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Developmental Biology

FACS-पृथक माउस उपग्रह कोशिकाओं के CUT &RUN विश्लेषण के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत माउस अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल है जो लक्ष्य के तहत दरार द्वारा मांसपेशी फाइबर में प्रतिलेखन विनियमन के अध्ययन के लिए अनुकूलित है और न्यूक्लियस (कट एंड रन) का उपयोग करके रिलीज करता है।

Abstract

छोटे सेल आबादी के साथ जीनोम-व्यापक विश्लेषण अध्ययन के लिए एक प्रमुख बाधा है, खासकर स्टेम सेल क्षेत्र में। यह काम अंग की मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, संरचनात्मक प्रोटीन की उच्च सामग्री वाला ऊतक। वयस्क चूहों से विच्छेदित अंग की मांसपेशियों को यांत्रिक रूप से डिस्पैस और टाइप 1 कोलेजनेस के साथ पूरक माध्यम में घुमाकर बाधित किया गया था। पाचन पर, होमोजेनेट को सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था, और कोशिकाओं को एफएसीएस बफर में निलंबित कर दिया गया था। व्यवहार्यता को ठीक करने योग्य व्यवहार्यता दाग के साथ निर्धारित किया गया था, और इम्यूनोस्टेन्ड उपग्रह कोशिकाओं को एफएसीएस द्वारा अलग किया गया था। कोशिकाओं को ट्राइटन एक्स -100 के साथ जोड़ा गया था और जारी नाभिक को कोनकानावेलिन ए चुंबकीय मोतियों से बांधा गया था। न्यूक्लियस /बीड कॉम्प्लेक्स को प्रतिलेखन कारक या रुचि के हिस्टोन संशोधनों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। धोने के बाद, न्यूक्लियस / बीड कॉम्प्लेक्स को प्रोटीन ए-माइक्रोकोकल न्यूक्लियस के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और क्रोमैटिन क्लीवेज को सीएसीएल2 के साथ शुरू किया गया था। डीएनए निष्कर्षण के बाद, पुस्तकालयों को उत्पन्न और अनुक्रमित किया गया था, और जीनोम-वाइड ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बाइंडिंग और सहसंयोजक हिस्टोन संशोधनों के लिए प्रोफाइल जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण द्वारा प्राप्त किए गए थे। विभिन्न हिस्टोन चिह्नों के लिए प्राप्त चोटियों से पता चला कि बाध्यकारी घटनाएं उपग्रह कोशिकाओं के लिए विशिष्ट थीं। इसके अलावा, ज्ञात आकृति विश्लेषण ने खुलासा किया कि प्रतिलेखन कारक अपने आत्मीय प्रतिक्रिया तत्व के माध्यम से क्रोमैटिन से बंधा था। इसलिए यह प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं में जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित है।

Introduction

कंकाल धारीदार मांसपेशियां कुलमानव शरीर के वजन का औसतन 40% प्रतिनिधित्व करती हैं। मांसपेशी फाइबर चोट पर पुनर्जनन के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जिसे नवगठित मायोसाइट्स के संलयन और नए मायोफाइबर की पीढ़ी द्वारा वर्णित किया जाता है जोक्षतिग्रस्त लोगों को प्रतिस्थापित करते हैं2। 1961 में, अलेक्जेंडर माउरो ने मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की आबादी की सूचना दी जिसे उन्होंने उपग्रह कोशिका3 कहा। ये स्टेम सेल प्रतिलेखन कारक युग्मित बॉक्स 7 (पैक्स 7) को व्यक्त करते हैं, और बेसल लैमिना और मांसपेशी फाइबर4 के सरकोलेममा के बीच स्थित होते हैं। उन्हें भेदभाव 34 (सीडी 34; एक हेमटोपोइएटिक, एंडोथेलियल पूर्वज और मेसेनकाइमल स्टेम सेल मार्कर), इंटीग्रिन अल्फा 7 (आईटीजीए 7; एक चिकनी, हृदय और कंकाल की मांसपेशी मार्कर), साथ ही सी-एक्स-सी केमोकाइन रिसेप्टर टाइप 4 (सीएक्ससीआर 4; एक लिम्फोसाइट, हेमटोपोइएटिक और सैटेलाइट सेल मार्कर) के क्लस्टर को व्यक्त करने की सूचना दी गई थी। बेसल स्थितियों में, उपग्रह कोशिकाएं एक विशेष माइक्रोएन्वायरमेंट में रहती हैं जो उन्हें एकस्थिर अवस्था में रखती हैं। मांसपेशियों की क्षति पर, वे सक्रिय हो जाते हैं, प्रसार करते हैं, और मायोजेनेसिस7 से गुजरते हैं। हालांकि, मांसपेशियों की कोशिकाओं की कुल संख्या के केवल एक मामूली अंश में योगदान करते हुए, उनके जीनोम-व्यापी विश्लेषण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, खासकर शारीरिक सेटिंग्स (कुल कोशिकाओं का <1%) के तहत।

उपग्रह कोशिकाओं से क्रोमैटिन अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसमें क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन शामिल है, जिसके बाद बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण (CHIP-seq) या लक्ष्य और टैगेशन (CUT &tag) प्रयोगों के तहत दरार शामिल है। फिर भी, ये दो तकनीकें कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं प्रस्तुत करती हैं जो निर्विवाद रहती हैं। दरअसल, CHIP-seq को पर्याप्त क्रोमैटिन उत्पन्न करने के लिए उच्च मात्रा में प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता होती है, जिसका एक बड़ा हिस्सा सोनिकेशन चरण के दौरान खो जाता है। कट एंड टैग कम सेल संख्या के लिए अधिक उपयुक्त है, लेकिन टीएन 5 ट्रांसपोसेस गतिविधि के कारण सीएचआईपी-सेक की तुलना में अधिक ऑफ-टारगेट क्लीवेज साइट्स उत्पन्न करता है। इसके अलावा, चूंकि इस एंजाइम में ओपन-क्रोमैटिन क्षेत्रों के लिए एक उच्च संबंध है, इसलिए सीयूटी एंड टैग दृष्टिकोण का उपयोग हेटेरोक्रोमैटिन 8,9 के बजाय जीनोम के सक्रिय रूप से स्थानांतरित क्षेत्रों से जुड़े हिस्टोन संशोधनों या प्रतिलेखन कारकों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो एफएसीएस द्वारा माउस अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है ताकि लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लियस (कट एंड रन) 10,11 विश्लेषण का उपयोग करके रिलीज किया जा सके। विभिन्न चरणों में ऊतक, सेल सॉर्टिंग और नाभिक अलगाव के यांत्रिक व्यवधान शामिल हैं। एक व्यवहार्य सेल निलंबन की तैयारी के संबंध में विधि की दक्षता, सहसंयोजक हिस्टोन संशोधनों और प्रतिलेखन कारकों के लिए कट एंड रन विश्लेषण करके प्रदर्शित की गई थी। पृथक कोशिकाओं की गुणवत्ता वर्णित विधि को क्रोमैटिन तैयार करने के लिए विशेष रूप से आकर्षक बनाती है जो मूल जीनोमिक अधिभोग स्थिति को ईमानदारी से पकड़ती है, और विशिष्ट लोकी (4 सी-सेक) या जीनोम-वाइड स्तरों (एचआई-सी) पर उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ संयोजन में गुणसूत्र रचना को पकड़ने के लिए उपयुक्त होने की संभावना है।

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Protocol

चूहों को राष्ट्रीय पशु देखभाल दिशानिर्देशों (यूरोपीय आयोग के निर्देश 86/609 / सीईई) के अनुपालन में एक मान्यता प्राप्त पशु घर में रखा गया था; अनुसंधान के लिए प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग पर फ्रांसीसी डिक्री संख्या 87-848)। एपीएएफआईएस संख्या # 22281 के तहत 2010/63 / यूरोपीय संघ के निर्देश के अनुसार नैतिक मूल्यांकन और प्राधिकरण के लिए नैतिक समिति (कॉम'एथ, स्ट्रासबर्ग, फ्रांस) और फ्रांसीसी अनुसंधान मंत्रालय (एमईएसआर) को इच्छित जोड़तोड़ प्रस्तुत किए गए थे।

1. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव के लिए सेल निलंबन की तैयारी (चित्रा 1)।

