Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Een efficiënt protocol voor CUT&RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen, aangepast aan de studie van transcriptieregulatie in spiervezels door splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN).

Abstract

Genoomwijde analyses met kleincellige populaties zijn een belangrijke beperking voor studies, met name op het gebied van stamcellen. Dit werk beschrijft een efficiënt protocol voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van satellietcellen uit de ledemaatspier, een weefsel met een hoog gehalte aan structurele eiwitten. Ontlede ledemaatspieren van volwassen muizen werden mechanisch verstoord door fijnhakken in medium aangevuld met dispase en type I collagenase. Na de spijsvertering werd het homogenaat gefilterd door celzeven en werden de cellen gesuspendeerd in de FACS-buffer. De levensvatbaarheid werd bepaald met een fixeerbare levensvatbaarheidskleuring en immunogekleurde satellietcellen werden geïsoleerd door FACS. Cellen werden gelyseerd met Triton X-100 en vrijgekomen kernen werden gebonden aan concanavalin A magnetische kralen. Kern/kraalcomplexen werden geïncubeerd met antilichamen tegen de transcriptiefactor of histonmodificaties van belang. Na wasbeurten werden kern/kraalcomplexen geïncubeerd met proteïne A-microkokkennuclease en werd chromatinesplitsing geïnitieerd met CaCl2. Na DNA-extractie werden bibliotheken gegenereerd en gesequenced, en de profielen voor genoombrede transcriptiefactorbinding en covalente histonmodificaties werden verkregen door bio-informatica-analyse. De pieken die voor de verschillende histonmarkeringen werden verkregen, toonden aan dat de bindingsgebeurtenissen specifiek waren voor satellietcellen. Bovendien onthulde bekende motiefanalyse dat de transcriptiefactor gebonden was aan chromatine via het verwante responselement. Dit protocol is daarom aangepast om genregulatie te bestuderen in spiercellen van volwassen muizen.

Introduction

Dwarsgestreepte skeletspieren vertegenwoordigen gemiddeld 40% van het gewicht van het totale menselijk lichaam1. Spiervezels vertonen een opmerkelijk vermogen tot regeneratie bij letsel, wat wordt beschreven door de fusie van nieuw gevormde myocyten en de aanmaak van nieuwe myovezels die de beschadigde vervangen2. In 1961 rapporteerde Alexander Mauro een populatie van mononucleaire cellen die hij satellietcellen3 noemde. Deze stamcellen brengen de transcriptiefactor gepaarde box 7 (PAX7) tot expressie en bevinden zich tussen de basale lamina en het sarcolemma van spiervezels4. Er werd gemeld dat ze het cluster van differentiatie 34 (CD34; een hematopoëtische, endotheliale voorloper en mesenchymale stamcelmarker), integrine alfa 7 (ITGA7; een gladde, hart- en skeletspiermarker) tot expressie brachten, evenals de C-X-C chemokinereceptor type 4 (CXCR4; een lymfocyt-, hematopoëtische en satellietcelmarker)5. In basale omstandigheden bevinden satellietcellen zich in een bepaalde micro-omgeving die ze in een rusttoestand houdt6. Bij spierbeschadiging worden ze geactiveerd, vermenigvuldigen ze zich en ondergaan ze myogenese7. Omdat ze echter slechts een klein deel van het totale aantal spiercellen uitmaken, zijn hun genoombrede analyses bijzonder uitdagend, vooral onder fysiologische omstandigheden (<1% van het totale aantal cellen).

Er zijn verschillende methoden beschreven voor chromatine-isolatie uit satellietcellen, waarbij chromatine-immunoprecipitatie wordt gevolgd door massale parallelle sequencing (ChIP-seq) of splitsing onder doelen en tagmentatie-experimenten (CUT&Tag). Desalniettemin hebben deze twee technieken enkele belangrijke beperkingen die onbetwist blijven. ChIP-seq vereist inderdaad een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal om voldoende chromatine te genereren, waarvan een groot deel verloren gaat tijdens de sonicatiestap. CUT&Tag is meer geschikt voor een laag celaantal, maar genereert meer off-target splitsingsplaatsen dan ChIP-seq vanwege de Tn5-transposase-activiteit. Bovendien, aangezien dit enzym een hoge affiniteit heeft voor open-chromatineregio's, kan de CUT&Tag-benadering bij voorkeur worden gebruikt voor het analyseren van histonmodificaties of transcriptiefactoren die verband houden met actief getranscribeerde regio's van het genoom, in plaats van tot zwijgen gebracht heterochromatine 8,9.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat de isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen door FACS mogelijk maakt voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN)10,11-analyse. De verschillende stappen omvatten de mechanische verstoring van weefsel, celsortering en kernisolatie. De efficiëntie van de methode, met betrekking tot de bereiding van een levensvatbare celsuspensie, werd aangetoond door het uitvoeren van CUT&RUN-analyse voor covalente histonmodificaties en transcriptiefactoren. De kwaliteit van geïsoleerde cellen maakt de beschreven methode bijzonder aantrekkelijk voor het bereiden van chromatine dat de oorspronkelijke genomische bezettingstoestand getrouw vastlegt, en is waarschijnlijk geschikt voor het vastleggen van de chromosoomconformatie in combinatie met high-throughput sequencing op specifieke loci (4C-seq) of op genoombrede niveaus (Hi-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Muizen werden gehouden in een erkende stal, in overeenstemming met de National Animal Care Guidelines (richtlijn 86/609/EEG van de Europese Commissie; Frans decreet nr. 87-848) over het gebruik van proefdieren voor onderzoek. Voorgenomen manipulaties werden voorgelegd aan de ethische commissie (Com'Eth, Straatsburg, Frankrijk) en aan het Franse ministerie van Onderzoek (MESR) voor ethische evaluatie en autorisatie volgens de richtlijn 2010/63/EU onder het APAFIS-nummer #22281.

1. Bereiding van celsuspensie voor isolatie van satellietcellen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) (figuur 1)

