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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Ein effizientes Protokoll für die CUT&RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Hier wird ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaße vorgestellt, das für die Untersuchung der Transkriptionsregulation in Muskelfasern durch Spaltung unter Targets und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease (CUT&RUN) geeignet ist.

Abstract

Genomweite Analysen mit kleinen Zellpopulationen sind eine große Einschränkung für Studien, insbesondere im Stammzellbereich. Diese Arbeit beschreibt ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Isolierung von Satellitenzellen aus dem Gliedmaßenmuskel, einem Gewebe mit einem hohen Gehalt an Strukturproteinen. Die präparierten Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen wurden mechanisch durch Zerkleinern in Medium, das mit Dispase und Typ-I-Kollagenase ergänzt wurde, gestört. Nach dem Aufschluss wurde das Homogenat durch Zellsiebe filtriert und die Zellen wurden in FACS-Puffer suspendiert. Die Viabilität wurde mit fixierbarer Viabilitätsfärbung bestimmt, und immungefärbte Satellitenzellen wurden mittels FACS isoliert. Die Zellen wurden mit Triton X-100 lysiert und die freigesetzten Zellkerne wurden an Concanavalin-A-Magnetkügelchen gebunden. Die Zellkern-/Bead-Komplexe wurden mit Antikörpern gegen den Transkriptionsfaktor oder die interessierenden Histonmodifikationen inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellkern-/Kügelchenkomplexe mit der Protein-A-Mikrokokken-Nuklease inkubiert und die Chromatinspaltung mit CaCl2 eingeleitet. Nach der DNA-Extraktion wurden Bibliotheken erstellt und sequenziert, und die Profile für die genomweite Transkriptionsfaktorbindung und kovalente Histonmodifikationen wurden durch bioinformatische Analyse erhalten. Die für die verschiedenen Histonmarkierungen erhaltenen Peaks zeigten, dass die Bindungsereignisse spezifisch für Satellitenzellen waren. Darüber hinaus ergab die Analyse bekannter Motive, dass der Transkriptionsfaktor über sein verwandtes Antwortelement an das Chromatin gebunden ist. Dieses Protokoll wurde daher angepasst, um die Genregulation in Satellitenzellen der Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen zu untersuchen.

Introduction

Die quergestreifte Skelettmuskulatur macht durchschnittlich 40 % des Gewichts des gesamten menschlichen Körpers aus1. Muskelfasern weisen eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration nach Verletzungen auf, die durch die Fusion neu gebildeter Myozyten und die Bildung neuer Myofasern beschrieben wird, die die beschädigten ersetzen2. Im Jahr 1961 berichtete Alexander Mauro über eine Population von mononukleären Zellen, die er als Satellitenzellen bezeichnete3. Diese Stammzellen exprimieren den Transkriptionsfaktor Pair Box 7 (PAX7) und befinden sich zwischen der Basallamina und dem Sarkolemma der Muskelfasern4. Es wurde berichtet, dass sie den Cluster der Differenzierung 34 (CD34; ein hämatopoetischer, endothelialer Vorläufer und mesenchymaler Stammzellmarker), Integrin alpha 7 (ITGA7; ein glatter Marker für Herz- und Skelettmuskeln) sowie den C-X-C-Chemokinrezeptor Typ 4 (CXCR4; ein Lymphozyten-, hämatopoetischer und Satellitenzellmarker) exprimierten5. Unter basalen Bedingungen befinden sich Satellitenzellen in einer bestimmten Mikroumgebung, die sie in einem Ruhezustand hält6. Bei Muskelschäden werden sie aktiviert, vermehren sich und durchlaufen eine Myogenese7. Da sie jedoch nur einen kleinen Teil der Gesamtzahl der Muskelzellen ausmachen, sind ihre genomweiten Analysen eine besondere Herausforderung, insbesondere unter physiologischen Bedingungen (<1 % der gesamten Zellen).

Es wurden verschiedene Methoden zur Chromatinisolierung aus Satellitenzellen beschrieben, die eine Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender massiver paralleler Sequenzierung (ChIP-seq) oder Spaltung unter Targets und Tagmentation (CUT&Tag) beinhalten. Nichtsdestotrotz weisen diese beiden Techniken einige erhebliche Einschränkungen auf, die unangefochten bleiben. In der Tat erfordert ChIP-seq eine große Menge an Ausgangsmaterial, um genügend Chromatin zu erzeugen, von dem ein großer Teil während des Beschallungsschritts verloren geht. CUT&Tag eignet sich besser für eine niedrige Zellzahl, erzeugt aber aufgrund der Tn5-Transposase-Aktivität mehr Off-Target-Spaltstellen als ChIP-seq. Da dieses Enzym eine hohe Affinität zu offenen Chromatinregionen aufweist, könnte der CUT&Tag-Ansatz bevorzugt für die Analyse von Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren verwendet werden, die mit aktiv transkribierten Regionen des Genoms assoziiert sind, anstelle von stillgelegtemHeterochromatin 8,9.

Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Isolierung von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaßen mittels FACS für die Spaltung unter den Zielen und die Freisetzung mittels Nuklease-Analyse (CUT&RUN)10,11 ermöglicht. Die verschiedenen Schritte umfassen den mechanischen Aufschluss des Gewebes, die Zellsortierung und die Zellkernisolierung. Die Effizienz der Methode in Bezug auf die Herstellung einer lebensfähigen Zellsuspension wurde durch die Durchführung von CUT&RUN-Analysen auf kovalente Histonmodifikationen und Transkriptionsfaktoren demonstriert. Die Qualität der isolierten Zellen macht die beschriebene Methode besonders attraktiv für die Herstellung von Chromatin, das den nativen genomischen Belegungszustand originalgetreu erfasst und wahrscheinlich für die Erfassung der Chromosomenkonformation in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierung an spezifischen Loci (4C-seq) oder auf genomweiten Ebenen (Hi-C) geeignet ist.

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Protocol

Die Mäuse wurden in einem akkreditierten Tierstall gehalten, in Übereinstimmung mit den nationalen Tierpflegerichtlinien (Richtlinie 86/609/EWG der Europäischen Kommission; Französisches Dekret Nr. 87-848) über die Verwendung von Versuchstieren zu Forschungszwecken. Beabsichtigte Manipulationen wurden der Ethikkommission (Com'Eth, Straßburg, Frankreich) und dem französischen Forschungsministerium (MESR) zur ethischen Bewertung und Genehmigung gemäß der Richtlinie 2010/63/EU unter der APAFIS-Nummer #22281 vorgelegt.