  1. मांसपेशियों के ऊतकों का अलगाव
    1. एक सफाई एजेंट (तालिका 1) का उपयोग करके मांसपेशियों के विच्छेदन के लिए उपकरणों को डिकॉन्टैमिनेट करें, जिसमें फोर्स, स्केलपेल और कैंची शामिल हैं, और आसुत पानी से अच्छी तरह से कुल्ला करें।
    2. दो 2 एमएल ट्यूब (तालिका 1) तैयार करें, जिनमें से प्रत्येक में 1 एमएल मांसपेशी अलगाव बफर होता है, और उन्हें कटी हुई मांसपेशियों को इकट्ठा करने के लिए बर्फ पर रखें।
    3. 10 सप्ताह के दो सी57/बीएल6जे नर चूहों को सीओ2 श्वासावरोध के कारण बलि दी गई। प्रत्येक पूरे माउस पर 70% इथेनॉल स्प्रे करें। बल का उपयोग करके पिछले अंग से त्वचा को छील दें। फीमर, टिबिया और फाइबुला (प्रति माउस लगभग 1 मिलीग्राम मांसपेशियों) के आसपास की सभी अंग की मांसपेशियों को विच्छेदित करें।
      नोट: 15 सप्ताह की उम्र के बाद उपग्रह कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है।
    4. कटे हुए अंग की मांसपेशियों को 2 एमएल ट्यूबों में रखें जिसमें चरण 1.1.2 में तैयार मांसपेशी अलगाव बफर के 1 एमएल होते हैं। उसी प्रक्रिया का पालन करते हुए दूसरे माउस से मांसपेशियों को इकट्ठा करें। कटी हुई मांसपेशियों को बर्फ पर कैंची से तब तक रगड़ें जब तक कि 1 मिमी3 टुकड़े से छोटे न हो जाएं।
      नोट: मांसपेशियों को मुख्य रूप से वर्णित12 के रूप में एकत्र और कीमा किया गया था। चरण 1.2 या 1.3 का पालन करते हुए ऊतक पाचन करें।
  2. कोलेजनेस एंजाइम के साथ ऊतक पाचन
    1. दो चूहों से कीमा मांसपेशी निलंबन को 50 एमएल ट्यूब (तालिका 1) में डालकर स्थानांतरित करें, जिसमें 18 एमएल मांसपेशी अलगाव बफर (5 एमएल [5 यू / एमएल] डिस्पेस के साथ पूरक और 5 मिलीग्राम टाइप 1 कोलेजनेज़ के साथ पूरक) (तालिका 1)।
    2. ट्यूब को कसकर बंद करें और इसे प्रयोगशाला फिल्म (तालिका 1) के साथ सील करें। इसे 30 मिनट के लिए 100 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलते पानी के स्नान (तालिका 1) में क्षैतिज रूप से रखें।
    3. 30 मिनट के बाद, टाइप 1 कोलेजनेस के 5 मिलीग्राम जोड़ें। 100 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलते पानी के स्नान में आंदोलन के तहत 30 मिनट के लिए ट्यूबों को रखें।
    4. पाचन पर, विघटन की दक्षता में सुधार करने के लिए 10 एमएल पिपेट के साथ मांसपेशियों के निलंबन को 10 बार ऊपर और नीचे करें। 5 मिनट के लिए 400 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज। ट्यूब के निचले भाग में एक स्पष्ट गोली दिखाई देगी। ट्यूब में 5 एमएल मध्यम छोड़कर, 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
      नोट: माध्यम छोड़ने से कोशिकाओं को तनाव से बचने में मदद मिलती है। ताजा मांसपेशी अलगाव बफर के 10 एमएल जोड़ें और 10 एमएल पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके गोली को फिर से निलंबित करें।
    5. खुले 50 एमएल ट्यूबों पर 100 μm, 70 μm, और 40 μm सेल स्ट्रेनर्स (प्रत्येक प्रकार का एक) (तालिका 1) रखें। निलंबन को क्रमिक सेल स्ट्रेनर्स (100 μm, 70 μm, 40 μm) पर पिपेट करें और प्रवाह को 50 mL ट्यूबों में इकट्ठा करें, जिसमें 40 μm से नीचे की कोशिकाएं हों।
    6. 5 मिनट के लिए 400 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को 2 एमएल रहने तक छोड़ दें, और फिर 0.2-1 एमएल पिपेट का उपयोग करें जब तक कि 100-200 μL न रह जाए। लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 2 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें (तालिका 2)। 3 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    7. 5 मिनट के लिए 400 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और 20-200 μL पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें। ठंडे FACS बफर के 100 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें (तालिका 2)। बर्फ पर रखें।
  3. लिबेरेस थर्मोलिसिन कम (टीएल) एंजाइम के साथ ऊतक पाचन के लिए वैकल्पिक विधि
    1. चरण 1.1 में दिए गए विवरणों का पालन करें। ऊतक अलगाव के लिए।
    2. लिबरेज-मध्यस्थता ऊतक विघटन के लिए, चरण 1.1.2 में वर्णित मांसपेशी अलगाव बफर के बजाय रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) अलगाव बफर (तालिका 2) के 2 एमएल में मांसपेशियों की कटाई करें।
    3. दोनों चूहों से कीमा मांसपेशी निलंबन को 50 एमएल ट्यूब (तालिका 1) में डालकर स्थानांतरित करें, जिसमें 18 एमएल आरपीएमआई आइसोलेशन बफर होता है, जो 5 मिलीग्राम / एमएल (तालिका 1) (यानी, 0.083 मिलीग्राम / एमएल और 0.167 मिलीग्राम / एमएल अंतिम सांद्रता) पर लिबेरेस टीएल के 300 या 600 μ एल के साथ पूरक होता है।
    4. ट्यूब को कसकर बंद करें और इसे प्रयोगशाला फिल्म (तालिका 1) के साथ सील करें। इसे 30 मिनट के लिए 100 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलते पानी के स्नान (तालिका 1) में क्षैतिज रूप से रखें।
    5. पाचन पर, पिपेट को 10 एमएल पिपेट के साथ 10 बार ऊपर और नीचे करें ताकि विघटन की दक्षता में सुधार हो सके।
    6. 5 मिनट के लिए 400 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज। ट्यूब के निचले भाग में एक स्पष्ट गोली दिखाई देगी। ट्यूब में 5 एमएल मध्यम छोड़कर, 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें। माध्यम छोड़ने से कोशिकाओं को तनाव से बचने में मदद मिलती है। ताजा आरपीएमआई आइसोलेशन बफर के 10 एमएल जोड़ें, और 10 एमएल पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके गोली को फिर से निलंबित करें।
    7. खुले 50 एमएल ट्यूबों पर 100 μm, 70 μm, और 40 μm सेल स्ट्रेनर्स (प्रत्येक प्रकार का एक) (तालिका 1) रखें।
    8. निलंबन को क्रमिक सेल स्ट्रेनर्स (100 μm, 70 μm, 40 μm) पर पिपेट करें और प्रवाह को 50 mL ट्यूबों में इकट्ठा करें, जिसमें 40 μm से नीचे की कोशिकाएं हों।
    9. 5 मिनट के लिए 400 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को 2 एमएल रहने तक छोड़ दें, और फिर 0.2-1 एमएल पिपेट का उपयोग करें जब तक कि 100-200 μL न रह जाए।
    10. लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 2 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें (तालिका 2)। 3 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    11. 5 मिनट के लिए 400 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और 20-200 μL पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    12. ठंडे FACS बफर के 100 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें (तालिका 2)। बर्फ पर रखें।
  4. एफएसीएस अलगाव के लिए सेल निलंबन की तैयारी
    1. चरण 1.2.12 में प्राप्त सेल निलंबन के 10 μL को एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। यह नमूना बिना दाग वाले नियंत्रण या नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 2) का गठन करेगा। एफएसीएस बफर के 190 μL जोड़ें, 5 एमएल ट्यूब (तालिका 1) में स्थानांतरित करें, और बर्फ पर स्टोर करें।
    2. चरण 1.2.12 में 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन के शेष 90 μL को सेंट्रीफ्यूज करें और एक पिपेट (20-200 μL टिप वॉल्यूम) का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए सीरम-मुक्त डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में पतला 400 μL फिक्सेबल व्यवहार्यता दाग (तालिका 3) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. 5 मिनट के लिए 400 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को धोएं और एफएसीएस बफर के 100 μL जोड़ें। धीरे से ट्यूबों को तीन बार उलटा करें और 5 मिनट के लिए 400 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सेंट्रीफ्यूजेशन समय के दौरान, फ्लोरोफोरेस के साथ युग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के मास्टर मिश्रण के 100 μL तैयार करें और CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 और CXCR4 (तालिका 3) के खिलाफ निर्देशित करें, जो FACS बफर में पतला है।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज, पिपेट (20-200 μL टिप वॉल्यूम) का उपयोग करके सेल सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और 100 μL एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें। धीरे से ट्यूब को तीन बार घुमाएं। भंवर मत करो। 30 मिनट के लिए बर्फ पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज। 20-200 μL पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और कोशिकाओं को धोने के लिए 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 500 μL जोड़ें। धीरे से ट्यूब को तीन बार घुमाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें और 20-200 μL पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    7. एफएसीएस बफर के 500 μL में सेल गोली को पुन: निलंबित करें और निलंबन को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: लिबेरेस पाचन से प्राप्त सेल निलंबन उसी तरह से संसाधित होता है।
  5. एफएसीएस द्वारा उपग्रह कोशिकाओं का चयन
    1. संक्षेप में सेल सस्पेंशन (2-5 सेकंड) को भंवर करें और 100 μm नोजल से लैस फ्लो साइटोमीटर पर कोशिकाओं को संसाधित करें (तालिका 1)।
    2. चरण 1.4.1 (चित्रा 2) पर संग्रहीत बिना दाग वाले नमूने के आधार पर विभिन्न गेट आकार निर्धारित करें।
    3. सेल संग्रह में सुधार करने और एफएसीएस बफर के 500 μL जोड़ने के लिए शुद्ध भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के 1 मिलीलीटर के साथ 5 एमएल ट्यूब कोट करें।
    4. एंटीबॉडी-लेबल वाले नमूने के साथ बिना दाग वाले नमूने का आदान-प्रदान करें।
    5. फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) और साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) (चित्रा 3 ए) के अनुसार रुचि की आबादी का चयन करें, और एफएससी-ए और फॉरवर्ड स्कैटर ऊंचाई (एफएससी-एच) (चित्रा 3 बी)14 के साथ डबल सेल को हटा दें।
    6. स्थिर व्यवहार्यता दाग नकारात्मक धुंधलापन के साथ जीवित कोशिकाओं की पहचान करें (चित्रा 3 सी)।
    7. CD31, CD45, TER119, और CD11b (चित्रा 3D) के लिए ऋणात्मक कक्षों का चयन करें.
    8. उपग्रह कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, पहले उन कोशिकाओं का चयन करें जो CD34 और ITGA7 (चित्रा 3E) के लिए सकारात्मक हैं, और फिर CD34- और ITGA7-चयनित जनसंख्या (चित्रा 3F) पर CXCR4-सकारात्मक कोशिकाओं का चयन करें।
    9. चयनित कोशिकाओं (तैयारी की गुणवत्ता के अनुसार 40,000 और 80,000 कोशिकाओं के बीच) को 500 एमएल लेपित ट्यूब में एकत्र करें जिसमें एफएसीएस बफर के 500 μL होते हैं।

2. ऊतक संवर्धन में पृथक आबादी का सत्यापन

  1. हाइड्रोजेल के साथ स्लाइड कोटिंग
    1. एफ12 माध्यम के 12 एमएल में एक शुद्ध हाइड्रोगेल मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) योग्य मैट्रिक्स (तालिका 1) के 280 μL को पतला करें।
    2. हाइड्रोगेल समाधान के साथ एक चैंबर स्लाइड (तालिका 1) कोट करें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    3. अगले दिन, सेल सीडिंग से पहले 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर चैंबर स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
  2. कोशिका वृद्धि और भेदभाव
    1. चरण 1.5.9 से प्राप्त लगभग 20,000 कोशिकाओं को प्रति कुएं प्लेट करें, और उन्हें 5 दिनों के लिए विकास माध्यम (तालिका 2) में विकसित करें। तैयारी की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए उन्हें संसाधित करने से पहले ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके चरण-कंट्रास्ट छवियां लें (चित्रा 4 बी)।
    2. मायोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, अतिरिक्त 7 दिनों के लिए मायोजेनिक माध्यम (तालिका 2) में चरण 2.2.1 से प्रवर्धित उपग्रह कोशिकाओं को विकसित करें। तैयारी की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए उन्हें संसाधित करने से पहले ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप (चित्रा 4 सी) का उपयोग करके चरण-कंट्रास्ट छवियां लें (चित्रा 4 डी)।
  3. इम्यूनोसाइटोफ्लोरेसेंस विश्लेषण।
    1. धीरे से माध्यम को हटा दें, कक्ष स्लाइड पर संवर्धित कोशिकाओं को 1x PBS के 100 μL के साथ दो बार धो लें, और उन्हें 1 घंटे के लिए RT पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) के 100 μL के साथ ठीक करें।
      नोट: यह कदम सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। कोशिकाओं को तनाव देने से रोकने के लिए माध्यम की एक छोटी मात्रा हमेशा कक्ष में रखी जानी चाहिए, और पीबीएस को कक्ष की दीवारों के माध्यम से डाला जाना चाहिए।
    2. कोशिकाओं को 1x PBS के 100 μL के साथ तीन बार धोएं, कोशिका झिल्ली को स्थिर करने के लिए 0.1% ट्वीन 20 (PBST) के साथ पूरक करें।
    3. 1 घंटे के लिए आरटी पर 5% एफसीएस (पीबीएसटी-एफसीएस) के साथ पूरक 1x PBST के 100 μL में इनक्यूबेशन द्वारा विशिष्ट संकेतों को ब्लॉक करें।
    4. उपग्रह कोशिकाओं और मायोफाइबर का पता लगाने के लिए क्रमशः 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटी-पैक्स 7 और एंटी-डिस्ट्रोफिन (डीएमडी) एंटीबॉडी (1x PBST-FCS में पतला) के मास्टर मिश्रण के 100 μL के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    5. कोशिकाओं को 1x PBST के 100 μL के साथ तीन बार धोएं, और उन्हें 100 μL बकरी विरोधी माउस Cy3 या बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा 488 द्वितीयक एंटीबॉडी (तालिका 3) के साथ 1 घंटे के लिए RT पर 1x PBST-FCS में पतला करें।
    6. आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान किए गए उपकरणों का उपयोग करके स्लाइड से चैंबर कुओं को अलग करें, 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) के साथ 20 μL जलीय माउंटिंग माध्यम जोड़ें, और स्लाइड को कवरस्लिप के साथ कवर करें (तालिका 1)।
    7. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ दाग वाली कोशिकाओं की छवि का निरीक्षण और कैप्चर करें।
    8. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (आंकड़े 4 बी, डी) का उपयोग करके छवियों को संसाधित करें।

3. कट एंड रन विश्लेषण

  1. एफएसीएस-पृथक उपग्रह कोशिकाओं पर कट एंड रन विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी।
    नोट: कट एंड रन अनिवार्य रूप से वर्णित के रूप में किया गया था।10,15. बफर संरचना में प्रस्तुत किया गया है तालिका 2.
    1. कट एंड रन परख के लिए, विधि 1, चरण 1.5.9, प्रति नमूना / एंटीबॉडी में प्राप्त लगभग 40,000 कोशिकाओं का उपयोग करें जिन्हें परीक्षण किया जाना चाहिए।
    2. 10 मिनट के लिए आरटी पर 500 x g पर FACS-पृथक उपग्रह कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर एक पिपेट (20-200 μL टिप वॉल्यूम) का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
    3. कोशिकाओं को 1 एमएल 1x PBS के साथ धोएं, 5 मिनट के लिए 500 x g पर RT पर सेंट्रीफ्यूज करें, एक पिपेट (0.2-1 एमएल टिप वॉल्यूम) का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और उन्हें ठंडे परमाणु निष्कर्षण बफर के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें (तालिका 2)। 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    4. इनक्यूबेशन के दौरान, एक 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें जिसमें 850 μL कोल्ड बाइंडिंग बफर (तालिका 2) हो और प्रति नमूना 20 μL concanavalin A-लेपित चुंबकीय मोती जोड़ें (तालिका 1)।
    5. चुंबकीय रैक का उपयोग करके 1 एमएल कोल्ड बाइंडिंग बफर के साथ मोतियों को दो बार धोएं (तालिका 1)। प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक धोने या बफर परिवर्तन के लिए, मोतियों को पिपेट (0.2-1 एमएल टिप वॉल्यूम) के साथ साफ किए गए सुपरनैटेंट को हटाने से पहले चुंबकीय रैक पर ट्यूब के किनारे 5 मिनट के लिए जमा होने दें। फिर, कोल्ड बाइंडिंग बफर के 300 μL में धीरे से पुन: निलंबित करें।
    6. 5 मिनट के लिए 600 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर नाभिक को सेंट्रीफ्यूज करें और परमाणु निष्कर्षण बफर के 600 μL में उन्हें धीरे से फिर से निलंबित करें। धीरे-धीरे निकाले गए नाभिक के 600 μL को 300 μL concanavalin A बीड स्लरी के साथ मिलाएं, और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. एक चुंबकीय रैक का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, जैसा कि चरण 3.1.4 में वर्णित है, और 1 एमएल कोल्ड ब्लॉकिंग बफर (तालिका 2) के साथ मोती-बाध्य नाभिक को धीरे से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    8. चुंबकीय रैक का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 1 एमएल कोल्ड वॉश बफर के साथ दो बार मोती-बाध्य नाभिक को धोएं (तालिका 2)। दूसरे धोने के दौरान, समान रूप से मोती-बाध्य नाभिक को 1.5 एमएल ट्यूबों में विभाजित करें। प्रत्येक ट्यूब को अगले चरण में एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इलाज किया जाएगा।
      नोट: इस उदाहरण में, 250 μL मोती-बाध्य नाभिक को चार 1.5 एमएल ट्यूबों में विभाजित किया गया था।
    9. एक चुंबकीय रैक का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को अलग करें, जैसा कि चरण 3.1.4 में वर्णित है, और एक पिपेट के साथ एस्पिरेट करें। एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी (तालिका 3), या किसी अन्य प्रजाति (यहां खरगोश) के आईजीजी को कोल्ड वॉश बफर के 250 μL में पतला करके नाभिक / मोती परिसरों को धीरे से पुन: निलंबित करें। कोमल आंदोलन के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी एआर, एच 3 के 4 एम 2, और एच 3 के 27 एसी के खिलाफ निर्देशित हैं।
    10. एक चुंबकीय रैक के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, जैसा कि चरण 3.1.4 में वर्णित है, 1 एमएल कोल्ड वॉश बफर के साथ दो बार मोती-बाध्य नाभिक को धोएं, और कोल्ड वॉश बफर के 100 μL में फिर से निलंबित करें।
    11. कोल्ड वॉश बफर के प्रति नमूने में 100 μL में 1.4 ng / μL पर प्रोटीन ए-माइक्रोकोकल न्यूक्लियस को पतला करें।
    12. 3.1.11 में प्राप्त नमूने के 100 μL में 100 μL प्रोटीन A-माइक्रोकोकल न्यूक्लियस जोड़ें और आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    13. एक चुंबकीय रैक के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, जैसा कि चरण 3.1.4 में वर्णित है, 1 एमएल कोल्ड वॉश बफर के साथ दो बार धोएं, और कोल्ड वॉश बफर के 150 μL में मोती-बाध्य नाभिक को फिर से निलंबित करें।
    14. डीएनए दरार शुरू करने के लिए, 150 μL नमूने में CaCl2 के 100 mM के 3 μL जोड़ें, फ्लिक करके जल्दी से मिलाएं, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। आरएनए को पचाने और डीएनए टुकड़ों को छोड़ने के लिए 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 150 μL स्टॉप बफर जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।
    15. डीएनए निष्कर्षण के लिए, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें।
    16. सतह पर तैरनेवाला को एक नए माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और गोली और मोतियों को छोड़ दें।
    17. 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 3 μL और 20 mg/mL प्रोटीनेज K के 2.5 μL जोड़ें। 70 डिग्री सेल्सियस (कोई हिलाना नहीं) पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    18. 300 μL फिनोल / क्लोरोफॉर्म / आइसोमाइल अल्कोहल, भंवर जोड़ें, 2 एमएल फेज-लॉक ट्यूबों में स्थानांतरित करें (16,000 x g पर 5 मिनट के लिए पूर्व-स्पिन), और 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    19. उसी ट्यूब में 300 μL क्लोरोफॉर्म जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। एक पिपेट (0.2-1 एमएल टिप वॉल्यूम) के साथ सुपरनैटेंट (~ 300 μL) एकत्र करें और एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    20. ग्लाइकोजन के 1 μL (20 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता) जोड़ें।
    21. 100% इथेनॉल के 750 μL जोड़ें और -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अवक्षेपित करें।
    22. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा डीएनए को पेलेट करें। 100% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ गोली धोएं, 16,000 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें, 16,000 x g पर 30 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और एक पिपेट (20-200 μL टिप वॉल्यूम) के साथ तरल को हटा दें।
    23. ~ 5 मिनट के लिए गोली को हवा में सुखाएं। 1 mM Tris-HCl (pH 8) और 0.1 mM एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (EDTA; pH 8) के 25 μL में पुन: निलंबित।
  2. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण
    1. इम्यूनोक्लेव्ड डीएनए से पुस्तकालय तैयार करें और उन्हें जीनोमिक प्लेटफॉर्म की मदद से युग्मित-अंत 100 बीपी रीडिंग के रूप में अनुक्रमित करें जैसा कि16 वर्णित है।
    2. एनकोड ब्लैकलिस्ट क्षेत्र (वी 2) के साथ अतिव्यापी रीडिंग को निकालें और शेष को दो समूहों में अलग करें: टुकड़ा आकार <120 बीपी (न्यूक्लियोसोम के बिना, सामान्य रूप से प्रतिलेखन कारकों के लिए) और टुकड़ा आकार >150 बीपी (न्यूक्लियोसोम के साथ, आमतौर पर हिस्टोन के निशान के लिए)। बोटी 2 (v2.3.4.3)17 का उपयोग करके mm10 संदर्भ जीनोम का मानचित्र।
    3. bamCoverage के साथ बड़ी फाइलें उत्पन्न करें (deeptools 3.3.0: bamCoverage - RPKM का उपयोग करके सामान्यीकृत करें - binSize 20)।
    4. आगे के विश्लेषण के लिए विशिष्ट रूप से मैप किए गए रीड को बनाए रखें।
    5. जीनोम कवरेज बेड (बेडटूल्स v2.26.0) के साथ कच्चे बेडग्राफ फाइलें उत्पन्न करें।
    6. पीक कॉलिंग के लिए एसईएसीआर 1.3 एल्गोरिथ्म (कड़े विकल्प) का उपयोग करें। लक्ष्य डेटा बेडग्राफ फ़ाइल को यूसीएससी बेडग्राफ प्रारूप में लोड करें जो शून्य सिग्नल वाले क्षेत्रों को छोड़ देता है, और पीक कॉलिंग18 के लिए एक अनुभवजन्य सीमा उत्पन्न करने के लिए नियंत्रण (आईजीजी) डेटा बेडग्राफ फ़ाइल करता है।
    7. नमूने19 के बीच समानता निर्धारित करने के लिए डीपटूल के साथ पियर्सन सहसंबंध विश्लेषण करें। कमांड लाइन मल्टीबामसमरी बिन का उपयोग करें - bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, इसके बाद प्लॉटकोरिलेशन -inresults.npz - corMethod pearson - स्किपज़ीरोज़ - प्लॉट शीर्षक "पियरसन कोरिलेशन ऑफ रीड काउंट्स" - whatToPlot हीटमैप - कलरमैप RdYlBu - प्लॉट नंबर्स -ओ heatmap_PearsonCorr_readCounts.png - आउटफाइलकोरमैट्रिक्स PearsonCorr_readCounts.tab।
    8. बेडग्राफ फाइलों और एसईएसीआर से प्राप्त बेड फ़ाइल चोटियों का उपयोग करके आईजीवी20 के साथ जीनोम-वाइड तीव्रता प्रोफाइल की कल्पना करें।
    9. पीक एनोटेशन और मोटिफ सर्च21 के लिए होमर का उपयोग करें।
    10. अंत में, आईजीवी पर उन्हें देखने के लिए पहले प्रकाशित लोगों के साथ डेटासेट की तुलना करें, और / या इनपुट डेटासेट22 के रूप में एसईएसीआर-जनित बेड फाइलों का उपयोग करके संवर्धन विश्लेषण।

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Representative Results

माउस कंकाल की मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं को गुंथर एट अल (इसके बाद प्रोटोकॉल 1)12 और लियू एट अल .23 (इसके बाद प्रोटोकॉल 2) के प्रोटोकॉल के संयोजन से अलग किया गया था। चूंकि प्रोटोकॉल 1 में प्रस्तावित कोलेजनेस और डिस्पेस की एकाग्रता का उपयोग करते समय पाचन के बाद गैर-पचने वाले मांसपेशी फाइबर फाइबर देखे गए थे, इसलिए मांसपेशियों के फाइबर पृथक्करण में सुधार के लिए एंजाइमों की मात्रा में वृद्धि हुई थी, जैसा कि चरण 1.2.1 और 1.2.3 में वर्णित है। जैसा कि प्रोटोकॉल 2 में संकेत दिया गया है, नमूने सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए पानी के स्नान में एक कोमल आंदोलन के अधीन थे। हमने सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से निस्पंदन किया, जैसा कि प्रोटोकॉल 1 में उल्लेख किया गया है, और लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के साथ इनक्यूबेशन (चरण 1.2.7 से 1.2.10 देखें)। प्रोटोकॉल 1 में, कोशिकाओं को इंटरफेज़ में मोनोन्यूक्लियेटेड कोशिकाओं को अलग करने के लिए 30% / 70% के पर्कॉल घनत्व ढाल पर लोड किया गया था, जिससे रुचि की कोशिकाओं का नुकसान हो सकता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल 2 में प्रस्तावित इस चरण को छोड़ दिया गया था।

एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए गेटिंग का उपयोग आकार (एफएससी) और ग्रैन्यूलैरिटी (एसएससी) (चित्रा 3 ए) के आधार पर मोनोन्यूक्लियेटेड कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया गया था। एफएससी-ए अक्ष पर 40 K से नीचे की घटनाओं को अनदेखा करके मलबे को बाहर रखा गया था, और 38.8% ± 3.6% कोशिकाओं का चयन किया गया था। एफएससी-ए बनाम फॉरवर्ड स्कैटर हाइट (एफएससी-एच) गेटिंग डेंसिटी प्लॉट्स का उपयोग डबल बहिष्करण (चित्रा 3 बी) के लिए किया गया था। फिक्सेबल व्यवहार्यता दाग मार्कर के लिए नकारात्मक कोशिकाओं का चयन करने के बाद, जीवित कोशिकाओं का औसत 34.3% ± 7.7% प्राप्त किया गया था (चित्रा 3 सी)।

चित्रा 3 सी में डॉट प्लॉट में दिखाया गया प्रतिशत, 75.4%, एकल जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत से मेल खाता है, जिसकी गणना मूल कोशिका आबादी से की जाती है, जो इस मामले में एकल है। 95.7% एकल कोशिकाएं लाइव घटनाओं से प्राप्त होती हैं जो कुल घटनाओं का 35% बनाती हैं। इस प्रकार, औसतन प्राप्त प्रतिशत 34.3% की गणना कुल घटनाओं से की जाती है, न कि मूल आबादी से।

लगभग 3% एकल जीवित कोशिकाएं ल्यूकोसाइट- (सीडी 45), मोनोसाइट- (सीडी 11 बी), एंडोथेलियल- (सीडी 31), और एरिथ्रोइड-विशिष्ट (टीईआर 119) मार्करों (चित्रा 3 डी) के लिए नकारात्मक थीं। सीडी 11 बी / सीडी 45 / सीडी 31 / टीईआर 11 9 नकारात्मक कोशिकाओं को सीडी 34 (हेमटोपोइएटिक, एंडोथेलियल पूर्वजों और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं) और आईटीजीए 7 (हृदय, चिकनी और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं) मार्करों (चित्रा 3 ई) की अभिव्यक्ति के अनुसार चुना गया था। सीएक्ससीआर 4 (लिम्फोसाइट्स, हेमटोपोइएटिक और उपग्रह कोशिकाओं) के लिए एक अंतिम गेटिंग कथित उपग्रह कोशिकाओं (चित्रा 3 एफ) का चयन करने के लिए किया गया था। सीडी 34 + / आईटीजीए 7 + कोशिकाओं से, ~ 80% सीएक्ससीआर 4 के लिए सकारात्मक पाए गए, जो कुल एकल जीवित कोशिकाओं के औसतन 1% ± 0.15% का प्रतिनिधित्व करता है, और 14 स्वतंत्र प्रयोगों के बीच प्रति माउस अंग की मांसपेशियों में 60,000 ± 14,000 कथित उपग्रह कोशिकाओं की पूर्ण संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। सीएक्ससीआर 4 + सेल अंश पर एक अतिरिक्त सहारा मूल्यांकन से पता चला कि लगभग 80% जीवित कोशिकाओं को पोस्ट-सॉर्टिंग के बाद प्राप्त किया गया था, जिनमें से लगभग 70% सीएक्ससीआर 4 + (चित्रा एस 1) थे, जो इस एफएसीएस-पृथक सेल आबादी की उच्च व्यवहार्यता और शुद्धता दिखाते हैं।

चूंकि विभिन्न अध्ययनों ने सेल अलगाव24,25 के लिए कोलेजनेस और लिबेरेस टीएल एंजाइमों की दक्षता की तुलना की, इसलिए इन दो पाचन विधियों को समानांतर में संसाधित किया गया है। लिबेरेस टीएल के 300 μL के साथ, पाचन कोलेजनेस की तुलना में कम कुशल था, क्योंकि बिना पचे हुए फाइबर बने रहे। इसके अलावा, अधिक सेल मलबे और बड़ी घटनाएं देखी गईं (आंकड़े एस 2 ए, बी), और एफवीएस 780 चयन (चित्रा एस 2 सी) के बाद औसतन केवल 17.3% एकल जीवित कोशिकाएं प्राप्त की गईं। लिबेरेस पाचन के साथ एक अतिरिक्त चिंता कोलेजनेस (आंकड़े एस 2 डी-एस 2 ई) की तुलना में सीडी 34 + / आईटीजीए 7 + कोशिकाओं की कम संख्या थी, भले ही सीएक्ससीआर 4 गेटिंग समान थी (चित्रा एस 2 एफ)। लिबेरेस टीएल के 600 μL के साथ, पाचन अधिक कुशल था। हालांकि, सेल मलबे की मात्रा बढ़ी हुई रही और सेल व्यवहार्यता घटिया (16.3%) रही (चित्रा एस 3)। इस प्रकार, उपग्रह सेल अलगाव के लिए लिबेरेस टीएल के साथ पाचन कम कुशल था।

जब बीज दिया जाता है, तो CD34+/ITGA7+/CXCR4+ कोशिकाओं (चित्रा 4A) के 70% से अधिक ने PAX7 (चित्रा 4B) व्यक्त किया, जबकि CD34+/ITGA7-/CXCR4- कोशिकाएं जो PAX7-नकारात्मक थीं (चित्रा 4C)। सीडी 34 + / आईटीजीए 7 + / सीएक्ससीआर 4 + कोशिकाएं 7 अतिरिक्त दिनों के लिए मायोजेनिक माध्यम में उगाए जाने पर मायोफाइबर में अंतर करने में सक्षम थीं, जैसा कि डिस्ट्रोफिन (डीएमडी) स्टेनिंग (चित्रा 4 डी) द्वारा दिखाया गया है, जो उनकी मायोजेनिक क्षमता की पुष्टि करता है। इस प्रकार, संयुक्त ऊतक संस्कृति और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण से पता चला है कि एफएसीएस-पृथक सीडी 34 + / आईटीजीए 7 + / सीएक्ससीआर 4 + कोशिकाएं उपग्रह कोशिकाएं हैं।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या पृथक उपग्रह कोशिकाएं कट एंड रन विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं, हिस्टोन एच 3 के एसिटाइलेटेड लाइसिन 27 (एच 3 के 27 एसी) और डाइमिथाइलेटेड लाइसिन 4 (एच 3 के 4 एम 2) की जीनोमिक प्रोफ़ाइल, सक्रिय प्रमोटर और एन्हांसर क्षेत्रों में पाए जाने वाले दो हिस्टोन संशोधननिर्धारित किए गए थे। हमारे डेटा ने H3K4me2 और H3K27ac के लिए क्रमशः 68,694 और 13,514 चोटियों को उजागर किया, जिसमें दो हिस्टोन चिह्नों (चित्रा S4A) के बीच एक समान जीनोमिक पुनर्विभाजन था। विस्तार से, हमने पाया कि चोटियों का एक-चौथाई निकटतम जीन के प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल (टीएसएस) से 2 केबी ± स्थित था, अधिकांश टीएसएस (चित्रा एस 4 बी) से -100 केबी या तो -100 केबी से -100 केबी स्थित थे। ध्यान दें, पियरसन विश्लेषण ने H3K27ac और H3K4me2 रीड प्रोफाइल (चित्रा S4C) के बीच 80% सहसंबंध दिखाया। यह आकलन करने के लिए कि उपर्युक्त प्रोटोकॉल से तैयार क्रोमैटिन उपग्रह कोशिकाओं से अलग किया गया था, उपग्रह सेल-विशिष्ट जीन के प्रमोटर पर H3K27ac और H3K4me2 की उपस्थिति निर्धारित की गई थी। H3K4me2 को Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4, और Vcam1 (चित्रा 5A) के TSS के आसपास समृद्ध किया गया था, लेकिन Itgam (CD11b) और Ptprc (CD45) (प्रतिरक्षा कोशिकाओं), Pecam (CD31; एंडोथेलियल कोशिकाओं) (चित्रा 5B), CKM (मांसपेशियों के तंतुओं का विकास), या Myh3 (मायोसिन भारी श्रृंखला तेजी से भ्रूण, मायोफाइबर) (चित्रा 5C) के आसपास नहीं। इसी तरह के परिणाम H3K27ac (चित्रा 5) के साथ प्राप्त किए गए थे। आईजीजी नमूने (चित्रा 5) के साथ लगभग कोई संकेत प्राप्त नहीं किया गया था। इसके अलावा, एसईएसीआर से प्राप्त एच 3 के 27 एसी चोटियों की तुलना प्रकाशित सीएचआईपी-सेक डेटासेट से एमएसीएस 2 पीक कॉलिंग के परिणामस्वरूप एक उच्च सहसंबंध दिखाया गया, जैसा कि प्रत्येक पैनल (सीएचआईपी-एटलस ट्रैक; चित्रा 5)। साथ में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के बाद प्राप्त पठन एफएसीएस-पृथक उपग्रह कोशिकाओं के क्रोमैटिन से उत्पन्न होते हैं और पहले से ही CHIP-seq विश्लेषण द्वारा पहचाने गए लोगों के साथ सहसंबंधित होते हैं।

जबकि माउस उपग्रह कोशिकाओं में एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण अध्ययनों ने अलगाव प्रक्रिया26 के कारण एक हड़ताली तनाव प्रतिक्रिया दिखाई, H3K4me2 या H3K27ac की उपस्थिति तनाव प्रतिक्रिया जीन पर निर्धारित की गई थी, जैसा कि Atf3, Azin1, Gls और Elf2 के साथ उदाहरण दिया गया है। परिणाम सबूत प्रदान करते हैं कि H3K27ac चिह्न ऐसे जीनों के प्रमोटर पर जमा नहीं होता है, और यह कि H3K4me2 का स्तर उपग्रह सेल-विशिष्ट जीन (चित्रा S5) के लिए प्राप्त की तुलना में कम रहता है। इस प्रकार, ये डेटा इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि अलगाव प्रक्रिया कितनी हल्की है।

इसके बाद, प्रतिलेखन कारकों के लिए हमारी अलगाव विधि की उपयुक्तता की जांच की गई। एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) के लिए कट एंड रन विश्लेषण, एक प्रतिलेखन कारक जो परमाणु रिसेप्टर्स सुपरफैमिली से संबंधित है और जो मायोजेनिक भेदभाव27 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, ने 7,840 चोटियों को उजागर किया। ये चोटियाँ मुख्य रूप से इंट्रॉन और इंटरजेनिक क्षेत्रों (चित्रा एस 4 ए) में स्थित थीं, या तो -100 केबी से -10 केबी, या टीएसएस (चित्रा एस 4 बी) से 10 केबी से 100 केबी। फाइटोलैनेटिक विश्लेषण से पता चला है कि एआर, ग्लुकोकोर्टिकोइड (जीआर / एनआर 3 सी 1), मिनरलोकॉर्टिकोइड (एमआर / एनआर 3 सी 2), और प्रोजेस्टेरोन (पीआर / एनआर 3 सी 3) रिसेप्टर्स के साथ, ऑक्सोस्टेरॉयड परमाणु रिसेप्टर्स उपपरिवार 28 का एक सदस्य है, जो डीएनए खंडों में होमोडीमर के रूप में बंधता है जो दो 5'-आरजीएएसीए -3' पैलिंड्रोमिक अर्ध-साइटों से बने होते हैं जो तीन आधार जोड़े29 द्वारा अलग होते हैं।. मोटिफ संवर्धन (एचओएमआर, http://homer.ucsd.edu/homer/) के हाइपरजियोमेट्रिक अनुकूलन के माध्यम से एक ज्ञात आकृति की खोज करने से पता चला कि एआर 5'-आरजीएनसीए-3' एआर हाफ-साइट मोटिफ, विशिष्ट 5'-आरजीएनएसीएएएनएनटीजीटीएनसी-3' ऑक्सोस्टेरॉइड मोटिफ (पीआर के रूप में चित्र में संदर्भित) और 5'-आरजीएनएसीएएएनएनटीजीटीएनसीसी -3' एआर आम सहमति आकृति से >32%, 17%, और 2% लक्षित क्षेत्रों में बंधा हुआ है। क्रमशः (चित्रा 6 ए)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कंकाल की मांसपेशी16 में ग्लुकोकोर्टिकोइड रिसेप्टर के लिए पहले समान अनुपात प्राप्त किए गए थे।

एसईएसीआर विश्लेषण ने पीक स्कोर >50 के साथ लगभग 500 चोटियों का अनावरण किया, जिनमें से 200 से अधिक >100 के स्कोर के साथ; जिनमें से कुछ चित्र 6 बी में उदाहरण दिए गए हैं। हमारे विश्लेषण ने पॉलीमाइन बायोसिंथेसिस (एएमडी 1, ओट और स्मोक्स) और प्रोस्टेट कैंसर (एकॉक्स 1, एफकेबीपी 5, और टीएमपीआरएसएस 2) में शामिल जीन के पहले वर्णित बाध्यकारी साइटों पर एआर के मामूली संवर्धन को भी उजागर किया (चित्रा एस 6)। दिलचस्प बात यह है कि एआर उपग्रह सेल स्टेमनेस (पैक्स 7, सीएक्ससीआर 4, और सीडी 34) (चित्रा एस 7) में शामिल जीन के लोकी पर पाया गया था। ध्यान दें, इन एआर-समृद्ध क्षेत्रों (चित्रा एस 6 और चित्रा एस 7) में से प्रत्येक में ऑक्सोस्टेरॉयड प्रतिक्रिया तत्व पाया गया था, यह दर्शाता है कि कट एंड रन डेटा में देखा गया एआर सिग्नल अत्यधिक विशिष्ट है।

Figure 1
चित्रा 1: माउस अंग की मांसपेशियों से उपग्रह सेल अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रोटोकॉल में चार मुख्य चरण शामिल हैं। संक्षेप में, चूहों की बलि दी जाती है, और पिछले अंग की मांसपेशियों को काटा जाता है (चरण 1.1.1-1.1.3) और कैंची का उपयोग करके यांत्रिक रूप से कीमा किया जाता है (चरण 1.4-1.5)। इसके बाद चरण 1.2.1-1.2.4 है, जिसके दौरान मांसपेशियों को कोलेजनेस और डिस्पेस का उपयोग करके पानी के स्नान में अलग किया जाता है। चरण 1.2.5-1.2.8 में, सेल निलंबन को लगातार 100, 70 और 40 μm सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है, और एरिथ्रोसाइट्स को लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर (चरण 1.2.9-1.2.12) का उपयोग करके समाप्त कर दिया जाता है। शेष सेल आबादी को फ्लोरोफोरे के साथ युग्मित एंटीबॉडी के साथ चरण 1.3 में लेबल किया जाता है, जो विशिष्ट सेलुलर फेनोटाइपिकल मार्करों के खिलाफ निर्देशित होते हैं। चरण 1.4 में आगे के आवेदन के लिए उपग्रह कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एफएसीएस से गुजरने वाले नमूने शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक बिना दाग वाली सेल तैयारी का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। (क) एफएससी-ए और एसएससी-ए पैरामीटरों के आधार पर रुचि की जनसंख्या का चयन। (बी) एफएससी-ए और एफएससी-एच के आधार पर एकल सेल पहचान। (सी) एपीसी-साइ 7 के लिए एकत्रित कोशिकाओं की ऑटो-फ्लोरेसेंस सीमा का लक्षण वर्णन मृत कोशिकाओं को चिह्नित करने वाले फिक्सेबल व्यवहार्यता दाग (एफवीएस 780) से संयुग्मित है। (डी-एफ)। पीई-साइ7 के लिए ऑटो-फ्लोरेसेंस माप सीडी 11 बी एंटीबॉडी से संयुग्मित और पीई-संयुग्मित टीईआर 119/सीडी 45/सीडी 31 मार्कर (डी) के साथ-साथ एलेक्सा फ्लुर 488 के लिए आईटीजीए 7 से संयुग्मित, एलेक्सा फ्लुर 405 को सीडी 34 (ई) से संयुग्मित और एपीसी फ्लोरोक्रोम के लिए सीएक्ससीआर 4 (एफ) से संयुग्मित है। गेट्स को ब्लैक बॉक्स के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: उपग्रह सेल सॉर्टिंग के लिए फ्लो साइटोमीटर गेटिंग रणनीति। (क) एफएससी-ए और एसएससी-ए पैरामीटरों के आधार पर रुचि की जनसंख्या का चयन। (बी) एफएससी-ए और एफएससी-एच के आधार पर एकल सेल पहचान। (सी) एफवीएस 780 के साथ जीवित कोशिकाओं की पहचान। (डी) सीडी 11 बी, सीडी 31, सीडी 45 और टीईआर 119 एंटीजन के आधार पर नकारात्मक सेल चयन। (E-F) सीडी 34 और आईटीजीए 7 (ई), साथ ही सीएक्ससीआर 4 (एफ) एंटीजन के आधार पर सकारात्मक सेल चयन। गेट्स को ब्लैक बॉक्स के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एफएसीएस-पृथक सीडी 34 + / आईटीजीए 7 + / सीएक्ससीआर 4 + और सीडी 34 + / आईटीजीए 7 - / सीएक्ससीआर 4 - कोशिकाओं का विश्लेषण। (ए) विकास माध्यम में संवर्धित सीडी 34+/आईटीजीए7+/सीएक्ससीआर4+ और सीडी34+/आईटीजीए7-/सीएक्ससीआर4- कोशिकाओं के फेज कंट्रास्ट चित्र। (ख) पैक्स7 (लाल) और डिस्ट्रोफिन (डीएमडी, हरा) के विरुद्ध निर्देशित प्रतिरक्षियों का उपयोग करते हुए विकास माध्यम में संवर्धित सीडी34+/आईटीजीए7+/सीएक्ससीआर4+ और सीडी34+/आईटीजीए7-/सीएक्ससीआर4-कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण। नाभिक DAPI (नीले) से सना हुआ था। मैजेंटा तीर पैक्स 7-पॉजिटिव कोशिकाओं का संकेत देते हैं। (सी) सीडी 34 + / आईटीजीए 7 + / सीएक्ससीआर 4 + कोशिकाओं की फेज कंट्रास्ट छवियां विकास माध्यम (बाएं पैनल) में 5 दिनों के लिए और मायोजेनिक माध्यम (दाएं पैनल) में 7 अतिरिक्त दिनों के लिए उगाई जाती हैं। (डी) विकास माध्यम (बाएं पैनल) में 5 दिनों के लिए और मायोजेनिक माध्यम (दाएं पैनल) में 7 अतिरिक्त दिनों के लिए पैक्स 7 (लाल) और डिस्ट्रोफिन (डीएमडी, हरा) के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करके सीडी 34 + / आईटीजीए 7 + / सीएक्ससीआर 4 + कोशिकाओं की इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण छवियां। नाभिक DAPI (नीले) से सना हुआ था। मैजेंटा तीर पैक्स 7-पॉजिटिव कोशिकाओं का संकेत देते हैं। हरे तीर डीएमडी-पॉजिटिव कोशिकाओं का संकेत देते हैं। स्केल बार: ब्राइटफील्ड पैनल = 25 μm; इम्यूनोफ्लोरेसेंस पैनल = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: उपग्रह सेल क्रोमैटिन के जीनोमिक प्रोफाइल। "कट एंड रन द्वारा उपग्रह कोशिकाओं के क्रोमैटिन पर उपग्रह सेल-विशिष्ट जीन (ए), प्रतिरक्षा और एंडोथेलियल सेल-विशिष्ट जीन (बी), और मायोफिबर-विशिष्ट जीन (सी) पर एच 3 के 4 एम 2 और एच 3 के 27 एसी का स्थानीयकरण"। सक्रिय प्रमोटरों को हरे रंग में बॉक्स किया जाता है, जबकि निष्क्रिय प्रमोटरों को भूरे रंग में बॉक्स किया जाता है। आईजीजी के साथ किए गए कट एंड रन को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। हिस्टोन के निशान के लिए H3K27ac संवर्धन विश्लेषण प्रत्येक ट्रैक के नीचे प्रस्तुत किया गया है। प्रकाशित डेटासेट के आत्मविश्वास के स्तर को दिखाने वाले संवर्धन स्कोर को हीटमैप के रूप में दर्शाया गया है। भूरे रंग के सितारे (*) मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं में किए गए H3K27ac CHIP-seq चोटियों को संदर्भित करते हैं, नीले सितारों को H3K4me3 और गुलाबी को H4K16me1 के लिए संदर्भित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: उपग्रह सेल क्रोमैटिन पर एआर जीनोमिक वितरण । (ए) उपग्रह कोशिकाओं में एआर चोटियों का होमर-ज्ञात आकृति विश्लेषण। पीआर: प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर। एनबी लक्ष्य एक विशेष आकृति प्रस्तुत करने वाली चोटियों की संख्या को संदर्भित करता है। (बी) कट एंड रन द्वारा निर्धारित उपग्रह कोशिकाओं के क्रोमैटिन पर संकेतित जीन पर एच 3 के 4 एम 2 और एआर का स्थानीयकरण। आईजीजी के साथ किए गए कट एंड रन को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: सामग्री, अभिकर्मकों और सॉफ्टवेयर की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: बफर रचनाएं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: एंटीबॉडी संदर्भ और सांद्रता। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: सेल तैयारी पोस्ट-सॉर्टिंग का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। (क) एफएससी-ए और एसएससी-ए पैरामीटरों के आधार पर रुचि की जनसंख्या का चयन। (बी) एफएससी-ए और एफएससी-एच के आधार पर एकल सेल पहचान। (सी) स्थिर व्यवहार्यता दाग (एफवीएस 780) के साथ जीवित कोशिकाओं की पहचान। (डी) सीडी 11 बी, सीडी 31, सीडी 45 और टीईआर 119 एंटीजन के आधार पर नकारात्मक सेल चयन। (E-F) सीडी 34 और आईटीजीए 7 (ई) के साथ-साथ सीएक्ससीआर 4 (एफ) एंटीजन के आधार पर सकारात्मक सेल चयन। गेट्स को ब्लैक बॉक्स के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2: लिबेरेस टीएल के 300 μL के साथ पाचन के बाद उपग्रह सेल सॉर्टिंग के लिए फ्लो साइटोमीटर गेटिंग रणनीति। (क) एफएससी-ए और एसएससी-ए पैरामीटरों के आधार पर रुचि की जनसंख्या का चयन। (बी) एफएससी-ए और एफएससी-एच के आधार पर एकल सेल पहचान। (सी) एफवीएस 780 के साथ जीवित कोशिकाओं की पहचान। (डी) सीडी 11 बी, सीडी 31, सीडी 45 और टीईआर 119 एंटीजन के आधार पर नकारात्मक सेल चयन। (E-F) सीडी 34 और आईटीजीए 7 (ई) के साथ-साथ सीएक्ससीआर 4 (एफ) एंटीजन के आधार पर सकारात्मक सेल चयन। गेट्स को ब्लैक बॉक्स के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 3: लिबेरेस टीएल के 600 μL के साथ पाचन के बाद उपग्रह सेल सॉर्टिंग के लिए फ्लो साइटोमीटर गेटिंग रणनीति। (क) एफएससी-ए और एसएससी-ए पैरामीटरों के आधार पर रुचि की जनसंख्या का चयन। (बी) एफएससी-ए और एफएससी-एच के आधार पर एकल सेल पहचान। (सी) एफवीएस 780 के साथ जीवित कोशिकाओं की पहचान। (डी) सीडी 11 बी, सीडी 31, सीडी 45 और टीईआर 119 एंटीजन के आधार पर नकारात्मक सेल चयन। (E-F) सीडी 34 और आईटीजीए 7 (ई) के साथ-साथ सीएक्ससीआर 4 (एफ) एंटीजन के आधार पर सकारात्मक सेल चयन। गेट्स को ब्लैक बॉक्स के रूप में दर्शाया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: H3K4me2, H3K27ac, और AR जीनोमिक स्थानों का लक्षण वर्णन। (ए) उपग्रह कोशिकाओं में जीनोम विशेषताओं के अनुसार एच 3 के 4 एम 2, एच 3 के 27 एसी और एआर के चरम वितरण को दर्शाने वाले पाई चार्ट। (बी) पाई चार्ट उपग्रह कोशिकाओं में निकटतम टीएसएस से उनकी दूरी के अनुसार H3K4me2, H3K27ac और AR के चरम वितरण को दर्शाते हैं। (सी) हीटमैप एच 3 के 4 एम 2, एच 3 के 27 एसी और आईजीजी नियंत्रण के बीच पियरसन सहसंबंध को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 5: तनाव-प्रतिक्रिया प्रेरित जीन पर उपग्रह सेल क्रोमैटिन के जीनोमिक प्रोफाइल। "उपग्रह कोशिकाओं के क्रोमैटिन पर संकेतित जीन पर H3K4me2 और H3K27ac का स्थानीयकरण"। आईजीजी के साथ इम्यूनोप्रेसिपेशन का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 6: ज्ञात एआर लक्ष्य जीन पर उपग्रह सेल क्रोमैटिन के जीनोमिक प्रोफाइल। एच3के4एमई2, एच3के27एसी और एआर का स्थानीयकरण कट एंड रन द्वारा निर्धारित उपग्रह कोशिकाओं के क्रोमैटिन पर संकेतित जीन है। एआर चोटियों को नीले रंग में बॉक्स किया जाता है, और संबंधित एआर-उत्तरदायी तत्व नीचे प्रस्तुत किए जाते हैं। आईजीजी के साथ किए गए कट एंड रन को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 7: उनके चुनिंदा रूप से व्यक्त जीन पर उपग्रह सेल क्रोमैटिन के जीनोमिक प्रोफाइल। एच3के4एमई2, एच3के27एसी और एआर का स्थानीयकरण कट एंड रन द्वारा निर्धारित उपग्रह कोशिकाओं के क्रोमैटिन पर संकेतित जीन है। एआर चोटियों को नीले रंग में बॉक्स किया जाता है, और संबंधित एआर-उत्तरदायी तत्व नीचे प्रस्तुत किए जाते हैं। आईजीजी के साथ किए गए कट एंड रन को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान अध्ययन माउस उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक मानकीकृत, विश्वसनीय और आसानी से प्रदर्शन करने वाली विधि की रिपोर्ट करता है, साथ ही साथ कट एंड रन विधि द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का मूल्यांकन भी करता है।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। एकत्र कोशिकाओं की उच्च संख्या सुनिश्चित करने के लिए पहला मांसपेशी व्यवधान और फाइबर पाचन है। एंजाइम एकाग्रता में वृद्धि के बावजूद, प्रोटोकॉल 1 का उपयोग करने की तुलना में अधिक जीवित कोशिकाएं प्राप्त की गईं। उपग्रह कोशिकाएं विभिन्न झिल्ली प्रोटीन के एक विशिष्ट पैटर्न को व्यक्त करती हैं। हमारी छंटाई की कठोरता को बढ़ाने के लिए, हमने पहले वर्णित नकारात्मक (सीडी 31, टीईआर 119, सीडी 45, और सीडी 11 बी) और सकारात्मक (सीडी 34, आईटीजीए 7, और सीएक्ससीआर 4) उपग्रह सेल मार्कर30,31 के संयोजन का उपयोग किया। इस रणनीति का उपयोग करते हुए, जीवित कथित उपग्रह कोशिकाओं का औसत 1% प्राप्त किया गया था। यह परिणाम अपेक्षित सीमा में है, क्योंकि उपग्रह कोशिकाएं चूहोंमें वयस्कता में मांसपेशियों की कोशिका आबादी का 2% -7% प्रतिनिधित्व करती हैं। उपग्रह सेल चयन मार्करों के लिए एक नियंत्रण के रूप में, CD34+/ITGA7-/CXCR4- कोशिकाओं को अलग किया गया था। इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग ने प्रदर्शित किया कि, जबकि सीडी 34 + / आईटीजीए 7 - / सीएक्ससीआर 4- कोशिकाओं ने पैक्स 7 को व्यक्त नहीं किया था, सीडी 34 + / आईटीजीए 7 + / सीएक्ससीआर 4 + क्रमबद्ध कोशिकाओं का 70% इस उपग्रह सेल-विशिष्ट मार्कर के लिए सकारात्मक था, जिससे यह प्रदर्शित होता है कि एफएसीएस पृथक आबादी उपग्रह कोशिकाओं से मेल खाती है। इसके अलावा, 7 दिनों के लिए मायोजेनिक माध्यम में विकसित 70% उपग्रह कोशिकाएं पैक्स 7-/ डीएमडी + थीं, जैसा कि इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा दिखाया गया है, और एक लम्बी बहुराष्ट्रीय मायोफिबर का गठन किया, यह दर्शाता है कि पृथक उपग्रह कोशिकाओं ने अपनी स्टेमनेस क्षमता को संरक्षित किया।

नमूना तैयार करने में प्रमुख सीमा एंजाइमों की उच्च सांद्रता का उपयोग हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप बड़ी मात्रा में विघटित जैविक सामग्री होती है, लेकिन कोशिका मृत्यु में वृद्धि में योगदान हो सकता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, कम एंजाइम मात्रा की आवश्यकता वाले एक परख का परीक्षण किया गया था। इस संदर्भ में, लिबेरेस टीएल, पारंपरिक कोलेजनेस33 का एक शुद्ध रूप, परीक्षण किया गया था। यद्यपि पाचन इस एंजाइम के साथ स्पष्ट रूप से अधिक कुशल था, सेल मलबे की मात्रा बढ़ी हुई रही, और सेल व्यवहार्यता थोड़ी कम हो गई। ये अवलोकन पिछली रिपोर्टों के अनुरूप हैं जिन्होंने लिबरेज-मध्यस्थता ऊतक पाचन की तुलना पुनः संयोजक कोलेजनेस या कस्टम कोलेजनेस24,25 के साथ की थी। इसके अलावा, भले ही एंडोथेलियल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनुपात कोलेजनेस और लिबेरेस पाचन के बीच समान था, लेकिन उपग्रह कोशिकाओं का प्रतिशत लिबरेज-संसाधित नमूने में कम था, कुल मिलाकर यह दर्शाता है कि उपग्रह सेल अलगाव के लिए लिबेरेस की सिफारिश नहीं की जाती है। इस एंजाइम का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फेनोटाइपिक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है और अंततः मांसपेशियों और / या अन्य ऊतकों के संदर्भ में अनुशंसित किया जा सकता है। यह लिबेरेस टीएल पर बताई गई जानकारी के अनुरूप है क्योंकि व्यवहार्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं34,35,36 को प्रभावी ढंग से अलग करने के लिए सबसे उपयुक्त है।

एक और संभावित मुद्दा उपग्रह कोशिकाओं को अलग करने और सॉर्ट करने दोनों के कारण होने वाला तनाव है। हालांकि, माउस उपग्रह कोशिकाओं26 में एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण द्वारा पहचाने गए तनाव प्रतिक्रिया जीन के प्रमोटर क्षेत्र में H3K27ac की अनुपस्थिति और कम H3K4me2 स्तर से पता चलता है कि प्रक्रिया तनाव प्रतिक्रिया ट्रांसक्रिप्शनल प्रदर्शनों को प्रेरित नहीं करने के लिए पर्याप्त हल्की है। ध्यान देने योग्य अन्य सीमाएं चयनित एंटीजन हैं जो अनुभवात्मक रहते हैं। हालांकि, अध्ययन अद्वितीय सतह मार्कर संयोजनों के बीच एक उच्च ओवरलैप दिखाते हैं जो कंकाल की मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं30,31 के लिए समृद्ध हैं।

एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम क्रमबद्ध कोशिकाओं से नाभिक का शुद्धिकरण है। इसके लिए, कोशिकाओं को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए सॉर्टिंग की गति कम रखी जाती है, लेकिन इतनी तेज कि वे एफएसीएस बफर में बहुत लंबे समय तक संग्रहीत नहीं होते हैं। दरअसल, कट एंड रन नाभिक तय नहीं हैं, और लंबे समय इनक्यूबेशन समय प्रोटोकॉल से प्राप्त पठन को प्रभावित कर सकता है। एक माउस के दो पिछले अंगों से एक विशिष्ट तैयारी एक एंटीबॉडी और एक आईजीजी नियंत्रण के साथ कट एंड रन की अनुमति देती है, जिसमें प्रत्येक के लिए क्रोमैटिन की मात्रा 2.5 एनजी होती है।

कट एंड रन प्रयोगों, प्रतिलेखन कारक बाइंडिंग और एपिजेनेटिक संशोधनों का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, ने H3K4me2 और H3K27ac के लिए मजबूत और मजबूत पठन संकेत प्रदान किए। प्रतिरक्षा या एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ-साथ मायोफाइबर में व्यक्त जीन की तुलना में उपग्रह कोशिकाओं में व्यक्त किए जाने वाले जीन ों पर H3K4me2 और H3K27ac के उच्च पठन स्तर से पता चला है कि संकेत मुख्य रूप से उपग्रह कोशिकाओं के नाभिक से प्रवर्धित था। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल ने मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं में एआर के सिस्ट्रोम की पहचान को संभव बना दिया, जो आज तक माउस एआर एंटीबॉडी की खराब गुणवत्ता और कोशिकाओं में कम एआर अभिव्यक्ति स्तर के लिए अंतर्निहित एक तकनीकी मुद्दा बना हुआ है जो अत्यधिक एंड्रोजन-संवेदनशील नहीं हैं, जैसे उपकला प्रोस्टेट कोशिकाएं। यहां प्रस्तुत आंकड़ों ने उच्च आत्मविश्वास शिखर स्कोर के साथ एआर-बाउंड क्षेत्रों का अनावरण किया। चूंकि मूल रूप से प्रति एंटीबॉडी केवल एक प्रतिकृति का मूल्यांकन किया गया था, इसलिए प्रति स्थिति कम से कम दो अतिरिक्त जैविक प्रतिकृतियां जोड़कर हमारे डेटासेट की मजबूती में सुधार किया जाएगा। हालांकि, एआर ज्ञात लक्ष्य जीन और संबंधित हिस्टोन निशान, जिन्हें मूल रूप से प्रोस्टेट जैसे अन्य ऊतक संदर्भों में अत्यधिक व्यक्त और / या आसानी से पता लगाने योग्य के रूप में वर्णित किया गया है, कम अभिव्यक्ति स्तर पेश करते हैं और उपग्रह कोशिकाओं में पता लगाने के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण हैं।

कट एंड रन दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि यह अनिर्धारित कोशिकाओं में किया जाता है। इस प्रकार, हम प्रतिलेखन कारकों और उनकी बाध्यकारी साइट के बीच बातचीत की अस्पष्ट प्रकृति के कारण कुछ एआर लक्ष्यों से चूक गए होंगे। इसी तरह, कुछ पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, जैसे कि एसिटिलीकरण, भी लाबिल हो सकते हैं। इसलिए, एफएसीएस सॉर्टिंग के बाद, और नाभिक को अलग करने से पहले, फॉर्मलाडेहाइड या पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ एक प्रकाश निर्धारण चरण सहित, प्रोटीन / डीएनए इंटरैक्शन और हिस्टोन संशोधनों को स्थिर करने के लिए विचार किया जा सकता है।

यद्यपि इस पेपर से पता चलता है कि एफएसीएस-पृथक उपग्रह कोशिकाओं पर कट एंड रन परख आयोजित की जा सकती है, अन्य विश्लेषण जो गैर-निश्चित क्रोमैटिन जैसे एटीएसी-सेक का उपयोग करते हैं, वे भी किए जा सकते हैं। इसके अलावा, भले ही यहां मांसपेशियों को बेसल शारीरिक स्थितियों में काटा गया था, इस प्रोटोकॉल को चोट या उम्र बढ़ने जैसे रोग संबंधी संदर्भों पर लागू किया जा सकता है। ये सभी प्रोटोकॉल उपयोग उपग्रह कोशिकाओं में जीन नियामक तंत्र की विस्तृत समझ की अनुमति देंगे, और यह समझने में मदद कर सकते हैं कि पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों द्वारा इन तंत्रों को कैसे बदला जा सकता है।

सारांश में, यह कम लागत और समय-कुशल प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशी अग्रदूत कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक भर्ती और क्रोमैटिन परिदृश्य का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी प्रयोगात्मक सेटिंग प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल द्वारा तैयार क्रोमैटिन ने उपग्रह कोशिकाओं में एआर सिस्ट्रोम का पहला जीनोम-व्यापी विश्लेषण प्रदान किया है और जीन विनियमन पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए अनास्तासिया बानवर्थ को धन्यवाद देते हैं। हम आईजीबीएमसी पशु घर सुविधा, सेल कल्चर, माउस क्लिनिकल इंस्टीट्यूट (आईसीएस, इलकिर्च, फ्रांस), इमेजिंग, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, फ्लो साइटोमेट्री और जेनोमईस्ट प्लेटफॉर्म को धन्यवाद देते हैं, जो 'फ्रांस जेनोमिक' कंसोर्टियम (एएनआर -10-आईएनबीएस -0009) का सदस्य है।

इंटरडिसिप्लिनरी थीमैटिक इंस्टीट्यूट आईएमसीबीआईओ का यह काम, स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय, सीएनआरएस और इनसेरम के आईटीआई 2021-2028 कार्यक्रम के हिस्से के रूप में, आईडीएक्स यूनिस्ट्रा (एएनआर -10-आईडीईएक्स -0002) और एसएफआरआई-स्ट्रैट'यूएस परियोजना (एएनआर 20-एसएफआरआई-0012) और यूरो आईएमसीबीआईओ (एएनआर -17-यूरो -002) द्वारा समर्थित था। आईएनएसईआरएम, सीएनआरएस, यूनिस्ट्रा, आईजीबीएमसी, एजेंस नेशनल डे ला रेचरचे (एएनआर-16-सीई11-0009, एआर2जीआर), एएफएम-टेलेथन रणनीतिक कार्यक्रम 24376 (डीडी को), आईएनएसईआरएम युवा शोधकर्ता अनुदान (डीडी को), एएनआर -10-एलएबीएक्स-0030-आईएनआरटी और एएनआर द्वारा प्रबंधित एक फ्रांसीसी राज्य निधि द्वारा अतिरिक्त वित्त पोषण प्रदान किया गया था। जे.आर. को यूनिवर्सिटी फ्रैंको-एलेमांडे और मिनिस्टेरे डी एल'एनसेग्नेमेंट सुपेरिअर डी ला रेचरचे एट डी एल'इनोवेशन से प्रोग्राम सीडीएफए-07-22 द्वारा समर्थित किया गया था, और केजी को एसोसिएशन ऑफ ला रेचरचे ए एल'आईजीबीएमसी (एआरआई) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

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References

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Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

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