  1. Isolatie van spierweefsel
    1. Ontsmet de hulpmiddelen voor spierdissectie, inclusief pincet, scalpels en scharen, met een reinigingsmiddel (tabel 1) en spoel grondig af met gedestilleerd water.
    2. Maak twee buisjes van 2 ml (tabel 1), elk met 1 ml spierisolatiebuffer, en plaats ze op ijs voor het verzamelen van geoogste spieren.
    3. Offer twee 10 weken oude C57/Bl6J mannelijke muizen door CO2 -verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. Spuit 70% ethanol over elke hele muis. Trek de huid van de achterpoot af met een pincet. Ontleed alle ledemaatspieren rond het dijbeen, scheenbeen en kuitbeen (ongeveer 1 mg spieren per muis).
      OPMERKING: Het aantal satellietcellen neemt af na de leeftijd van 15 weken.
    4. Plaats de geoogste ledemaatspieren in buisjes van 2 ml met 1 ml spierisolatiebuffer die in stap 1.1.2 is bereid. Verzamel de spieren van de tweede muis volgens dezelfde procedure. Hak de geoogste spieren fijn met een schaar op ijs tot kleiner dan 1 mm3 fragmenten zijn verkregen.
      OPMERKING: Spieren werden verzameld en gehakt, voornamelijk zoals beschreven12. Voer weefselvertering uit volgens stap 1.2 of 1.3.
  2. Weefselvertering met collagenase-enzym
    1. Breng de gehakte spiersuspensie van de twee muizen over door ze in een buis van 50 ml te gieten (tabel 1) met 18 ml spierisolatiebuffer (aangevuld met 5 ml [5 E/ml] dispase en 5 mg type I collagenase) (tabel 1).
    2. Sluit de buis goed af en sluit deze af met laboratoriumfolie (tabel 1). Plaats het horizontaal in een schudwaterbad (tabel 1) bij 37 °C bij 100 tpm gedurende 30 minuten.
    3. Voeg na 30 minuten 5 mg collagenase type I toe. Bewaar de buizen nog 30 minuten onder beweging in een schudwaterbad bij 37 °C bij 100 omw/min.
    4. Na de spijsvertering pipet u de spiersuspensie 10 keer op en neer met een pipet van 10 ml om de efficiëntie van de dissociatie te verbeteren. Centrifugeer bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min. Aan de onderkant van de buis zal een heldere pellet zichtbaar zijn. Gooi het supernatans weg met een pipet van 10 ml en laat 5 ml medium in de buis.
      OPMERKING: Door het medium te verlaten, wordt stress van de cellen voorkomen. Voeg 10 ml verse spierisolatiebuffer toe en resuspendeer de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 10 ml.
    5. Plaats celzeefjes van 100 μm, 70 μm en 40 μm (van elke soort) (tabel 1) op open buisjes van 50 ml. Pipetteer de suspensie op de opeenvolgende celzeven (100 μm, 70 μm, 40 μm) en vang de doorstroom op in de buisjes van 50 ml, die cellen van minder dan 40 μm bevatten.
    6. Centrifugeer de suspensie bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatans weg met een pipet van 10 ml totdat er nog 2 ml over is en gebruik vervolgens een pipet van 0,2-1 ml totdat er nog 100-200 μl over is. Resuspendeer de pellet in 2 ml lysebuffer voor rode bloedcellen (tabel 2). Incubeer 3 minuten op ijs.
    7. Centrifugeer bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatans weg met een pipet van 20-200 μl. Resuspendeer de cellen in 100 μL koude FACS-buffer (tabel 2). Leg op ijs.
  3. Alternatieve methode voor weefselvertering met Liberase thermolysine laag (TL) enzym
    1. Volg de beschrijvingen in stap 1.1. voor weefselisolatie.
    2. Voor liberase-gemedieerde weefseldesaggregatie, oogst spieren in 2 ml isolatiebuffer van het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (tabel 2), in plaats van spierisolatiebuffer beschreven in stap 1.1.2.
    3. Breng de gehakte spiersuspensie van de twee muizen over door ze in een buis van 50 ml te gieten (tabel 1) met 18 ml RPMI-isolatiebuffer aangevuld met 300 of 600 μl Liberase TL van 5 mg/ml (tabel 1) (d.w.z. respectievelijk 0,083 mg/ml en 0,167 mg/ml eindconcentraties)13.
    4. Sluit de buis goed af en sluit deze af met laboratoriumfolie (tabel 1). Plaats het horizontaal in een schudwaterbad (tabel 1) bij 37 °C bij 100 tpm gedurende 30 minuten.
    5. Na de spijsvertering pipet u de spiersuspensie 10 keer op en neer met een pipet van 10 ml om te dissociëren en de efficiëntie van de dissociatie te verbeteren.
    6. Centrifugeer bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min. Aan de onderkant van de buis zal een heldere pellet zichtbaar zijn. Gooi het supernatans weg met een pipet van 10 ml en laat 5 ml medium in de buis. Door het medium te verlaten, wordt stress van de cellen voorkomen. Voeg 10 ml verse RPMI-isolatiebuffer toe en resuspendeer de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 10 ml.
    7. Plaats celzeefjes van 100 μm, 70 μm en 40 μm (van elke soort) (tabel 1) op open buisjes van 50 ml.
    8. Pipeteer de suspensie op opeenvolgende celzeven (100 μm, 70 μm, 40 μm) en vang de doorstroom op in de buisjes van 50 ml, die cellen van minder dan 40 μm bevatten.
    9. Centrifugeer de suspensie bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatans weg met een pipet van 10 ml totdat er nog 2 ml over is en gebruik vervolgens een pipet van 0,2-1 ml totdat er nog 100-200 μl over is.
    10. Resuspendeer de pellet in 2 ml lysebuffer voor rode bloedcellen (tabel 2). Incubeer 3 minuten op ijs.
    11. Centrifugeer bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatans weg met een pipet van 20-200 μl.
    12. Resuspendeer de cellen in 100 μL koude FACS-buffer (tabel 2). Leg op ijs.
  4. Bereiding van celsuspensie voor FACS-isolatie
    1. Breng 10 μl van de in stap 1.2.12 verkregen celsuspensie over in een vers buisje van 1,5 ml. Dit monster vormt de niet-bevlekte of de negatieve controle (figuur 2). Voeg 190 μL FACS-buffer toe, breng over naar een buis van 5 ml (tabel 1) en bewaar op ijs.
    2. Centrifugeer de resterende 90 μl van de in stap 1.2.12 verkregen celsuspensie gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 400 x g en gooi het supernatans weg met behulp van een pipet (tipvolume 20-200 μl). Incubeer de cellen met 400 μL fixeerbare levensvatbaarheidskleuring (tabel 3) verdund in serumvrije Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    3. Was de cellen door centrifugeren bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 minuten en voeg 100 μL FACS-buffer toe. Keer de buisjes driemaal voorzichtig om en centrifugeer opnieuw bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min.
    4. Bereid tijdens de centrifugatietijd 100 μl van een mastermix van primaire antilichamen gekoppeld aan fluoroforen en gericht tegen CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 en CXCR4 (tabel 3), verdund in FACS-buffer.
    5. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het celsupernatans weg met behulp van een pipet (20-200 μl tipvolume) en voeg het 100 μl antilichaammengsel toe. Keer de buis voorzichtig drie keer om. Draai niet vortex. Incubeer 30 minuten in het donker op ijs.
    6. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg met een pipet van 20-200 μl en voeg 500 μl 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe om de cellen te wassen. Keer de buis voorzichtig drie keer om. Centrifugeer opnieuw bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg met een pipet van 20-200 μl.
    7. Resuspendeer de celpellet in 500 μL FACS-buffer en breng de suspensie over in een buisje van 5 ml.
      OPMERKING: de celsuspensie die wordt verkregen uit de vertering van Liberase wordt op dezelfde manier verwerkt.
  5. Selectie van satellietcellen door FACS
    1. Draai de celsuspensie kort (2-5 sec) en verwerk de cellen op een flowcytometer die is uitgerust met een mondstuk van 100 μm (tabel 1).
    2. Bepaal de verschillende poortafmetingen op basis van het ongekleurde monster dat is opgeslagen in stap 1.4.1 (figuur 2).
    3. Smeer een tube van 5 ml in met 1 ml puur foetaal kalfsserum (FCS) om de celverzameling te verbeteren en voeg 500 μl FACS-buffer toe.
    4. Vervang het ongekleurde monster door het met antilichamen gelabelde monster.
    5. Selecteer de populatie van belang op basis van het voorwaartse verspreidingsgebied (FSC-A) en het zijspreidingsgebied (SSC-A) (Figuur 3A) en verwijder doubletcellen met de FSC-A en voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) (Figuur 3B)14.
    6. Identificeer levende cellen met een fixeerbare levensvatbaarheid, vleknegatief, kleuring (Figuur 3C).
    7. Selecteer negatieve cellen voor CD31, CD45, TER119 en CD11b (Afbeelding 3D).
    8. Om satellietcellen te identificeren, selecteert u eerst de cellen die positief zijn voor CD34 en ITGA7 (Figuur 3E) en selecteert u vervolgens de CXCR4-positieve cellen op de CD34- en ITGA7-geselecteerde populatie (Figuur 3F).
    9. Verzamel de geselecteerde cellen (tussen 40.000 en 80.000 cellen, afhankelijk van de kwaliteit van het preparaat) in de gecoate buis van 5 ml met 500 μL FACS-buffer.