1. Herstellung einer Zellsuspension zur Isolierung von Satellitenzellen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) (Abbildung 1)

  1. Isolierung von Muskelgewebe
    1. Dekontaminieren Sie die Werkzeuge für die Muskeldissektion, einschließlich Pinzette, Skalpell und Schere, mit einem Reinigungsmittel (Tabelle 1) und spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab.
    2. Bereiten Sie zwei 2-ml-Röhrchen (Tabelle 1) vor, die jeweils 1 ml Muskelisolationspuffer enthalten, und legen Sie sie auf Eis, um die entnommenen Muskeln zu sammeln.
    3. Tötung von zwei 10 Wochen alten männlichen C57/Bl6J-Mäusen durch CO2 -Erstickung mit anschließender Zervixluxation. Sprühen Sie 70%iges Ethanol über jede Maus. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette von der Hintergliedmaße ab. Sezieren Sie alle Gliedmaßenmuskeln, die den Oberschenkelknochen, das Schienbein und das Wadenbein umgeben, (ca. 1 mg Muskeln pro Maus).
      HINWEIS: Die Anzahl der Satellitenzellen nimmt nach einem Alter von 15 Wochen ab.
    4. Die entnommenen Gliedmaßenmuskeln werden in 2-ml-Röhrchen gegeben, die 1 ml Muskelisolationspuffer enthalten, der in Schritt 1.1.2 vorbereitet wurde. Entnehmen Sie die Muskeln der zweiten Maus nach dem gleichen Verfahren. Die geernteten Muskeln mit einer Schere auf Eis zerkleinern, bis kleiner als1 mm 3 Fragmente sind.
      HINWEIS: Die Muskeln wurden hauptsächlich wie beschrieben gesammelt und zerkleinert12. Führen Sie den Gewebeaufschluss entweder nach Schritt 1.2 oder 1.3 durch.
  2. Gewebeverdauung mit Kollagenase-Enzym
    1. Übertragen Sie die zerkleinerte Muskelsuspension von den beiden Mäusen, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen (Tabelle 1) gießen, das 18 ml Muskelisolationspuffer enthält (ergänzt mit 5 ml [5 U/ml] Dispase und 5 mg Typ-I-Kollagenase) (Tabelle 1).
    2. Verschließen Sie das Röhrchen fest und verschließen Sie es mit Laborfolie (Tabelle 1). Legen Sie es waagerecht in ein Schüttelwasserbad (Tabelle 1) bei 37 °C bei 100 U/min für 30 min.
    3. Nach 30 Minuten 5 mg Kollagenase Typ I hinzufügen. Die Röhrchen werden weitere 30 min unter Rühren in einem Schüttelwasserbad bei 37 °C bei 100 U/min aufbewahrt.
    4. Nach der Verdauung pipettieren Sie die Muskelsuspension 10 Mal mit einer 10-ml-Pipette auf und ab, um die Effizienz der Dissoziation zu verbessern. Bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugieren. Am Boden des Röhrchens ist ein durchsichtiges Pellet sichtbar. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette und lassen Sie 5 ml Medium im Röhrchen.
      HINWEIS: Das Verlassen des Mediums hilft, die Zellen nicht zu belasten. Fügen Sie 10 ml frischen Muskelisolationspuffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettieren.
    5. 100-μm-, 70-μm- und 40-μm-Zellsiebe (eines von jeder Art) (Tabelle 1) auf offene 50-ml-Röhrchen legen. Pipettieren Sie die Suspension auf die aufeinanderfolgenden Zellsiebe (100 μm, 70 μm, 40 μm) und sammeln Sie den Durchfluss in die 50-ml-Röhrchen, die Zellen unter 40 μm enthalten.
    6. Die Suspension wird bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette, bis noch 2 ml übrig sind, und verwenden Sie dann eine 0,2-1-ml-Pipette, bis noch 100-200 μl übrig sind. Resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (Tabelle 2). 3 Minuten auf Eis inkubieren.
    7. Bei 4 °C bei 400 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand mit einer 20-200 μl Pipette entsorgen. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl kaltem FACS-Puffer (Tabelle 2). Auf Eis legen.
  3. Alternative Methode zur Gewebeverdauung mit dem Enzym Liberase Thermolysin low (TL)
    1. Befolgen Sie die Beschreibungen in Schritt 1.1. zur Gewebeisolierung.
    2. Für die Liberase-vermittelte Gewebedisaggregation werden die Muskeln in 2 ml Isolationspuffer des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Tabelle 2) anstelle des in Schritt 1.1.2 beschriebenen Muskelisolationspuffers entnommen.
    3. Die zerkleinerte Muskelsuspension der beiden Mäuse wird in ein 50-ml-Röhrchen (Tabelle 1) überführt, das 18 ml RPMI-Isolationspuffer enthält, ergänzt mit 300 oder 600 μl Liberase TL in einer Konzentration von 5 mg/ml (Tabelle 1) (d. h. 0,083 mg/ml bzw. 0,167 mg/ml Endkonzentration)13.
    4. Verschließen Sie das Röhrchen fest und verschließen Sie es mit Laborfolie (Tabelle 1). Legen Sie es waagerecht in ein Schüttelwasserbad (Tabelle 1) bei 37 °C bei 100 U/min für 30 min.
    5. Nach der Verdauung pipettieren Sie die Muskelsuspension 10 Mal mit einer 10-ml-Pipette auf und ab, um zu dissoziieren und die Effizienz der Dissoziation zu verbessern.
    6. Bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugieren. Am Boden des Röhrchens ist ein durchsichtiges Pellet sichtbar. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette und lassen Sie 5 ml Medium im Röhrchen. Das Verlassen des Mediums hilft, die Zellen nicht zu belasten. Fügen Sie 10 ml frischen RPMI-Isolationspuffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettieren.
    7. 100-μm-, 70-μm- und 40-μm-Zellsiebe (eines von jeder Art) (Tabelle 1) auf offene 50-ml-Röhrchen legen.
    8. Pipettieren Sie die Suspension auf aufeinanderfolgende Zellsiebe (100 μm, 70 μm, 40 μm) und sammeln Sie den Durchfluss in die 50-ml-Röhrchen, die Zellen unter 40 μm enthalten.
    9. Die Suspension wird bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette, bis noch 2 ml übrig sind, und verwenden Sie dann eine 0,2-1-ml-Pipette, bis noch 100-200 μl übrig sind.
    10. Resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (Tabelle 2). 3 Minuten auf Eis inkubieren.
    11. Bei 4 °C bei 400 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand mit einer 20-200 μl Pipette entsorgen.
    12. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl kaltem FACS-Puffer (Tabelle 2). Auf Eis legen.
  4. Herstellung der Zellsuspension für die FACS-Isolierung
    1. 10 μl der in Schritt 1.2.12 erhaltenen Zellsuspension werden in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen überführt. Diese Probe stellt die ungefärbte Kontrolle oder die Negativkontrolle dar (Abbildung 2). Geben Sie 190 μl FACS-Puffer hinzu, füllen Sie ihn in ein 5-ml-Röhrchen (Tabelle 1) und lagern Sie ihn auf Eis.
    2. Die restlichen 90 μl der in Schritt 1.2.12 erhaltenen Zellsuspension werden bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette (20-200 μl Spitzenvolumen) verworfen. Die Zellen werden mit 400 μl fixierbarer Viabilitätsfarbe (Tabelle 3) verdünnt in serumfreiem modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
    3. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C bei 400 x g für 5 Minuten und fügen Sie 100 μl FACS-Puffer hinzu. Die Röhrchen werden dreimal vorsichtig umgedreht und erneut bei 4 °C bei 400 x g für 5 min zentrifugiert.
    4. Während der Zentrifugationszeit werden 100 μl eines Mastermixes aus Primärantikörpern hergestellt, die an Fluorophore gekoppelt und gegen CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 und CXCR4 gerichtet sind (Tabelle 3), verdünnt in FACS-Puffer.
    5. Bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Zellüberstand mit einer Pipette (20-200 μl Spitzenvolumen) verwerfen und die 100 μl Antikörpermischung hinzufügen. Drehen Sie das Rohr dreimal vorsichtig um. Keine Wirbel machen. Im Dunkeln auf Eis 30 Minuten inkubieren.
    6. Bei 400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 20-200-μl-Pipette und fügen Sie 500 μl 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um die Zellen zu waschen. Drehen Sie das Rohr dreimal vorsichtig um. Bei 400 x g für 5 min bei 4 °C erneut zentrifugieren und den Überstand mit einer 20-200 μl Pipette entsorgen.
    7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl FACS-Puffer und überführen Sie die Suspension in ein 5-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Die aus dem Liberase-Verdau gewonnene Zellsuspension wird auf die gleiche Weise verarbeitet.
  5. Satellitenzellen-Selektion durch FACS
    1. Die Zellsuspension kurz vortex (2-5 sec) und die Zellen auf einem Durchflusszytometer mit einer 100 μm Düse verarbeiten (Tabelle 1).
    2. Bestimmen Sie die verschiedenen Gategrößen anhand der ungefärbten Probe, die in Schritt 1.4.1 gelagert wurde (Abbildung 2).
    3. Beschichten Sie ein 5-ml-Röhrchen mit 1 ml reinem fötalem Kälberserum (FCS), um die Zellentnahme zu verbessern, und fügen Sie 500 μl FACS-Puffer hinzu.
    4. Tauschen Sie die ungefärbte Probe gegen die Antikörper-markierte Probe aus.
    5. Wählen Sie die interessierende Grundgesamtheit entsprechend der Vorwärtsstreufläche (FSC-A) und der Seitenstreufläche (SSC-A) aus (Abbildung 3A) und entfernen Sie Dublettenzellen mit der FSC-A- und Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) (Abbildung 3B)14.
    6. Identifizierung lebender Zellen mit fixierbarer Viabilitätsfärbung (Abbildung 3C).
    7. Wählen Sie negative Zellen für CD31, CD45, TER119 und CD11b aus (Abbildung 3D).
    8. Um Satellitenzellen zu identifizieren, wählen Sie zuerst die Zellen aus, die positiv für CD34 und ITGA7 sind (Abbildung 3E), und wählen Sie dann die CXCR4-positiven Zellen in der CD34- und ITGA7-selektierten Population aus (Abbildung 3F).
    9. Sammeln Sie die ausgewählten Zellen (je nach Qualität des Präparats zwischen 40.000 und 80.000 Zellen) in das beschichtete 5-ml-Röhrchen, das 500 μl FACS-Puffer enthält.

