Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ett effektivt protokoll för CUT&RUN-analys av FACS-isolerade mussatellitceller

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Här presenteras ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av muskelsatellitceller i musextremiteter anpassade för studier av transkriptionsreglering i muskelfibrer genom klyvning under mål och frisättning med hjälp av nukleas (CUT&RUN).

Abstract

Genomomfattande analyser med små cellpopulationer är ett stort hinder för studier, särskilt inom stamcellsområdet. Detta arbete beskriver ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av satellitceller från extremitetsmuskeln, en vävnad med ett högt innehåll av strukturella proteiner. Dissekerade extremitetsmuskler från vuxna möss stördes mekaniskt genom malning i medium kompletterat med dispase och kollagenas typ I. Vid matsmältningen filtrerades homogenatet genom cellsilar och cellerna suspenderades i FACS-buffert. Viabiliteten bestämdes med fixerbar viabilitetsfläck och immunfärgade satellitceller isolerades med FACS. Celler lyserades med Triton X-100 och frigjorda kärnor bands till konanavalin A magnetiska pärlor. Kärn-/pärlkomplex inkuberades med antikroppar mot transkriptionsfaktorn eller histonmodifieringar av intresse. Efter tvätt inkuberades kärn-/pärlkomplex med protein A-mikrokocknukleas, och kromatinklyvning initierades med CaCl2. Efter DNA-extraktion genererades och sekvenserades bibliotek, och profilerna för genomomfattande transkriptionsfaktorbindning och kovalenta histonmodifieringar erhölls genom bioinformatisk analys. De toppar som erhölls för de olika histonmarkeringarna visade att bindningshändelserna var specifika för satellitceller. Dessutom avslöjade känd motivanalys att transkriptionsfaktorn var bunden till kromatin via dess kognata responselement. Detta protokoll är därför anpassat för att studera genreglering i vuxna mösss muskelsatellitceller.

Introduction

Tvärstrimmiga skelettmuskler utgör i genomsnitt 40 % av vikten av den totala människokroppen1. Muskelfibrer uppvisar en anmärkningsvärd förmåga till regenerering vid skada, vilket beskrivs av sammansmältningen av nybildade myocyter och genereringen av nya myofibrer som ersätter de skadade2. År 1961 rapporterade Alexander Mauro en population av mononukleära celler som han kallade satellitceller3. Dessa stamceller uttrycker transkriptionsfaktorn parad box 7 (PAX7) och är belägna mellan den basala laminan och sarkolemma av muskelfibrer4. De rapporterades uttrycka kluster av differentiering 34 (CD34; en hematopoetisk, endotelial stamcellsmarkör och mesenkymal stamcellsmarkör), integrin alfa 7 (ITGA7; en markör för glatt muskulatur, hjärt- och skelettmuskulatur), såväl som C-X-C-kemokinreceptorn typ 4 (CXCR4; en lymfocyt-, hematopoetisk och satellitcellmarkör)5. Under basala förhållanden befinner sig satellitceller i en viss mikromiljö som håller dem i ett vilande tillstånd6. Vid muskelskador aktiveras de, förökar sig och genomgår myogenes7. Men eftersom de bara bidrar till en mindre del av det totala antalet muskelceller är deras genomomfattande analyser särskilt utmanande, särskilt under fysiologiska miljöer (<1 % av det totala antalet celler).

Olika metoder för kromatinisolering från satellitceller har beskrivits, vilka involverar kromatinimmunprecipitering följt av massiv parallell sekvensering (ChIP-seq) eller klyvning under targets och tagmentation (CUT&Tag) experiment. Ändå har dessa två tekniker några betydande begränsningar som förblir oemotsagda. Faktum är att ChIP-seq kräver en stor mängd utgångsmaterial för att generera tillräckligt med kromatin, varav en stor del går förlorad under ultraljudsbehandlingen. CUT&Tag är mer lämpligt för lågt cellantal, men genererar fler klyvningsställen utanför målet än ChIP-seq på grund av Tn5-transposasaktiviteten. Dessutom, eftersom detta enzym har en hög affinitet för öppna kromatinregioner, kan CUT&Tag-metoden företrädesvis användas för att analysera histonmodifieringar eller transkriptionsfaktorer associerade med aktivt transkriberade regioner i genomet, istället för tystat heterokromatin 8,9.

Här presenteras ett detaljerat protokoll som gör det möjligt att isolera musmuskelsatellitceller med FACS för klyvning under mål och frisättning med hjälp av nukleas (CUT&RUN)10,11-analys. De olika stegen involverar mekanisk störning av vävnad, cellsortering och isolering av kärnor. Metodens effektivitet, när det gäller beredning av en livskraftig cellsuspension, demonstrerades genom att utföra CUT&RUN-analys för kovalenta histonmodifieringar och transkriptionsfaktorer. Kvaliteten på isolerade celler gör den beskrivna metoden särskilt attraktiv för att framställa kromatin som fångar det ursprungliga genomiska beläggningstillståndet troget, och är sannolikt lämplig för att fånga kromosomkonformationen i kombination med storskalig sekvensering på specifika loci (4C-seq) eller på genomomfattande nivåer (Hi-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Möss hölls i ett ackrediterat djurstall, i enlighet med nationella riktlinjer för djurvård (Europeiska kommissionens direktiv 86/609/EEG; Franskt dekret nr 87-848) om användning av försöksdjur för forskning. Planerade manipulationer lämnades in till den etiska kommittén (Com'Eth, Strasbourg, Frankrike) och till det franska forskningsministeriet (MESR) för etisk utvärdering och godkännande enligt 2010/63/EU-direktivet under APAFIS-nummer #22281.