2. Validatie van de geïsoleerde populatie in weefselkweek

  1. Diacoating met hydrogel
    1. Verdun 280 μl van een gekwalificeerde matrix met pure hydrogel menselijke embryonale stamcellen (hESC) (tabel 1) in 12 ml serumvrij DMEM/F12-medium.
    2. Smeer een objectglaasje (tabel 1) in met de hydrogeloplossing en incubeer het een nacht bij 4 °C.
    3. De volgende dag incubeer de kamerglaasje bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur voordat u de cellen zaait.
  2. Celgroei en differentiatie
    1. Plaat ongeveer 20.000 cellen, verkregen uit stap 1.5.9, per putje, en kweek ze gedurende 5 dagen in groeimedium (tabel 2). Maak fasecontrastbeelden met behulp van een helderveldmicroscoop (Figuur 4A) en bewerk ze vervolgens voor immunofluorescentieanalyse om de kwaliteit van het preparaat te waarborgen (Figuur 4B).
    2. Om myogenese te induceren, kweekt u geamplificeerde satellietcellen uit stap 2.2.1 in myogeen medium (tabel 2) gedurende nog eens 7 dagen. Maak beelden met fasecontrast met behulp van een helderveldmicroscoop (Figuur 4C) voordat u ze verwerkt voor immunofluorescentieanalyse om de kwaliteit van het preparaat te waarborgen (Figuur 4D).
  3. Immunocytofluorescentie-analyse
    1. Verwijder het medium voorzichtig, was de cellen die op kamertemperatuur zijn gekweekt tweemaal met 100 μL 1x PBS en fixeer ze gedurende 1 uur met 100 μL 4 % paraformaldehyde (PFA) bij RT.
      NOTITIE: Deze stap moet met zorg worden uitgevoerd. Er moet altijd een kleine hoeveelheid medium in de kamer worden bewaard om overbelasting van de cellen te voorkomen, en de PBS moet door de wanden van de kamer worden gegoten.
    2. Was de cellen drie keer met 100 μL 1x PBS, aangevuld met 0,1% Tween 20 (PBST) om de celmembranen te permeabiliseren.
    3. Blokkeer niet-specifieke signalen door incubatie in 100 μL 1x PBST aangevuld met 5% FCS (PBST-FCS) bij RT gedurende 1 uur.
    4. Incubeer de cellen met 100 μL van een mastermix van anti-PAX7- en anti-dystrofine (DMD)-antilichamen (verdund in 1x PBST-FCS) bij 4 °C gedurende een nacht, om respectievelijk satellietcellen en myovezels te detecteren.
    5. Was de cellen driemaal met 100 μL 1x PBST en incubeer ze met 100 μL geit anti-muis Cy3 of geit anti-konijn Alexa 488 secundaire antilichamen (tabel 3) verdund in 1x PBST-FCS bij RT gedurende 1 uur.
    6. Koppel de kamerputjes los van het objectglaasje met behulp van de door de leverancier geleverde apparatuur, voeg 20 μL waterig montagemedium met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe en dek het glaasje af met een dekglaasje (tabel 1).
    7. Observeer en leg het beeld van de gekleurde cellen vast met een confocale microscoop.
    8. Verwerk de beelden met behulp van beeldanalysesoftware (figuren 4B,D).

