Summary
여기에 제시된 것은 뉴클레아제를 사용한 표적 절단 및 방출에 의한 근육 섬유의 전사 조절 연구에 적합한 마우스 사지 근육 위성 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분리를 위한 효율적인 프로토콜입니다(CUT&RUN).
Abstract
작은 세포 집단을 사용한 게놈 전체 분석은 특히 줄기 세포 분야에서 연구의 주요 제약 조건입니다. 이 연구는 구조 단백질 함량이 높은 조직인 사지 근육에서 위성 세포를 분리하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 성인 마우스에서 절개된 사지 근육은 dispase 및 type I 콜라겐분해효소가 보충된 배지에서 다져서 기계적으로 파괴되었습니다. 분해 시, 균질액을 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 세포를 FACS 완충액에 현탁시켰다. 생존율은 고정 가능한 생존도 염색으로 측정하고, 면역염색된 위성 세포는 FACS로 분리했습니다. 세포를 Triton X-100으로 용해시키고 방출된 핵을 콘카나발린 A 자성 비드에 결합시켰습니다. 핵/비드 복합체는 전사 인자 또는 관심 히스톤 변형에 대한 항체와 함께 배양되었습니다. 세척 후, 핵/비드 복합체를 단백질 A-마이크로코커스 뉴클레아제로 배양하고, 염색질 절단은 CaCl2로 개시하였다. DNA 추출 후, 라이브러리를 생성하고 서열을 분석하고, 생물정보학 분석을 통해 게놈 전체 전사 인자 결합 및 공유 히스톤 변형에 대한 프로파일을 얻었다. 다양한 히스톤 마크에 대해 얻은 피크는 결합 이벤트가 위성 세포에 특이적임을 보여주었습니다. 또한, 알려진 모티프 분석은 전사 인자가 동족 반응 요소를 통해 염색질에 결합되어 있음을 밝혔습니다. 따라서 이 프로토콜은 성체 마우스 사지 근육 위성 세포의 유전자 조절을 연구하는 데 적합합니다.
Introduction
골격근은 평균 인체 전체 체중의 40%를 차지한다1. 근섬유는 손상 시 현저한 재생 능력을 나타내는데, 이는 새로 형성된 근세포의 융합과 손상된 근섬유를 대체하는 새로운 근섬유의 생성으로 설명된다2. 1961년, 알렉산더 마우로(Alexander Mauro)는 위성 세포(satellite cell)라고 명명한 단핵 세포(mononuclear cell)의 집단을 보고했다.3 이들 줄기세포는 전사인자 쌍을 이루는 상자7(PAX7)을 발현하며, 근섬유의 기저층(basal lamina)과 근섬유(sarcolemma) 사이에위치한다4. 이들은 분화 클러스터 34(CD34, 조혈, 내피 전구 세포 및 중간엽 줄기 세포 마커), 인테그린 알파 7(ITGA7, 부드러운 심장 및 골격근 마커) 및 C-X-C 케모카인 수용체 유형 4(CXCR4, 림프구, 조혈 및 위성 세포 마커)5를 발현하는 것으로 보고되었습니다. 기초 조건에서, 위성 세포는 정지 상태를 유지하는 특정 미세환경에 상주한다6. 근육이 손상되면 근육이 활성화되고 증식하며 근육 형성을 겪는다7. 그러나 전체 근육 세포 수의 극히 일부에만 기여하기 때문에 게놈 전체 분석은 특히 생리학적 환경(전체 세포의 <1%)에서 특히 까다롭습니다.
위성 세포로부터 염색질 분리를 위한 다양한 방법이 설명되었는데, 이는 염색질 면역침전 후 대규모 병렬 염기서열분석(ChIP-seq) 또는 표적 및 태깅 하에서의 절단(CUT&Tag) 실험을 포함합니다. 그럼에도 불구하고 이 두 가지 기술에는 도전하지 않은 몇 가지 중요한 한계가 있습니다. 실제로, ChIP-seq는 충분한 염색질을 생성하기 위해 많은 양의 출발 물질을 필요로하며, 그 중 상당 부분은 초음파 처리 단계에서 손실됩니다. CUT&Tag는 낮은 세포 수에 더 적합하지만 Tn5 전이효소 활성으로 인해 ChIP-seq보다 더 많은 off-target 절단 부위를 생성합니다. 또한, 이 효소는 개방 염색질 영역에 대한 친화력이 높기 때문에 침묵된 헤테로크로마틴 8,9 대신 게놈의 능동적으로 전사된 영역과 관련된 히스톤 변형 또는 전사 인자를 분석하기 위해 CUT&Tag 접근법을 우선적으로 사용할 수 있습니다.
여기에 제시된 것은 뉴클레아제(CUT&RUN)10,11 분석을 사용하여 표적 아래 절단 및 방출을 위해 FACS에 의해 마우스 사지 근육 위성 세포를 분리할 수 있는 자세한 프로토콜입니다. 다양한 단계에는 조직의 기계적 파괴, 세포 분류 및 핵 분리가 포함됩니다. 생존 가능한 세포 현탁액의 제조와 관련하여이 방법의 효율성은 공유 히스톤 변형 및 전사 인자에 대한 CUT &RUN 분석을 수행하여 입증되었습니다. 분리된 세포의 품질은 기술된 방법을 본래의 게놈 점유 상태를 충실하게 포착하는 염색질 제조에 특히 매력적으로 만들고, 특이적 유전자좌(4C-seq) 또는 게놈 전체 수준(Hi-C)에서 고처리량 시퀀싱과 함께 염색체 형태를 포착하는 데 적합할 가능성이 높다.
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Protocol
생쥐는 국가 동물 관리 지침(유럽연합 집행위원회 지침 86/609/CEE; 프랑스 법령 no.87-848) 연구를 위한 실험실 동물 사용에 관한 것입니다. 의도된 조작은 APAFIS 번호 #22281에 따라 2010/63/EU 지침에 따라 윤리적 평가 및 승인을 위해 윤리 위원회(Com'Eth, Strasbourg, France) 및 프랑스 연구부(MESR)에 제출되었습니다.
1. 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 위성 세포 분리를 위한 세포 현탁액 준비(그림 1)
- 근육 조직의 분리
- 세척제(표 1)를 사용하여 집게, 메스, 가위를 포함한 근육 해부용 도구의 오염을 제거하고 증류수로 철저히 헹굽니다.
- 각각 1mL의 근육 분리 완충액을 포함하는 2개의 2mL 튜브(표 1)를 준비하고 수확된 근육을 수집하기 위해 얼음 위에 놓습니다.
- 10주 된 C57/Bl6J 수컷 마우스 2마리를 CO2 질식 후 자궁경부 탈구로 희생합니다. 각 마우스 전체에 70% 에탄올을 뿌립니다. 집게를 사용하여 뒷다리의 피부를 벗겨냅니다. 대퇴골, 경골 및 비골을 둘러싼 모든 사지 근육을 절개합니다(마우스당 약 1mg의 근육).
알림: 위성 세포 수는 생후 15주 이후에 감소합니다. - 채취한 사지 근육을 1.1.2단계에서 준비한 1mL의 근육 분리 완충액이 들어 있는 2mL 튜브에 넣습니다. 동일한 절차에 따라 두 번째 쥐에서 근육을 수집합니다. 수확한 근육을 얼음 위에서 가위로 1mm 미만이 될 때까지 다지다3 개의 파편이 얻어집니다.
참고: 근육을 채취하여 주로 설명된 대로다졌다 12. 1.2 또는 1.3단계에 따라 조직 분해를 수행합니다.
- 콜라겐 분해 효소를 이용한 조직 분해
- 18mL의 근육 분리 완충액(5mL[5U/mL]의 디스파제와 5mg의 I형 콜라겐분해효소로 보충됨)을 포함하는 50mL 튜브(표 1)에 두 마우스의 다진 근육 현탁액을 부어 옮깁니다(표 1).
- 튜브를 단단히 닫고 실험실 필름으로 밀봉합니다(표 1). 1분 동안 37rpm에서 100°C의 흔들리는 수조(표 30)에 수평으로 놓습니다.
- 30분 후 I형 콜라겐분해효소 5mg을 추가합니다. 30rpm에서 37°C의 흔들리는 수조에서 100분 동안 튜브를 교반하면서 튜브를 유지합니다.
- 소화 시 10mL 피펫으로 근육 현탁액을 위아래로 10회 피펫팅하여 해리 효율을 향상시킵니다. 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 투명한 펠릿이 보입니다. 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 튜브에 5mL의 배지를 남깁니다.
알림: 배지를 떠나면 세포에 스트레스가 가해지는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 10mL의 새로운 근육 분리 완충액을 추가하고 10mL 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다. - 100 μm, 70 μm 및 40 μm 셀 스트레이너(각 종류 중 하나씩)(표 1)를 개방된 50mL 튜브에 놓습니다. 현탁액을 연속적인 셀 스트레이너(100 μm, 70 μm, 40 μm)에 피펫팅하고 40 μm 미만의 세포를 포함하는 50 mL 튜브로 플로우스루를 수집합니다.
- 현탁액을 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 2mL가 남을 때까지 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 버린 다음 100-200μL가 남을 때까지 0.2-1mL 피펫을 사용합니다. 펠릿을 2mL의 적혈구 용해 완충액에 재현탁시킵니다(표 2). 얼음 위에서 3분간 배양합니다.
- 4°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 20-200 μL 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 100μL의 콜드 FACS 버퍼에 셀을 재현탁합니다(표 2). 얼음 위에 놓습니다.
- Liberase thermolysin low (TL) 효소를 사용한 조직 분해를 위한 대체 방법
- 1.1단계의 설명을 따릅니다. 조직 분리용.
- Liberase 매개 조직 분해를 위해 단계 1.1.2에 설명된 근육 분리 완충액 대신 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 분리 완충액(표 2) 2mL에서 근육을 수확합니다.
- 5mg/mL에서 300 또는 600μL의 리베라아제 TL이 보충된 18mL의 RPMI 분리 완충액이 포함된 50mL 튜브(표 1)에 두 마우스의 다진 근육 현탁액을 부어 옮깁니다(표 1)(즉, 각각 0.083mg/mL 및 0.167mg/mL 최종 농도)13.
- 튜브를 단단히 닫고 실험실 필름으로 밀봉합니다(표 1). 1분 동안 37rpm에서 100°C의 흔들리는 수조(표 30)에 수평으로 놓습니다.
- 소화 시 10mL 피펫으로 근육 현탁액을 위아래로 10회 피펫팅하여 해리하고 해리 효율을 향상시킵니다.
- 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 투명한 펠릿이 보입니다. 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 튜브에 5mL의 배지를 남깁니다. 배지를 떠나면 세포에 스트레스가 가해지는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 10mL의 새 RPMI 분리 버퍼를 추가하고 10mL 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.
- 100 μm, 70 μm 및 40 μm 셀 스트레이너(각 종류 중 하나씩)(표 1)를 개방된 50mL 튜브에 놓습니다.
- 현탁액을 연속적인 셀 스트레이너(100 μm, 70 μm, 40 μm)에 피펫팅하고 40 μm 미만의 세포가 들어 있는 50 mL 튜브로 플로우스루를 수집합니다.
- 현탁액을 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 2mL가 남을 때까지 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 버린 다음 100-200μL가 남을 때까지 0.2-1mL 피펫을 사용합니다.
- 펠릿을 2mL의 적혈구 용해 완충액에 재현탁시킵니다(표 2). 얼음 위에서 3분간 배양합니다.
- 4°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 20-200 μL 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.
- 100μL의 콜드 FACS 버퍼에 셀을 재현탁합니다(표 2). 얼음 위에 놓습니다.
- FACS 분리를 위한 세포 현탁액 준비
- 1.2.12단계에서 얻은 세포 현탁액 10μL를 새 1.5mL 튜브에 옮깁니다. 이 샘플은 염색되지 않은 대조군 또는 음성 대조군을 구성합니다(그림 2). 190μL의 FACS 완충액을 추가하고 5mL 튜브(표 1)로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.
- 단계 1.2.12에서 얻은 셀 현탁액의 나머지 90μL를 4°C, 400xg에서 5분 동안 원심분리하고 피 펫(20-200μL 팁 부피)을 사용하여 상층액을 폐기합니다. 실온(RT)에서 15분 동안 혈청이 없는 Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM)에 희석한 400μL의 고정 가능한 생존도 염색(표 3)으로 세포를 배양합니다.
- 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척하고 100μL의 FACS 완충액을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집고 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
- 원심분리 시간 동안 형광단에 결합되고 CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 및 CXCR4(표 3)에 대해 유도된 1차 항체의 마스터 믹스 100μL를 FACS 완충액에 희석하여 준비합니다.
- 4 °C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하고, 피펫(20-200 μL 팁 부피)을 사용하여 세포 상층액을 버리고, 100 μL 항체 혼합물을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집습니다. 소용돌이치지 마십시오. 얼음 위의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
- 400 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 20-200 μL 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 500 μL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 세포를 세척합니다. 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집습니다. 4 °C에서 5분 동안 400 x g 에서 다시 원심분리하고 20-200 μL 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.
- 세포 펠릿을 500μL의 FACS 완충액에 재현탁시키고 현탁액을 5mL 튜브로 옮깁니다.
주: Liberase 소화에서 얻어진 세포 현탁액은 동일한 방법으로 가공됩니다.
- FACS에 의한 위성 셀 선택
- 세포 현탁액을 간단히 소용돌이치고(2-5초) 100μm 노즐이 장착된 유세포 분석기에서 세포를 처리합니다(표 1).
- 1.4.1단계에서 보관된 염색되지 않은 시료를 기준으로 다양한 게이트 크기를 결정합니다(그림 2).
- 5mL 튜브에 1mL의 순수 태아 송아지 혈청(FCS)을 코팅하여 세포 수집을 개선하고 500μL의 FACS 완충액을 추가합니다.
- 염색되지 않은 검체를 항체 표지 검체로 교환합니다.
- 전방 산란 영역(FSC-A)과 측면 산란 영역(SSC-A)에 따라 관심 모집단을 선택하고(그림 3A), FSC-A 및 전방 산란 높이(FSC-H)가 있는 doublet cell을 제거합니다(그림 3B)14.
- 고정 가능한 생존력 염색 음성 염색으로 살아있는 세포를 식별합니다(그림 3C).
- CD31, CD45, TER119 및 CD11b에 대한 음성 셀을 선택합니다(그림 3D).
- 위성 세포를 식별하려면 먼저 CD34 및 ITGA7에 대해 양성인 세포를 선택한 다음(그림 3E) CD34 및 ITGA7 선택 모집단에서 CXCR4 양성 세포를 선택합니다(그림 3F).
- 500μL의 FACS 완충액이 들어 있는 5mL 코팅 튜브에서 선택한 세포(전처리 품질에 따라 40,000개에서 80,000개 사이)를 수집합니다.
2. 조직 배양에서 분리된 집단의 검증
- 하이드로겔을 이용한 슬라이드 코팅
- 순수 하이드로겔 인간 배아 줄기 세포(hESC) 인증 매트릭스(표 1) 280μL를 무혈청 DMEM/F12 배지 12mL에 희석합니다.
- 챔버 슬라이드(표 1)에 하이드로겔 용액을 코팅하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 다음날 챔버 슬라이드를 37 °C 및 5 % CO2 에서 1 시간 동안 배양 한 후 세포 파종 전.
- 세포 성장 및 분화
- 웰당 1.5.9단계에서 얻은 약 20,000개의 세포를 도금하고 성장 배지(표 2)에서 5일 동안 성장시킵니다. 제제의 품질을 보장하기 위해 면역형광 분석을 위해 처리하기 전에 명시야 현미경을 사용하여 위상차 이미지를 촬영합니다(그림 4A).
- 근육 형성을 유도하기 위해 2.2.1 단계에서 근육 생성 배지 (표 2)에서 증폭 된 위성 세포를 추가로 7 일 동안 성장시킵니다. 면역형광 분석을 위해 처리하기 전에 명시야 현미경(그림 4C)을 사용하여 위상차 이미지를 촬영하여 제제의 품질을 보장합니다(그림 4D).
- 면역세포 형광 분석
- 배지를 부드럽게 제거하고 챔버 슬라이드에서 배양한 세포를 1x PBS 100μL로 두 번 세척하고 RT에서 1시간 동안 100μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다.
알림: 이 단계는 주의해서 수행해야 합니다. 세포에 스트레스를 가하는 것을 방지하기 위해 항상 챔버에 소량의 매체를 보관해야 하며 PBS는 챔버 벽을 통해 부어야 합니다. - 세포막을 투과시키기 위해 0.1% 트윈 20(PBST)을 보충한 1x PBS 100μL로 세포를 세 번 세척합니다.
- RT에서 1시간 동안 5% FCS(PBST-FCS)가 보충된 1x PBST의 100μL에서 배양하여 비특이적 신호를 차단합니다.
- 4°C에서 밤새 항-PAX7 및 항-디스트로핀(DMD) 항체(1x PBST-FCS로 희석)의 마스터 믹스 100μL로 세포를 배양하여 위성 세포와 근섬유를 각각 검출합니다.
- 1x PBST의 100 μL로 세포를 3 회 세척하고, 1 시간 동안 RT에서 1x PBST-FCS에 희석 된 100 μL의 염소 항 마우스 Cy3 또는 염소 항 토끼 Alexa 488 2 차 항체 (표 3)로 배양합니다.
- 공급업체에서 제공한 장비를 사용하여 슬라이드에서 챔버 웰을 분리하고 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)이 포함된 20μL의 수성 장착 매체를 추가하고 슬라이드를 커버슬립으로 덮습니다(표 1).
- 컨포칼 현미경으로 염색된 세포의 이미지를 관찰하고 캡처합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다(그림 4B,D).
- 배지를 부드럽게 제거하고 챔버 슬라이드에서 배양한 세포를 1x PBS 100μL로 두 번 세척하고 RT에서 1시간 동안 100μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다.
3. CUT&RUN 분석
- FACS 분리 위성 셀에 대한 CUT&RUN 분석을 위한 시료 전처리
참고: CUT&RUN은 기본적으로 설명된 대로 수행되었습니다.10,15. 버퍼 조성물은 표 2.- CUT&RUN 분석의 경우 검사해야 하는 샘플/항체당 방법 1, 1.5.9단계에서 얻은 약 40,000개의 세포를 사용합니다.
- FACS 분리 위성 셀을 RT에서 500 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음 피펫(20-200 μL 팁 부피)을 사용하여 상층액을 버립니다.
- 1x PBS 1mL로 세포를 세척하고, 실온에서 500 x g 으로 5분 동안 원심분리하고, 피펫(0.2-1mL 팁 부피)을 사용하여 상층액을 폐기하고, 1mL의 저온 핵 추출 버퍼에 재현탁시킵니다(표 2). 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
- 배양 중에 850μL의 냉간 결합 완충액이 들어 있는 1.5mL 튜브 1개를 준비하고(표 2) 샘플당 20μL의 concanavalin A 코팅 마그네틱 비드를 추가합니다(표 1).
- 마그네틱 랙을 사용하여 1mL의 콜드 바인딩 버퍼로 비드를 두 번 세척합니다(표 1). 절차 전반에 걸쳐 세척 또는 완충액을 교체할 때마다 비드가 마그네틱 랙의 튜브 측면에 5분 동안 축적되도록 한 후 피펫(0.2-1mL 팁 부피)으로 투명화된 상청액을 제거합니다. 그런 다음 300μL의 콜드 바인딩 버퍼에 부드럽게 재현탁합니다.
- 핵을 4°C, 600 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 600μL의 핵 추출 완충액에 부드럽게 재현탁시킵니다. 추출된 600μL의 핵을 300μL의 concanavalin A 비드 슬러리와 부드럽게 혼합하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 3.1.4 단계에서 설명한 대로 마그네틱 랙을 사용하여 상층액을 제거하고 1mL의 콜드 블로킹 버퍼로 비드 결합 핵을 부드럽게 재현탁합니다(표 2). 상온에서 5분 동안 배양합니다.
- 마그네틱 랙을 사용하여 상층액을 제거하고 1mL의 냉수 세척 완충액으로 비드 결합 핵을 두 번 세척합니다(표 2). 두 번째 세척 중에 비드 결합 핵을 1.5mL 튜브로 균등하게 분할합니다. 각 튜브는 다음 단계에서 특정 항체로 치료됩니다.
참고: 이 예에서는 250μL의 비드 결합 핵을 4개의 1.5mL 튜브로 분할했습니다. - 3.1.4단계에 설명된 대로 마그네틱 랙을 사용하여 상층액을 분리하고 피펫으로 흡입합니다. 특정 1차 항체(표 3) 또는 250μL의 냉수 완충액에 희석된 다른 종(여기서는 토끼)의 IgG를 사용하여 핵/비드 복합체를 부드럽게 재현탁시킵니다. 4 °C에서 밤새 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
참고: 여기에 사용된 항체는 AR, H3K4me2 및 H3K27ac에 대한 것입니다. - 단계 3.1.4에 설명된 대로 마그네틱 랙으로 상층액을 제거하고, 1mL의 냉세척 완충액으로 비드 결합 핵을 2회 세척하고, 100μL의 냉세척 완충액에 재현탁합니다.
- 단백질 A-마이크로코칼 뉴클레아제를 1.4ng/μL로 희석하여 냉간 세척 완충액 샘플당 100μL로 희석합니다.
- 3.1.11에서 얻은 100μL의 샘플에 단백질 A-마이크로코칼 뉴클레아제 100μL를 첨가하고 교반하면서 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 단계 3.1.4에 설명된 대로 마그네틱 랙으로 상층액을 제거하고, 1mL의 냉수 완충액으로 2회 세척하고, 150μL의 냉세척 완충액에 비드 결합 핵을 재현탁시킵니다.
- DNA 절단을 시작하려면 150μL의 샘플에 100mM의 CaCl2 3μL를 추가하고 튕겨 빠르게 혼합한 다음 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 150μL의 정지 완충액을 첨가하여 반응을 중지하고 37°C에서 20분 동안 배양하여 RNA를 분해하고 DNA 단편을 방출합니다.
- DNA 추출의 경우 샘플을 4°C에서 16,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 새 미세분리 튜브로 옮기고 펠릿과 비드를 버립니다.
- 3μL의 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 2.5μL의 20mg/mL 단백질 분해효소 K를 추가합니다. 70°C에서 10분간 배양합니다(흔들지 않음).
- 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 300μL, 와류를 넣고 2mL 위상 고정 튜브(16,000 x g에서 5분 동안 사전 회전)로 옮기고 4°C에서 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 동일한 튜브에 클로로포름 300μL를 추가하고 4°C에서 16,000 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다. 피펫(0.2-1 mL 팁 부피)으로 상층액(~300 μL)을 수집하고 새 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
- 1μL의 글리코겐(20mg/mL 농도)을 추가합니다.
- 750μL의 100% 에탄올을 넣고 -20°C에서 밤새 침전시킵니다.
- 4°C에서 16,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 DNA를 펠렛화합니다. 펠릿을 100% 에탄올 1mL로 세척하고, 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 16,000 x g에서 30초 동안 원심분리하고, 피펫(20-200 μL 팁 부피)으로 액체를 제거합니다.
- 펠릿을 ~5분 동안 자연 건조합니다. 25 mM Tris-HCl (pH 8) 및 0.1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, pH 8)의 8 μL에 재현탁 시키십시오.
- 생물정보학 분석
- 면역절단된 DNA로부터 라이브러리를 준비하고 설명된 대로 게놈 플랫폼의 도움을 받아 paired-end 100 bp 판독으로 염기서열을 분석합니다16.
- ENCODE 블랙리스트 영역(V2)과 겹치는 읽기를 제거하고 나머지 읽기를 두 그룹으로 분리합니다: 단편 크기 <120 bp (뉴클레오솜 없음, 일반적으로 전사 인자의 경우) 및 절편 크기 >150 bp (뉴클레오솜 포함, 일반적으로 히스톤 표시용). Bowtie 2(v2.3.4.3)17을 사용하여 mm10 참조 게놈에 매핑합니다.
- bamCoverage를 사용하여 bigwig 파일을 생성합니다(deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
- 추가 분석을 위해 고유하게 매핑된 읽기를 유지합니다.
- genomeCoverageBed(bedtools v2.26.0)를 사용하여 원시 베드그래프 파일을 생성합니다.
- 피크 호출에 SEACR 1.3 알고리즘(엄격한 옵션)을 사용합니다. 제로 신호를 포함하는 영역을 생략하는 UCSC 베드그래프 형식으로 대상 데이터 베드그래프 파일을 로드하고, 피크 호출18에 대한 경험적 임계값을 생성하기 위해 제어(IgG) 데이터 베드그래프 파일을 로드합니다.
- deeptools를 사용하여 Pearson 상관 분석을 수행하여 샘플 간의 유사성을 확인합니다19. 명령줄 multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab을 차례로 사용합니다.
- 베드그래프 파일과 SEACR에서 얻은 베드 파일 피크를 사용하여 IGV20 으로 게놈 전체 강도 프로파일을 시각화합니다.
- 피크 주석 및 모티프 검색에 HOMER 사용21.
- 마지막으로, ChIP-Atlas Peak 브라우저를 사용하여 이전에 게시된 데이터 세트와 데이터 세트를 비교하여 IGV에서 시각화하거나 SEACR 생성 베드 파일을 입력 데이터 세트22로 사용하여 농축 분석을 수행합니다.
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Representative Results
마우스 골격근으로부터의 위성 세포는 Gunther et al.(이하, 프로토콜 1)12 및 Liu et al.23 (이하 프로토콜 2)의 프로토콜을 결합하여 분리하였다. 프로토콜 1에서 제안된 콜라겐분해효소 및 디스파아제의 농도를 사용할 때 소화되지 않은 근섬유가 소화 후에 관찰되었기 때문에, 단계 1.2.1 및 1.2.3에 기술된 바와 같이 근섬유 해리를 개선하기 위해 효소의 양을 증가시켰다. 프로토콜 2에 표시된 바와 같이, 샘플은 세포 생존력을 유지하기 위해 수조에서 부드러운 교반을 거쳤습니다. 프로토콜 1에서 언급한 바와 같이 세포 스트레이너를 통한 여과 및 적혈구 용해 완충액으로 배양을 수행했습니다(1.2.7-1.2.10단계 참조). 프로토콜 1에서는 세포를 30%/70%의 Percoll 밀도 구배로 로드하여 간기에서 단핵 세포를 분리했으며, 이는 관심 세포의 손실로 이어질 수 있습니다. 따라서 이 단계는 프로토콜 2에서 제안된 대로 생략되었습니다.
FSC-A 대 SSC-A 게이팅은 크기(FSC) 및 입도(SSC)를 기준으로 단핵 세포를 식별하는 데 사용되었습니다(그림 3A). FSC-A 축에서 40K 미만의 이벤트를 무시하여 파편을 배제하고 세포의 38.8% ± 3.6%를 선택했습니다. FSC-A 대 전방 산란 높이(FSC-H) 게이팅 밀도 플롯은 이중항 배제를 위해 사용되었습니다(그림 3B). 고정 가능한 생존도 염색 마커에 대해 음성인 세포를 선택한 후 평균 34.3% ± 7.7%의 살아있는 세포를 얻었습니다(그림 3C).
그림 3C의 점도표에 표시된 백분율(75.4%)은 모세포 집단(이 경우 단일 세포)에서 계산된 단일 살아있는 세포의 비율에 해당합니다. 단일 셀의 95.7%는 전체 이벤트의 35%를 차지하는 라이브 이벤트에서 얻습니다. 따라서 평균적으로 얻은 백분율 34.3%는 상위 모집단이 아닌 전체 사건에서 계산됩니다.
단일 살아있는 세포의 약 3%는 백혈구-(CD45), 단핵구-(CD11b), 내피-(CD31) 및 적혈구 특이적(TER119) 마커에 대해 음성이었습니다(그림 3D). CD11b/CD45/CD31/TER119 음성 세포는 CD34(조혈, 내피 전구 세포 및 중간엽 줄기 세포) 및 ITGA7(심장, 평활근 및 골격근 세포) 마커의 발현에 따라 선택되었습니다(그림 3E). CXCR4(림프구, 조혈 및 위성 세포)에 대한 최종 게이팅을 수행하여 추정 위성 세포를 선택했습니다(그림 3F). CD34+/ITGA7+ 세포에서 ~80%가 CXCR4에 대해 양성인 것으로 밝혀졌는데, 이는 전체 단일 살아있는 세포의 평균 1% ± 0.15%를 나타내며, 14개의 독립적인 실험에서 마우스 사지 근육당 60,000개 ± 14,000개의 추정 위성 세포의 절대 수를 나타냅니다. CXCR4+ 세포 분획에 대한 추가 리조트 평가는 사후 분류 후 살아있는 세포의 약 80%가 얻어졌으며, 그 중 거의 70%가 CXCR4+(그림 S1)인 것으로 나타났으며, 이는 이 FACS 분리 세포 집단의 높은 생존력과 순도를 보여줍니다.
다양한 연구에서 세포 분리에 대한 콜라겐 분해 효소와 리베라 제 TL 효소의 효율을 비교했기 때문에,24,25,이 두 가지 분해 방법은 병렬로 처리되었습니다. 300 μL의 리베라아제 TL을 사용하면 소화되지 않은 섬유질이 남아 있기 때문에 콜라겐분해효소보다 소화 효율이 떨어졌습니다. 또한, 더 많은 세포 파편과 큰 사건이 관찰되었으며(그림 S2A,B), FVS 780 선택 후 단일 살아있는 세포의 평균 17.3%만이 얻어졌습니다(그림 S2C). 리브라아제 소화에 대한 추가적인 우려는 CXCR4 게이팅이 유사하더라도 콜라겐분해효소(그림 S2D-S2E)에 비해 CD34+/ITGA7+ 세포 수가 적다는 것입니다(그림 S2F). 600 μL의 Liberase TL을 사용하면 분해가 더 효율적입니다. 그러나 세포 잔해의 양은 여전히 증가했고 세포 생존율은 표준 이하(16.3%)였습니다(그림 S3). 따라서 Liberase TL을 사용한 분해는 위성 세포 분리에 덜 효율적이었습니다.
시드 시 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 세포의 70% 이상(그림 4A)은 PAX7 음성인 CD34+/ITGA7/CXCR4- 세포(그림 4C)와 달리 PAX7을 발현했습니다(그림 4B). CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 세포는 디스트로핀(DMD) 염색(그림 4D)에서 알 수 있듯이 7일 동안 근육 형성 배지에서 추가로 성장했을 때 근육 섬유로 분화할 수 있었습니다. 따라서 조직 배양 및 면역형광 분석을 결합한 결과 FACS 분리 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 세포가 위성 세포임을 알 수 있었습니다.
분리된 위성 세포가 CUT&RUN 분석에 적합한지 여부를 결정하기 위해 활성 프로모터 및 인핸서 영역에서 발견되는 두 가지 히스톤 변형인 히스톤 H3의 아세틸화 라이신 27(H3K27ac) 및 디메틸화 라이신 4(H3K4me2)의 게놈 프로파일을 측정했습니다. 우리의 데이터는 H3K4me2 및 H3K27ac에 대해 각각 68,694 및 13,514 피크를 발견했으며, 두 히스톤 마크 사이에 유사한 게놈 재분할이 있었습니다(그림 S4A). 상세하게, 피크의 1/4은 가장 가까운 유전자의 전사 시작 부위(TSS)로부터 2 kb ± 위치했으며, 대다수는 TSS에서 -100 kb 내지 -10 kb 또는 10 kb 내지 100 kb 중 어느 쪽에 위치하였다(그림 S4B). 참고로, Pearson 분석은 H3K27ac와 H3K4me2 판독 프로파일 간에 80%의 상관관계를 보여주었습니다(그림 S4C). 상술한 프로토콜로부터 제조된 염색질이 위성 세포로부터 분리되었다는 것을 평가하기 위해, 위성 세포 특이적 유전자의 프로모터에서 H3K27ac 및 H3K4me2의 존재를 결정하였다. H3K4me2는 Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 및 Vcam1(그림 5A)의 TSS 주변에서 농축되었지만, Itgam(CD11b) 및 Ptprc(CD45)(면역 세포), Pecam(CD31, 내피 세포)(그림 5B), Ckm(근육 섬유 발달) 또는 Myh3(myosin 중쇄 고속 배아, 근섬유)(그림 5C)에서는 농축되지 않았습니다. H3K27ac에서도 유사한 결과를 얻었습니다(그림 5). IgG 샘플에서는 거의 신호가 수집되지 않았습니다(그림 5). 또한, SEACR에서 얻은 H3K27ac 피크와 공개된 ChIP-seq 데이터 세트에서 MACS2 피크 호출로 인한 피크를 비교한 결과, 각 패널 아래에 나와 있는 바와 같이 높은 상관관계를 보여주었습니다(ChIP-Atlas 트랙; 그림 5). 이러한 결과는 생물정보학 분석 후 얻은 판독값이 FACS 분리 위성 세포의 염색질에서 유래하고 이전에 ChIP-seq 분석으로 식별된 판독값과 상관관계가 있음을 나타냅니다.
마우스 위성 세포에서의 단일-세포 RNA 서열분석 연구는 분리 절차(26)에 의해 야기된 현저한 스트레스 반응을 보여주었지만, H3K4me2 또는 H3K27ac의 존재는 Atf3, Azin1, Gls, 및 Elf2로 예시된 바와 같이 스트레스 반응 유전자에서 결정되었다. 그 결과는 H3K27ac 마크가 그러한 유전자의 프로모터에 증착되지 않고, H3K4me2의 수준이 위성 세포 특이적 유전자에 대해 얻어진 것에 비해 낮게 유지된다는 증거를 제공한다(그림 S5). 따라서 이러한 데이터는 격리 절차가 얼마나 경미한지를 강조합니다.
다음으로, 전사 인자에 대한 분리 방법의 적합성을 조사했습니다. 핵 수용체 슈퍼패밀리에 속하고 근육 분화에 중요한 역할을 하는 전사 인자인 안드로겐 수용체(AR)에 대한 CUT&RUN 분석은27 7,840개의 피크를 밝혀냈습니다. 이러한 피크는 주로 TSS에서 -100 kb 내지 -10 kb 또는 10 kb 내지 100 kb 중 하나인 인트론 및 유전자 간 영역(그림 S4A)에 위치하였다(그림 S4B). 계통발생학적 분석은 AR이 글루코코르티코이드(GR/Nr3c1), 미네랄로코르티코이드(MR/Nr3c2) 및 프로게스테론(PR/Nr3c3) 수용체와 함께 옥소스테로이드 핵 수용체 아과(28)의 구성원이며, 3개의 염기쌍으로 분리된 2개의 5′-RGAACA-3′ 회문 반부위로 구성된 DNA 세그먼트에 호모다이머로 결합한다는 것을 밝혔다 29. 모티프 농축의 초기하학적 최적화(HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/)를 통해 알려진 모티프를 검색한 결과, AR은 5′-RGRNCA-3′ AR 반부위 모티프, 전형적인 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ 옥소스테로이드 모티프(그림에서 PR로 지칭됨) 및 표적 영역의 >32%, 17% 및 2%에서 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR 합의 모티프에 결합되어 있음이 밝혀졌습니다. 각각(그림 6A). 골격근(16)에서 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor)에 대해 유사한 비율이 이전에 얻어졌다는 것을 주목해야 한다.
SEACR 분석은 최고 점수 >50으로 거의 500개의 피크를 공개했으며 그 중 200개 이상이 >100점; 그 중 일부는 도 6B에 예시되어 있다. 또한 분석한 결과, 폴리아민 생합성(Amd1, Oat, Smox)과 전립선암(Acox1, Fkbp5, Tmprss2)에 관여하는 유전자의 결합 부위에서 AR이 약간 강화되는 것을 확인할 수 있었습니다(그림 S6). 흥미롭게도, AR은 위성 세포 줄기(Pax7, Cxcr4 및 Cd34)에 관여하는 유전자 자리에서 발견되었습니다(그림 S7). 주목할 점은 옥소스테로이드 반응 요소가 이러한 AR 농축 영역 각각에서 발견되었으며(그림 S6 및 그림 S7), CUT&RUN 데이터에서 볼 수 있는 AR 신호가 매우 특이적임을 보여줍니다.
그림 1: 쥐의 사지 근육에서 위성 세포를 분리하는 데 사용되는 프로토콜의 개략도 . 프로토콜은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다. 간단히 말해서 쥐를 희생시키고 뒷다리 근육을 수확하고(1.1.1-1.1.3단계) 가위를 사용하여 기계적으로 다집니다(1.4-1.5단계). 그 다음에는 1.2.1-1.2.4 단계가 이어지며, 이 단계에서 콜라겐분해효소와 디스파제를 사용하여 수조에서 근육을 해리합니다. 단계 1.2.5-1.2.8에서, 세포 현탁액은 100, 70 및 40 μm 세포 스트레이너를 통해 연속적으로 여과되고, 적혈구 용해 완충액을 사용하여 적혈구를 제거한다(단계 1.2.9-1.2.12). 나머지 세포 집단은 1.3단계에서 형광단에 결합된 항체로 표지되며, 이는 특정 세포 표현형 마커에 대해 지시됩니다. 1.4단계에는 추가 적용을 위해 위성 셀을 수집하기 위해 FACS를 통과하는 샘플이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 염색되지 않은 세포 전처리의 유세포 분석 분석. (A) FSC-A 및 SSC-A 매개변수를 기반으로 한 관심 모집단의 선택. (B) FSC-A 및 FSC-H를 기반으로 한 단일 세포 식별. (C) 죽은 세포를 표시하는 고정 가능한 생존도 염색(FVS 780)에 접합된 APC-Cy7에 대해 수집된 세포의 자동 형광 역치의 특성 분석. (D-F)입니다. CD11b 항체에 접합된 PE-Cy7 및 TER119/CD45/CD31 마커(D)에 접합된 PE에 대한 자동 형광 측정, ITGA7에 접합된 Alexa fluor 488, CD34(E)에 접합된 Alexa fluor 405 및 CXCR4(F)에 접합된 APC 형광 색소에 대한 자동 형광 측정. 게이트는 블랙박스로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 위성 세포 분류를 위한 유세포 분석기 게이팅 전략. (A) FSC-A 및 SSC-A 매개변수를 기반으로 관심 모집단의 선택. (B) FSC-A 및 FSC-H를 기반으로 한 단일 세포 식별. (C) FVS 780을 이용한 살아있는 세포의 동정. (D) CD11b, CD31, CD45 및 TER119 항원에 기반한 음성 세포 선택. (E-F) CD34 및 ITGA7(E)과 CXCR4(F) 항원을 기반으로 하는 양성 세포 선택. 게이트는 블랙박스로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FACS 분리 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 및 CD34+/ITGA7-/CXCR4- 세포 분석. (A) 성장 배지에서 배양된 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 및 CD34+/ITGA7-/CXCR4- 세포의 위상차 이미지. (B) PAX7(빨간색) 및 디스트로핀(DMD, 녹색)에 대한 항체를 사용하여 성장 배지에서 배양된 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 및 CD34+/ITGA7-/CXCR4- 세포의 면역형광 분석. 핵은 DAPI(파란색)로 염색되었습니다. 자홍색 화살표는 PAX7 양성 세포를 나타냅니다. (C) 성장 배지(왼쪽 패널)에서 5일 동안 성장한 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 세포와 근육 배지(오른쪽 패널)에서 추가로 7일 동안 성장한 세포의 위상차 이미지. (D) PAX7(빨간색) 및 디스트로핀(DMD, 녹색)에 대한 항체를 사용하여 성장 배지(왼쪽 패널)에서 5일 동안 성장하고 근육 형성 배지(오른쪽 패널)에서 추가로 7일 동안 성장한 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 세포의 면역형광 분석 이미지. 핵은 DAPI(파란색)로 염색되었습니다. 자홍색 화살표는 PAX7 양성 세포를 나타냅니다. 녹색 화살표는 DMD 양성 세포를 나타냅니다. 스케일 바: 명시야 패널 = 25 μm; 면역형광 패널 = 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 위성 세포 염색질의 게놈 프로파일. CUT&RUN에 의한 위성 세포 특이적 유전자(A), 면역 및 내피 세포 특이적 유전자(B), 근섬유 특이적 유전자(C)에서 위성 세포의 염색질에 H3K4me2 및 H3K27ac의 국소화. 활성 프로모터는 녹색 박스로 표시되고, 비활성 프로모터는 갈색 박스로 표시됩니다. IgG로 수행한 CUT&RUN을 음성 대조군으로 사용했습니다. 히스톤 마크에 대한 H3K27ac 농축 분석은 각 트랙 아래에 표시됩니다. 게시된 데이터 세트의 신뢰도 수준을 보여 주는 보강 점수는 히트맵으로 표시됩니다. 갈색 별(*)은 근육 위성 세포에서 수행되는 H3K27ac ChIP-seq 피크를 나타내고, 파란색 별은 H3K4me3, 분홍색 별은 H4K16me1을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 위성 세포 염색질의 AR 게놈 분포. (A) 위성 세포의 AR 피크에 대한 HOMER 알려진 모티프 분석. PR: 프로게스테론 수용체. Nb 타겟은 특정 모티프를 나타내는 피크의 수를 나타냅니다. (B) CUT&RUN에 의해 결정된 위성 세포의 염색질에 표시된 유전자에서 H3K4me2 및 AR의 국소화. IgG로 수행한 CUT&RUN을 음성 대조군으로 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 재료, 시약 및 소프트웨어 목록. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 완충액 조성물. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 항체 참조 및 농도. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 세포 준비 후 분류의 유세포 분석 분석. (A) FSC-A 및 SSC-A 매개변수를 기반으로 관심 모집단의 선택. (B) FSC-A 및 FSC-H를 기반으로 한 단일 세포 식별. (C) 고정 가능한 생존도 염색(FVS 780)이 있는 살아있는 세포의 식별. (D) CD11b, CD31, CD45 및 TER119 항원에 기반한 음성 세포 선택. (E-F) CD34 및 ITGA7 (E) 및 CXCR4 (F) 항원을 기반으로 한 양성 세포 선택. 게이트는 블랙박스로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 300μL의 Liberase TL을 사용한 분해 후 위성 세포 분류를 위한 유세포 분석기 게이팅 전략. (A) FSC-A 및 SSC-A 매개변수를 기반으로 관심 모집단의 선택. (B) FSC-A 및 FSC-H를 기반으로 한 단일 세포 식별. (C) FVS 780을 이용한 살아있는 세포의 동정. (D) CD11b, CD31, CD45 및 TER119 항원에 기반한 음성 세포 선택. (E-F) CD34 및 ITGA7 (E) 및 CXCR4 (F) 항원을 기반으로 한 양성 세포 선택. 게이트는 블랙박스로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 600μL의 Liberase TL을 사용한 분해 후 위성 세포 분류를 위한 유세포 분석기 게이팅 전략. (A) FSC-A 및 SSC-A 매개변수를 기반으로 관심 모집단의 선택. (B) FSC-A 및 FSC-H를 기반으로 한 단일 세포 식별. (C) FVS 780을 이용한 살아있는 세포의 동정. (D) CD11b, CD31, CD45 및 TER119 항원에 기반한 음성 세포 선택. (E-F) CD34 및 ITGA7 (E) 및 CXCR4 (F) 항원을 기반으로 한 양성 세포 선택. 게이트는 블랙박스로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: H3K4me2, H3K27ac 및 AR 게놈 위치의 특성화. (A) 위성 세포의 게놈 특징에 따른 H3K4me2, H3K27ac 및 AR의 피크 분포를 보여주는 파이 차트. (B) 위성 셀에서 가장 가까운 TSS까지의 거리에 따라 H3K4me2, H3K27ac 및 AR의 피크 분포를 나타내는 파이 차트. (C) H3K4me2, H3K27ac 및 IgG 대조군 간의 Pearson 상관 관계를 보여주는 히트맵. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: 스트레스 반응 유도 유전자에서 위성 세포 염색질의 게놈 프로파일. 위성 세포의 염색질에 표시된 유전자에서 H3K4me2 및 H3K27ac의 국소화. IgG를 사용한 면역침전은 음성 대조군으로 사용되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 6: 알려진 AR 표적 유전자에서 위성 세포 염색질의 게놈 프로파일. CUT&RUN으로 측정한 위성 세포의 염색질에 표시된 유전자에서 H3K4me2, H3K27ac 및 AR의 국소화. AR 피크는 파란색 박스로 표시되며 해당 AR 반응 요소는 아래에 나와 있습니다. IgG로 수행한 CUT&RUN을 음성 대조군으로 사용했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 7: 선택적으로 발현된 유전자에서 위성 세포 염색질의 게놈 프로파일. CUT&RUN으로 측정한 위성 세포의 염색질에 표시된 유전자에서 H3K4me2, H3K27ac 및 AR의 국소화. AR 피크는 파란색 박스로 표시되며 해당 AR 반응 요소는 아래에 나와 있습니다. IgG로 수행한 CUT&RUN을 음성 대조군으로 사용했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구는 마우스 위성 세포의 분리 및 배양을 위한 표준화되고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법과 CUT&RUN 방법에 의한 전사 조절 평가를 보고합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫 번째는 근육 파괴와 섬유질 소화를 통해 많은 수의 세포를 수집할 수 있도록 하는 것입니다. 효소 농도가 증가했음에도 불구하고, 프로토콜 1을 사용한 것보다 더 많은 살아있는 세포를 얻었다. 위성 세포는 다양한 막 단백질의 특정 패턴을 발현합니다. 분류의 엄격성을 높이기 위해, 앞서 설명한 음성(CD31, TER119, CD45 및 CD11b) 및 양성(CD34, ITGA7 및 CXCR4) 위성 셀 마커(30,31)의 조합을 사용했습니다. 이 전략을 사용하여 살아있는 추정 위성 세포의 평균 1%를 얻었습니다. 이 결과는 위성 세포가 생쥐32에서 성인기에 근육 세포 집단의 2%-7%를 대표하기 때문에 예상했던 범위 내에 있습니다. 위성 셀 선택 마커에 대한 대조군으로, CD34+/ITGA7-/CXCR4- 세포를 분리하였다. 면역형광 염색은 CD34+/ITGA7-/CXCR4- 세포가 PAX7을 발현하지 않는 반면, CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 분류 세포의 70%가 이 위성 세포 특이적 마커에 대해 양성임을 입증하여 FACS 분리 집단이 위성 세포에 해당함을 입증했습니다. 또한, 7일 동안 근육 배지에서 성장한 위성 세포의 70%는 면역염색에서 알 수 있듯이 PAX7-/DMD+였으며 길쭉한 다핵 근섬유를 형성하여 분리된 위성 세포가 줄기 전위를 보존했음을 입증했습니다.
시료 전처리의 주요 한계는 고농도의 효소를 사용하는 것인데, 이로 인해 많은 양의 해리된 생물학적 물질이 생성되지만 세포 사멸 증가에 기여할 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 더 적은 양의 효소가 필요한 분석을 테스트했습니다. 이러한 맥락에서, 전통적인 콜라겐 분해 효소33의 정제 된 형태 인 Liberase TL을 테스트했습니다. 이 효소를 사용하면 소화가 더 효율적이었지만 세포 파편의 양은 계속 증가했고 세포 생존율은 약간 낮아졌습니다. 이러한 관찰은 리베라제 매개 조직 소화를 재조합 콜라겐 분해 효소 또는 맞춤형 콜라겐 분해 효소24,25와 비교한 이전 보고서와 일치합니다. 또한, 콜라겐분해효소와 리베라아제 소화 사이에서 내피세포와 면역세포의 비율이 비슷했음에도 불구하고, 위성세포의 비율은 리베라제-처리된 샘플에서 더 낮았으며, 전반적으로 리베라아제가 위성세포 분리에 권장되지 않음을 보여주었다. 이 효소의 사용은 면역 세포의 표현형 및 정량 분석에 적합하며 결국 근육 및/또는 기타 조직의 맥락에서 권장될 수 있습니다. 이것은 효과적으로 생존 가능한 면역 세포34,35,36을 분리하는 데 가장 적합한 것으로 Liberase TL에보고 된 것과 일치합니다.
또 다른 잠재적인 문제는 위성 셀의 해리 및 분류로 인한 스트레스입니다. 그러나, H3K27ac의 부재 및 마우스 위성 세포(26)에서 단일-세포 RNA 서열분석에 의해 확인된 스트레스 반응 유전자의 프로모터 영역에서의 낮은 H3K4me2 수준은 절차가 스트레스 반응 전사 레퍼토리를 유도하지 않을 만큼 충분히 경미하다는 것을 보여준다. 주목해야 할 다른 한계는 경험적으로 남아 있는 선택된 항원입니다. 그러나, 연구는 골격근 위성 세포(30,31)에 대해 농축된 독특한 표면 마커 조합 사이의 높은 중첩을 보여준다.
또 다른 중요한 단계는 분류된 세포에서 핵을 정제하는 것입니다. 이를 위해 셀을 손상시키지 않기 위해 분류 속도를 낮게 유지하지만 FACS 버퍼에 너무 오래 저장되지 않을 만큼 충분히 빠릅니다. 실제로 CUT&RUN 핵은 고정되어 있지 않으며 배양 시간이 길면 프로토콜에서 얻은 판독에 영향을 미칠 수 있습니다. 쥐 한 마리의 뒷다리 두 개에서 추출한 일반적인 제제는 각각 2.5ng의 염색질을 사용하여 하나의 항체와 하나의 IgG 대조군으로 CUT&RUN을 허용합니다.
전사 인자 결합 및 후성유전학적 변형을 평가하기 위해 설계된 CUT&RUN 실험은 H3K4me2 및 H3K27ac에 대한 강력하고 강력한 판독 신호를 제공했습니다. 면역 세포나 내피 세포 및 근섬유에서 발현되는 유전자와 비교했을 때, 위성 세포에서 발현되는 것으로 알려진 유전자에서 H3K4me2 및 H3K27ac의 높은 판독 수준은 신호가 주로 위성 세포 핵에서 증폭됨을 보여주었습니다. 또한, 이 프로토콜은 근육 줄기 세포에서 AR의 시스트롬을 식별할 수 있게 했으며, 이는 현재까지 마우스 AR 항체의 낮은 품질과 상피 전립선 세포와 같이 안드로겐에 민감하지 않은 세포의 낮은 AR 발현 수준에 내재된 기술적 문제로 남아 있습니다. 여기에 제시된 데이터는 신뢰도 높은 최고 점수를 가진 AR 바인딩 지역을 공개했습니다. 원래는 항체당 하나의 복제물만 평가되었기 때문에 조건당 최소 2개의 생물학적 복제물을 추가하여 데이터 세트의 견고성을 향상시킬 것입니다. 그러나 AR로 알려진 표적 유전자 및 각 히스톤 마크는 원래 전립선과 같은 다른 조직 맥락에서 고도로 발현되거나 쉽게 검출 가능한 것으로 설명되었지만 발현 수준이 낮고 위성 세포에서 검출하기가 매우 어렵습니다.
CUT&RUN 접근 방식의 한 가지 한계는 고정되지 않은 셀에서 수행된다는 것입니다. 따라서 전사 인자와 결합 부위 간의 상호 작용의 불안정한 특성 때문에 일부 AR 표적을 놓쳤을 수 있습니다. 유사하게, 아세틸화(acetylation)와 같은 일부 번역 후 변형(post-translational modification)도 다소 불안정할 수 있습니다. 따라서 포름알데히드 또는 파라포름알데히드로 광 고정 단계를 포함하여 FACS 분류 후 핵을 분리하기 전에 단백질/DNA 상호 작용 및 히스톤 변형을 안정화하는 것으로 간주될 수 있습니다.
이 논문은 CUT&RUN 분석이 FACS 분리 위성 셀에서 수행될 수 있음을 보여주지만, ATAC-seq와 같은 비고정 염색질을 사용하는 다른 분석도 수행할 수 있습니다. 또한, 여기서 근육이 기초 생리학적 조건에서 수확되었음에도 불구하고, 이 프로토콜은 부상이나 노화와 같은 병리학적 맥락에 적용될 수 있습니다. 이러한 모든 프로토콜 사용은 위성 세포의 유전자 조절 메커니즘을 자세히 이해할 수 있도록 하고 이러한 메커니즘이 병태생리학적 조건에 의해 어떻게 변경될 수 있는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
요약하면, 이 저비용 및 시간 효율적인 프로토콜은 골격근 전구체 세포에서 전사 인자 모집 및 염색질 환경을 연구하기 위한 효과적인 실험 환경을 제공합니다. 이 프로토콜로 준비된 크로마틴은 위성 세포에서 AR 시트롬의 첫 번째 게놈 전체 분석을 제공했으며 유전자 조절에 대한 향후 연구를 용이하게 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
훌륭한 기술 지원을 제공해 주신 Anastasia Bannwarth에게 감사드립니다. IGBMC 동물 사육 시설, 세포 배양, Mouse Clinical Institute(ICS, Illkirch, France), 이미징, 전자 현미경, 유세포 분석 및 'France Génomique' 컨소시엄(ANR-10-INBS-0009)의 회원인 GenomEast 플랫폼에 감사드립니다.
스트라스부르 대학교, CNRS 및 Inserm의 ITI 2021-2028 프로그램의 일환으로 학제 간 주제 연구소 IMCBio의 이 작업은 IdEx Unistra(ANR-10-IDEX-0002)와 SFRI-STRAT'US 프로젝트(ANR 20-SFRI-0012) 및 EUR IMCBio(ANR-17-EURE-0023)의 지원을 받았습니다. 추가 자금은 INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon 전략 프로그램 24376 (D.D.), INSERM 젊은 연구자 보조금 (D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT 및 프레임 프로그램 Investissements d' Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02)에 따라 ANR이 관리하는 프랑스 국가 기금에 의해 전달되었습니다. J.R.은 Université franco-allemande 및 Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation의 프로그램 CDFA-07-22와 Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI)의 K.G.의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
References
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