1. Beredning av cellsuspension för isolering av satellitceller genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) (figur 1)

  1. Isolering av muskelvävnad
    1. Dekontaminera verktygen för muskeldissektion, inklusive pincett, skalpeller och sax, med ett rengöringsmedel (tabell 1) och skölj noggrant med destillerat vatten.
    2. Förbered två 2 ml rör (tabell 1), som var och en innehåller 1 ml muskelisoleringsbuffert, och lägg dem på is för att samla upp skördade muskler.
    3. Avliva två 10 veckor gamla C57/Bl6J-hanmöss genom CO2 kvävning följt av cervikal luxation. Spraya 70 % etanol över varje mus. Dra av huden från bakbenet med en pincett. Dissekera alla extremitetsmuskler som omger lårbenet, skenbenet och vadbenet (cirka 1 mg muskler per mus).
      OBS: Antalet satellitceller minskar efter 15 veckors ålder.
    4. Placera de skördade extremitetsmusklerna i 2 ml rör som innehåller 1 ml muskelisoleringsbuffert som beretts i steg 1.1.2. Samla in musklerna från den andra musen enligt samma procedur. Finhacka de skördade musklerna med en sax på is tills mindre än 1 mm3 fragment erhålls.
      OBS: Muskler samlades in och hackades huvudsakligen enligt beskrivningen12. Utför vävnadsnedbrytning antingen enligt steg 1.2 eller 1.3.
  2. Vävnadsnedbrytning med kollagenasenzym
    1. Överför den malda muskelsuspensionen från de två mössen genom att hälla dem i ett 50 ml rör (tabell 1) som innehåller 18 ml muskelisoleringsbuffert (kompletterat med 5 ml [5 E/ml] dispase och 5 mg kollagenas typ I) (tabell 1).
    2. Stäng röret ordentligt och försegla det med laboratoriefilm (tabell 1). Placera den horisontellt i ett skakande vattenbad (tabell 1) vid 37 °C vid 100 rpm i 30 min.
    3. Efter 30 minuter, tillsätt 5 mg kollagenas typ I. Håll rören i ytterligare 30 minuter under omrörning i ett skakande vattenbad vid 37 °C vid 100 rpm.
    4. Vid matsmältningen, pipettera muskelsuspensionen upp och ner 10 gånger med en 10 ml pipett för att förbättra effektiviteten av dissociationen. Centrifugera vid 4 °C vid 400 x g i 5 min. En klar pellet kommer att synas i botten av röret. Kassera supernatanten med en 10 ml pipett och lämna 5 ml medium i röret.
      OBS: Att lämna mediet hjälper till att undvika att stressa cellerna. Tillsätt 10 ml färsk muskelisoleringsbuffert och återsuspendera pelleten genom att pipettera upp och ner med en 10 ml pipett.
    5. Placera 100 μm, 70 μm och 40 μm cellsilar (en av varje typ) (tabell 1) på öppna 50 ml rör. Pipettera suspensionen på de på varandra följande cellsilarna (100 μm, 70 μm, 40 μm) och samla upp genomströmningen i 50 ml-rören som innehåller celler under 40 μm.
    6. Centrifugera suspensionen vid 4 °C vid 400 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten med en 10 ml pipett tills 2 ml återstår, och använd sedan en 0,2-1 ml pipett tills 100-200 μl återstår. Återsuspendera pelleten i 2 ml lysbuffert för röda blodkroppar (tabell 2). Inkubera på is i 3 min.
    7. Centrifugera vid 4 °C vid 400 x g i 5 minuter och kassera supernatanten med en 20-200 μL pipett. Återsuspendera cellerna i 100 μl kall FACS-buffert (tabell 2). Lägg på is.
  3. Alternativ metod för vävnadsnedbrytning med Liberase thermolysin low (TL) enzym
    1. Följ beskrivningarna i steg 1.1. för vävnadsisolering.
    2. För Liberase-medierad vävnadsdisaggregering, skörda musklerna i 2 ml isoleringsbuffert från Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (tabell 2), i stället för muskelisoleringsbuffert som beskrivs i steg 1.1.2.
    3. Överför den malda muskelsuspensionen från de två mössen genom att hälla dem i ett 50 ml rör (tabell 1) innehållande 18 ml RPMI-isoleringsbuffert kompletterat med 300 eller 600 μl Liberase TL vid 5 mg/ml (tabell 1) (dvs. 0,083 mg/ml respektive 0,167 mg/ml slutliga koncentrationer)13.
    4. Stäng röret ordentligt och försegla det med laboratoriefilm (tabell 1). Placera den horisontellt i ett skakande vattenbad (tabell 1) vid 37 °C vid 100 rpm i 30 min.
    5. Vid matsmältningen, pipettera muskelsuspensionen upp och ner 10 gånger med en 10 ml pipett för att dissociera och förbättra dissociationens effektivitet.
    6. Centrifugera vid 4 °C vid 400 x g i 5 min. En klar pellet kommer att synas i botten av röret. Kassera supernatanten med en 10 ml pipett och lämna 5 ml medium i röret. Att lämna mediet hjälper till att undvika att stressa cellerna. Tillsätt 10 ml färsk RPMI-isoleringsbuffert och återsuspendera pelleten genom att pipettera upp och ner med en 10 ml pipett.
    7. Placera 100 μm, 70 μm och 40 μm cellsilar (en av varje typ) (tabell 1) på öppna 50 ml rör.
    8. Pipettera suspensionen över varandra följande cellsilar (100 μm, 70 μm, 40 μm) och samla upp genomströmningen i 50 ml-rören som innehåller celler under 40 μm.
    9. Centrifugera suspensionen vid 4 °C vid 400 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten med en 10 ml pipett tills 2 ml återstår, och använd sedan en 0,2-1 ml pipett tills 100-200 μl återstår.
    10. Återsuspendera pelleten i 2 ml lysbuffert för röda blodkroppar (tabell 2). Inkubera på is i 3 min.
    11. Centrifugera vid 4 °C vid 400 x g i 5 minuter och kassera supernatanten med en 20-200 μL pipett.
    12. Återsuspendera cellerna i 100 μl kall FACS-buffert (tabell 2). Lägg på is.
  4. Beredning av cellsuspension för FACS-isolering
    1. Överför 10 μl av cellsuspensionen från steg 1.2.12 till ett nytt 1,5 ml rör. Detta prov kommer att utgöra den ofärgade kontrollen eller den negativa kontrollen (figur 2). Tillsätt 190 μl FACS-buffert, överför till ett 5 ml rör (tabell 1) och förvara på is.
    2. Centrifugera de återstående 90 μl av cellsuspensionen som erhölls i steg 1.2.12 vid 4 °C vid 400 x g i 5 minuter och kassera supernatanten med en pipett (20-200 μL spetsvolym). Inkubera cellerna med 400 μl fixerbar viabilitetsfläck (tabell 3) utspädd i serumfritt Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) i 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
    3. Tvätta cellerna genom centrifugering vid 4 °C vid 400 x g i 5 minuter och tillsätt 100 μl FACS-buffert. Vänd försiktigt rören upp och ner tre gånger och centrifugera igen vid 4 °C vid 400 x g i 5 minuter.
    4. Under centrifugeringstiden bereds 100 μl av en masterblandning av primära antikroppar kopplade till fluoroforer och riktade mot CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 och CXCR4 (tabell 3), utspädda i FACS-buffert.
    5. Centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C, kassera cellsupernatanten med en pipett (20–200 μL spetsvolym) och tillsätt 100 μL antikroppsblandningen. Vänd försiktigt röret tre gånger. Virvla inte. Ruvas i mörker på is i 30 min.
    6. Centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten med en 20-200 μL pipett och tillsätt 500 μL 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att tvätta cellerna. Vänd försiktigt röret tre gånger. Centrifugera på nytt vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten med en 20-200 μL pipett.
    7. Återsuspendera cellpelleten i 500 μl FACS-buffert och överför suspensionen till ett 5 ml rör.
      OBS: cellsuspensionen som erhålls från Liberase digestion bearbetas på samma sätt.
  5. Val av satellitceller med FACS
    1. Virvla cellsuspensionen kort (2-5 sek) och bearbeta cellerna på en flödescytometer utrustad med ett 100 μm munstycke (tabell 1).
    2. Bestäm de olika grindstorlekarna baserat på det ofärgade provet som lagrades i steg 1.4.1 (figur 2).
    3. Bestryk ett 5 ml rör med 1 ml rent fetalt kalvserum (FCS) för att förbättra celluppsamlingen och tillsätt 500 μl FACS-buffert.
    4. Byt ut det ofärgade provet mot det antikroppsmärkta provet.
    5. Välj den population som är av intresse enligt framåtspridningsområdet (FSC-A) och sidospridningsområdet (SSC-A) (figur 3A) och ta bort dubblettceller med FSC-A och framåtspridningshöjden (FSC-H) (figur 3B)14.
    6. Identifiera levande celler med fixerbar livsduglighetsfläck negativ färgning (Figur 3C).
    7. Välj negativa celler för CD31, CD45, TER119 och CD11b (figur 3D).
    8. För att identifiera satellitceller, välj först de celler som är positiva för CD34 och ITGA7 (figur 3E) och välj sedan de CXCR4-positiva cellerna på den CD34- och ITGA7-selekterade populationen (figur 3F).
    9. Samla de valda cellerna (mellan 40 000 och 80 000 celler, beroende på preparatets kvalitet) i det 5 ml belagda röret som innehåller 500 μL FACS-buffert.