3. CUT&RUN-analyse

  1. Monstervoorbereiding voor CUT&RUN-analyse op FACS-geïsoleerde satellietcellen
    OPMERKING: CUT&RUN is in wezen uitgevoerd zoals beschreven10,15. De samenstelling van de buffer wordt weergegeven in Tabel 2.
    1. Gebruik voor de CUT&RUN-test ongeveer 40.000 van de cellen die zijn verkregen in methode 1, stap 1.5.9, per monster/antilichaam dat moet worden getest.
    2. Centrifugeer de FACS-geïsoleerde satellietcellen bij RT bij 500 x g gedurende 10 minuten en gooi het supernatans vervolgens weg met een pipet (20-200 μL tipvolume).
    3. Was de cellen met 1 ml 1x PBS, centrifugeer bij RT bij 500 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatans weg met een pipet (0,2-1 ml tipvolume) en resuspendeer ze in 1 ml koude nucleaire extractiebuffer (tabel 2). Incubeer 20 minuten op ijs.
    4. Maak tijdens de incubatie een buisje van 1,5 ml met 850 μl koudebindingsbuffer (tabel 2) en voeg per monster 20 μl concanavalin A-gecoate magnetische kralen toe (tabel 1).
    5. Was de kralen twee keer met 1 ml koudebindingsbuffer met behulp van een magnetisch rek (tabel 1). Laat voor elke wasbeurt of bufferwissel tijdens de procedure de parels zich gedurende 5 minuten ophopen aan de zijkant van de buis op het magnetische rek voordat u het geklaarde supernatans verwijdert met een pipet (0,2-1 ml tipvolume). Resuspendeer vervolgens voorzichtig in 300 μL koudebindingsbuffer.
    6. Centrifugeer de kernen gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 600 x g en resuspendeer ze voorzichtig in 600 μl nucleaire extractiebuffer. Meng de 600 μL geëxtraheerde kernen voorzichtig met de 300 μL concanavalin A-parelslurry en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    7. Verwijder het supernatans met behulp van een magnetisch rek, zoals beschreven in stap 3.1.4, en resuspendeer de met kralen gebonden kernen voorzichtig met 1 ml koudeblokkerende buffer (tabel 2). Incubeer bij RT gedurende 5 min.
    8. Verwijder het supernatans met behulp van een magnetisch rek en was de parelgebonden kernen twee keer met 1 ml koude wasbuffer (tabel 2). Verdeel tijdens de tweede wasbeurt de kraalgebonden kernen gelijkmatig in buisjes van 1,5 ml. Elke buis wordt in de volgende stap behandeld met een specifiek antilichaam.
      OPMERKING: In dit voorbeeld werd 250 μL kraalgebonden kernen gesplitst in vier buisjes van 1,5 ml.
    9. Scheid het supernatans met behulp van een magnetisch rek, zoals beschreven in stap 3.1.4, en zuig op met een pipet. Resuspendeer de kern/parelcomplexen voorzichtig met een specifiek primair antilichaam (tabel 3), of een IgG van een andere soort (hier konijn) verdund in 250 μL koude wasbuffer. Incubeer 's nachts bij 4 °C en schud zachtjes.
      OPMERKING: De antilichamen die hier worden gebruikt, zijn gericht tegen AR, H3K4me2 en H3K27ac.
    10. Verwijder het supernatans met een magnetisch rek, zoals beschreven in stap 3.1.4, was de kraalgebonden kernen tweemaal met 1 ml koude wasbuffer en resuspendeer in 100 μl koude wasbuffer.
    11. Verdun eiwit A-microkokkennuclease bij 1,4 ng/μL in 100 μL per monster koude wasbuffer.
    12. Voeg 100 μl eiwit A-microkokkennuclease toe aan de 100 μl monster verkregen in 3.1.11 en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C onder roeren.
    13. Verwijder het supernatans met een magnetisch rek, zoals beschreven in stap 3.1.4, was tweemaal met 1 ml koude wasbuffer en resuspendeer de parelgebonden kernen in 150 μl koude wasbuffer.
    14. Om de DNA-splitsing te starten, voegt u 3 μL van 100 mM CaCl2 toe aan de 150 μL monster, mengt u snel door te tikken en incubeert u gedurende 30 minuten op ijs. Stop de reactie door 150 μL stopbuffer toe te voegen en gedurende 20 minuten bij 37 °C te incuberen om het RNA te verteren en de DNA-fragmenten vrij te geven.
    15. Voor DNA-extractie centrifugeert u de monsters bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
    16. Breng het supernatans over in een nieuwe microfuge-buis en gooi de pellet en kralen weg.
    17. Voeg 3 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 2,5 μL 20 mg/ml proteïnase K toe. Incubeer gedurende 10 minuten bij 70 °C (niet schudden).
    18. Voeg 300 μL fenol/chloroform/isoamylalcohol, vortex, over naar 2 ml phase-lock buizen (5 minuten voorgedraaid bij 16.000 x g) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C.
    19. Voeg 300 μL chloroform toe aan dezelfde buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C. Vang het supernatans (~300 μL) op met een pipet (0,2-1 ml tipvolume) en breng het over in een nieuw buisje van 1,5 ml.
    20. Voeg 1 μL glycogeen toe (concentratie van 20 mg/ml).
    21. Voeg 750 μL 100% ethanol toe en sla een nacht neer bij -20 °C.
    22. Pelleteer het DNA door centrifugeren gedurende 15 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C. Was de pellet met 1 ml 100% ethanol, centrifugeer gedurende 5 minuten op 16.000 x g, gooi het supernatant weg, centrifugeer gedurende 30 s op 16.000 x g en verwijder de vloeistof met een pipet (20-200 μL tipvolume).
    23. Laat de pellet ~5 minuten aan de lucht drogen. Resuspenderen in 25 μl van 1 mM Tris-HCl (pH 8) en 0,1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA; pH 8).
  2. Bio-informatica analyse
    1. Bereid bibliotheken voor van immunogespleten DNA en sequentie ze als gepaarde 100 bp-lezingen met behulp van het genomische platform zoals beschreven16.
    2. Verwijder reads die overlappen met het ENCODE blacklist-gebied (V2) en verdeel de resterende reads in twee groepen: fragmentgrootte <120 bp (zonder nucleosoom, in het algemeen voor transcriptiefactoren) en fragmentgrootte >150 bp (met nucleosomen, normaal gesproken voor histonmarkeringen). Kaart naar het mm10-referentiegenoom met behulp van Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Genereer bigwig-bestanden met bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Bewaar uniek in kaart gebrachte lezingen voor verdere analyse.
    5. Genereer onbewerkte bedgraph-bestanden met genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Gebruik het SEACR 1.3-algoritme (stringente optie) voor de piekoproep. Laad het doelgegevensbedgraafbestand in UCSC-bedgraafindeling dat regio's weglaat die een nulsignaal bevatten, en het IgG-gegevensbedgraafbestand (Control Control) om een empirische drempel te genereren voor piekaanroep18.
    7. Voer een Pearson-correlatieanalyse uit met deeptools om de gelijkenis tussen de monsters te bepalen19. Gebruik de opdrachtregel multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, gevolgd door plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualiseer de genoombrede intensiteitsprofielen met IGV20 met behulp van bedgraph-bestanden en de bedfile-pieken verkregen uit SEACR.
    9. Gebruik HOMER voor piekannotatie en zoeken naar motieven21.
    10. Vergelijk ten slotte de datasets met eerder gepubliceerde datasets met de ChIP-Atlas Peak-browser om ze te visualiseren op IGV en/of verrijkingsanalyse met behulp van de door SEACR gegenereerde bedbestanden als invoerdataset22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Satellietcellen uit skeletspieren van muizen werden geïsoleerd door de protocollen van Gunther et al. (hierna Protocol 1)12 en van Liu et al.23 (hierna Protocol 2) te combineren. Aangezien na de spijsvertering niet-verteerde spiervezels werden waargenomen bij gebruik van de concentratie collagenase en dispase zoals voorgesteld in Protocol 1, werd de hoeveelheid enzymen verhoogd om de dissociatie van spiervezels te verbeteren, zoals beschreven in de stappen 1.2.1 en 1.2.3. Zoals aangegeven in Protocol 2, werden de monsters onderworpen aan een zachte agitatie in een waterbad om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. We voerden filtratie uit door middel van celzeven, zoals vermeld in Protocol 1, en incubatie met lysebuffer voor rode bloedcellen (zie stappen 1.2.7 tot en met 1.2.10). In Protocol 1 werden cellen geladen op een Percoll-dichtheidsgradiënt van 30%/70% om eenkernige cellen in de interfase te isoleren, wat mogelijk heeft geleid tot het verlies van interessante cellen. Deze stap werd dus overgeslagen, zoals voorgesteld in Protocol 2.

FSC-A versus SSC-A gating werd gebruikt om eenkernige cellen te identificeren op basis van grootte (FSC) en granulariteit (SSC) (Figuur 3A). Puin werd uitgesloten door gebeurtenissen onder 40 K op de FSC-A-as te negeren, en 38,8% ± 3,6% van de cellen werd geselecteerd. FSC-A versus forward scatter height (FSC-H) gating density plots werden gebruikt voor doubletuitsluiting (Figuur 3B). Na het selecteren van de cellen die negatief waren voor de fixeerbare levensvatbaarheidsvlekmarker, werd een gemiddelde van 34,3% ± 7,7% van de levende cellen verkregen (Figuur 3C).

