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Developmental Biology

Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&RUN).

Abstract

Análises genômicas amplas com populações de pequenas células são uma grande restrição para estudos, particularmente no campo de células-tronco. Este trabalho descreve um protocolo eficiente para o isolamento de células satélites do músculo do membro ativado por fluorescência (FACS), um tecido com alto conteúdo de proteínas estruturais. Os músculos dos membros dissecados de camundongos adultos foram mecanicamente interrompidos pela picagem em meio suplementado com dispase e colagenase tipo I. Após a digestão, o homogeneizado foi filtrado através de filtros celulares, e as células foram suspensas em tampão FACS. A viabilidade foi determinada pela coloração de viabilidade fixável, e as células satélites imunomarcadas foram isoladas por FACS. As células foram lisadas com Triton X-100 e os núcleos liberados foram ligados a esferas magnéticas de concanavalina A. Complexos núcleo/grânulo foram incubados com anticorpos contra o fator de transcrição ou modificações de histonas de interesse. Após as lavagens, os complexos núcleo/grânulo foram incubados com a proteína A-micrococcal nuclease, e a clivagem da cromatina foi iniciada com CaCl2. Após a extração do DNA, bibliotecas foram geradas e sequenciadas, e os perfis para ligação do genoma amplo ao fator de transcrição e modificações covalentes de histonas foram obtidos por análise bioinformática. Os picos obtidos para as várias marcas de histonas mostraram que os eventos de ligação foram específicos para células satélites. Além disso, a análise de motivos conhecidos revelou que o fator de transcrição estava ligado à cromatina através de seu elemento de resposta cognato. Este protocolo é, portanto, adaptado para estudar a regulação gênica em células satélites musculares de membros de camundongos adultos.

Introduction

Os músculos estriados esqueléticos representam, em média, 40% do peso total do corpo humano1. As fibras musculares exibem notável capacidade de regeneração após a lesão, que é descrita pela fusão de miócitos neoformados e pela geração de novas miofibras que substituem aslesadas2. Em 1961, Alexander Mauro relatou uma população de células mononucleares que denominou como células satélites3. Essas células-tronco expressam o fator de transcrição pareado caixa 7 (PAX7) e estão localizadas entre a lâmina basal e o sarcolema das fibrasmusculares4. Foi relatado que eles expressam o cluster de diferenciação 34 (CD34; um marcador hematopoiético, progenitor endotelial e de células-tronco mesenquimais), integrina alfa 7 (ITGA7; um marcador liso, cardíaco e músculo esquelético), bem como o receptor de quimiocina C-X-C tipo 4 (CXCR4; um marcador de linfócitos, hematopoiéticos e células satélites)5. Em condições basais, as células satélites residem em um microambiente particular que as mantém em estadoquiescente6. Com o dano muscular, tornam-se ativados, proliferam e sofrem miogênese7. No entanto, contribuindo apenas para uma pequena fração do número total de células musculares, suas análises genômicas são particularmente desafiadoras, especialmente em ambientes fisiológicos (<1% do total de células).

Vários métodos para isolamento de cromatina a partir de células satélites têm sido descritos, os quais envolvem imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento paralelo maciço (ChIP-seq) ou clivagem sob alvos e experimentos de tagmentação (CUT&Tag). No entanto, essas duas técnicas apresentam algumas limitações significativas que permanecem incontestadas. De fato, ChIP-seq requer uma alta quantidade de material de partida para gerar cromatina suficiente, uma grande proporção da qual é perdida durante a etapa de sonicação. CUT&Tag é mais apropriado para baixo número de células, mas gera mais locais de clivagem fora do alvo do que ChIP-seq devido à atividade de transposição Tn5. Além disso, como essa enzima tem alta afinidade por regiões de cromatina aberta, a abordagem CUT&Tag pode ser preferencialmente usada para analisar modificações de histonas ou fatores de transcrição associados a regiões ativamente transcritas do genoma, em vez de heterocromatina silenciada 8,9.

Apresenta-se aqui um protocolo detalhado que permite o isolamento de células satélites musculares de membros de camundongos por FACS para clivagem sob alvos e liberação utilizando análise de nucleases (CUT&RUN)10,11. As várias etapas envolvem a ruptura mecânica do tecido, a classificação celular e o isolamento dos núcleos. A eficiência do método, no que se refere à preparação de uma suspensão celular viável, foi demonstrada através da análise CUT&RUN para modificações de histonas covalentes e fatores de transcrição. A qualidade das células isoladas torna o método descrito particularmente atraente para a preparação de cromatina que captura fielmente o estado de ocupação genômica nativa, e é provável que seja adequado para capturar a conformação cromossômica em combinação com o sequenciamento de alto rendimento em loci específicos (4C-seq) ou em níveis genômicos amplos (Hi-C).

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Protocol

Os camundongos foram mantidos em biotério credenciado, de acordo com as Diretrizes Nacionais de Cuidados com Animais (Diretiva 86/609/CEE da Comissão Europeia; Decreto francês no.87-848) sobre o uso de animais de laboratório para pesquisa. As manipulações pretendidas foram submetidas ao Comitê de Ética (Com'Eth, Estrasburgo, França) e ao Ministério da Pesquisa francês (MESR) para avaliação ética e autorização de acordo com a diretiva 2010/63/EU sob o número APAFIS #22281.