2. Validering av den isolerade populationen i vävnadskultur

  1. Glidbeläggning med hydrogel
    1. Späd 280 μl av en ren hydrogel human embryonal stamcellsgodkänd matris (hESC) (tabell 1) i 12 ml serumfritt DMEM/F12-medium.
    2. Bestryk ett kammarglas (tabell 1) med hydrogellösningen och inkubera den över natten vid 4 °C.
    3. Nästa dag, inkubera kammarglaset vid 37 °C och 5 % CO2 i 1 timme före cellsådd.
  2. Celltillväxt och differentiering
    1. Platta ut cirka 20 000 celler, erhållna från steg 1.5.9, per brunn och odla dem i tillväxtmedium (tabell 2) i 5 dagar. Ta faskontrastbilder med hjälp av ett ljusfältsmikroskop (figur 4A) innan du bearbetar dem för immunofluorescensanalys för att säkerställa preparatets kvalitet (figur 4B).
    2. För att inducera myogenes, odla amplifierade satellitceller från steg 2.2.1 i myogent medium (tabell 2) i ytterligare 7 dagar. Ta faskontrastbilder med ljusfältsmikroskop (figur 4C) innan du bearbetar dem för immunofluorescensanalys för att säkerställa preparatets kvalitet (figur 4D).
  3. Analys av immunocytofluorescens
    1. Ta försiktigt bort mediet, tvätta cellerna som odlats på kammarglaset med 100 μl 1x PBS två gånger och fixera dem med 100 μl 4 % paraformaldehyd (PFA) vid RT i 1 timme.
      OBS: Detta steg bör utföras med försiktighet. En liten volym medium bör alltid förvaras i kammaren för att förhindra att cellerna stressas, och PBS bör hällas genom kammarens väggar.
    2. Tvätta cellerna tre gånger med 100 μL 1x PBS, kompletterat med 0,1 % Tween 20 (PBST) för att permeabilisera cellmembranen.
    3. Blockera ospecifika signaler genom inkubation i 100 μL 1x PBST kompletterat med 5 % FCS (PBST-FCS) vid RT i 1 timme.
    4. Inkubera cellerna med 100 μL av en masterblandning av anti-PAX7- och anti-dystrofinantikroppar (DMD) (utspädda i 1x PBST-FCS) vid 4 °C över natten, för att detektera satellitceller respektive myofibrer.
    5. Tvätta cellerna tre gånger med 100 μl 1x PBST och inkubera dem med 100 μL getantimusantimusanti3 eller getantikanin Alexa 488 sekundära antikroppar (tabell 3) utspädda i 1x PBST-FCS vid RT i 1 timme.
    6. Lossa kammarbrunnarna från objektglaset med hjälp av den utrustning som tillhandahålls av leverantören, tillsätt 20 μl vattenhaltigt monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och täck objektglaset med ett täckglas (tabell 1).
    7. Observera och fånga bilden av de färgade cellerna med ett konfokalmikroskop.
    8. Bearbeta bilderna med hjälp av bildanalysprogram (figur 4B,D).