Het percentage in de dot plot in figuur 3C, 75,4%, komt overeen met het percentage enkelvoudige levende cellen, berekend op basis van de oudercelpopulatie, in dit geval de enkelvoudige cellen. 95,7% van de afzonderlijke cellen wordt verkregen uit de live-evenementen die 35% van het totale aantal gebeurtenissen uitmaken. Het gemiddeld verkregen percentage van 34,3% wordt dus berekend op basis van het totaal aantal gebeurtenissen en niet op basis van de ouderpopulaties.

Ongeveer 3% van de afzonderlijke levende cellen was negatief voor leukocyten- (CD45), monocyten- (CD11b), endotheel- (CD31) en erytroïde-specifieke (TER119) markers (Figuur 3D). CD11b/CD45/CD31/TER119-negatieve cellen werden vervolgens geselecteerd op basis van hun expressie van CD34 (hematopoëtische, endotheliale voorlopercellen en mesenchymale stamcellen) en ITGA7 (hart-, gladde en skeletspiercellen) markers (Figuur 3E). Een laatste gating voor CXCR4 (lymfocyten, hematopoëtische en satellietcellen) werd uitgevoerd om vermeende satellietcellen te selecteren (Figuur 3F). Van de CD34+/ITGA7+-cellen bleek ~80% positief te zijn voor CXCR4, wat neerkomt op een gemiddelde van 1% ± 0,15% van het totale aantal afzonderlijke levende cellen, en een absoluut aantal van 60.000 ± 14.000 vermeende satellietcellen per muizenledemaatspieren onder 14 onafhankelijke experimenten. Een aanvullende beoordeling van de CXCR4+-celfractie onthulde dat ongeveer 80% van de levende cellen werd verkregen na nasortering, waarvan bijna 70% CXCR4+ (Figuur S1), wat de hoge levensvatbaarheid en zuiverheid van deze FACS-geïsoleerde celpopulatie aantoont.

Aangezien verschillende studies de efficiëntie van collagenase- en Liberase TL-enzymen voor celisolatie24,25 vergeleken, zijn deze twee verteringsmethoden parallel verwerkt. Met 300 μL Liberase TL was de vertering minder efficiënt dan met collagenase, omdat er onverteerde vezels overbleven. Bovendien werden meer celresten en grote gebeurtenissen waargenomen (figuren S2A,B), en werd gemiddeld slechts 17,3% van de afzonderlijke levende cellen verkregen na FVS 780-selectie (figuur S2C). Een bijkomend probleem bij de vertering van Liberase was het lage aantal CD34+/ITGA7+-cellen in vergelijking met collagenase (figuren S2D-S2E), hoewel CXCR4-gating vergelijkbaar was (figuur S2F). Met 600 μL Liberase TL verliep de vertering efficiënter. De hoeveelheid celresten bleef echter verhoogd en de levensvatbaarheid van de cel ondermaats (16,3%) (Figuur S3). De vertering met Liberase TL was dus minder efficiënt voor de isolatie van satellietcellen.

Bij zaaien bracht meer dan 70% van de CD34+/ITGA7+/CXCR4+-cellen (Figuur 4A) PAX7 tot expressie (Figuur 4B), in tegenstelling tot CD34+/ITGA7-/CXCR4-cellen die PAX7-negatief waren (Figuur 4C). CD34+/ITGA7+/CXCR4+-cellen waren in staat om te differentiëren tot myovezels wanneer ze gedurende 7 extra dagen in een myogeen medium werden gekweekt, zoals blijkt uit de kleuring van dystrofine (DMD) (Figuur 4D), wat hun myogeen potentieel bevestigt. Zo toonden gecombineerde weefselkweek- en immunofluorescentieanalyses aan dat FACS-geïsoleerde CD34+/ITGA7+/CXCR4+-cellen satellietcellen zijn.

Om te bepalen of geïsoleerde satellietcellen geschikt zijn voor CUT&RUN-analyse, werd het genomische profiel van geacetyleerd lysine 27 (H3K27ac) en gedimethyleerd lysine 4 (H3K4me2) van histon H3 bepaald, twee histonmodificaties die worden aangetroffen in actieve promotor- en enhancerregio's. Onze gegevens brachten 68.694 en 13.514 pieken aan het licht voor respectievelijk H3K4me2 en H3K27ac, met een vergelijkbare genomische verdeling tussen de twee histonmarkeringen (Figuur S4A). In detail ontdekten we dat een kwart van de pieken zich ± 2 kb van de transcriptiestartplaats (TSS) van het dichtstbijzijnde gen bevond, waarbij de meerderheid zich op -100 kb tot -10 kb of 10 kb tot 100 kb van de TSS bevond (Figuur S4B). Merk op dat de analyse van Pearson een correlatie van 80% liet zien tussen H3K27ac- en H3K4me2-leesprofielen (Figuur S4C). Om te beoordelen of het chromatine dat uit bovengenoemd protocol is bereid, uit satellietcellen is geïsoleerd, is de aanwezigheid van H3K27ac en H3K4me2 bij de promotor van satellietcelspecifieke genen bepaald. H3K4me2 was verrijkt rond de TSS van Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 en Vcam1 (Figuur 5A), maar niet rond die van Itgam (CD11b) en Ptprc (CD45) (immuuncellen), Pecam (CD31; endotheelcellen) (Figuur 5B), Ckm (ontwikkelende spiervezels) of Myh3 (myosine zware keten snel embryonaal, myofibers) (Figuur 5C). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met H3K27ac (Figuur 5). Er werd bijna geen signaal verkregen met het IgG-monster (Figuur 5). Bovendien toonde vergelijking van de H3K27ac-pieken verkregen uit SEACR met die als gevolg van MACS2-piekaanroepen uit gepubliceerde ChIP-seq-datasets een hoge correlatie, zoals vermeld onder elk paneel (ChIP-Atlas-track; Figuur 5). Samen geven deze resultaten aan dat de metingen die worden verkregen na de bioinformatica-analyse afkomstig zijn van het chromatine van FACS-geïsoleerde satellietcellen en correleren met de metingen die eerder zijn geïdentificeerd door ChIP-seq-analyses.

Terwijl eencellige RNA-sequencingstudies in satellietcellen van muizen een opvallende stressrespons lieten zien, veroorzaakt door de isolatieprocedure26, werd de aanwezigheid van H3K4me2 of H3K27ac bepaald bij stressresponsgenen, zoals geïllustreerd met Atf3, Azin1, Gls en Elf2. De resultaten leveren bewijs dat het H3K27ac-merk niet wordt afgezet bij de promotor van dergelijke genen en dat de niveaus van H3K4me2 laag blijven in vergelijking met die verkregen voor satellietcelspecifieke genen (Figuur S5). Deze gegevens laten dus zien hoe mild de isolatieprocedure is.

Vervolgens werd gekeken naar de geschiktheid van onze isolatiemethode voor transcriptiefactoren. CUT&RUN-analyse voor de androgeenreceptor (AR), een transcriptiefactor die behoort tot de superfamilie van nucleaire receptoren en die een belangrijke rol speelt bij myogene differentiatie27, ontrafelde 7.840 pieken. Deze pieken bevonden zich voornamelijk in intron- en intergene regio's (Figuur S4A), ofwel -100 kb tot -10 kb, ofwel 10 kb tot 100 kb van de TSS (Figuur S4B). Fylogenetische analyses toonden aan dat AR, naast de glucocorticoïde (GR/Nr3c1), de mineralocorticoïde (MR/Nr3c2) en de progesteron (PR/Nr3c3) receptoren, lid is van de oxosteroïde nucleaire receptoren subfamilie 28, die als homodimeren binden aan DNA-segmenten die bestaan uit twee 5′-RGAACA-3′ palindromische halfsites gescheiden door drie basenparen 29. Zoeken naar een bekend motief door middel van hypergeometrische optimalisatie van motiefverrijking (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) onthulde dat AR gebonden is aan het 5′-RGRNCA-3′ AR half-site motief, aan het typische 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ oxosteroïdenmotief (in de figuur aangeduid als PR), en aan het 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR-consensusmotief in >32%, 17% en 2% van de beoogde regio's, (figuur 6A). Opgemerkt moet worden dat eerder vergelijkbare verhoudingen werden verkregen voor de glucocorticoïdreceptor inskeletspieren16.

SEACR-analyse onthulde bijna 500 pieken met een piekscore >50, waarvan meer dan 200 met een score >100; sommige daarvan worden geïllustreerd in figuur 6B. Onze analyse bracht ook een bescheiden verrijking van AR aan het licht op de eerder beschreven bindingsplaatsen van genen die betrokken zijn bij de biosynthese van polyamines (Amd1, Oat en Smox) en bij prostaatkanker (Acox1, Fkbp5 en Tmprss2) (Figuur S6). Interessant is dat de AR werd gevonden op de loci van genen die betrokken zijn bij de stam van satellietcellen (Pax7, Cxcr4 en Cd34) (Figuur S7). Merk op dat het oxosteroïde-responselement werd gevonden in elk van deze AR-verrijkte regio's (Figuur S6 en Figuur S7), wat aantoont dat het AR-signaal dat in de CUT&RUN-gegevens wordt gezien, zeer specifiek is.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van het protocol dat wordt gebruikt voor de isolatie van satellietcellen uit de spieren van de ledematen van muizen. Het protocol bestaat uit vier hoofdstappen. In het kort worden muizen geofferd en worden de spieren van de achterpoten geoogst (stappen 1.1.1-1.1.3) en mechanisch gehakt met een schaar (stappen 1.4-1.5). Dit wordt gevolgd door de stappen 1.2.1-1.2.4, waarbij de spieren in een waterbad worden gedissocieerd met behulp van collagenase en dispase. In de stappen 1.2.5-1.2.8 wordt de celsuspensie achtereenvolgens door 100, 70 en 40 μm celzeven gefilterd en worden erytrocyten geëlimineerd met behulp van lysebuffer voor rode bloedcellen (stappen 1.2.9-1.2.12). De overige celpopulaties worden in stap 1.3 gelabeld met antilichamen gekoppeld aan fluoroforen, die gericht zijn tegen specifieke cellulaire fenotypische markers. Stap 1.4 omvat monsters die door FACS gaan om satellietcellen te verzamelen voor verdere toepassing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Flowcytometrie-analyse van een onkleurig celpreparaat. (A) Selectie van de populatie van belang op basis van FSC-A- en SSC-A-parameters. (B) Identificatie van één cel op basis van FSC-A en FSC-H. (C) Karakterisering van de autofluorescentiedrempel van verzamelde cellen voor APC-Cy7 geconjugeerd aan de fixeerbare levensvatbaarheidskleuring (FVS 780) die dode cellen markeert. (D-F). Autofluorescentiemeting voor PE-Cy7 geconjugeerd aan CD11b-antilichaam en PE-geconjugeerd aan TER119/CD45/CD31-markers (D), evenals voor Alexa fluor 488 geconjugeerd aan ITGA7, Alexa fluor 405 geconjugeerd aan CD34 (E) en APC-fluorochroom geconjugeerd aan CXCR4 (F). Poorten worden weergegeven als zwarte dozen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Flowcytometer-gatingstrategie voor het sorteren van satellietcellen. (A) Selectie van de populatie van belang op basis van FSC-A- en SSC-A-parameters. (B) Identificatie van één cel op basis van FSC-A en FSC-H. (C) Identificatie van levende cellen met FVS 780. (D) Negatieve celselectie op basis van CD11b-, CD31-, CD45- en TER119-antigenen. (E-F) Positieve celselectie op basis van CD34 en ITGA7 (E), evenals CXCR4 (F) antigenen. Poorten worden weergegeven als zwarte dozen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Analyse van FACS-geïsoleerde CD34+/ITGA7+/CXCR4+ en CD34+/ITGA7-/CXCR4-cellen. (A) Fasecontrastbeelden van CD34+/ITGA7+/CXCR4+ en CD34+/ITGA7-/CXCR4- cellen gekweekt in groeimedium. (B) Immunofluorescentieanalyse van CD34+/ITGA7+/CXCR4+ en CD34+/ITGA7-/CXCR4-cellen gekweekt in groeimedium met behulp van antilichamen gericht tegen PAX7 (rood) en dystrofine (DMD, groen). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Magenta pijlen duiden op PAX7-positieve cellen. (C) Fasecontrastbeelden van CD34+/ITGA7+/CXCR4+-cellen die gedurende 5 dagen in groeimedium (linkerpaneel) en gedurende 7 extra dagen in myogeen medium (rechterpaneel) zijn gekweekt. (D) Immunofluorescentieanalysebeelden van CD34+/ITGA7+/CXCR4+-cellen die gedurende 5 dagen in groeimedium (linkerpaneel) en gedurende 7 extra dagen in myogeen medium (rechterpaneel) zijn gekweekt met behulp van antilichamen gericht tegen PAX7 (rood) en dystrofine (DMD, groen). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Magenta pijlen duiden op PAX7-positieve cellen. Groene pijlen geven DMD-positieve cellen aan. Schaalbalken: helderveldpanelen = 25 μm; immunofluorescentiepanelen = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Genomische profielen van satellietcelchromatine. Lokalisatie van H3K4me2 en H3K27ac op satellietcelspecifieke genen (A), immuun- en endotheelcelspecifieke genen (B) en myofiberspecifieke genen (C) op het chromatine van satellietcellen door CUT&RUN. Actieve promotors zijn groen omkaderd, terwijl inactieve promotors bruin zijn omkaderd. CUT&RUN uitgevoerd met IgG werd gebruikt als negatieve controle. H3K27ac-verrijkingsanalyse voor histonmarkeringen wordt onder elk spoor weergegeven. De verrijkingsscore die de betrouwbaarheidsniveaus van gepubliceerde gegevenssets weergeeft, wordt weergegeven als een heatmap. Bruine sterren (*) verwijzen naar H3K27ac ChIP-seq-pieken uitgevoerd in spiersatellietcellen, blauwe sterren naar H3K4me3 en de roze naar H4K16me1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: AR-genomische verdeling op satellietcelchromatine . (A) HOMER-bekende motiefanalyse van AR-pieken in satellietcellen. PR: progesteronreceptor. Nb-doel verwijst naar het aantal pieken dat een bepaald motief presenteert. (B) Lokalisatie van H3K4me2 en AR op aangegeven genen op het chromatine van satellietcellen bepaald door CUT&RUN. CUT&RUN uitgevoerd met IgG werd gebruikt als negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Lijst van materialen, reagentia en software. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Buffersamenstellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Verwijzingen en concentraties van antilichamen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Flowcytometrie-analyse van de celvoorbereiding na sortering. (A) Selectie van de populatie van belang op basis van FSC-A- en SSC-A-parameters. (B) Identificatie van één cel op basis van FSC-A en FSC-H. (C) Identificatie van levende cellen met fixeerbare levensvatbaarheidskleuring (FVS 780). (D) Negatieve celselectie op basis van CD11b-, CD31-, CD45- en TER119-antigenen. (E-F) Positieve celselectie op basis van CD34 en ITGA7 (E) en CXCR4 (F) antigenen. Poorten worden weergegeven als zwarte dozen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Flowcytometerstrategie voor het sorteren van satellietcellen na destructie met 300 μL Liberase TL. (A) Selectie van de populatie van belang op basis van FSC-A- en SSC-A-parameters. (B) Identificatie van één cel op basis van FSC-A en FSC-H. (C) Identificatie van levende cellen met FVS 780. (D) Negatieve celselectie op basis van CD11b-, CD31-, CD45- en TER119-antigenen. (E-F) Positieve celselectie op basis van CD34 en ITGA7 (E) en CXCR4 (F) antigenen. Poorten worden weergegeven als zwarte dozen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Flowcytometerstrategie voor het sorteren van satellietcellen na destructie met 600 μL Liberase TL. (A) Selectie van de populatie van belang op basis van FSC-A- en SSC-A-parameters. (B) Identificatie van één cel op basis van FSC-A en FSC-H. (C) Identificatie van levende cellen met FVS 780. (D) Negatieve celselectie op basis van CD11b-, CD31-, CD45- en TER119-antigenen. (E-F) Positieve celselectie op basis van CD34 en ITGA7 (E) en CXCR4 (F) antigenen. Poorten worden weergegeven als zwarte dozen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Karakterisering van H3K4me2-, H3K27ac- en AR-genomische locaties. (A) Cirkeldiagrammen die de piekverdeling van H3K4me2, H3K27ac en AR weergeven volgens genoomkenmerken in satellietcellen. (B) Cirkeldiagrammen die de piekverdeling van H3K4me2, H3K27ac en AR weergeven op basis van hun afstand tot de dichtstbijzijnde TSS in satellietcellen. (C) Heatmap met de Pearson-correlatie tussen H3K4me2, H3K27ac en IgG-controle. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Genomische profielen van satellietcelchromatine bij stressrespons-geïnduceerde genen. Lokalisatie van H3K4me2 en H3K27ac op geïndiceerde genen op het chromatine van satellietcellen. Immunoprecipitatie met IgG werd gebruikt als negatieve controle. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Genomische profielen van satellietcelchromatine bij bekende AR-doelgenen. Lokalisatie van H3K4me2, H3K27ac en AR op aangegeven genen op het chromatine van satellietcellen bepaald door CUT&RUN. AR-pieken zijn blauw omkaderd en bijbehorende AR-responsieve elementen worden hieronder weergegeven. CUT&RUN uitgevoerd met IgG werd gebruikt als negatieve controle. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Genomische profielen van satellietcelchromatine bij hun selectief tot expressie gebrachte genen. Lokalisatie van H3K4me2, H3K27ac en AR op aangegeven genen op het chromatine van satellietcellen bepaald door CUT&RUN. AR-pieken zijn blauw omkaderd en bijbehorende AR-responsieve elementen worden hieronder weergegeven. CUT&RUN uitgevoerd met IgG werd gebruikt als negatieve controle. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De huidige studie rapporteert een gestandaardiseerde, betrouwbare en eenvoudig uit te voeren methode voor de isolatie en kweek van muissatellietcellen, evenals de beoordeling van transcriptionele regulatie door de CUT&RUN-methode.