2. Validierung der isolierten Population in Gewebekultur

  1. Gleitbeschichtung mit Hydrogel
    1. Verdünnen Sie 280 μl einer reinen Hydrogel-Matrix aus humanen embryonalen Stammzellen (hESC) (Tabelle 1) in 12 ml serumfreiem DMEM/F12-Medium.
    2. Einen Objektträger (Tabelle 1) mit der Hydrogellösung bestreichen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    3. Am nächsten Tag wird der Objektträger vor der Zellaussaat 1 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
  2. Zellwachstum und Zelldifferenzierung
    1. Verteilen Sie ca. 20.000 Zellen, die Sie aus Schritt 1.5.9 erhalten haben, pro Vertiefung und züchten Sie sie 5 Tage lang in Wachstumsmedium (Tabelle 2). Nehmen Sie Phasenkontrastbilder mit einem Hellfeldmikroskop auf (Abbildung 4A), bevor Sie sie für die Immunfluoreszenzanalyse verarbeiten, um die Qualität des Präparats sicherzustellen (Abbildung 4B).
    2. Um die Myogenese zu induzieren, werden amplifizierte Satellitenzellen aus Schritt 2.2.1 für weitere 7 Tage in myogenem Medium (Tabelle 2) gezüchtet. Nehmen Sie Phasenkontrastbilder mit einem Hellfeldmikroskop auf (Abbildung 4C), bevor Sie sie für die Immunfluoreszenzanalyse verarbeiten, um die Qualität des Präparats sicherzustellen (Abbildung 4D).
  3. Immunzytofluoreszenz-Analyse
    1. Entfernen Sie das Medium vorsichtig, waschen Sie die Zellen, die auf dem Objektträger kultiviert wurden, zweimal mit 100 μl 1x PBS und fixieren Sie sie mit 100 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei RT für 1 h.
      HINWEIS: Dieser Schritt sollte mit Vorsicht durchgeführt werden. Ein kleines Volumen des Mediums sollte immer in der Kammer aufbewahrt werden, um eine Belastung der Zellen zu vermeiden, und das PBS sollte durch die Wände der Kammer gegossen werden.
    2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 100 μl 1x PBS, ergänzt mit 0,1% Tween 20 (PBST), um die Zellmembranen zu permeabilisieren.
    3. Blockieren Sie unspezifische Signale durch Inkubation in 100 μl 1x PBST, ergänzt mit 5% FCS (PBST-FCS) bei RT für 1 h.
    4. Inkubieren Sie die Zellen mit 100 μl einer Mastermischung aus Anti-PAX7- und Anti-Dystrophin (DMD)-Antikörpern (verdünnt in 1x PBST-FCS) bei 4 °C über Nacht, um Satellitenzellen bzw. Myofasern nachzuweisen.
    5. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 100 μl 1x PBST und inkubieren Sie sie mit 100 μl Ziegen-Anti-Maus-Cy3- oder Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern Alexa 488 (Tabelle 3), verdünnt in 1x PBST-FCS bei RT für 1 h.
    6. Trennen Sie die Kammervertiefungen mit den vom Lieferanten bereitgestellten Geräten vom Objektträger, fügen Sie 20 μl wässriges Eindeckmedium mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) hinzu und decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab (Tabelle 1).
    7. Beobachten und erfassen Sie das Bild der gefärbten Zellen mit einem konfokalen Mikroskop.
    8. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware (Abbildungen 4B,D).

3. CUT&RUN-Analyse

  1. Probenvorbereitung für die CUT&RUN-Analyse an FACS-isolierten Satellitenzellen
    HINWEIS: CUT&RUN wurde im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt10,15. Die Pufferzusammensetzung ist dargestellt in Tabelle 2.
    1. Für den CUT&RUN-Assay werden ca. 40.000 der in Methode 1, Schritt 1.5.9 gewonnenen Zellen pro zu testender Probe/Antikörper verwendet.
    2. Zentrifugieren Sie die FACS-isolierten Satellitenzellen bei RT bei 500 x g für 10 Minuten und verwerfen Sie dann den Überstand mit einer Pipette (20-200 μl Spitzenvolumen).
    3. Die Zellen werden mit 1 ml 1x PBS gewaschen, 5 Minuten lang bei RT bei 500 x g zentrifugiert, der Überstand mit einer Pipette (0,2-1 ml Spitzenvolumen) verworfen und in 1 ml kaltem Kernextraktionspuffer resuspendiert (Tabelle 2). 20 Minuten auf Eis inkubieren.
    4. Während der Inkubation wird ein 1,5-ml-Röhrchen mit 850 μl kaltem Bindungspuffer (Tabelle 2) vorbereitet und 20 μl Concanavalin A-beschichtete Magnetkügelchen pro Probe hinzugefügt (Tabelle 1).
    5. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 ml kaltem Bindepuffer unter Verwendung eines Magnetgestells (Tabelle 1). Lassen Sie die Kügelchen bei jedem Wasch- oder Pufferwechsel während des gesamten Verfahrens 5 Minuten lang an der Seite des Röhrchens auf dem Magnetgestell ansammeln, bevor Sie den entfernten Überstand mit einer Pipette (0,2-1 ml Spitzenvolumen) entfernen. Anschließend vorsichtig in 300 μl kaltem Bindungspuffer resuspendieren.
    6. Die Kerne werden bei 4 °C bei 600 x g für 5 min zentrifugiert und vorsichtig in 600 μl Kernextraktionspuffer resuspendiert. Die 600 μl extrahierten Zellkerne werden vorsichtig mit den 300 μl Concanavalin A-Kügelchenaufschlämmung gemischt und 10 Minuten lang bei 4 °C inkubiert.
    7. Entfernen Sie den Überstand mit einem magnetischen Gestell, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, und resuspendieren Sie die perlengebundenen Kerne vorsichtig mit 1 ml Kälteblockierpuffer (Tabelle 2). 5 Minuten bei RT inkubieren.
    8. Entfernen Sie den Überstand mit einem magnetischen Gestell und waschen Sie die perlengebundenen Kerne zweimal mit 1 ml kaltem Waschpuffer (Tabelle 2). Beim zweiten Waschen werden die perlengebundenen Kerne gleichmäßig in 1,5-ml-Röhrchen aufgeteilt. Jedes Röhrchen wird im nächsten Schritt mit einem spezifischen Antikörper behandelt.
      HINWEIS: In diesem Beispiel wurden 250 μl perlengebundene Kerne in vier 1,5-ml-Röhrchen aufgeteilt.
    9. Trennen Sie den Überstand mit einem magnetischen Gestell, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, und saugen Sie ihn mit einer Pipette an. Die Zellkern-/Kügelchenkomplexe werden vorsichtig mit einem spezifischen Primärantikörper (Tabelle 3) oder einem IgG einer anderen Spezies (hier Kaninchen) resuspendiert, das in 250 μl Kaltwaschpuffer verdünnt ist. Bei 4 °C über Nacht unter leichtem Rühren inkubieren.
      HINWEIS: Die hier verwendeten Antikörper richten sich gegen AR, H3K4me2 und H3K27ac.
    10. Entfernen Sie den Überstand mit einem magnetischen Gestell, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, waschen Sie die perlengebundenen Kerne zweimal mit 1 ml kaltem Waschpuffer und resuspendieren Sie ihn in 100 μl kaltem Waschpuffer.
    11. Verdünnen Sie die Protein-A-Mikrokokken-Nuklease mit 1,4 ng/μl in 100 μl pro Probe des Kaltwaschpuffers.
    12. Zu den 100 μl der unter 3.1.11 erhaltenen Probe werden 100 μl Protein-A-Mikrokokken-Nuklease zugegeben und 1 h lang bei 4 °C unter Rühren inkubiert.
    13. Der Überstand wird mit einem magnetischen Gestell entfernt, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, zweimal mit 1 ml kaltem Waschpuffer gewaschen und die perlengebundenen Kerne in 150 μl kaltem Waschpuffer resuspendiert.
    14. Um die DNA-Spaltung einzuleiten, fügen Sie 3 μl 100 mM CaCl2 zu den 150 μl der Probe hinzu, mischen Sie schnell durch Schnippen und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 150 μl Stopppuffer und inkubieren Sie bei 37 °C für 20 Minuten, um die RNA zu verdauen und die DNA-Fragmente freizusetzen.
    15. Für die DNA-Extraktion zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g bei 4 °C für 5 min.
    16. Füllen Sie den Überstand in ein neues Mikrofugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet und die Kügelchen.
    17. Fügen Sie 3 μl 10%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2,5 μl 20 mg/ml Proteinase K hinzu. 10 min bei 70 °C (nicht schütteln) inkubieren.
    18. 300 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und Vortex hinzufügen, in 2-ml-Phase-Lock-Röhrchen überführen (5 min bei 16.000 x g vorgeschleudert) und 5 min bei 16.000 x g bei 4 °C zentrifugieren.
    19. 300 μl Chloroform in dasselbe Röhrchen geben und 5 min bei 16.000 x g bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand (~300 μl) mit einer Pipette (0,2-1 ml Spitzenvolumen) auffangen und in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen.
    20. Fügen Sie 1 μl Glykogen (20 mg/ml Konzentration) hinzu.
    21. 750 μl 100%iges Ethanol zugeben und über Nacht bei -20 °C ausfällen.
    22. Pelletieren Sie die DNA durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 16.000 x g bei 4 °C. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 100%igem Ethanol, zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 16.000 x g, verwerfen Sie den Überstand, zentrifugieren Sie es 30 s lang bei 16.000 x g und entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette (20-200 μl Spitzenvolumen).
    23. Lassen Sie das Pellet ~5 Minuten lang an der Luft trocknen. Resuspendieren in 25 μl 1 mM Tris-HCl (pH 8) und 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; pH 8).
  2. Bioinformatische Analyse
    1. Bereiten Sie Bibliotheken aus immungespaltener DNA vor und sequenzieren Sie sie als 100-bp-Reads mit gepaarten Enden mit Hilfe der genomischen Plattform, wie beschrieben16.
    2. Entfernen Sie Reads, die sich mit der ENCODE-Blacklist-Region (V2) überlappen, und teilen Sie die verbleibenden Reads in zwei Gruppen auf: Fragmentgröße <120 bp (ohne Nukleosom, im Allgemeinen für Transkriptionsfaktoren) und Fragmentgröße >150 bp (mit Nukleosomen, normalerweise für Histonmarkierungen). Zuordnung zum mm10-Referenzgenom mit Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Generieren Sie Bigwig-Dateien mit bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Bewahren Sie eindeutig zugeordnete Lesevorgänge für weitere Analysen auf.
    5. Generieren Sie rohe Bedgraph-Dateien mit genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Verwenden Sie den SEACR 1.3-Algorithmus (stringente Option) für den Spitzenaufruf. Laden Sie die Zieldaten-Bedgraph-Datei im UCSC-Bedgraph-Format, das Bereiche auslässt, die Nullsignale enthalten, und die Control-Daten-Bedgraph-Datei (IgG), um einen empirischen Schwellenwert für Peak-Aufrufe18 zu generieren.
    7. Führen Sie eine Pearson-Korrelationsanalyse mit deeptools durch, um die Ähnlichkeit zwischen den Proben19 zu bestimmen. Verwenden Sie die Befehlszeile multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, gefolgt von plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualisieren Sie die genomweiten Intensitätsprofile mit IGV20 unter Verwendung von Bedgraph-Dateien und den von SEACR erhaltenen Peaks der Bed-Datei.
    9. Verwenden Sie HOMER für die Peak-Annotation und die Motivsuche21.
    10. Vergleichen Sie schließlich die Datensätze mit zuvor veröffentlichten Datensätzen mit dem ChIP-Atlas Peak-Browser, um sie auf IGV und/oder Anreicherungsanalyse zu visualisieren, wobei die von SEACR generierten Bettdateien als Eingabedatensatz22 verwendet werden.

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Representative Results

Satellitenzellen aus der Skelettmuskulatur von Mäusen wurden durch die Kombination der Protokolle von Gunther et al. (im Folgenden Protokoll 1)12 und von Liu et al.23 (im Folgenden Protokoll 2) isoliert. Da nicht verdaute Muskelfasern nach der Verdauung beobachtet wurden, wenn die in Protokoll 1 vorgeschlagene Konzentration von Kollagenase und Dispase verwendet wurde, wurde die Menge der Enzyme erhöht, um die Dissoziation der Muskelfasern zu verbessern, wie in den Schritten 1.2.1 und 1.2.3 beschrieben. Wie in Protokoll 2 angegeben, wurden die Proben einer sanften Bewegung in einem Wasserbad unterzogen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Wir führten eine Filtration durch Zellsiebe durch, wie in Protokoll 1 erwähnt, und eine Inkubation mit Erythrozyten-Lysepuffer (siehe Schritte 1.2.7 bis 1.2.10). In Protokoll 1 wurden die Zellen auf einen Percoll-Dichtegradienten von 30%/70% geladen, um einkernige Zellen an der Interphase zu isolieren, was möglicherweise zum Verlust von Zellen von Interesse geführt hat. Daher wurde dieser Schritt, wie in Protokoll Nr. 2 vorgeschlagen, weggelassen.

FSC-A versus SSC-A Gating wurde verwendet, um einkernige Zellen anhand von Größe (FSC) und Granularität (SSC) zu identifizieren (Abbildung 3A). Trümmer wurden ausgeschlossen, indem Ereignisse unter 40 K auf der FSC-A-Achse ignoriert wurden, und 38,8 % ± 3,6 % der Zellen wurden selektiert. FSC-A-Dichtediagramme im Vergleich zur Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) wurden für den Dublettenausschluss verwendet (Abbildung 3B). Nach Selektion der Zellen, die für den Marker für die fixierbare Viabilitätsfärbung negativ waren, wurden durchschnittlich 34,3 % ± 7,7 % der lebenden Zellen erhalten (Abbildung 3C).

Der im Punktdiagramm in Abbildung 3C dargestellte Prozentsatz von 75,4 % entspricht dem Prozentsatz einzelner lebender Zellen, berechnet aus der Elternzellpopulation, in diesem Fall den Einzelzellen. 95,7 % der Einzelzellen stammen aus den Live-Ereignissen, die 35 % der gesamten Ereignisse ausmachen. Daher wird der Prozentsatz von 34,3 %, der im Durchschnitt erzielt wird, aus den Gesamtereignissen und nicht aus den Elternpopulationen berechnet.

Etwa 3% der einzelnen lebenden Zellen waren negativ für Leukozyten- (CD45), Monozyten- (CD11b), Endothel- (CD31) und Erythroid-spezifische (TER119) Marker (Abbildung 3D). CD11b/CD45/CD31/TER119-negative Zellen wurden dann nach ihrer Expression von CD34- (hämatopoetische, endotheliale Vorläuferzellen und mesenchymale Stammzellen) und ITGA7-Marker (Herz-, Glatt- und Skelettmuskelzellen) ausgewählt (Abbildung 3E). Ein abschließendes Gating für CXCR4 (Lymphozyten, hämatopoetische und Satellitenzellen) wurde durchgeführt, um putative Satellitenzellen zu selektieren (Abbildung 3F). Von den CD34+/ITGA7+-Zellen wurden ~80 % als positiv für CXCR4 befunden, was einem Durchschnitt von 1 % ± 0,15 % der gesamten einzelnen lebenden Zellen entspricht, und einer absoluten Anzahl von 60.000 ± 14.000 mutmaßlichen Satellitenzellen pro Mausgliedmaßenmuskeln in 14 unabhängigen Experimenten. Eine zusätzliche Bewertung der CXCR4+-Zellfraktion ergab, dass nach der Nachsortierung etwa 80 % der lebenden Zellen gewonnen wurden, von denen fast 70 % CXCR4+ waren (Abbildung S1), was die hohe Lebensfähigkeit und Reinheit dieser FACS-isolierten Zellpopulation zeigt.

Da verschiedene Studien die Effizienz von Kollagenase- und Liberase TL-Enzymen für die Zellisolierung verglichenhaben 24,25, wurden diese beiden Verdauungsmethoden parallel bearbeitet. Bei 300 μL Liberase TL war die Verdauung weniger effizient als bei Kollagenase, da unverdaute Ballaststoffe zurückblieben. Darüber hinaus wurden mehr Zelltrümmer und große Ereignisse beobachtet (Abbildungen S2A,B), und nur 17,3 % der einzelnen lebenden Zellen wurden im Durchschnitt nach der FVS 780-Selektion erhalten (Abbildung S2C). Ein weiteres Problem bei der Verdau von Liberase war die geringe Anzahl von CD34+/ITGA7+-Zellen im Vergleich zur Kollagenase (Abbildungen S2D-S2E), obwohl das CXCR4-Gating ähnlich war (Abbildung S2F). Mit 600 μl Liberase TL war der Aufschluss effizienter. Die Menge an Zelltrümmern blieb jedoch erhöht und die Zellviabilität unterdurchschnittlich (16,3 %) (Abbildung S3). Daher war der Verdau mit Liberase TL für die Isolierung von Satellitenzellen weniger effizient.

Bei der Aussaat exprimierten mehr als 70 % der CD34+/ITGA7+/CXCR4+-Zellen (Abbildung 4A) PAX7 (Abbildung 4B), im Gegensatz zu CD34+/ITGA7-/CXCR4-Zellen, die PAX7-negativ waren (Abbildung 4C). CD34+/ITGA7+/CXCR4+-Zellen waren in der Lage, sich in Myofasern zu differenzieren, wenn sie 7 weitere Tage lang in einem myogenen Medium gezüchtet wurden, wie die Dystrophin-Färbung (DMD) zeigte (Abbildung 4D), was ihr myogenes Potenzial bestätigt. So zeigten kombinierte Gewebekultur- und Immunfluoreszenzanalysen, dass FACS-isolierte CD34+/ITGA7+/CXCR4+ Zellen Satellitenzellen sind.

Um festzustellen, ob isolierte Satellitenzellen für die CUT&RUN-Analyse geeignet sind, wurde das genomische Profil von acetyliertem Lysin 27 (H3K27ac) und dimethyliertem Lysin 4 (H3K4me2) von Histon H3, zwei Histonmodifikationen, die an aktiven Promotor- und Enhancerregionen gefunden wurden, bestimmt. Unsere Daten zeigten 68.694 bzw. 13.514 Peaks für H3K4me2 und H3K27ac mit einer ähnlichen genomischen Verteilung zwischen den beiden Histonmarkierungen (Abbildung S4A). Im Detail fanden wir heraus, dass ein Viertel der Peaks ± 2 kb von der Transkriptionsstartstelle (TSS) des nächstgelegenen Gens entfernt waren, die Mehrheit entweder -100 kb bis -10 kb oder 10 kb bis 100 kb vom TSS entfernt (Abbildung S4B). Bemerkenswert ist, dass die Pearson-Analyse eine 80%ige Korrelation zwischen den Leseprofilen H3K27ac und H3K4me2 zeigte (Abbildung S4C). Um zu beurteilen, ob das aus dem oben genannten Protokoll hergestellte Chromatin aus Satellitenzellen isoliert wurde, wurde das Vorhandensein von H3K27ac und H3K4me2 am Promotor von satellitenzellspezifischen Genen bestimmt. H3K4me2 war um die TSS von Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 und Vcam1 angereichert (Abbildung 5A), aber nicht um die von Itgam (CD11b) und Ptprc (CD45) (Immunzellen), Pecam (CD31; Endothelzellen) (Abbildung 5B), Ckm (sich entwickelnde Muskelfasern) oder Myh3 (Myosin schwerkettig schnell embryonal, Myofasern) (Abbildung 5C). Ähnliche Ergebnisse wurden mit H3K27ac erzielt (Abbildung 5). Mit der IgG-Probe wurde fast kein Signal erhalten (Abbildung 5). Darüber hinaus zeigte der Vergleich der H3K27ac-Peaks, die von SEACR erhalten wurden, mit denen, die sich aus MACS2-Peak-Aufrufen aus veröffentlichten ChIP-seq-Datensätzen ergaben, eine hohe Korrelation, wie unter jedem Panel (ChIP-Atlas-Track; Abbildung 5). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die nach der bioinformatischen Analyse erhaltenen Messwerte aus dem Chromatin von FACS-isolierten Satellitenzellen stammen und mit denen korrelieren, die zuvor durch ChIP-seq-Analysen identifiziert wurden.

Während Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudien in Maus-Satellitenzellen eine auffällige Stressantwort zeigten, die durch das Isolationsverfahren26 verursacht wurde, wurde das Vorhandensein von H3K4me2 oder H3K27ac an Stressantwortgenen bestimmt, wie z.B. bei Atf3, Azin1, Gls und Elf2. Die Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass die H3K27ac-Markierung nicht am Promotor solcher Gene abgelagert wird und dass die H3K4me2-Spiegel im Vergleich zu denen, die für satellitenzellspezifische Gene erhalten wurden, niedrig bleiben (Abbildung S5). Diese Daten verdeutlichen also, wie mild das Isolationsverfahren ist.

Als nächstes wurde die Eignung unserer Isolationsmethode für Transkriptionsfaktoren untersucht. Die CUT&RUN-Analyse für den Androgenrezeptor (AR), einen Transkriptionsfaktor, der zur Superfamilie der Kernrezeptoren gehört und eine wichtige Rolle bei der myogenen Differenzierung spielt27, entschlüsselte 7.840 Peaks. Diese Peaks befanden sich hauptsächlich in Intron- und intergenen Regionen (Abbildung S4A), entweder -100 kb bis -10 kb oder 10 kb bis 100 kb vom TSS entfernt (Abbildung S4B). Phylogenetische Analysen ergaben, dass AR neben dem Glukokortikoid (GR/Nr3c1), dem Mineralokortikoid (MR/Nr3c2) und dem Progesteron (PR/Nr3c3) Rezeptoren ein Mitglied der Oxosteroid-Kernrezeptoren 28 ist, die als Homodimere an DNA-Abschnitte binden, die aus zwei 5′-RGAACA-3′-palindromischen Halbstellen bestehen, die durch drei Basenpaare getrennt sind 29. Die Suche nach einem bekannten Motiv mittels hypergeometrischer Optimierung der Motivanreicherung (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) ergab, dass AR in >32%, 17% und 2% der Zielregionen an das 5′-RGRNCA-3′ AR Half-Site-Motiv, an das typische 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ Oxosteroid-Motiv (in der Abbildung als PR bezeichnet) und an das 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR-Konsensusmotiv gebunden ist. (Abbildung 6A). Es sollte angemerkt werden, dass ähnliche Anteile zuvor für den Glukokortikoidrezeptor in der Skelettmuskulatur16 erhalten wurden.

Die SEACR-Analyse enthüllte fast 500 Peaks mit einem Spitzenwert von >50, davon mehr als 200 mit einem Wert von >100; einige davon sind in Abbildung 6B beispielhaft dargestellt. Unsere Analyse ergab auch eine bescheidene Anreicherung von AR an den zuvor beschriebenen Bindungsstellen von Genen, die an der Polyaminbiosynthese (Amd1, Hafer und Smox) und an Prostatakrebs (Acox1, Fkbp5 und Tmprss2) beteiligt sind (Abbildung S6). Interessanterweise wurde die AR an den Loci von Genen gefunden, die an der Stammbildung von Satellitenzellen beteiligt sind (Pax7, Cxcr4 und Cd34) (Abbildung S7). Bemerkenswert ist, dass das Oxosteroid-Response-Element in jeder dieser AR-angereicherten Regionen gefunden wurde (Abbildung S6 und Abbildung S7), was zeigt, dass das AR-Signal, das in den CUT&RUN-Daten zu sehen ist, hochspezifisch ist.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls, das für die Isolierung von Satellitenzellen aus den Gliedmaßenmuskeln von Mäusen verwendet wird. Das Protokoll besteht aus vier Hauptschritten. Kurz gesagt, die Mäuse werden geopfert, die Muskeln der Hintergliedmaßen entnommen (Schritte 1.1.1-1.1.3) und mechanisch mit einer Schere zerkleinert (Schritte 1.4-1.5). Es folgen die Schritte 1.2.1-1.2.4, in denen die Muskeln in einem Wasserbad mit Kollagenase und Dispase dissoziiert werden. In den Schritten 1.2.5-1.2.8 wird die Zellsuspension nacheinander durch 100-, 70- und 40-μm-Zellsiebe filtriert und die Erythrozyten werden mit Hilfe von Erythrozyten-Lysepuffer eliminiert (Schritte 1.2.9-1.2.12). Die restlichen Zellpopulationen werden in Schritt 1.3 mit Antikörpern markiert, die an Fluorophore gekoppelt sind, die gegen spezifische zelluläre phänotypische Marker gerichtet sind. Schritt 1.4 umfasst die Proben, die durch FACS geleitet werden, um Satellitenzellen für die weitere Anwendung zu sammeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Durchflusszytometrische Analyse eines ungefärbten Zellpräparats. (A) Auswahl der interessierenden Grundgesamtheit auf der Grundlage von FSC-A- und SSC-A-Parametern. (B) Einzelzellidentifikation auf der Grundlage von FSC-A und FSC-H. (C) Charakterisierung der Autofluoreszenzschwelle von gesammelten Zellen für APC-Cy7, konjugiert mit der fixierbaren Viabilitätsfärbung (FVS 780), die tote Zellen markiert. (D-F). Autofluoreszenzmessung für PE-Cy7 konjugiert mit CD11b-Antikörper und PE-konjugiert mit TER119/CD45/CD31-Markern (D) sowie für Alexa fluor 488 konjugiert mit ITGA7, Alexa fluor 405 konjugiert mit CD34 (E) und APC-Fluorochrom konjugiert mit CXCR4 (F). Tore werden als Black Boxes dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Gating-Strategie des Durchflusszytometers für die Sortierung von Satellitenzellen. (A) Auswahl der interessierenden Grundgesamtheit auf der Grundlage von FSC-A- und SSC-A-Parametern. (B) Einzelzellidentifikation auf der Grundlage von FSC-A und FSC-H. (C) Identifizierung lebender Zellen mit FVS 780. (D) Negative Zellselektion basierend auf CD11b-, CD31-, CD45- und TER119-Antigenen. (E-F) Positive Zellselektion basierend auf CD34 und ITGA7 (E) sowie CXCR4 (F) Antigenen. Tore werden als Black Boxes dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Analyse von FACS-isolierten CD34+/ITGA7+/CXCR4+ und CD34+/ITGA7-/CXCR4- Zellen. (A) Phasenkontrastaufnahmen von CD34+/ITGA7+/CXCR4+ und CD34+/ITGA7-/CXCR4- Zellen, die in Wachstumsmedium kultiviert wurden. (B) Immunfluoreszenzanalyse von CD34+/ITGA7+/CXCR4+ und CD34+/ITGA7-/CXCR4-Zellen, die in Wachstumsmedium unter Verwendung von Antikörpern gegen PAX7 (rot) und Dystrophin (DMD, grün) kultiviert wurden. Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Magenta-Pfeile zeigen PAX7-positive Zellen an. (C) Phasenkontrastaufnahmen von CD34+/ITGA7+/CXCR4+ Zellen, die 5 Tage lang in Wachstumsmedium (linkes Bild) und 7 weitere Tage in myogenem Medium (rechtes Bild) gezüchtet wurden. (D) Immunfluoreszenz-Analysebilder von CD34+/ITGA7+/CXCR4+-Zellen, die 5 Tage lang in Wachstumsmedium (linkes Bild) und für weitere 7 Tage in myogenem Medium (rechtes Bild) unter Verwendung von Antikörpern gegen PAX7 (rot) und Dystrophin (DMD, grün) gezüchtet wurden. Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Magenta-Pfeile zeigen PAX7-positive Zellen an. Grüne Pfeile zeigen DMD-positive Zellen an. Maßstabsleisten: Hellfeld-Panels = 25 μm; Immunfluoreszenz-Panels = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Genomische Profile des Chromatins von Satellitenzellen. Lokalisierung von H3K4me2 und H3K27ac an satellitenzellspezifischen Genen (A), immun- und endothelzellspezifischen Genen (B) und myofaserspezifischen Genen (C) auf dem Chromatin von Satellitenzellen mittels CUT&RUN. Aktive Promotoren sind grün umrandet, während inaktive Promotoren braun umrandet sind. CUT&RUN mit IgG wurde als Negativkontrolle verwendet. Die H3K27ac-Anreicherungsanalyse für Histonmarkierungen wird unter jeder Spur dargestellt. Der Anreicherungswert, der das Konfidenzniveau der veröffentlichten Datensätze anzeigt, wird als Heatmap dargestellt. Braune Sterne (*) beziehen sich auf H3K27ac ChIP-seq-Peaks, die in Muskelsatellitenzellen durchgeführt werden, blaue Sterne auf H3K4me3 und die rosafarbenen auf H4K16me1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: AR-Genomverteilung auf dem Chromatin von Satellitenzellen. (A) HOMER-Analyse bekannter Motive von AR-Peaks in Satellitenzellen. PR: Progesteronrezeptor. Das Nb-Ziel bezieht sich auf die Anzahl der Peaks, die ein bestimmtes Motiv darstellen. (B) Lokalisation von H3K4me2 und AR an indizierten Genen auf dem Chromatin von Satellitenzellen, bestimmt durch CUT&RUN. CUT&RUN mit IgG wurde als Negativkontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Liste der Materialien, Reagenzien und Software. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Zusammensetzung der Puffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Antikörperreferenzen und -konzentrationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Durchflusszytometrische Analyse der Zellvorbereitung nach der Sortierung. (A) Auswahl der interessierenden Grundgesamtheit auf der Grundlage von FSC-A- und SSC-A-Parametern. (B) Einzelzellidentifikation auf der Grundlage von FSC-A und FSC-H. (C) Identifizierung lebender Zellen mit fixierbarer Viabilitätsfärbung (FVS 780). (D) Negative Zellselektion basierend auf CD11b-, CD31-, CD45- und TER119-Antigenen. (E-F) Positive Zellselektion basierend auf CD34 und ITGA7 (E) sowie CXCR4 (F) Antigenen. Tore werden als Black Boxes dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Durchflusszytometer-Gating-Strategie für die Sortierung von Satellitenzellen nach dem Aufschluss mit 300 μl Liberase TL. (A) Auswahl der interessierenden Grundgesamtheit auf der Grundlage von FSC-A- und SSC-A-Parametern. (B) Einzelzellidentifikation auf der Grundlage von FSC-A und FSC-H. (C) Identifizierung lebender Zellen mit FVS 780. (D) Negative Zellselektion basierend auf CD11b-, CD31-, CD45- und TER119-Antigenen. (E-F) Positive Zellselektion basierend auf CD34 und ITGA7 (E) sowie CXCR4 (F) Antigenen. Tore werden als Black Boxes dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Durchflusszytometer-Gating-Strategie für die Sortierung von Satellitenzellen nach dem Aufschluss mit 600 μl Liberase TL. (A) Auswahl der interessierenden Grundgesamtheit auf der Grundlage von FSC-A- und SSC-A-Parametern. (B) Einzelzellidentifikation auf der Grundlage von FSC-A und FSC-H. (C) Identifizierung lebender Zellen mit FVS 780. (D) Negative Zellselektion basierend auf CD11b-, CD31-, CD45- und TER119-Antigenen. (E-F) Positive Zellselektion basierend auf CD34 und ITGA7 (E) sowie CXCR4 (F) Antigenen. Tore werden als Black Boxes dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Charakterisierung der genomischen Positionen von H3K4me2, H3K27ac und AR. (A) Tortendiagramme, die die Spitzenverteilung von H3K4me2, H3K27ac und AR nach Genommerkmalen in Satellitenzellen darstellen. (B) Tortendiagramme, die die Spitzenverteilung von H3K4me2, H3K27ac und AR in Abhängigkeit von ihrer Entfernung zum nächstgelegenen TSS in Satellitenzellen darstellen. (C) Heatmap, die die Pearson-Korrelation zwischen H3K4me2, H3K27ac und IgG-Kontrolle zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Genomische Profile des Satellitenzellchromatins an Stressantwort-induzierten Genen. Lokalisation von H3K4me2 und H3K27ac an indizierten Genen auf dem Chromatin von Satellitenzellen. Die Immunpräzipitation mit IgG wurde als Negativkontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Genomische Profile des Satellitenzellchromatins an bekannten AR-Zielgenen. Lokalisierung von H3K4me2, H3K27ac und AR an indizierten Genen auf dem Chromatin von Satellitenzellen, bestimmt durch CUT&RUN. AR-Peaks sind blau umrandet, und die entsprechenden AR-responsiven Elemente sind unten dargestellt. CUT&RUN mit IgG wurde als Negativkontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Genomische Profile des Chromatins von Satellitenzellen an ihren selektiv exprimierten Genen. Lokalisierung von H3K4me2, H3K27ac und AR an indizierten Genen auf dem Chromatin von Satellitenzellen, bestimmt durch CUT&RUN. AR-Peaks sind blau umrandet, und die entsprechenden AR-responsiven Elemente sind unten dargestellt. CUT&RUN mit IgG wurde als Negativkontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die vorliegende Studie berichtet über eine standardisierte, zuverlässige und einfach durchzuführende Methode zur Isolierung und Kultivierung von Maus-Satellitenzellen sowie zur Beurteilung der Transkriptionsregulation durch die CUT&RUN-Methode.

Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Die erste ist der Muskelaufschluss und die Verdauung von Ballaststoffen, um eine hohe Anzahl gesammelter Zellen zu gewährleisten. Trotz der erhöhten Enzymkonzentration wurden mehr lebende Zellen gewonnen als mit Protokoll 1. Satellitenzellen exprimieren ein spezifisches Muster verschiedener Membranproteine. Um die Stringenz unserer Sortierung zu erhöhen, verwendeten wir eine Kombination aus zuvor beschriebenen negativen (CD31, TER119, CD45 und CD11b) und positiven (CD34, ITGA7 und CXCR4) Satellitenzellmarkern30,31. Mit dieser Strategie wurde durchschnittlich 1% der lebenden mutmaßlichen Satellitenzellen gewonnen. Dieses Ergebnis liegt im Bereich dessen, was erwartet wurde, da Satellitenzellen 2%-7% der Muskelzellpopulation im Erwachsenenalter bei Mäusen ausmachen32. Als Kontrolle für die Marker für die Satellitenzellauswahl wurden CD34+/ITGA7-/CXCR4-Zellen isoliert. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass, während CD34+/ITGA7-/CXCR4-Zellen PAX7 nicht exprimierten, 70% der CD34+/ITGA7+/CXCR4+-sortierten Zellen positiv für diesen satellitenzellspezifischen Marker waren, was zeigt, dass die isolierte FACS-Population Satellitenzellen entspricht. Darüber hinaus waren 70% der Satellitenzellen, die 7 Tage lang in myogenem Medium gezüchtet wurden, PAX7-/DMD+, wie durch Immunfärbung gezeigt wurde, und bildeten eine längliche, mehrkernige Myofaser, was zeigt, dass isolierte Satellitenzellen ihr Stammzellpotenzial konservierten.

Die größte Einschränkung bei der Probenvorbereitung könnte die Verwendung einer hohen Konzentration von Enzymen sein, die zu einer großen Menge an dissoziiertem biologischem Material führt, aber zu einem erhöhten Zelltod beitragen kann. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein Assay getestet, der eine geringere Enzymmenge erfordert. In diesem Zusammenhang wurde Liberase TL, eine gereinigte Form der traditionellen Kollagenase33, getestet. Obwohl die Verdauung mit diesem Enzym offenbar effizienter war, blieb die Menge an Zelltrümmern erhöht und die Lebensfähigkeit der Zellen war leicht verringert. Diese Beobachtungen stimmen mit früheren Berichten überein, in denen die Liberase-vermittelte Gewebeverdauung mit der rekombinanten Kollagenase oder der benutzerdefinierten Kollagenase verglichenwurde 24,25. Obwohl das Verhältnis von Endothel- und Immunzellen zwischen Kollagenase und Lilase-Verdauung ähnlich war, war der Prozentsatz der Satellitenzellen in der Liberase-verarbeiteten Probe geringer, was insgesamt zeigt, dass Liberase nicht für die Isolierung von Satellitenzellen empfohlen wird. Die Verwendung dieses Enzyms eignet sich für die phänotypische und quantitative Analyse von Immunzellen und könnte möglicherweise im Zusammenhang mit Muskeln und/oder anderen Geweben empfohlen werden. Dies steht im Einklang mit dem, was über Liberase TL berichtet wurde, das am besten geeignet ist, lebensfähige Immunzellen effektiv zu isolieren34,35,36.

Ein weiteres potenzielles Problem ist der Stress, der sowohl durch die Dissoziation als auch durch die Sortierung von Satellitenzellen verursacht wird. Das Fehlen von H3K27ac und die niedrigen H3K4me2-Spiegel in der Promotorregion von Stressantwortgenen, die durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung in Maussatellitenzellen identifiziert wurden26, zeigen jedoch, dass das Verfahren mild genug ist, um das transkriptionelle Repertoire der Stressantwort nicht zu induzieren. Weitere Einschränkungen, die zu beachten sind, sind die ausgewählten Antigene, die empirisch bleiben. Studien zeigen jedoch eine hohe Überlappung zwischen einzigartigen Oberflächenmarker-Kombinationen, die für Skelettmuskel-Satellitenzellen angereichert sind30,31.

Ein weiterer kritischer Schritt ist die Aufreinigung von Zellkernen aus sortierten Zellen. Dazu wird die Sortiergeschwindigkeit niedrig gehalten, um die Zellen nicht zu beschädigen, aber schnell genug, dass sie nicht zu lange im FACS-Puffer gelagert werden. In der Tat sind CUT&RUN-Kerne nicht fixiert, und eine längere Inkubationszeit kann den aus dem Protokoll gewonnenen Lesewert beeinflussen. Ein typisches Präparat aus den beiden Hintergliedmaßen einer Maus ermöglicht CUT&RUN mit einem Antikörper und einer IgG-Kontrolle mit einer Menge von jeweils 2,5 ng Chromatin.

CUT&RUN-Experimente, die zur Beurteilung der Transkriptionsfaktorbindung und epigenetischer Modifikationen entwickelt wurden, lieferten starke und robuste Lesesignale für H3K4me2 und H3K27ac. Die hohen Konzentrationen von H3K4me2 und H3K27ac auf Genen, von denen bekannt ist, dass sie in Satellitenzellen exprimiert werden, im Vergleich zu Genen, die in Immun- oder Endothelzellen sowie in Myofasern exprimiert werden, zeigten, dass das Signal hauptsächlich aus den Kernen der Satellitenzellen verstärkt wurde. Darüber hinaus ermöglichte dieses Protokoll die Identifizierung des Cirstroms des AR in Muskelstammzellen, was bis heute ein technisches Problem ist, das mit der schlechten Qualität der AR-Antikörper der Maus und den niedrigen AR-Expressionsniveaus in nicht hochgradig androgensensitiven Zellen, wie z. B. epithelialen Prostatazellen, zusammenhängt. Die hier vorgestellten Daten zeigten AR-gebundene Regionen mit hohen Konfidenz-Spitzenwerten. Da ursprünglich nur ein Replikat pro Antikörper untersucht wurde, wird die Robustheit unserer Datensätze verbessert, indem mindestens zwei zusätzliche biologische Replikate pro Bedingung hinzugefügt werden. Bekannte AR-Zielgene und entsprechende Histonmarkierungen, die ursprünglich als hochexprimiert und/oder in anderen Gewebekontexten wie der Prostata leicht nachweisbar beschrieben wurden, weisen jedoch niedrigere Expressionsniveaus auf und sind in Satellitenzellen sehr schwierig zu detektieren.

Eine Einschränkung des CUT&RUN-Ansatzes besteht darin, dass er in nicht fixierten Zellen durchgeführt wird. Daher könnten wir einige AR-Ziele aufgrund der labilen Natur der Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und ihrer Bindungsstelle übersehen haben. In ähnlicher Weise können auch einige posttranslationale Modifikationen, wie z. B. die Acetylierung, ziemlich labil sein. Daher könnte ein leichter Fixierungsschritt mit Formaldehyd oder Paraformaldehyd nach der FACS-Sortierung und vor der Isolierung der Kerne in Betracht gezogen werden, um die Protein/DNA-Wechselwirkungen und Histonmodifikationen zu stabilisieren.

Obwohl diese Arbeit zeigt, dass CUT&RUN-Assays an FACS-isolierten Satellitenzellen durchgeführt werden können, können auch andere Analysen durchgeführt werden, die nicht-fixiertes Chromatin wie ATAC-seq verwenden. Obwohl hier Muskeln unter basalen physiologischen Bedingungen entnommen wurden, kann dieses Protokoll auf pathologische Kontexte wie Verletzungen oder Alterung angewendet werden. All diese Protokollanwendungen werden ein detailliertes Verständnis der genregulatorischen Mechanismen in Satellitenzellen ermöglichen und helfen zu verstehen, wie diese Mechanismen durch pathophysiologische Bedingungen verändert werden könnten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses kostengünstige und zeiteffiziente Protokoll eine effektive experimentelle Umgebung bietet, um die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und die Chromatinlandschaft in Skelettmuskel-Vorläuferzellen zu untersuchen. Das mit diesem Protokoll hergestellte Chromatin hat die erste genomweite Analyse von AR-Cistrome in Satellitenzellen ermöglicht und wird zukünftige Studien zur Genregulation erleichtern.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Wir danken Anastasia Bannwarth für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken dem IGBMC-Tierstall, der Zellkultur, dem Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankreich), der Bildgebung, der Elektronenmikroskopie, der Durchflusszytometrie und der GenomEast-Plattform, einem Mitglied des "France Génomique"-Konsortiums (ANR-10-INBS-0009).

Diese Arbeit des Interdisziplinären Thematischen Instituts IMCBio im Rahmen des ITI-Programms 2021-2028 der Universität Straßburg, CNRS und Inserm wurde von IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) und vom Projekt SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) und EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) im Rahmen des französischen Programms "Investitionen in die Zukunft" unterstützt. Weitere Mittel wurden von INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), dem AFM-Téléthon Strategic Program 24376 (an D.D.), INSERM Young Researcher Grant (an D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT und einem französischen Staatsfonds bereitgestellt, der von der ANR im Rahmen des Rahmenprogramms Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02) verwaltet wird. J.R. wurde durch das Programm CDFA-07-22 der Université franco-allemande und des Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation und K.G. durch die Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

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References

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CUT&RUN-Analyse FACS-isolierte Maus-Satellitenzellen Stammzellfeld kleine Zellpopulationen effizientes Protokoll Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung Gliedmaßenmuskel Strukturproteine Hacking Medium Dispase Typ-I-Kollagenase Zellsiebe FACS-Puffer Viabilitätsfärbung immungefärbte Satellitenzellen Triton X-100 Concanavalin A-Magnetkügelchen Transkriptionsfaktor Histonmodifikationen Protein-A-Mikrokokken-Nuklease Chromatinspaltung CaCl2 DNA-Extraktion Bibliotheken Bioinformatische Analyse
Ein effizientes Protokoll für die CUT&amp;RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen
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Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

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