3. CUT&RUN-analys

  1. Provberedning för CUT&RUN-analys på FACS-isolerade satellitceller
    OBS: CUT&RUN utfördes i huvudsak enligt beskrivningen10,15. Buffertsammansättningen presenteras i Tabell 2.
    1. För CUT&RUN-analysen, använd cirka 40 000 av de celler som erhölls i metod 1, steg 1.5.9, per prov/antikropp som måste testas.
    2. Centrifugera de FACS-isolerade satellitcellerna vid RT vid 500 x g i 10 minuter och kassera sedan supernatanten med en pipett (20–200 μL spetsvolym).
    3. Tvätta cellerna med 1 ml 1 x PBS, centrifugera vid RT vid 500 x g i 5 minuter, kassera supernatanten med en pipett (0,2-1 ml spetsvolym) och återsuspendera dem i 1 ml kall kärnextraktionsbuffert (tabell 2). Inkubera på is i 20 min.
    4. Under inkubationen bereds ett 1,5 ml rör som innehåller 850 μl kallbindningsbuffert (tabell 2) och 20 μl konkanavalin A-belagda magnetiska pärlor per prov (tabell 1).
    5. Tvätta pärlorna två gånger med 1 ml kallbindningsbuffert med hjälp av ett magnetställ (tabell 1). För varje tvätt eller buffertbyte under hela proceduren, låt pärlorna samlas vid sidan av röret på magnetstället i 5 minuter innan du tar bort den rensade supernatanten med en pipett (0,2-1 ml spetsvolym). Blanda sedan försiktigt i 300 μl kallbindande buffert.
    6. Centrifugera kärnorna vid 4 °C vid 600 x g i 5 minuter och återsuspendera dem försiktigt i 600 μl kärnextraktionsbuffert. Blanda försiktigt 600 μl extraherade kärnor med 300 μl concanavalin A-pärlslam och inkubera vid 4 °C i 10 minuter.
    7. Avlägsna supernatanten med hjälp av ett magnetställ, enligt beskrivningen i steg 3.1.4, och återsuspendera försiktigt de pärlbundna kärnorna med 1 ml köldblockerande buffert (tabell 2). Inkubera vid RT i 5 min.
    8. Ta bort supernatanten med hjälp av ett magnetställ och tvätta de pärlbundna kärnorna två gånger med 1 ml kalltvättbuffert (tabell 2). Under den andra tvätten, dela upp de pärlbundna kärnorna lika i 1.5 ml rör. Varje tub kommer att behandlas med en specifik antikropp i nästa steg.
      OBS: I detta exempel delades 250 μL pärlbundna kärnor i fyra 1,5 ml rör.
    9. Separera supernatanten med hjälp av ett magnetställ, enligt beskrivningen i steg 3.1.4, och aspirera med en pipett. Återsuspendera försiktigt kärn-/pärlkomplexen med en specifik primär antikropp (tabell 3) eller ett IgG av en annan art (här kanin) utspätt i 250 μl kalltvättbuffert. Inkubera vid 4 °C över natten under lätt omrörning.
      OBS: Antikropparna som används här är riktade mot AR, H3K4me2 och H3K27ac.
    10. Ta bort supernatanten med ett magnetställ, enligt beskrivningen i steg 3.1.4, tvätta de pärlbundna kärnorna två gånger med 1 ml kalltvättsbuffert och återsuspendera i 100 μl kalltvättbuffert.
    11. Späd protein A-mikrokocknukleas vid 1,4 ng/μL i 100 μL per prov av kalltvättbuffert.
    12. Tillsätt 100 μl protein A-mikrokocknukleas till de 100 μl prov som erhölls i 3.1.11 och inkubera vid 4 °C i 1 timme under omrörning.
    13. Ta bort supernatanten med ett magnetställ, enligt beskrivningen i steg 3.1.4, tvätta två gånger med 1 ml kalltvättbuffert och återsuspendera de pärlbundna kärnorna i 150 μl kalltvättbuffert.
    14. För att initiera DNA-klyvning, tillsätt 3 μL 100 mM CaCl2 till 150 μL provet, blanda snabbt genom att snärta och inkubera på is i 30 minuter. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 150 μl stoppbuffert och inkubera vid 37 °C i 20 minuter för att smälta RNA:t och frigöra DNA-fragmenten.
    15. För DNA-extraktion, centrifugera proverna vid 16 000 x g vid 4 °C i 5 minuter.
    16. Överför supernatanten till ett nytt mikrofugerör och kassera pelleten och kulorna.
    17. Tillsätt 3 μl 10 % natriumdodecylsulfat (SDS) och 2,5 μl 20 mg/ml proteinas K. Blanda genom inversion. Inkubera i 10 minuter vid 70 °C (skakas ej).
    18. Tillsätt 300 μl fenol/kloroform/isoamylalkohol, virvlar, överför till 2 ml faslockrör (förcentrifugerade i 5 minuter vid 16 000 x g) och centrifugera i 5 minuter vid 16 000 x g vid 4 °C.
    19. Tillsätt 300 μl kloroform till samma rör och centrifugera i 5 minuter vid 16 000 x g vid 4 °C. Samla upp supernatanten (~300 μL) med en pipett (0,2-1 ml spetsvolym) och överför till en ny 1,5 ml slang.
    20. Tillsätt 1 μl glykogen (20 mg/ml koncentration).
    21. Tillsätt 750 μl 100 % etanol och fäll ut över natten vid -20 °C.
    22. Pelletera DNA genom centrifugering i 15 minuter vid 16 000 x g vid 4 °C. Tvätta pelleten med 1 ml 100 % etanol, centrifugera i 5 minuter vid 16 000 x g, kassera supernatanten, centrifugera i 30 s vid 16 000 x g och ta bort vätskan med en pipett (20-200 μL spetsvolym).
    23. Lufttorka pelleten i ~5 min. Återsuspendera i 25 μl 1 mM Tris-HCl (pH 8) och 0,1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA; pH 8).
  2. Bioinformatisk analys
    1. Förbered bibliotek från immunklyvt DNA och sekvensera dem som parade 100 bp-läsningar med hjälp av den genomiska plattformen enligt beskrivningen16.
    2. Ta bort läsningar som överlappar med den svartlistade regionen ENCODE (V2) och separera de återstående läsningarna i två grupper: fragmentstorlek <120 bp (utan nukleosom, i allmänhet för transkriptionsfaktorer) och fragmentstorlek >150 bp (med nukleosomer, normalt för histonmärken). Mappa till mm10-referensgenomet med hjälp av Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Generera bigwig-filer med bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Behåll unikt mappade läsningar för ytterligare analys.
    5. Generera råa bedgraph-filer med genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Använd SEACR 1.3-algoritmen (strikt alternativ) för toppsamtalet. Läs in måldata-bedgraph-filen i UCSC-bedgraph-format som utelämnar regioner som innehåller nollsignal- och kontrolldata-bedgraph-fil (IgG) för att generera ett empiriskt tröskelvärde för toppanrop18.
    7. Utför en Pearson-korrelationsanalys med deeptools för att fastställa likheten mellan proverna19. Använd kommandoraden multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, följt av plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualisera de genomomfattande intensitetsprofilerna med IGV20 med hjälp av bedgraph-filer och bäddfilstopparna erhållna från SEACR.
    9. Använd HOMER för toppnotering och motivsökning21.
    10. Jämför slutligen datauppsättningarna med tidigare publicerade med ChIP-Atlas Peak-webbläsaren för att visualisera dem på IGV och/eller berikningsanalys med hjälp av de SEACR-genererade bäddfilerna som en indatauppsättning22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Satellitceller från musskelettmuskler isolerades genom att kombinera protokollen från Gunther et al. (nedan protokoll 1)12 och från Liu et al.23 (nedan kallat protokoll 2). Eftersom icke-smälta muskelfibrer observerades efter matsmältning vid användning av den koncentration av kollagenas och dispase som föreslogs i protokoll 1, ökades mängden enzymer för att förbättra muskelfiberdissociationen, som beskrivs i steg 1.2.1 och 1.2.3. Som anges i protokoll 2 utsattes proverna för en försiktig omrörning i ett vattenbad för att bibehålla cellviabiliteten. Vi utförde filtrering genom cellsilar, som nämns i protokoll 1, och inkubation med lysbuffert för röda blodkroppar (se steg 1.2.7 till 1.2.10). I protokoll 1 laddades cellerna på en Percoll-densitetsgradient på 30%/70% för att isolera mononukleära celler vid interfasen, vilket kan ha lett till förlust av celler av intresse. Detta steg utelämnades därför, vilket föreslogs i protokoll 2.