Dit protocol omvat verschillende kritieke stappen. De eerste is spierverstoring en vezelvertering om een groot aantal verzamelde cellen te garanderen. Ondanks de verhoogde enzymconcentratie werden er meer levende cellen verkregen dan bij gebruik van Protocol 1. Satellietcellen brengen een specifiek patroon van verschillende membraaneiwitten tot expressie. Om de striktheid van onze sortering te vergroten, gebruikten we een combinatie van eerder beschreven negatieve (CD31, TER119, CD45 en CD11b) en positieve (CD34, ITGA7 en CXCR4) satellietcelmarkers30,31. Met behulp van deze strategie werd gemiddeld 1% van de levende vermeende satellietcellen verkregen. Deze uitkomst ligt in het bereik van wat werd verwacht, aangezien satellietcellen 2%-7% van de spiercelpopulatie op volwassen leeftijd bij muizen vertegenwoordigen. Als controle voor de selectiemarkers van de satellietcellen werden CD34+/ITGA7-/CXCR4-cellen geïsoleerd. Immunofluorescerende kleuring toonde aan dat, terwijl CD34+/ITGA7-/CXCR4-cellen geen PAX7 tot expressie brachten, 70% van de gesorteerde CD34+/ITGA7+/CXCR4+ gesorteerde cellen positief waren voor deze satellietcelspecifieke marker, waarmee werd aangetoond dat de FACS-geïsoleerde populatie overeenkomt met satellietcellen. Bovendien was 70% van de satellietcellen die gedurende 7 dagen in myogeen medium werden gekweekt PAX7-/DMD+, zoals aangetoond door immunokleuring, en vormden ze een langwerpige meerkernige myovezel, wat aantoont dat geïsoleerde satellietcellen hun stampotentieel behielden.

De belangrijkste beperking bij de monstervoorbereiding kan het gebruik van een hoge concentratie enzymen zijn, wat resulteert in een grote hoeveelheid gedissocieerd biologisch materiaal, maar kan bijdragen aan een verhoogde celdood. Om dit probleem op te lossen, werd een test getest die een lagere hoeveelheid enzymen vereiste. In dit kader werd Liberase TL, een gezuiverde vorm van het traditionele collagenase33, getest. Hoewel de spijsvertering blijkbaar efficiënter was met dit enzym, bleef de hoeveelheid celresten hoog en was de levensvatbaarheid van de cel iets verlaagd. Deze waarnemingen zijn in overeenstemming met eerdere rapporten die Liberase-gemedieerde weefselvertering hiermee vergeleken met recombinant collagenase of aangepaste collagenase24,25. Bovendien, hoewel het aandeel endotheel- en immuuncellen vergelijkbaar was tussen collagenase en Liberase vertering, was het percentage satellietcellen lager in het met Libase verwerkte monster, wat over het algemeen aantoont dat Liberase niet wordt aanbevolen voor isolatie van satellietcellen. Het gebruik van dit enzym is geschikt voor de fenotypische en kwantitatieve analyse van immuuncellen en kan uiteindelijk worden aanbevolen in de context van spier- en/of andere weefsels. Dit is in overeenstemming met wat is gerapporteerd over Liberase TL als het meest geschikt om levensvatbare immuuncellen effectief te isoleren34,35,36.

Een ander potentieel probleem is de stress die wordt veroorzaakt door zowel het dissociëren als het sorteren van satellietcellen. De afwezigheid van H3K27ac en de lage H3K4me2-niveaus in het promotorgebied van stressresponsgenen geïdentificeerd door eencellige RNA-sequencing in muissatellietcellen26 tonen echter aan dat de procedure mild genoeg is om het transcriptierepertoire van stressrespons niet te induceren. Andere beperkingen die moeten worden opgemerkt, zijn de geselecteerde antigenen die empirisch blijven. Studies tonen echter een grote overlap aan tussen unieke combinaties van oppervlaktemarkers die verrijkt zijn voor skeletspiersatellietcellen30,31.

Een extra cruciale stap is de zuivering van kernen uit gesorteerde cellen. Hiervoor wordt de sorteersnelheid laag gehouden om de cellen niet te beschadigen, maar snel genoeg om ze niet te lang in de FACS-buffer te bewaren. CUT&RUN-kernen liggen inderdaad niet vast en een langere incubatietijd kan van invloed zijn op de uitlezing van het protocol. Een typische bereiding van de twee achterpoten van één muis maakt CUT&RUN mogelijk met één antilichaam en één IgG-controle, met een hoeveelheid van 2,5 ng chromatine voor elk.

CUT&RUN-experimenten, ontworpen om transcriptiefactorbinding en epigenetische modificaties te beoordelen, leverden sterke en robuuste leessignalen op voor H3K4me2 en H3K27ac. De hoge leesniveaus van H3K4me2 en H3K27ac op genen waarvan bekend is dat ze tot expressie komen in satellietcellen, vergeleken met genen die tot expressie worden gebracht in immuun- of endotheelcellen en in myovezels, toonden aan dat het signaal voornamelijk werd versterkt door de kernen van de satellietcellen. Bovendien maakte dit protocol de identificatie van de cistrome van de AR in spierstamcellen mogelijk, wat tot op heden een technisch probleem blijft dat inherent is aan de slechte kwaliteit van AR-antilichamen van muizen en de lage AR-expressieniveaus in cellen die niet erg androgeengevoelig zijn, zoals epitheliale prostaatcellen. De hier gepresenteerde gegevens onthulden AR-gebonden regio's met hoge betrouwbaarheidspiekscores. Aangezien oorspronkelijk slechts één replicaat per antilichaam werd beoordeeld, zal de robuustheid van onze datasets worden verbeterd door ten minste twee extra biologische replicaten per aandoening toe te voegen. AR-bekende doelgenen en respectievelijke histonmarkeringen, oorspronkelijk beschreven als sterk tot expressie gebracht en/of gemakkelijk detecteerbaar in andere weefselcontexten zoals de prostaat, vertonen echter lagere expressieniveaus en zijn zeer moeilijk te detecteren in satellietcellen.

Een beperking van de CUT&RUN-aanpak is dat deze wordt uitgevoerd in niet-gefixeerde cellen. Het is dus mogelijk dat we sommige AR-doelen hebben gemist vanwege de labiele aard van de interacties tussen transcriptiefactoren en hun bindingsplaats. Evenzo kunnen sommige posttranslationele modificaties, zoals acetylering, ook nogal labiel zijn. Daarom kan worden overwogen om een lichte fixatiestap met formaldehyde of paraformaldehyde op te nemen, na FACS-sortering en vóór het isoleren van de kernen, om de eiwit/DNA-interacties en histonmodificaties te stabiliseren.

Hoewel dit artikel aantoont dat CUT&RUN-assays kunnen worden uitgevoerd op FACS-geïsoleerde satellietcellen, kunnen ook andere analyses worden uitgevoerd die niet-gefixeerd chromatine gebruiken, zoals ATAC-seq. Bovendien, hoewel hier spieren werden geoogst in basale fysiologische omstandigheden, kan dit protocol worden toegepast op pathologische contexten zoals letsel of veroudering. Al deze protocoltoepassingen zullen een gedetailleerd begrip van genregulerende mechanismen in satellietcellen mogelijk maken en kunnen helpen begrijpen hoe deze mechanismen kunnen worden veranderd door pathofysiologische omstandigheden.

Samenvattend biedt dit goedkope en tijdbesparende protocol een effectieve experimentele setting om de rekrutering van transcriptiefactoren en het chromatinelandschap in voorlopercellen van skeletspieren te bestuderen. Chromatine bereid door dit protocol heeft de eerste genoombrede analyse van AR-cistrome in satellietcellen opgeleverd en zal toekomstige studies naar genregulatie vergemakkelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij danken Anastasia Bannwarth voor haar uitstekende technische assistentie. We danken de IGBMC-dierenstalfaciliteit, de celkweek, het Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrijk), de beeldvorming, de elektronenmicroscopie, de flowcytometrie en het GenomEast-platform, lid van het consortium 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

Dit werk van het Interdisciplinair Thematisch Instituut IMCBio, als onderdeel van het ITI 2021-2028-programma van de Universiteit van Straatsburg, CNRS en Inserm, werd ondersteund door IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) en door het SFRI-STRAT'US-project (ANR 20-SFRI-0012) en EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) in het kader van het Franse Investments for the Future-programma. Aanvullende financiering werd verstrekt door INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategisch programma 24376 (aan D.D.), INSERM young researcher grant (aan D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, en een Frans staatsfonds beheerd door de ANR in het kader van het kaderprogramma Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. werd gesteund door het programma CDFA-07-22 van de Université franco-allemande en Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, en K.G. door de Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Tags

CUT&RUN-analyse FACS-geïsoleerde muissatellietcellen stamcelveld kleine celpopulaties efficiënt protocol fluorescentie-geactiveerde celsortering ledemaatspier structurele eiwitten hakken medium dispase type I collagenase celzeven FACS-buffer levensvatbaarheidskleuring immunogekleurde satellietcellen Triton X-100 Concanavalin A magnetische kralen transcriptiefactor histonmodificaties eiwit A-microkokkennuclease chromatinesplitsing CaCl2 DNA-extractie Bibliotheken Bio-informatica Analyse
Een efficiënt protocol voor CUT&amp;RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter