伝子への局在をCUT&RUNで決定。ARピークは青色で囲まれており、対応するARレスポンシブ要素を以下に示します。IgGを用いたCUT&RUNをネガティブコントロールとして使用しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究は、マウスサテライト細胞の単離と培養、ならびにCUT&RUN法による転写制御の評価のための標準化された信頼性と実施が容易な方法を報告する。
このプロトコルには、いくつかの重要なステップが含まれます。1つ目は、筋肉の破壊と繊維の消化で、多くの細胞を確実に集めることです。酵素濃度が上昇したにもかかわらず、プロトコル1を使用した場合よりも多くの生細胞が得られました。サテライト細胞は、さまざまな膜タンパク質の特定のパターンを発現します。選別の厳密性を高めるために、前述のネガティブ(CD31、TER119、CD45、およびCD11b)とポジティブ(CD34、ITGA7、およびCXCR4)のサテライトセルマーカーの組み合わせを使用しました30,31。この戦略を用いて、生きている推定サテライト細胞の平均1%が得られました。サテライト細胞はマウスの成体期の筋細胞集団の2%〜7%を占めるため、この結果は予想された範囲です32。サテライト細胞選択マーカーのコントロールとして、CD34+/ITGA7-/CXCR4-細胞を単離した。免疫蛍光染色により、CD34+/ITGA7-/CXCR4-細胞はPAX7を発現しないのに対し、CD34+/ITGA7+/CXCR4+ソートされた細胞の70%がこのサテライト細胞特異的マーカーに陽性であることが示され、FACS単離集団がサテライト細胞に対応することが実証されました。また、筋原性培地で7日間増殖させたサテライト細胞の70%がPAX7-/DMD+であり、細長い多核筋線維を形成し、単離されたサテライト細胞が幹細胞性電位を保存していることが示されました。
サンプル調製における主な制限は、高濃度の酵素を使用することであり、その結果、大量の解離した生体物質が得られますが、細胞死の増加に寄与する可能性があります。この問題を解決するために、より少ない酵素量を必要とするアッセイが試験されました。これに関連して、従来のコラゲナーゼ33の精製形態であるリベラーゼTLが試験されました。この酵素では消化が明らかに効率的になりましたが、細胞破片の量は増加したままであり、細胞生存率はわずかに低下しました。これらの観察結果は、リベラーゼを介した組織消化を組換えコラゲナーゼまたはカスタムコラゲナーゼと比較した以前の報告と一致しています24,25。さらに、内皮細胞と免疫細胞の割合はコラゲナーゼとリベラーゼ消化でほぼ同じでしたが、リベラーゼで処理したサンプルではサテライト細胞の割合が低く、全体的にリベラーゼはサテライト細胞の単離には推奨されないことが示されました。この酵素の使用は、免疫細胞の表現型および定量分析に適しており、最終的には筋肉および/または他の組織の文脈で推奨される可能性があります。これは、リベラーゼTLが生存免疫細胞を効果的に分離するのに最も適していると報告されているものと一致しています34,35,36。
もう一つの潜在的な問題は、サテライトセルの解離と選別の両方によって引き起こされるストレスです。しかしながら、マウス衛星細胞における単一細胞RNAシーケンシングによって同定されたストレス応答遺伝子のプロモーター領域におけるH3K27acの不在および低H3K4me2レベル26は、この手順がストレス応答転写レパートリーを誘導しないのに十分穏やかであることを示している。注意すべき他の制限は、経験的なままの選択された抗原です。しかし、研究は、骨格筋サテライト細胞に富むユニークな表面マーカーの組み合わせの間に高い重複があることを示しています30,31。
さらに重要なステップは、選別された細胞からの核の精製です。このため、細胞を傷つけないように選別速度を低く保ちますが、FACSバッファーに長時間保存しすぎないように十分な速度を維持します。実際、CUT&RUNの核は固定されておらず、インキュベーション時間が長くなると、プロトコールから得られるリードに影響を与える可能性があります。1匹のマウスの2つの後肢から作製した典型的な調製物では、1つの抗体と1つのIgGコントロールで、それぞれ2.5 ngのクロマチン量でCUT&RUNを行うことができます。
転写因子の結合とエピジェネティックな修飾を評価するためにデザインされたCUT&RUN実験により、H3K4me2とH3K27acの強力で頑健なリードシグナルが得られました。サテライト細胞で発現することが知られている遺伝子のH3K4me2およびH3K27acのリードレベルは、免疫細胞や内皮細胞、筋線維で発現している遺伝子と比較して、シグナルが主にサテライト細胞の核から増幅されていることを示しました。さらに、このプロトコルは、マウスAR抗体の質の低さと、上皮性前立腺細胞などの男性ホルモン感受性が高くない細胞のAR発現レベルが低いことに固有の技術的問題である筋肉幹細胞のARのシストロムの識別を可能にしました。ここで紹介したデータにより、信頼度の高いピークスコアを持つAR結合領域が明らかになりました。当初は1つの抗体につき1つのレプリケートしか評価されていなかったため、条件ごとに少なくとも2つの生物学的レプリケートを追加することで、データセットの頑健性が向上します。しかし、ARの既知の標的遺伝子およびそれぞれのヒストンマークは、当初は高発現および/または前立腺などの他の組織状況で容易に検出できると説明されていましたが、発現レベルが低く、サテライト細胞で検出することは非常に困難です。
CUT&RUNアプローチの限界の1つは、未固定のセルで実行されることです。したがって、転写因子とその結合部位の間の相互作用の不安定な性質のために、いくつかのARターゲットを見逃した可能性があります。同様に、アセチル化などの翻訳後修飾もかなり不安定です。したがって、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドによる光固定ステップを含め、FACSソーティング後、および核を単離する前に、タンパク質/DNA相互作用とヒストン修飾を安定化させることが考えられます。
この論文では、CUT&RUNアッセイがFACS単離されたサテライトセルで実施できることを示しましたが、ATAC-seqのような非固定クロマチンを用いた他の解析も実施される可能性があります。さらに、ここで筋肉は基礎生理学的条件で採取されましたが、このプロトコルは傷害や老化などの病理学的状況に適用される可能性があります。これらすべてのプロトコルの使用により、サテライト細胞の遺伝子制御メカニズムを詳細に理解することができ、これらのメカニズムが病態生理学的状態によってどのように変化するかを理解するのに役立つ可能性があります。
要約すると、この低コストで時間効率の高いプロトコルは、骨格筋前駆細胞における転写因子の動員とクロマチンランドスケープを研究するための効果的な実験環境を提供します。このプロトコルによって調製されたクロマチンは、サテライトセルにおけるARシストロムの最初のゲノムワイド分析を提供し、遺伝子調節に関する将来の研究を促進します。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
優れた技術支援を提供してくれたAnastasia Bannwarthに感謝します。IGBMCアニマルハウス施設、細胞培養、マウス臨床研究所(ICS、Illkirch、フランス)、イメージング、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、および「France Génomique」コンソーシアムのメンバーであるGenomEastプラットフォーム(ANR-10-INBS-0009)に感謝します。
ストラスブール大学、CNRS、InsermのITI 2021-2028プログラムの一環として、学際的テーマ別研究所IMCBioのこの取り組みは、フランスの未来への投資プログラムの枠組みの下で、IdEx Unistra(ANR-10-IDEX-0002)とSFRI-STRAT'USプロジェクト(ANR 20-SFRI-0012)およびEUR IMCBio(ANR-17-EURE-0023)の支援を受けました。追加資金は、INSERM、CNRS、Unistra、IGBMC、Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR)、AFM-Téléthon strategic program 24376 (to D.D.)、INSERM young researcher grant (to D.D.)、ANR-10-LABX-0030-INRT、およびフレームプログラムInvestissements d'Avenir(ANR-10-IDEX-0002-02)の下でANRが管理するフランスの国家基金によって提供されました。J.R.は、Université franco-allemandeおよびMinistère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'InnovationのプログラムCDFA-07-22、およびAssociation pour la Recherche à l'IGBMC(ARI)のK.G.の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
References
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