FSC-A kontra SSC-A-reglering användes för att identifiera mononukleära celler baserat på storlek (FSC) och granularitet (SSC) (figur 3A). Skräp uteslöts genom att ignorera händelser under 40 K på FSC-A-axeln, och 38,8 % ± 3,6 % av cellerna valdes ut. FSC-A kontra FSC-H-diagram (forward scatter height) användes för dubbel uteslutning (figur 3B). Efter att ha valt de celler som var negativa för den fixerbara livsduglighetsfläckmarkören erhölls i genomsnitt 34,3 % ± 7,7 % av de levande cellerna (figur 3C).

Procentandelen som visas i punktdiagrammet i figur 3C, 75,4 %, motsvarar procentandelen enskilda levande celler, beräknad från föräldracellpopulationen, som i detta fall är singlarna. 95,7 % av enskilda celler hämtas från livehändelserna, som utgör 35 % av de totala händelserna. Således beräknas den procentandel på 34,3 % som erhålls i genomsnitt från det totala antalet händelser och inte från föräldrapopulationerna.

Cirka 3 % av de enskilda levande cellerna var negativa för leukocyt- (CD45), monocyt- (CD11b), endotel- (CD31) och erytroidspecifika (TER119) markörer (Figur 3D). CD11b/CD45/CD31/TER119-negativa celler valdes sedan ut enligt deras uttryck av CD34 (hematopoetiska, endoteliala stamceller och mesenkymala stamceller) och ITGA7 (hjärt-, glatt- och skelettmuskelceller) markörer (Figur 3E). En slutlig reglering för CXCR4 (lymfocyter, hematopoetiska celler och satellitceller) utfördes för att välja ut förmodade satellitceller (figur 3F). Från CD34+/ITGA7+-cellerna visade sig ~80 % vara positiva för CXCR4, vilket motsvarar i genomsnitt 1 % ± 0,15 % av det totala antalet enskilda levande celler, och ett absolut antal på 60 000 ± 14 000 förmodade satellitceller per muslemsmuskler bland 14 oberoende experiment. En ytterligare utsortering av CXCR4+-cellfraktionen avslöjade att cirka 80 % av de levande cellerna erhölls efter eftersortering, varav nästan 70 % var CXCR4+ (figur S1), vilket visar den höga livskraften och renheten hos denna FACS-isolerade cellpopulation.

Eftersom olika studier jämförde effektiviteten av kollagenas och Liberase TL-enzymer för cellisolering24,25 har dessa två matsmältningsmetoder bearbetats parallellt. Med 300 μL Liberase TL var matsmältningen mindre effektiv än med kollagenas, eftersom osmälta fibrer fanns kvar. Dessutom observerades mer cellskräp och stora händelser (figur S2A,B), och endast 17,3 % av enstaka levande celler erhölls i genomsnitt efter FVS 780-selektion (figur S2C). Ett ytterligare problem med nedbrytningen av Liberase var det låga antalet CD34+/ITGA7+-celler jämfört med kollagenas (figur S2D-S2E), även om CXCR4-reglering var likartad (figur S2F). Med 600 μL Liberase TL blev matsmältningen effektivare. Mängden cellskräp förblev dock förhöjd och cellviabiliteten undermålig (16,3 %) (Figur S3). Således var digestion med Liberase TL mindre effektiv för isolering av satellitceller.

Vid sådd uttryckte mer än 70 % av CD34+/ITGA7+/CXCR4+-cellerna (figur 4A) PAX7 (figur 4B), i motsats till CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler som var PAX7-negativa (figur 4C). CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler kunde differentiera till myofibrer när de odlades i ett myogent medium i ytterligare 7 dagar, vilket visades genom dystrofin (DMD) färgning (Figur 4D), vilket bekräftar deras myogena potential. Kombinerade vävnadsodlings- och immunofluorescensanalyser visade således att FACS-isolerade CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler är satellitceller.

För att avgöra om isolerade satellitceller är lämpliga för CUT&RUN-analys bestämdes den genomiska profilen för acetylerad lysin 27 (H3K27ac) och dimetylerad lysin 4 (H3K4me2) av histon H3, två histonmodifieringar som finns i aktiva promotor- och förstärkarregioner. Våra data avslöjade 68 694 och 13 514 toppar för H3K4me2 respektive H3K27ac, med en liknande genomisk fördelning mellan de två histonmärkena (Figur S4A). I detalj fann vi att en fjärdedel av topparna var belägna ± 2 kb från transkriptionsstartplatsen (TSS) för den närmaste genen, majoriteten var lokaliserade antingen -100 kb till -10 kb, eller 10 kb till 100 kb från TSS (Figur S4B). Värt att notera är att Pearson-analysen visade en 80-procentig korrelation mellan H3K27ac- och H3K4me2-läsprofiler (figur S4C). För att bedöma om kromatinet framställt från ovannämnda protokoll var isolerat från satellitceller bestämdes förekomsten av H3K27ac och H3K4me2 vid promotorn av satellitcellspecifika gener. H3K4me2 anrikades runt TSS för Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 och Vcam1 (Figur 5A), men inte för Itgam (CD11b) och Ptprc (CD45) (immunceller), Pecam (CD31; endotelceller) (Figur 5B), Ckm (muskelfibrer under utveckling) eller Myh3 (myosin tung kedja snabbt embryonal, myofibrer) (Figur 5C). Liknande resultat erhölls med H3K27ac (figur 5). Nästan ingen signal erhölls med IgG-provet (figur 5). Dessutom visade jämförelsen av H3K27ac-topparna som erhållits från SEACR med de som erhållits från MACS2-toppanrop från publicerade ChIP-seq-dataset en hög korrelation, vilket noteras under varje panel (ChIP-Atlas-spår; Figur 5). Sammantaget indikerar dessa resultat att de avläsningar som erhålls efter den bioinformatiska analysen härstammar från kromatinet i FACS-isolerade satellitceller och korrelerar med de som tidigare identifierats av ChIP-seq-analyser.

Medan encells-RNA-sekvenseringsstudier i mussatellitceller visade en slående stressrespons, orsakad av isoleringsproceduren26, bestämdes närvaron av H3K4me2 eller H3K27ac vid stressresponsgener, vilket exemplifieras med Atf3, Azin1, Gls och Elf2. Resultaten ger belägg för att H3K27ac-märket inte deponeras vid promotorn för sådana gener och att nivåerna av H3K4me2 förblir låga jämfört med de som erhålls för satellitcellspecifika gener (figur S5). Dessa data belyser alltså hur mild isoleringsproceduren är.

Därefter undersöktes lämpligheten av vår isoleringsmetod för transkriptionsfaktorer. CUT&RUN-analys för androgenreceptorn (AR), en transkriptionsfaktor som tillhör superfamiljen nukleära receptorer och som spelar en viktig roll i myogen differentiering27, avslöjade 7 840 toppar. Dessa toppar var huvudsakligen belägna i intron- och intergena regioner (Figur S4A), antingen -100 kb till -10 kb, eller 10 kb till 100 kb från TSS (Figur S4B). Fylogenetiska analyser visade att AR, tillsammans med glukokortikoiden (GR/Nr3c1), mineralkortikoiden (MR/Nr3c2) och progesteronreceptorerna (PR/Nr3c3), är en medlem av underfamiljen28 av oxosteroidnukleära receptorer, som binder som homodimerer till DNA-segment som består av två 5′-RGAACA-3′ palindromiska halvplatser åtskilda av tre baspar29. Sökning efter ett känt motiv med hjälp av hypergeometrisk optimering av motivanrikning (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) avslöjade att AR är bundet till 5′-RGRNCA-3′ AR-motivet på halva platsen, till det typiska 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ oxosteroidmotivet (i figuren kallat PR) och till 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR-konsensusmotivet i >32 %, 17 % och 2 % av målregionerna, (figur 6A). Det bör noteras att liknande proportioner tidigare erhölls för glukokortikoidreceptorn i skelettmuskulaturen16.

SEACR-analysen avslöjade nästan 500 toppar med en topppoäng >50, med mer än 200 av dem med en poäng >100; några av dem exemplifieras i figur 6B. Vår analys avslöjade också en blygsam anrikning av AR vid de tidigare beskrivna bindningsställena för gener som är involverade i polyaminbiosyntes (Amd1, Oat och Smox) och i prostatacancer (Acox1, Fkbp5 och Tmprss2) (Figur S6). Intressant nog hittades AR på platserna för gener som är involverade i satellitcellstam (Pax7, Cxcr4 och Cd34) (Figur S7). Värt att notera är att oxosteroidresponselementet hittades i vart och ett av dessa AR-berikade områden (Figur S6 och Figur S7), vilket visar att AR-signalen som ses i CUT&RUN-data är mycket specifik.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av det protokoll som används för satellitcellisolering från musens lemmuskler. Protokollet består av fyra huvudsteg. I korthet offras möss och bakbensmusklerna skördas (steg 1.1.1-1.1.3) och mals mekaniskt med sax (steg 1.4-1.5). Detta följs av steg 1.2.1-1.2.4, under vilka musklerna dissocieras i ett vattenbad med kollagenas och dispas. I steg 1.2.5-1.2.8 filtreras cellsuspensionen genom 100, 70 och 40 μm cellsilar, i följd, och erytrocyter elimineras med hjälp av lysbuffert för röda blodkroppar (steg 1.2.9-1.2.12). De återstående cellpopulationerna märks i steg 1.3 med antikroppar kopplade till fluoroforer, som är riktade mot specifika cellulära fenotypiska markörer. Steg 1.4 omfattar prover som passerar genom FACS för att samla in satellitceller för vidare tillämpning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Flödescytometrianalys av ett ofärgat cellpreparat. A) Urval av den berörda populationen på grundval av FSC-A- och SSC-A-parametrarna. B) Identifiering av enskilda celler baserad på FSC-A och FSC-H. (C) Karakterisering av autofluorescenströskeln för insamlade celler för APC-Cy7 konjugerad till den fixerbara viabilitetsfläcken (FVS 780) som markerar döda celler. (D-F). Autofluorescensmätning för PE-Cy7 konjugerad till CD11b-antikropp och PE-konjugerad till TER119/CD45/CD31-markörer (D), samt för Alexa fluor 488 konjugerad till ITGA7, Alexa fluor 405 konjugerad till CD34 (E) och APC-fluorokrom konjugerad till CXCR4 (F). Grindar representeras som svarta lådor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Strategi för flödescytometerstyrning för satellitcellsortering. A) Urval av den berörda populationen på grundval av FSC-A- och SSC-A-parametrarna. B) Identifiering av enskilda celler baserad på FSC-A och FSC-H. C) Identifiering av levande celler med FVS 780. D) Negativ cellselektion baserad på CD11b-, CD31-, CD45- och TER119-antigener. (E-F) Positiv cellselektion baserad på CD34 och ITGA7 (E), samt CXCR4 (F) antigener. Grindar representeras som svarta lådor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Analys av FACS-isolerade CD34+/ITGA7+/CXCR4+ och CD34+/ITGA7-/CXCR4- celler. A) Faskontrastbilder av CD34+/ITGA7+/CXCR4+ och CD34+/ITGA7-/CXCR4- celler odlade i odlingsmedium. B) Immunofluorescensanalys av CD34+/ITGA7+/CXCR4+ och CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler odlade i odlingsmedium med antikroppar riktade mot PAX7 (rött) och dystrofin (DMD, grönt). Kärnorna färgades med DAPI (blått). Magentafärgade pilar indikerar PAX7-positiva celler. (C) Faskontrastbilder av CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler som odlats i 5 dagar i odlingsmedium (vänster panel) och i ytterligare 7 dagar i myogent medium (höger panel). (D) Immunofluorescensanalysbilder av CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler odlade i 5 dagar i odlingsmedium (vänster panel) och i ytterligare 7 dagar i myogent medium (höger panel) med antikroppar riktade mot PAX7 (röd) och dystrofin (DMD, grön). Kärnorna färgades med DAPI (blått). Magentafärgade pilar indikerar PAX7-positiva celler. Gröna pilar indikerar DMD-positiva celler. Skalstaplar: ljusfältspaneler = 25 μm; Immunofluorescenspaneler = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Genomiska profiler för satellitcellkromatin. Lokalisering av H3K4me2 och H3K27ac vid satellitcellspecifika gener (A), immun- och endotelcellsspecifika gener (B) och myofiberspecifika gener (C) på kromatin hos satellitceller med CUT&RUN. Aktiva promotorer är förpackade i grönt, medan inaktiva promotorer är förpackade i brunt. CUT&RUN utförd med IgG användes som negativ kontroll. H3K27ac-anrikningsanalys för histonmärken presenteras under varje spår. Berikningspoäng som visar konfidensnivåerna för publicerade datauppsättningar visas som en termisk karta. Bruna stjärnor (*) avser H3K27ac ChIP-seq-toppar som utförs i muskelsatellitceller, blå stjärnor som H3K4me3 och den rosa som H4K16me1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: AR-genomisk fördelning på satellitcellskromatin . (A) HOMER-känd motivanalys av AR-toppar i satellitceller. PR: progesteronreceptor. Nb-mål avser antalet toppar som presenterar ett visst motiv. (B) Lokalisering av H3K4me2 och AR vid indikerade gener på kromatinet hos satellitceller bestämda med CUT&RUN. CUT&RUN utförd med IgG användes som negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Lista över material, reagenser och programvara. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Buffertsammansättningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Antikroppsreferenser och antikroppskoncentrationer. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tilläggsfigur 1: Flödescytometrianalys av cellberedningen efter sortering. A) Urval av den berörda populationen på grundval av FSC-A- och SSC-A-parametrarna. B) Identifiering av enskilda celler baserad på FSC-A och FSC-H. C) Identifiering av levande celler med fixerbar viabilitetsfläck (FVS 780). D) Negativ cellselektion baserad på CD11b-, CD31-, CD45- och TER119-antigener. (E-F) Positiv cellselektion baserad på CD34 och ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Grindar representeras som svarta lådor. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Flödescytometerregleringsstrategi för satellitcellsortering efter uppslutning med 300 μL Liberase TL. A) Urval av den berörda populationen på grundval av FSC-A- och SSC-A-parametrarna. B) Identifiering av enskilda celler baserad på FSC-A och FSC-H. C) Identifiering av levande celler med FVS 780. D) Negativ cellselektion baserad på CD11b-, CD31-, CD45- och TER119-antigener. (E-F) Positiv cellselektion baserad på CD34 och ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Grindar representeras som svarta lådor. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Flödescytometerregleringsstrategi för satellitcellsortering efter uppslutning med 600 μL Liberase TL. A) Urval av den berörda populationen på grundval av FSC-A- och SSC-A-parametrarna. B) Identifiering av enskilda celler baserad på FSC-A och FSC-H. C) Identifiering av levande celler med FVS 780. D) Negativ cellselektion baserad på CD11b-, CD31-, CD45- och TER119-antigener. (E-F) Positiv cellselektion baserad på CD34 och ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Grindar representeras som svarta lådor. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Karakterisering av H3K4me2, H3K27ac och AR-genomiska platser. (A) Cirkeldiagram som visar toppfördelningen av H3K4me2, H3K27ac och AR enligt genomets egenskaper i satellitceller. (B) Cirkeldiagram som visar toppfördelningen av H3K4me2, H3K27ac och AR enligt deras avstånd till närmaste TSS i satellitceller. (C) Värmekarta som visar Pearson-korrelationen mellan H3K4me2, H3K27ac och IgG-kontroll. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Genomiska profiler av satellitcellkromatin vid stress-responsinducerade gener. Lokalisering av H3K4me2 och H3K27ac vid indikerade gener på kromatinet i satellitceller. Immunoprecipitering med IgG användes som negativ kontroll. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur 6: Genomiska profiler av satellitcellkromatin vid kända AR-målgener. Lokalisering av H3K4me2, H3K27ac och AR vid indikerade gener på kromatinet i satellitceller bestämda med CUT&RUN. AR-toppar är inramade i blått, och motsvarande AR-responsiva element presenteras nedan. CUT&RUN utförd med IgG användes som negativ kontroll. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur 7: Genomiska profiler av satellitcellkromatin vid deras selektivt uttryckta gener. Lokalisering av H3K4me2, H3K27ac och AR vid indikerade gener på kromatinet i satellitceller bestämda med CUT&RUN. AR-toppar är inramade i blått, och motsvarande AR-responsiva element presenteras nedan. CUT&RUN utförd med IgG användes som negativ kontroll. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den aktuella studien redovisar en standardiserad, tillförlitlig och lättanvänd metod för isolering och odling av mussatellitceller, samt bedömning av transkriptionsreglering med CUT&RUN-metoden.

Detta protokoll omfattar flera kritiska steg. Den första är muskelstörningar och fibersmältning för att säkerställa ett stort antal insamlade celler. Trots den ökade enzymkoncentrationen erhölls fler levande celler än med hjälp av protokoll 1. Satellitceller uttrycker ett specifikt mönster av olika membranproteiner. För att öka stringensen i vår sortering använde vi en kombination av tidigare beskrivna negativa (CD31, TER119, CD45 och CD11b) och positiva (CD34, ITGA7 och CXCR4) satellitcellmarkörer30,31. Med hjälp av denna strategi erhölls i genomsnitt 1 % av levande förmodade satellitceller. Detta resultat ligger i intervallet för vad som förväntades, eftersom satellitceller representerar 2%-7% av muskelcellpopulationen vid vuxen ålder hos möss32. Som en kontroll för satellitcellselektionsmarkörerna isolerades CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler. Immunofluorescensfärgning visade att, medan CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler inte uttryckte PAX7, var 70 % av CD34+/ITGA7+/CXCR4+-sorterade celler positiva för denna satellitcellspecifika markör, vilket visar att den FACS-isolerade populationen motsvarar satellitceller. Dessutom var 70 % av satellitcellerna som odlades i myogent medium i 7 dagar PAX7-/DMD+, vilket visades genom immunfärgning, och bildade en långsträckt multinukleär myofiber, vilket visar att isolerade satellitceller bevarade sin stampotential.