1. Preparação da suspensão celular para isolamento de células satélites por fluorescência (FACS) (Figura 1)

  1. Isolamento do tecido muscular
    1. Descontaminar os instrumentos de dissecção muscular, incluindo pinças, bisturis e tesouras, com um agente de limpeza (Tabela 1), e enxaguar abundantemente com água destilada.
    2. Preparar dois tubos de 2 mL (Tabela 1), cada um contendo 1 mL de tampão de isolamento muscular, e colocá-los sobre gelo para coleta dos músculos colhidos.
    3. Sacrificar dois camundongos machos C57/Bl6J com 10 semanas de idade por asfixia por CO2 seguida de luxação cervical. Borrife etanol a 70% sobre cada rato inteiro. Descasque a pele do membro posterior usando pinças. Disseque todos os músculos dos membros ao redor do fêmur, tíbia e fíbula (aproximadamente 1 mg de músculos por camundongo).
      NOTA: O número de células satélites diminui após 15 semanas de idade.
    4. Colocar os músculos dos membros colhidos em tubos de 2 ml contendo 1 ml de tampão de isolamento muscular preparado no passo 1.1.2. Colete os músculos do segundo mouse seguindo o mesmo procedimento. Pique os músculos colhidos com tesoura sobre gelo até obter fragmentos menores que1 mm 3 .
      OBS: Os músculos foram coletados e picados principalmente conforme descrito12. Efectuar a digestão dos tecidos seguindo os passos 1.2 ou 1.3.
  2. Digestão tecidual com enzima colagenase
    1. Transferir a suspensão do músculo picado dos dois camundongos despejando-os em um tubo de 50 mL (Tabela 1) contendo 18 mL de tampão de isolamento muscular (suplementado com 5 mL [5 U/mL] de dispase e 5 mg de colagenase tipo I) (Tabela 1).
    2. Fechar bem o tubo e selá-lo com filme de laboratório (Tabela 1). Colocar horizontalmente em banho-maria (Tabela 1) a 37 °C a 100 rpm por 30 min.
    3. Após 30 min, adicionar 5 mg de colagenase tipo I. Mantenha os tubos por mais 30 min sob agitação em banho-maria a 37 °C a 100 rpm.
    4. Após a digestão, pipetar a suspensão muscular para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 mL para melhorar a eficiência da dissociação. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Um pellet transparente será visível no fundo do tubo. Descarte o sobrenadante com pipeta de 10 mL, deixando 5 mL de meio no tubo.
      NOTA: Deixar o meio ajuda a evitar o estresse das células. Adicionar 10 mL de tampão de isolamento muscular fresco e ressuspender o pellet pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL.
    5. Colocar filtros celulares de 100 μm, 70 μm e 40 μm (um de cada tipo) (Tabela 1) em tubos abertos de 50 mL. Pipetar a suspensão para os filtros celulares sucessivos (100 μm, 70 μm, 40 μm) e coletar o fluxo para os tubos de 50 mL, contendo células abaixo de 40 μm.
    6. Centrifugar a suspensão a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta de 10 mL até restarem 2 mL e, em seguida, use uma pipeta de 0,2-1 mL até que restem 100-200 μL. Ressuspender o pellet em 2 mL de tampão de lise eritrocitária (Tabela 2). Incubar no gelo por 3 min.
    7. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta de 20-200 μL. Ressuspender as células em 100 μL de tampão FACS frio (Tabela 2). Coloque no gelo.
  3. Método alternativo para digestão tecidual com a enzima Liberase termolisina baixa (TL)
    1. Siga as descrições na etapa 1.1. para isolamento tecidual.
    2. Para desagregação tecidual mediada por liberase, colher os músculos em 2 mL de tampão de isolamento do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Tabela 2), em vez do tampão de isolamento muscular descrito no passo 1.1.2.
    3. Transferir a suspensão muscular picada dos dois camundongos despejando-os em um tubo de 50 mL (Tabela 1) contendo 18 mL de tampão de isolamento RPMI suplementado com 300 ou 600 μL de LT de Liberase a 5 mg/mL (Tabela 1) (ou seja, concentrações finais de 0,083 mg/mL e 0,167 mg/mL, respectivamente)13.
    4. Fechar bem o tubo e selá-lo com filme de laboratório (Tabela 1). Colocar horizontalmente em banho-maria (Tabela 1) a 37 °C a 100 rpm por 30 min.
    5. Após a digestão, pipetar a suspensão muscular para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 mL para dissociar e melhorar a eficiência da dissociação.
    6. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Um pellet transparente será visível no fundo do tubo. Descarte o sobrenadante com pipeta de 10 mL, deixando 5 mL de meio no tubo. Deixar o meio ajuda a evitar o estresse das células. Adicionar 10 mL de tampão de isolamento RPMI fresco e ressuspender o pellet pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL.
    7. Colocar filtros celulares de 100 μm, 70 μm e 40 μm (um de cada tipo) (Tabela 1) em tubos abertos de 50 mL.
    8. Pipetar a suspensão em filtros celulares sucessivos (100 μm, 70 μm, 40 μm) e coletar o fluxo para os tubos de 50 mL, contendo células abaixo de 40 μm.
    9. Centrifugar a suspensão a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta de 10 mL até restarem 2 mL e, em seguida, use uma pipeta de 0,2-1 mL até que restem 100-200 μL.
    10. Ressuspender o pellet em 2 mL de tampão de lise eritrocitária (Tabela 2). Incubar no gelo por 3 min.
    11. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta de 20-200 μL.
    12. Ressuspender as células em 100 μL de tampão FACS frio (Tabela 2). Coloque no gelo.
  4. Preparação de suspensão celular para isolamento de FACS
    1. Transferir 10 μL da suspensão celular obtida na etapa 1.2.12 para um tubo fresco de 1,5 ml. Esta amostra constituirá o controle não corado ou o controle negativo (Figura 2). Adicionar 190 μL de tampão FACS, transferir para um tubo de 5 mL (Tabela 1) e armazenar em gelo.
    2. Centrifugar os restantes 90 μL da suspensão celular obtida no passo 1.2.12 a 4 °C a 400 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta (volume da ponta de 20-200 μL). Incubar as células com 400 μL de coloração de viabilidade fixável (Tabela 3) diluída em meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco sem soro por 15 min à temperatura ambiente (TR).
    3. Lavar as células por centrifugação a 4 °C a 400 x g durante 5 min e adicionar 100 μL de tampão FACS. Inverta suavemente os tubos três vezes e centrifugue novamente a 4 °C a 400 x g durante 5 min.
    4. Durante o tempo de centrifugação, preparar 100 μL de uma mistura mestre de anticorpos primários acoplados a fluoróforos e direcionados contra CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 e CXCR4 (Tabela 3), diluídos em tampão FACS.
    5. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante celular utilizando uma pipeta (volume de ponta de 20-200 μL) e adicionar a mistura de anticorpos de 100 μL. Inverta suavemente o tubo três vezes. Não vórtice. Incubar no escuro no gelo por 30 min.
    6. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta de 20-200 μL e adicione 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x para lavar as células. Inverta suavemente o tubo três vezes. Recentrifugar a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta de 20-200 μL.
    7. Ressuspender o pellet de células em 500 μL de tampão FACS e transferir a suspensão para um tubo de 5 mL.
      NOTA: a suspensão celular obtida da digestão com Liberase é processada da mesma forma.
  5. Seleção de células satélites por FACS
    1. Vórtice brevemente a suspensão celular (2-5 s) e processe as células em um citômetro de fluxo equipado com um bocal de 100 μm (Tabela 1).
    2. Determinar os vários tamanhos de porta com base na amostra não manchada armazenada na etapa 1.4.1 (Figura 2).
    3. Cubra um tubo de 5 mL com 1 mL de soro fetal puro para bezerro (SFC) para melhorar a coleta celular e adicione 500 μL de tampão FACS.
    4. Troque a amostra não corada pela amostra marcada com anticorpos.
    5. Selecionar a população de interesse de acordo com a área de dispersão anterior (FSC-A) e área de dispersão lateral (SSC-A) (Figura 3A), e remover células duplas com a altura de dispersão FSC-A e anterior (FSC-H) (Figura 3B)14.
    6. Identificar células vivas com viabilidade fixável, coloração negativa (Figura 3C).
    7. Selecione células negativas para CD31, CD45, TER119 e CD11b (Figura 3D).
    8. Para identificar células satélites, selecione primeiro as células positivas para CD34 e ITGA7 (Figura 3E) e, em seguida, selecione as células CXCR4 positivas na população selecionada para CD34 e ITGA7 (Figura 3F).
    9. Coletar as células selecionadas (entre 40.000 e 80.000 células, de acordo com a qualidade da preparação) no tubo revestido de 5 mL contendo 500 μL de tampão FACS.

2. Validação da população isolada em cultura de tecidos

  1. Revestimento de lâmina com hidrogel
    1. Diluir 280 μL de uma matriz qualificada com células estaminais embrionárias humanas (hESC) de hidrogel puro (Tabela 1) em 12 ml de meio DMEM/F12 sem soro.
    2. Cobrir uma lâmina de câmara (Tabela 1) com a solução de hidrogel e incubá-la durante a noite a 4 °C.
    3. No dia seguinte, incubar a lâmina da câmara a 37 °C e 5% CO2 por 1 h antes da semeadura celular.
  2. Crescimento e diferenciação celular
    1. Placatear aproximadamente 20.000 células, obtidas a partir do passo 1.5.9, por poço, e cultivá-las em meio de cultura (Tabela 2) por 5 dias. Realizar imagens de contraste de fase em microscópio de campo claro (Figura 4A), antes de processá-las para análise de imunofluorescência para garantir a qualidade do preparo (Figura 4B).
    2. Para induzir a miogênese, crescer células satélites amplificadas a partir do passo 2.2.1 em meio miogênico (Tabela 2) por mais 7 dias. Captar imagens de contraste de fase em microscópio de campo claro (Figura 4C) antes de processá-las para análise de imunofluorescência para garantir a qualidade do preparo (Figura 4D).
  3. Análise por imunocitofluorescência
    1. Remover suavemente o meio, lavar as células que foram cultivadas em lâmina de câmara com 100 μL de 1x PBS duas vezes e fixá-las com 100 μL de paraformaldeído (PFA) a 4 % em TR por 1 h.
      OBS: Esta etapa deve ser realizada com cuidado. Um pequeno volume de meio deve ser sempre mantido na câmara para evitar estresse das células, e o PBS deve ser derramado através das paredes da câmara.
    2. Lavar as células três vezes com 100 μL de PBS 1x, suplementado com Tween 20 a 0,1% (PBST) para permeabilizar as membranas celulares.
    3. Bloquear sinais inespecíficos por incubação em 100 μL de 1x PBST suplementado com 5% FCS (PBST-FCS) em TR por 1 h.
    4. Incubar as células com 100 μL de uma mistura mestra de anticorpos anti-PAX7 e antidistrofina (DMD) (diluídos em 1x PBST-FCS) a 4 °C durante a noite, para detectar células satélites e miofibras, respectivamente.
    5. Lavar as células três vezes com 100 μL de 1x PBST e incubá-las com 100 μL de anticorpos secundários de cabra anti-camundongo Cy3 ou cabra anti-coelho Alexa 488 (Tabela 3) diluídos em 1x PBST-FCS em TR por 1 h.
    6. Dissociar os orifícios da lâmina utilizando o equipamento fornecido pelo fornecedor, adicionar 20 μL de meio de montagem aquoso com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e cobrir a lâmina com uma lamínula (Tabela 1).
    7. Observar e capturar a imagem das células coradas com um microscópio confocal.
    8. Processar as imagens utilizando um software de análise de imagens (Figuras 4B,D).

3. Análise CUT&RUN

  1. Preparação de amostras para análise CUT&RUN em células satélites isoladas por FACS
    NOTA: CUT&RUN foi realizado essencialmente como descrito10,15. A composição do tampão é apresentada em Tabela 2.
    1. Para o ensaio CUT&RUN, utilizar aproximadamente 40.000 das células obtidas no método 1, etapa 1.5.9, por amostra/anticorpo que deve ser testado.
    2. Centrifugar as células satélites isoladas do FACS em RT a 500 x g por 10 min e, em seguida, descartar o sobrenadante usando uma pipeta (volume de ponta de 20-200 μL).
    3. Lavar as células com 1 mL de PBS 1x, centrifugar em TR a 500 x g por 5 min, descartar o sobrenadante com pipeta (volume da ponta de 0,2-1 mL) e ressuspendê-las em 1 mL de tampão de extração nuclear frio (Tabela 2). Incubar no gelo por 20 min.
    4. Durante a incubação, preparar um tubo de 1,5 mL contendo 850 μL de tampão de ligação a frio (Tabela 2) e adicionar 20 μL de esferas magnéticas revestidas com concanavalina A por amostra (Tabela 1).
    5. Lavar as contas duas vezes com 1 mL de tampão de ligação a frio usando um rack magnético (Tabela 1). Para cada lavagem ou troca de tampão ao longo do procedimento, deixe as contas se acumularem ao lado do tubo no rack magnético por 5 min antes de remover o sobrenadante limpo com uma pipeta (volume de ponta de 0,2-1 mL). Em seguida, ressuspenda suavemente em 300 μL de tampão de ligação a frio.
    6. Centrifugar os núcleos a 4 °C a 600 x g durante 5 min e ressuspendê-los suavemente em 600 μL de tampão de extracção nuclear. Misturar suavemente os 600 μL dos núcleos extraídos com os 300 μL da pasta de esferas de concanavalina A e incubar a 4 °C durante 10 minutos.
    7. Remover o sobrenadante com um rack magnético, conforme descrito no passo 3.1.4, e ressuspender suavemente os núcleos ligados ao cordão com 1 ml de tampão de bloqueio a frio (Tabela 2). Incubar em TR por 5 min.
    8. Remova o sobrenadante com um rack magnético e lave os núcleos ligados ao cordão duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem a frio (Tabela 2). Durante a segunda lavagem, divida igualmente os núcleos ligados ao grânulo em tubos de 1,5 mL. Cada tubo será tratado com um anticorpo específico na etapa seguinte.
      NOTA: Neste exemplo, 250 μL de núcleos ligados a contas foram divididos em quatro tubos de 1,5 mL.
    9. Separe o sobrenadante utilizando um rack magnético, conforme descrito no passo 3.1.4, e aspirar com uma pipeta. Ressuspender suavemente os complexos núcleo/grânulos com um anticorpo primário específico (Tabela 3), ou uma IgG de outra espécie (aqui coelho) diluída em 250 μL de tampão de lavagem a frio. Incubar a 4 °C durante a noite com agitação suave.
      NOTA: Os anticorpos usados aqui são direcionados contra AR, H3K4me2 e H3K27ac.
    10. Remover o sobrenadante com um rack magnético, conforme descrito no passo 3.1.4, lavar os núcleos ligados ao cordão duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem a frio e ressuspender em 100 μL de tampão de lavagem a frio.
    11. Diluir a proteína A-nuclease microcócica a 1,4 ng/μL em 100 μL por amostra de tampão de lavagem a frio.
    12. Adicionar 100 μL de proteína A-nuclease microcócica aos 100 μL de amostra obtidos no ponto 3.1.11 e incubar a 4 °C durante 1 h com agitação.
    13. Remover o sobrenadante com um suporte magnético, conforme descrito no passo 3.1.4, lavar duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem a frio e ressuspender os núcleos ligados ao cordão em 150 μL de tampão de lavagem a frio.
    14. Para iniciar a clivagem do DNA, adicione 3 μL de 100 mM de CaCl2 aos 150 μL da amostra, misture rapidamente agitando e incube no gelo por 30 min. Parar a reacção adicionando 150 μL de tampão de paragem e incubar a 37 °C durante 20 minutos para digerir o ARN e libertar os fragmentos de ADN.
    15. Para a extração de DNA, centrifugar as amostras a 16.000 x g a 4 °C por 5 min.
    16. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microfuga e descarte o pellet e as contas.
    17. Adicionar 3 μL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% e 2,5 μL de 20 mg/mL de proteinase K. Misturar por inversão. Incubar durante 10 min a 70 °C (sem agitação).
    18. Adicionar 300 μL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, vórtice, transferir para tubos phase-lock de 2 mL (pré-girados por 5 min a 16.000 x g) e centrifugar por 5 min a 16.000 x g a 4 °C.
    19. Adicionar 300 μL de clorofórmio ao mesmo tubo e centrifugar durante 5 minutos a 16.000 x g a 4 °C. Coletar o sobrenadante (~300 μL) com uma pipeta (0,2-1 mL de volume da ponta) e transferir para um novo tubo de 1,5 mL.
    20. Adicionar 1 μL de glicogênio (concentração de 20 mg/mL).
    21. Adicionar 750 μL de etanol a 100% e precipitar durante a noite a -20 °C.
    22. Pellet o DNA por centrifugação por 15 min a 16.000 x g a 4 °C. Lavar o pellet com 1 mL de etanol 100%, centrifugar por 5 min a 16.000 x g, descartar o sobrenadante, centrifugar por 30 s a 16.000 x g e retirar o líquido com pipeta (volume de ponta de 20-200 μL).
    23. Seque o pellet ao ar por ~5 min. Ressuspender em 25 μL de Tris-HCl 1 mM (pH 8) e ácido etilenodiaminotetracético 0,1 mM (EDTA; pH 8).
  2. Análise de bioinformática
    1. Preparar bibliotecas a partir de DNA imunoclivado e sequenciá-las como leituras pareadas de 100 pb com a ajuda da plataforma genômica conforme descrito16.
    2. Remova as leituras sobrepostas à região da lista negra ENCODE (V2) e separe as leituras restantes em dois grupos: tamanho do fragmento <120 pb (sem nucleossomo, em geral para fatores de transcrição) e tamanho do fragmento >150 pb (com nucleossomos, normalmente para marcas de histonas). Mapeie para o genoma de referência mm10 usando Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Gere arquivos bigwig com bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Retenha leituras mapeadas exclusivamente para análise adicional.
    5. Gere arquivos bedgraph brutos com genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Use o algoritmo SEACR 1.3 (opção rigorosa) para a chamada de pico. Carregue o arquivo de bedgraph de dados de destino no formato de bedgraph UCSC que omite regiões contendo sinal zero e arquivo de bedgraph de dados de controle (IgG) para gerar um limiar empírico para chamadas de pico18.
    7. Realizar análise de correlação de Pearson com deeptools para determinar a similaridade entre as amostras19. Use a linha de comando multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, seguido por plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualize os perfis de intensidade genômica com IGV20 usando arquivos bedgraph e os picos de arquivo de leito obtidos do SEACR.
    9. Use HOMER para anotação de pico e pesquisa de motivos21.
    10. Finalmente, compare os conjuntos de dados com os publicados anteriormente com o navegador ChIP-Atlas Peak para visualizá-los no IGV e/ou análise de enriquecimento usando os arquivos de leito gerados pelo SEACR como um conjunto de dados de entrada22.

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Representative Results

Células satélites de músculos esqueléticos de camundongos foram isoladas pela combinação dos protocolos de Gunther et al.12 e Liu et al.23 (doravante Protocolo 2). Como as fibras musculares não digeridas foram observadas após a digestão quando se utilizou a concentração de colagenase e dispase proposta no Protocolo 1, a quantidade de enzimas foi aumentada para melhorar a dissociação das fibras musculares, conforme descrito nas etapas 1.2.1 e 1.2.3. Conforme indicado no Protocolo 2, as amostras foram submetidas a uma agitação suave em banho-maria para manter a viabilidade celular. Realizamos filtração através de filtros celulares, conforme mencionado no Protocolo 1, e incubação com tampão de lise de hemácias (ver passos 1.2.7 a 1.2.10). No Protocolo 1, as células foram carregadas em um gradiente de densidade de Percoll de 30%/70% para isolar células mononucleadas na interfase, o que pode ter levado à perda de células de interesse. Assim, essa etapa foi omitida, conforme proposto no Protocolo 2.

FSC-A versus SSC-A gating foi usado para identificar células mononucleadas com base no tamanho (FSC) e granularidade (SSC) (Figura 3A). Os detritos foram excluídos por ignorarem eventos abaixo de 40 K no eixo FSC-A, e 38,8% ± 3,6% das células foram selecionadas. Gráficos de densidade de acoplamento FSC-A versus altura de dispersão direta (FSC-H) foram usados para exclusão de duplos (Figura 3B). Após seleção das células negativas para o marcador de viabilidade fixável, obteve-se uma média de 34,3% ± 7,7% de células vivas (Figura 3C).

A porcentagem mostrada no dot plot da Figura 3C, 75,4%, corresponde à porcentagem de células vivas únicas, calculada a partir da população de células parentais, que é neste caso as solteiras. 95,7% das células individuais são obtidas a partir dos eventos ao vivo, que compõem 35% do total de eventos. Assim, o percentual de 34,3% obtido, em média, é calculado a partir do total de eventos e não das populações parentais.

Cerca de 3% das células vivas isoladas foram negativas para leucócitos (CD45), monócitos (CD11b), endotélios (CD31) e eritroide-específicos (TER119) (Figura 3D). As células CD11b/CD45/CD31/TER119 negativas foram então selecionadas de acordo com a expressão de marcadores CD34 (células hematopoéticas, progenitores endoteliais e células-tronco mesenquimais) e ITGA7 (células musculares cardíacas, lisas e esqueléticas) (Figura 3E). Um gating final para CXCR4 (linfócitos, hematopoiéticos e células satélites) foi realizado para selecionar células satélites putativas (Figura 3F). Das células CD34+/ITGA7+, ~80% foram positivas para CXCR4, o que representa uma média de 1% ± 0,15% do total de células vivas únicas, e um número absoluto de 60.000 ± 14.000 células satélites putativas por músculos de membros de camundongos entre 14 experimentos independentes. Uma avaliação adicional sobre a fração celular CXCR4+ revelou que cerca de 80% das células vivas foram obtidas após a pós-triagem, das quais quase 70% eram CXCR4+ (Figura S1), mostrando a alta viabilidade e pureza dessa população celular isolada por FACS.

Uma vez que vários estudos compararam a eficiência das enzimas LT colagenase e liberase no isolamento celular24,25, esses dois métodos de digestão têm sido processados em paralelo. Com 300 μL de LT liberase, a digestão foi menos eficiente do que com colagenase, pois permaneceram fibras não digeridas. Além disso, mais restos celulares e grandes eventos foram observados (Figuras S2A,B), e apenas 17,3% das células vivas únicas, em média, foram obtidas após a seleção do FVS 780 (Figura S2C). Uma preocupação adicional com a digestão da liberase foi o baixo número de células CD34+/ITGA7+ em comparação com a colagenase (Figuras S2D-S2E), embora o limiar CXCR4 fosse semelhante (Figura S2F). Com 600 μL de LT Liberase, a digestão foi mais eficiente. Entretanto, a quantidade de restos celulares permaneceu elevada e a viabilidade celular abaixo do padrão (16,3%) (Figura S3). Assim, a digestão com Liberase LT foi menos eficiente para o isolamento de células satélites.

Quando semeadas, mais de 70% das células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ (Figura 4A) expressaram PAX7 (Figura 4B), ao contrário das células CD34+/ITGA7-/CXCR4- negativas para PAX7 (Figura 4C). As células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ foram capazes de se diferenciar em miofibras quando cultivadas em meio miogênico por mais 7 dias, como demonstrado pela coloração de distrofina (DMD) (Figura 4D), confirmando seu potencial miogênico. Assim, a cultura de tecidos combinada e as análises de imunofluorescência mostraram que as células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ isoladas de FACS são células satélites.

Para determinar se as células satélites isoladas são adequadas para a análise de CUT&RUN, o perfil genômico de lisina acetilada 27 (H3K27ac) e lisina dimetilada 4 (H3K4me2) da histona H3, duas modificações de histonas encontradas nas regiões promotora ativa e potencializadora, foi determinado. Nossos dados revelaram 68.694 e 13.514 picos para H3K4me2 e H3K27ac, respectivamente, com uma partição genômica semelhante entre as duas marcas de histonas (Figura S4A). Em detalhes, descobrimos que um quarto dos picos estava localizado ± 2 kb do sítio de início da transcrição (TSS) do gene mais próximo, sendo a maioria localizada de -100 kb a -10 kb ou 10 kb a 100 kb do TSS (Figura S4B). Vale ressaltar que a análise de Pearson mostrou uma correlação de 80% entre os perfis de leitura de H3K27ac e H3K4me2 (Figura S4C). Para avaliar que a cromatina preparada a partir do protocolo supracitado foi isolada de células satélites, determinou-se a presença de H3K27ac e H3K4me2 no promotor de genes específicos de células satélites. A H3K4me2 foi enriquecida ao redor da SST de Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 e Vcam1 (Figura 5A), mas não nas de Itgam (CD11b) e Ptprc (CD45) (células imunes), Pecam (CD31; células endoteliais) (Figura 5B), Ckm (fibras musculares em desenvolvimento) ou Myh3 (miosina de cadeia pesada embrionária rápida, miofibras) (Figura 5C). Resultados semelhantes foram obtidos com H3K27ac (Figura 5). Quase nenhum sinal foi obtido com a amostra de IgG (Figura 5). Além disso, a comparação dos picos de H3K27ac obtidos do SEACR com aqueles resultantes da chamada de pico MACS2 a partir de conjuntos de dados ChIP-seq publicados mostrou uma alta correlação, como observado abaixo de cada painel (trilha ChIP-Atlas; Gráfico 5). Em conjunto, esses resultados indicam que as leituras obtidas após a análise de bioinformática são originárias da cromatina de células satélites isoladas por FACS e correlacionam-se com aquelas previamente identificadas pelas análises de ChIP-seq.

Enquanto estudos de sequenciamento de RNA de célula única em células satélites de camundongos mostraram uma resposta de estresse marcante, causada pelo procedimento de isolamento26, a presença de H3K4me2 ou H3K27ac foi determinada em genes de resposta ao estresse, como exemplificado com Atf3, Azin1, Gls e Elf2. Os resultados fornecem evidências de que a marca H3K27ac não está depositada no promotor de tais genes, e que os níveis de H3K4me2 permanecem baixos em comparação com aqueles obtidos para genes específicos de células satélites (Figura S5). Assim, esses dados evidenciam o quão brando é o procedimento de isolamento.

Em seguida, a adequação de nosso método de isolamento para fatores de transcrição foi examinada. A análise CUT&RUN para o receptor de andrógeno (RA), um fator de transcrição pertencente à superfamília dos receptores nucleares e que desempenha um papel importante na diferenciação miogênica27, desvendou 7.840 picos. Esses picos localizaram-se principalmente nas regiões íntron e intergênica (Figura S4A), ou -100 kb a -10 kb, ou a 10 kb a 100 kb do TSS (Figura S4B). Análises filogenéticas revelaram que o RA, ao lado dos receptores glicocorticoide (GR/Nr3c1), mineralocorticoide (MR/Nr3c2) e progesterona (PR/Nr3c3), é membro da subfamília28 dos receptores nucleares oxoesteróides, que se ligam como homodímeros a segmentos de DNA constituídos por dois semisítios palindrômicos 5′-RGAACA-3′ separados por três pares de bases29. A busca de um motivo conhecido por meio da otimização hipergeométrica do enriquecimento de motivos (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) revelou que a RA está ligada ao motivo de meio sítio 5′-RGRNCA-3′ AR, ao motivo oxosteroide 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ típico (referido na figura como PR) e ao motivo de consenso 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR em >32%, 17% e 2% das regiões-alvo, respectivamente (Figura 6A). Deve-se ressaltar que proporções semelhantes foram previamente obtidas para o receptor de glicocorticoide no músculo esquelético16.

A análise do SEACR revelou quase 500 picos com pontuação máxima >50, com mais de 200 deles com pontuação >100; alguns dos quais são exemplificados na Figura 6B. Nossa análise também revelou um modesto enriquecimento de RA nos sítios de ligação descritos anteriormente de genes envolvidos na biossíntese de poliamina (Amd1, Aveia e Smox) e no câncer de próstata (Acox1, Fkbp5 e Tmprss2) (Figura S6). Curiosamente, o RA foi encontrado nos loci de genes envolvidos no tronco de células satélites (Pax7, Cxcr4 e Cd34) (Figura S7). Vale ressaltar que o elemento de resposta oxoesteróide foi encontrado em cada uma dessas regiões enriquecidas com RA (Figura S6 e Figura S7), demonstrando que o sinal de RA visto nos dados de CUT&RUN é altamente específico.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do protocolo utilizado para isolamento de células satélites de músculos de membros de camundongos. O protocolo é composto por quatro etapas principais. Resumidamente, os ratos são sacrificados, e os músculos dos membros posteriores são colhidos (passos 1.1.1-1.1.3) e picados mecanicamente usando tesouras (passos 1.4-1.5). Seguem-se os passos 1.2.1-1.2.4, durante os quais os músculos são dissociados em banho-maria com colagenase e dispase. Nas etapas 1.2.5-1.2.8, a suspensão celular é filtrada através de filtros celulares de 100, 70 e 40 μm, consecutivamente, e os eritrócitos são eliminados usando tampão de lise de hemácias (etapas 1.2.9-1.2.12). As populações celulares restantes são marcadas na etapa 1.3 com anticorpos acoplados a fluoróforos, que são direcionados contra marcadores fenotípicos celulares específicos. A etapa 1.4 inclui amostras que passam pelo FACS para coletar células satélites para posterior aplicação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise por citometria de fluxo de uma preparação celular não corada. (A) Seleção da população de interesse com base nos parâmetros FSC-A e SSC-A. (B) Identificação de célula única baseada em FSC-A e FSC-H. (C) Caracterização do limiar de autofluorescência das células coletadas para APC-Cy7 conjugado à coloração de viabilidade fixável (FVS 780) marcando células mortas. (D-F). Medição de autofluorescência para PE-Cy7 conjugado ao anticorpo CD11b e PE-conjugado aos marcadores TER119/CD45/CD31 (D), bem como para Alexa fluor 488 conjugado a ITGA7, Alexa fluor 405 conjugado a CD34 (E) e APC fluorocromo conjugado a CXCR4 (F). Os portões são representados como caixas pretas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Estratégia de acoplamento por citômetro de fluxo para triagem de células satélites. (A) Seleção da população de interesse com base nos parâmetros FSC-A e SSC-A. (B) Identificação de célula única baseada em FSC-A e FSC-H. (C) Identificação de células vivas com FVS 780. (D) Seleção celular negativa baseada nos antígenos CD11b, CD31, CD45 e TER119. (E-F) Seleção celular positiva baseada em CD34 e ITGA7 (E), bem como antígenos CXCR4 (F). Os portões são representados como caixas pretas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise das células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ e CD34+/ITGA7-/CXCR4- isoladas de FACS. (A) Imagens de contraste de fase de células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ e CD34+/ITGA7-/CXCR4- cultivadas em meio de crescimento. (B) Análise por imunofluorescência de células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ e CD34+/ITGA7-/CXCR4- cultivadas em meio de cultura utilizando anticorpos direcionados contra PAX7 (vermelho) e distrofina (DMD, verde). Os núcleos foram corados com DAPI (azul). As setas magenta indicam células positivas para PAX7. (C) Imagens de contraste de fase de células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ cultivadas por 5 dias em meio de crescimento (painel esquerdo) e por mais 7 dias em meio miogênico (painel direito). (D) Imagens de análise de imunofluorescência de células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ cultivadas por 5 dias em meio de crescimento (painel esquerdo) e por mais 7 dias em meio miogênico (painel direito) utilizando anticorpos direcionados contra PAX7 (vermelho) e distrofina (DMD, verde). Os núcleos foram corados com DAPI (azul). As setas magenta indicam células positivas para PAX7. As setas verdes indicam células DMD-positivas. Barras de escala: painéis de campo claro = 25 μm; painéis de imunofluorescência = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Perfis genômicos da cromatina de células satélites. Localização de H3K4me2 e H3K27ac em genes específicos de células satélites (A), genes imunes e endoteliais específicos de células (B) e genes específicos de miofibras (C) na cromatina de células satélites por CUT&RUN. Os promotores ativos são encaixotados em verde, enquanto os promotores inativos são encaixotados em marrom. CUT&RUN realizado com IgG foi utilizado como controle negativo. A análise de enriquecimento de H3K27ac para marcas de histonas é apresentada abaixo de cada faixa. O escore de enriquecimento que mostra os níveis de confiança dos conjuntos de dados publicados é descrito como um mapa de calor. Estrelas marrons (*) referem-se aos picos de ChIP-seq de H3K27ac realizados em células satélites musculares, estrelas azuis a H3K4me3 e a rosa a H4K16me1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Distribuição genômica do RA na cromatina de células satélites. (A) Análise de motivos conhecidos por HOMER de picos de RA em células satélites. RP: receptor de progesterona. Nb alvo refere-se ao número de picos que apresentam um determinado motivo. (B) Localização de H3K4me2 e AR nos genes indicados na cromatina de células satélites determinada por CUT&RUN. CUT&RUN realizado com IgG foi utilizado como controle negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de materiais, reagentes e software. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Composições de tampão. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Referências e concentrações de anticorpos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar 1: Análise por citometria de fluxo do preparo celular pós-triagem. (A) Seleção da população de interesse com base nos parâmetros FSC-A e SSC-A. (B) Identificação de célula única baseada em FSC-A e FSC-H. (C) Identificação de células vivas com coloração de viabilidade fixável (FVS 780). (D) Seleção celular negativa baseada nos antígenos CD11b, CD31, CD45 e TER119. (E-F) Seleção celular positiva baseada em CD34 e ITGA7 (E), bem como antígenos CXCR4 (F). Os portões são representados como caixas pretas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Estratégia de sincronização do citômetro de fluxo para triagem de células satélites após digestão com 300 μL de LT Liberase. (A) Seleção da população de interesse com base nos parâmetros FSC-A e SSC-A. (B) Identificação de célula única baseada em FSC-A e FSC-H. (C) Identificação de células vivas com FVS 780. (D) Seleção celular negativa baseada nos antígenos CD11b, CD31, CD45 e TER119. (E-F) Seleção celular positiva baseada em CD34 e ITGA7 (E), bem como antígenos CXCR4 (F). Os portões são representados como caixas pretas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Estratégia de acoplamento do citômetro de fluxo para triagem de células satélites após digestão com 600 μL de LT Liberase. (A) Seleção da população de interesse com base nos parâmetros FSC-A e SSC-A. (B) Identificação de célula única baseada em FSC-A e FSC-H. (C) Identificação de células vivas com FVS 780. (D) Seleção celular negativa baseada nos antígenos CD11b, CD31, CD45 e TER119. (E-F) Seleção celular positiva baseada em CD34 e ITGA7 (E), bem como antígenos CXCR4 (F). Os portões são representados como caixas pretas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Caracterização das localizações genômicas de H3K4me2, H3K27ac e RA. (A) Gráficos de pizza mostrando a distribuição de pico de H3K4me2, H3K27ac e AR de acordo com as características do genoma em células satélites. (B) Gráficos de pizza mostrando a distribuição de pico de H3K4me2, H3K27ac e AR de acordo com sua distância até o TSS mais próximo em células satélites. (C) Mapa de calor mostrando a correlação de Pearson entre H3K4me2, H3K27ac e controle IgG. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura complementar 5: Perfis genômicos da cromatina de células satélites em genes induzidos por resposta ao estresse. Localização de H3K4me2 e H3K27ac nos genes indicados na cromatina de células satélites. A imunoprecipitação com IgG foi utilizada como controle negativo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: Perfis genômicos da cromatina de células satélites em genes-alvo AR conhecidos. Localização de H3K4me2, H3K27ac e AR nos genes indicados na cromatina de células satélites determinada por CUT&RUN. Os picos de RA são encaixotados em azul, e os elementos AR-responsivos correspondentes são apresentados abaixo. CUT&RUN realizado com IgG foi utilizado como controle negativo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 7 suplementar: Perfis genômicos da cromatina de células satélites em seus genes expressos seletivamente. Localização de H3K4me2, H3K27ac e AR nos genes indicados na cromatina de células satélites determinada por CUT&RUN. Os picos de RA são encaixotados em azul, e os elementos AR-responsivos correspondentes são apresentados abaixo. CUT&RUN realizado com IgG foi utilizado como controle negativo. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O presente estudo relata um método padronizado, confiável e de fácil execução para o isolamento e cultivo de células satélites de camundongos, bem como a avaliação da regulação transcricional pelo método CUT&RUN.

Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro é a ruptura muscular e digestão de fibras para garantir um alto número de células coletadas. Apesar do aumento da concentração enzimática, mais células vivas foram obtidas do que usando o Protocolo 1. As células satélites expressam um padrão específico de várias proteínas de membrana. Para aumentar a estringência de nossa triagem, usamos uma combinação de marcadores celulares satélites negativos (CD31, TER119, CD45 e CD11b) e positivos (CD34, ITGA7 e CXCR4) previamente descritos30,31. Usando essa estratégia, obteve-se uma média de 1% de células satélites putativas vivas. Esse resultado está na faixa do esperado, uma vez que as células satélites representam 2%-7% da população de células musculares na idade adulta em camundongos32. Como controle para os marcadores de seleção de células satélites, células CD34+/ITGA7-/CXCR4- foram isoladas. A coloração por imunofluorescência demonstrou que, enquanto as células CD34+/ITGA7-/CXCR4- não expressaram PAX7, 70% das células classificadas CD34+/ITGA7+/CXCR4+ foram positivas para este marcador específico de células satélites, demonstrando que a população isolada de FACS corresponde a células satélites. Além disso, 70% das células satélites cultivadas em meio miogênico por 7 dias eram PAX7-/DMD+, como demonstrado pela imunomarcação, e formaram uma miofibra multinucleada alongada, demonstrando que as células satélites isoladas conservaram seu potencial de tronco.

A principal limitação no preparo das amostras pode ser o uso de uma alta concentração de enzimas, o que resulta em uma grande quantidade de material biológico dissociado, mas pode contribuir para o aumento da morte celular. Para resolver esse problema, um ensaio que requer menor quantidade de enzima foi testado. Nesse contexto, foi testada a Liberase LT, uma forma purificada da colagenase33 tradicional. Embora a digestão tenha sido aparentemente mais eficiente com esta enzima, a quantidade de restos celulares permaneceu elevada, e a viabilidade celular foi ligeiramente reduzida. Essas observações estão de acordo com relatos anteriores que compararam a digestão tecidual mediada por liberase com a colagenase recombinante ou colagenase personalizada24,25. Além disso, embora a proporção de células endoteliais e imunes tenha sido semelhante entre a digestão da colagenase e da liberase, a porcentagem de células satélites foi menor na amostra processada com liberase, mostrando que a liberase não é recomendada para isolamento de células satélites. O uso desta enzima é adequado para a análise fenotípica e quantitativa de células imunes e poderia eventualmente ser recomendado no contexto do músculo e/ou outros tecidos. Isso está de acordo com o que tem sido relatado sobre LT liberase como o mais adequado para isolar efetivamente células imunes viáveis34,35,36.

Outro problema potencial é o estresse causado pela dissociação e classificação de células satélites. Entretanto, a ausência de H3K27ac e os baixos níveis de H3K4me2 na região promotora de genes de resposta ao estresse identificados por sequenciamento de RNA unicelular em células satélites decamundongos26 mostram que o procedimento é leve o suficiente para não induzir o repertório transcricional da resposta ao estresse. Outras limitações a serem observadas são os antígenos selecionados que permanecem empíricos. No entanto, estudos mostram uma alta sobreposição entre combinações únicas de marcadores de superfície que são enriquecidas para células satélites do músculo esquelético30,31.

Uma etapa crítica adicional é a purificação de núcleos de células classificadas. Para isso, a velocidade de classificação é mantida baixa para não danificar as células, mas rápida o suficiente para que elas não sejam armazenadas por muito tempo em buffer FACS. De fato, os núcleos CUT&RUN não são fixos, e um tempo de incubação maior pode influenciar a leitura obtida a partir do protocolo. Uma preparação típica dos dois membros posteriores de um camundongo permite CUT&RUN com um anticorpo e um controle IgG, com uma quantidade de 2,5 ng de cromatina para cada um.

Os experimentos CUT&RUN, projetados para avaliar a ligação ao fator de transcrição e modificações epigenéticas, forneceram sinais de leitura fortes e robustos para H3K4me2 e H3K27ac. Os altos níveis de leitura de H3K4me2 e H3K27ac em genes sabidamente expressos em células satélites, comparados a genes expressos em células imunes ou endoteliais, bem como em miofibras, mostraram que o sinal foi amplificado predominantemente a partir dos núcleos das células satélites. Além disso, esse protocolo possibilitou a identificação do cistroma do RA em células-tronco musculares, o que até o momento permanece uma questão técnica inerente à baixa qualidade dos anticorpos de RA de camundongos e aos baixos níveis de expressão de RA em células pouco sensíveis a andrógenos, como as células epiteliais da próstata. Os dados aqui apresentados revelaram regiões ligadas à RA com altos escores de pico de confiança. Como apenas uma réplica foi originalmente avaliada por anticorpo, a robustez de nossos conjuntos de dados será melhorada pela adição de pelo menos duas réplicas biológicas adicionais por condição. No entanto, genes alvo conhecidos de RA e respectivas marcas de histonas, originalmente descritos como altamente expressos e/ou facilmente detectáveis em outros contextos teciduais, como a próstata, apresentam níveis de expressão mais baixos e são muito difíceis de detectar em células satélites.

Uma limitação da abordagem CUT&RUN é que ela é realizada em células não fixas. Assim, podemos ter perdido alguns alvos de RA devido à natureza lábil das interações entre os fatores de transcrição e seu sítio de ligação. Da mesma forma, algumas modificações pós-traducionais, como a acetilação, também podem ser bastante lábeis. Portanto, a inclusão de uma etapa de fixação à luz com formaldeído ou paraformaldeído, após a classificação FACS, e antes de isolar os núcleos, poderia ser considerada para estabilizar as interações proteína/DNA e modificações nas histonas.

Embora este trabalho mostre que ensaios CUT&RUN podem ser conduzidos em células satélites isoladas de FACS, outras análises que usam cromatina não fixa, como ATAC-seq, também podem ser realizadas. Além disso, embora aqui os músculos tenham sido colhidos em condições fisiológicas basais, este protocolo pode ser aplicado a contextos patológicos como lesão ou envelhecimento. Todos esses protocolos permitirão uma compreensão detalhada dos mecanismos de regulação gênica em células satélites, e poderão auxiliar no entendimento de como esses mecanismos podem ser alterados por condições fisiopatológicas.

Em resumo, este protocolo de baixo custo e tempo eficiente fornece um cenário experimental eficaz para estudar o recrutamento de fatores de transcrição e a paisagem da cromatina em células precursoras de músculo esquelético. A cromatina preparada por este protocolo proporcionou a primeira análise genômica ampla do cistroma AR em células satélites e facilitará futuros estudos sobre regulação gênica.

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Disclosures

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos a Anastasia Bannwarth por fornecer excelente assistência técnica. Agradecemos ao biotério do IGBMC, à cultura de células, ao Instituto Clínico de Camundongos (ICS, Illkirch, França), à imagem, à microscopia eletrônica, à citometria de fluxo e à plataforma GenomEast, membro do consórcio 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

Este trabalho do Instituto Temático Interdisciplinar IMCBio, como parte do programa ITI 2021-2028 da Universidade de Estrasburgo, CNRS e Inserm, foi apoiado pela IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) e pelo projeto SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) e EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) no âmbito do Programa Francês de Investimentos para o Futuro. Financiamento adicional foi entregue pelo INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon programa estratégico 24376 (para D.D.), INSERM bolsa para jovens pesquisadores (para D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, e um fundo estatal francês gerido pela ANR no âmbito do programa-quadro Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. foi apoiado pelo Programa CDFA-07-22 da Université franco-allemande e Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, e K.G. pela Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

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Análise CUT&RUN Células satélites de camundongo isoladas por FACS Campo de células-tronco Populações de pequenas células Protocolo eficiente Classificação de células ativadas por fluorescência Músculo do membro Proteínas estruturais Mincing Meio Dispase Colagenase tipo I Filtros de células Tampão FACS Coloração de viabilidade Células satélites imunomarcadas Triton X-100 Contas magnéticas de concanavalina A Fator de transcrição Modificações de histona Nuclease microcócica de proteína A Clivagem de cromatina CaCl2 Extração de DNA Bibliotecas Análise Bioinformática
Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&amp;RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS
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Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

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