Den största begränsningen vid provberedning kan vara användningen av en hög koncentration av enzymer, vilket resulterar i en stor mängd dissocierat biologiskt material, men kan bidra till ökad celldöd. För att lösa detta problem testades en analys som krävde lägre enzymmängd. I detta sammanhang testades Liberase TL, en renad form av det traditionella kollagenas33. Även om matsmältningen uppenbarligen var mer effektiv med detta enzym, förblev mängden cellskräp förhöjd och cellviabiliteten sänktes något. Dessa observationer stämmer överens med tidigare rapporter som jämfört Liberase-medierad vävnadsnedbrytning med detta med rekombinant kollagenas eller anpassat kollagenas24,25. Dessutom, även om andelen endotelceller och immunceller var likartad mellan kollagenas och Liberase-nedbrytningen, var andelen satellitceller lägre i det Liberase-behandlade provet, vilket totalt sett visar att Liberase inte rekommenderas för isolering av satellitceller. Användningen av detta enzym är lämplig för fenotypisk och kvantitativ analys av immunceller och kan så småningom rekommenderas i samband med muskelvävnad och/eller andra vävnader. Detta är i överensstämmelse med vad som har rapporterats om Liberase TL som den mest lämpade för att effektivt isolera livskraftiga immunceller34,35,36.

Ett annat potentiellt problem är stressen som orsakas av både dissocierande och sorterande satellitceller. Frånvaron av H3K27ac och de låga H3K4me2-nivåerna i promotorregionen för stressresponsgener som identifierats genom encells-RNA-sekvensering i mussatellitceller26 visar dock att proceduren är tillräckligt mild för att inte inducera stressresponsens transkriptionsrepertoar. Andra begränsningar som bör noteras är de utvalda antigenerna som förblir empiriska. Studier visar dock en hög överlappning mellan unika ytmarkörkombinationer som är berikade för skelettmuskulatursatellitceller30,31.

Ett ytterligare kritiskt steg är rening av kärnor från sorterade celler. För detta hålls sorteringshastigheten låg för att inte skada cellerna, men tillräckligt snabb för att de inte ska lagras för länge i FACS-bufferten. Faktum är att CUT&RUN-kärnor inte är fixerade, och en längre inkubationstid kan påverka avläsningen som erhålls från protokollet. Ett typiskt preparat från de två bakbenen på en mus möjliggör CUT&RUN med en antikropp och en IgG-kontroll, med en mängd på 2,5 ng kromatin för varje.

CUT&RUN-experiment, utformade för att bedöma transkriptionsfaktorbindning och epigenetiska modifieringar, gav starka och robusta lässignaler för H3K4me2 och H3K27ac. De höga avläsningsnivåerna av H3K4me2 och H3K27ac på gener som är kända för att uttryckas i satellitceller, jämfört med gener som uttrycks i immun- eller endotelceller samt i myofibrer, visade att signalen förstärks främst från satellitcellernas kärnor. Dessutom gjorde detta protokoll det möjligt att identifiera AR i muskelstamceller, vilket än i dag är ett tekniskt problem som beror på den dåliga kvaliteten på AR-antikroppar hos möss och de låga AR-uttrycksnivåerna i celler som inte är särskilt androgenkänsliga, såsom epitelprostataceller. De data som presenteras här avslöjade AR-bundna regioner med höga konfidenstopppoäng. Eftersom endast ett replikat ursprungligen bedömdes per antikropp, kommer robustheten i våra dataset att förbättras genom att lägga till minst två ytterligare biologiska replikat per tillstånd. Kända AR-målgener och respektive histonmärken, som ursprungligen beskrevs som höguttryckta och/eller lätt detekterbara i andra vävnadssammanhang såsom prostatan, uppvisar dock lägre uttrycksnivåer och är mycket utmanande att upptäcka i satellitceller.

En begränsning med CUT&RUN-metoden är att den utförs i ofixerade celler. Således kan vi ha missat några AR-mål på grund av den labila karaktären hos interaktionerna mellan transkriptionsfaktorer och deras bindningsställe. På samma sätt kan vissa posttranslationella modifieringar, såsom acetylering, också vara ganska labila. Att inkludera ett lätt fixeringssteg med formaldehyd eller paraformaldehyd, efter FACS-sortering och före isolering av kärnorna, kan därför övervägas för att stabilisera protein/DNA-interaktionerna och histonmodifieringarna.

Även om denna artikel visar att CUT&RUN-analyser kan utföras på FACS-isolerade satellitceller, kan även andra analyser som använder icke-fixerat kromatin såsom ATAC-seq utföras. Dessutom, även om muskler här skördades under basala fysiologiska förhållanden, kan detta protokoll tillämpas på patologiska sammanhang som skada eller åldrande. Alla dessa protokollanvändningar kommer att möjliggöra en detaljerad förståelse av genreglerande mekanismer i satellitceller, och kan hjälpa till att förstå hur dessa mekanismer kan förändras av patofysiologiska förhållanden.

Sammanfattningsvis ger detta billiga och tidseffektiva protokoll en effektiv experimentell miljö för att studera transkriptionsfaktorrekrytering och kromatinlandskap i skelettmuskelprekursorceller. Kromatin framställt av detta protokoll har gett den första genomomfattande analysen av AR-cistrom i satellitceller och kommer att underlätta framtida studier av genreglering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Anastasia Bannwarth för utmärkt teknisk assistans. Vi tackar IGBMC:s djurhusanläggning, cellodlingen, Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrike), avbildningen, elektronmikroskopin, flödescytometrin och GenomEast-plattformen, en medlem av konsortiet "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).

Detta arbete från det tvärvetenskapliga tematiska institutet IMCBio, som en del av ITI-programmet 2021-2028 vid Strasbourgs universitet, CNRS och Inserm, stöddes av IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) och av SFRI-STRAT'US-projektet (ANR 20-SFRI-0012) och EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) inom ramen för det franska programmet Investments for the Future. Ytterligare finansiering tillhandahölls av INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategiska program 24376 (till D.D.), INSERM young research grant (till D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, och en fransk statlig fond som förvaltas av ANR inom ramen för ramprogrammet Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. stöddes av programmet CDFA-07-22 från Université franco-allemande och Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, och K.G. av Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Tags

CUT&RUN-analys FACS-isolerade mussatellitceller stamcellsfält småcellpopulationer effektivt protokoll fluorescensaktiverad cellsortering extremitetsmuskel strukturella proteiner köttfärs medium dispas typ I-kollagenas cellsilar FACS-buffert viabilitetsfläck immunfärgade satellitceller Triton X-100 konkanavalin A magnetiska pärlor transkriptionsfaktor histonmodifieringar protein A-mikrokocknukleas kromatinklyvning CaCl2 DNA-extraktion Bibliotek Bioinformatisk analys
Ett effektivt protokoll för CUT&amp;RUN-analys av FACS-isolerade mussatellitceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter