Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En effektiv protokoll for CUT&RUN-analyse av FACS-isolerte musesatellittceller

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en effektiv protokoll for fluorescensaktivert cellesortering (FACS) isolering av mus lem muskel satellittceller tilpasset studiet av transkripsjonsregulering i muskelfibre ved spaltning under mål og frigjøring ved bruk av nuklease (CUT &RUN).

Abstract

Genombrede analyser med småcellepopulasjoner er en viktig begrensning for studier, spesielt innen stamcellefeltet. Dette arbeidet beskriver en effektiv protokoll for fluorescensaktivert cellesortering (FACS) isolering av satellittceller fra lemmermuskelen, et vev med høyt innhold av strukturelle proteiner. Dissekerte lemmemuskler fra voksne mus ble mekanisk forstyrret ved hakking i medium supplert med dispase og type I kollagenase. Ved fordøyelsen ble homogenatet filtrert gjennom cellesiler, og celler ble suspendert i FACS-buffer. Levedyktigheten ble bestemt med fikserbar levedyktighetsflekk, og immunfargede satellittceller ble isolert av FACS. Celler ble lysert med Triton X-100 og frigjorte kjerner ble bundet til concanavalin A magnetiske perler. Kjerne-/perlekomplekser ble inkubert med antistoffer mot transkripsjonsfaktoren eller histonmodifikasjoner av interesse. Etter vask ble kjerne-/perlekomplekser inkubert med protein A-mikrokokknuklease, og kromatinspaltning ble initiert med CaCl2. Etter DNA-ekstraksjon ble biblioteker generert og sekvensert, og profilene for genom-bred transkripsjonsfaktorbinding og kovalente histonmodifikasjoner ble oppnådd ved bioinformatisk analyse. Toppene oppnådd for de forskjellige histonmerkene viste at bindingshendelsene var spesifikke for satellittceller. Videre avslørte kjent motivanalyse at transkripsjonsfaktoren var bundet til kromatin via sitt kognitive responselement. Denne protokollen er derfor tilpasset for å studere genregulering i voksne mus lem muskel satellittceller.

Introduction

Skjelettstrikkede muskler representerer i gjennomsnitt 40% av vekten av den totale menneskekroppen1. Muskelfibre utviser en bemerkelsesverdig evne til regenerering ved skade, som er beskrevet ved fusjon av nydannede myocytter og generering av nye myofibre som erstatter de skadede2. I 1961 rapporterte Alexander Mauro en populasjon av mononukleære celler som han betegnet som satellittceller3. Disse stamcellene uttrykker transkripsjonsfaktorparet boks 7 (PAX7), og ligger mellom basal lamina og sarcolemma av muskelfibre4. De ble rapportert å uttrykke klyngen av differensiering 34 (CD34; en hematopoietisk, endotelial stamfar og mesenkymal stamcellemarkør), integrin alfa 7 (ITGA7; en glatt, hjerte- og skjelettmuskelmarkør), samt C-X-C kjemokinreseptor type 4 (CXCR4; en lymfocytt, hematopoietisk og satellittcellemarkør)5. I basale forhold bor satellittceller i et bestemt mikromiljø som holder dem i hviletilstand6. Ved muskelskade blir de aktivert, sprer seg og gjennomgår myogenese7. Imidlertid, som bare bidrar til en mindre brøkdel av det totale antall muskelceller, er deres genombrede analyser spesielt utfordrende, spesielt under fysiologiske innstillinger (<1% av totale celler).

Ulike metoder for kromatinisolering fra satellittceller har blitt beskrevet, som involverer kromatinimmunutfelling etterfulgt av massiv parallell sekvensering (ChIP-seq) eller spaltning under mål og tagmentation (CUT&Tag) eksperimenter. Likevel presenterer disse to teknikkene noen betydelige begrensninger som forblir uimotsagt. Faktisk krever ChIP-seq en høy mengde utgangsmateriale for å generere nok kromatin, hvorav en stor andel går tapt under sonikeringstrinnet. CUT&Tag er mer egnet for lavt cellenummer, men genererer flere off-target spaltningssteder enn ChIP-seq på grunn av Tn5-transposaseaktiviteten. I tillegg, siden dette enzymet har høy affinitet for åpne kromatinregioner, kan CUT&Tag-tilnærmingen fortrinnsvis brukes til å analysere histonmodifikasjoner eller transkripsjonsfaktorer assosiert med aktivt transkriberte regioner av genomet, i stedet for taushet heterokromatin 8,9.

Presentert her er en detaljert protokoll som tillater isolering av mus lem muskel satellittceller av FACS for spaltning under mål og frigjøring ved hjelp av nuklease (CUT &RUN) 10,11 analyse. De ulike trinnene involverer mekanisk forstyrrelse av vev, cellesortering og kjerneisolering. Metodens effektivitet, med hensyn til fremstilling av en levedyktig cellesuspensjon, ble demonstrert ved å utføre CUT&RUN-analyse for kovalente histonmodifikasjoner og transkripsjonsfaktorer. Kvaliteten på isolerte celler gjør den beskrevne metoden spesielt attraktiv for fremstilling av kromatin som fanger den opprinnelige genomiske okkupasjonstilstanden trofast, og vil sannsynligvis være egnet for å fange kromosomkonformasjonen i kombinasjon med høy gjennomstrømningssekvensering på spesifikke steder (4C-seq) eller på genombrede nivåer (Hi-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus ble holdt i et akkreditert dyrehus, i samsvar med nasjonale retningslinjer for dyrepleie (EU-kommisjonens direktiv 86/609 / CEE; Fransk dekret nr.87-848) om bruk av forsøksdyr til forskning. Tiltenkte manipulasjoner ble sendt til den etiske komiteen (Com'Eth, Strasbourg, Frankrike) og til det franske forskningsdepartementet (MESR) for etisk evaluering og autorisasjon i henhold til 2010/63/EU-direktivet under APAFIS nummer #22281.

1. Fremstilling av cellesuspensjon for isolering av satellittceller ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) (figur 1)

  1. Isolering av muskelvev
    1. Dekontaminer verktøyene for muskeldisseksjon, inkludert tang, skalpeller og saks, ved hjelp av et rengjøringsmiddel (tabell 1), og skyll grundig med destillert vann.
    2. Klargjør to 2 ml tuber (tabell 1), hver med 1 ml muskelisolasjonsbuffer, og legg dem på is for oppsamling av høstede muskler.
    3. Ofre to 10 uker gamle C57 / Bl6J hannmus ved CO2 -kvelning etterfulgt av cervikal dislokasjon. Spray 70% etanol over hver hele musen. Skrell av huden fra bakbenet ved hjelp av tang. Dissekere ut alle lemmer muskler rundt lårbenet, tibia, og fibula (ca. 1 mg muskler per mus).
      MERK: Antallet satellittceller synker etter 15 ukers alder.
    4. Plasser de høstede musklene i lemmene i rør som inneholder 1 ml muskelisolasjonsbuffer klargjort i trinn 1.1.2. Samle musklene fra den andre musen etter samme prosedyre. Hakk de høstede musklene med saks på is til mindre enn 1 mm3 fragmenter er oppnådd.
      MERK: Muskler ble samlet inn og hakket hovedsakelig som beskrevet12. Utfør vevsfordøyelse enten etter trinn 1.2 eller 1.3.
  2. Vevsfordøyelse med kollagenaseenzym
    1. Overfør den hakkede muskelsuspensjonen fra de to musene ved å helle dem i et 50 ml rør (tabell 1) inneholdende 18 ml muskelisolasjonsbuffer (supplert med 5 ml [5 E/ml] dispase og 5 mg type I kollagenase) (tabell 1).
    2. Lukk tuben godt og tett den med laboratoriefilm (tabell 1). Plasser den horisontalt i et ristende vannbad (tabell 1) ved 37 °C ved 100 o / min i 30 minutter.
    3. Etter 30 minutter, tilsett 5 mg type I kollagenase. Hold rørene i ytterligere 30 minutter under omrøring i et ristende vannbad ved 37 °C ved 100 o / min.
    4. Ved fordøyelsen pipetterer du muskelsuspensjonen opp og ned 10 ganger med en 10 ml pipette for å forbedre effektiviteten av dissosiasjonen. Sentrifuge ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter. En klar pellet vil være synlig i bunnen av røret. Kast supernatanten med en 10 ml pipette, og la det være 5 ml medium i slangen.
      MERK: Å forlate mediet bidrar til å unngå å stresse cellene. Tilsett 10 ml frisk muskelisolasjonsbuffer og resuspender pelleten ved å pipetere opp og ned med en 10 ml pipette.
    5. Plasser 100 μm, 70 μm og 40 μm cellesiler (en av hver type) (tabell 1) på åpne 50 ml rør. Pipetter suspensjonen på de påfølgende cellesilene (100 μm, 70 μm, 40 μm) og samle gjennomstrømningen inn i 50 ml rørene, som inneholder celler under 40 μm.
    6. Sentrifuger suspensjonen ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter. Kast supernatanten med en 10 ml pipette til det gjenstår 2 ml, og bruk deretter en 0,2-1 ml pipette til det gjenstår 100-200 μL. Resuspender pelleten i 2 ml lysisbuffer for røde blodceller (tabell 2). Inkuber på is i 3 min.
    7. Sentrifuge ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter og kast supernatanten med en 20-200 μL pipette. Resuspender cellene i 100 μL kald FACS-buffer (tabell 2). Plasser på is.
  3. Alternativ metode for vevsfordøyelse med Liberase termolysin lavt (TL) enzym
    1. Følg beskrivelsene i trinn 1.1. for vevsisolering.
    2. For Liberase-mediert vevsdisaggregering, høst muskler i 2 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) isolasjonsbuffer (tabell 2), i stedet for muskelisolasjonsbuffer beskrevet i trinn 1.1.2.
    3. Overfør den hakkede muskelsuspensjonen fra de to musene ved å helle dem i et 50 ml rør (tabell 1) inneholdende 18 ml RPMI-isolasjonsbuffer supplert med 300 eller 600 mikrol Liberase TL ved 5 mg/ml (tabell 1) (dvs. henholdsvis 0,083 mg/ml og 0,167 mg/ml endelige konsentrasjoner)13.
    4. Lukk tuben godt og tett den med laboratoriefilm (tabell 1). Plasser den horisontalt i et ristende vannbad (tabell 1) ved 37 °C ved 100 o / min i 30 minutter.
    5. Ved fordøyelse pipetterer du muskelsuspensjonen opp og ned 10 ganger med en 10 ml pipette for å dissosiere og forbedre effektiviteten av dissosiasjonen.
    6. Sentrifuge ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter. En klar pellet vil være synlig i bunnen av røret. Kast supernatanten med en 10 ml pipette, og la det være 5 ml medium i slangen. Å forlate mediet bidrar til å unngå å stresse cellene. Tilsett 10 ml fersk RPMI-isolasjonsbuffer, og resuspender pelleten ved å pipettere opp og ned med en 10 ml pipette.
    7. Plasser 100 μm, 70 μm og 40 μm cellesiler (en av hver type) (tabell 1) på åpne 50 ml rør.
    8. Pipetter suspensjonen på suksessive cellesiler (100 μm, 70 μm, 40 μm) og samle gjennomstrømningen inn i 50 ml rørene, som inneholder celler under 40 μm.
    9. Sentrifuger suspensjonen ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter. Kast supernatanten med en 10 ml pipette til det gjenstår 2 ml, og bruk deretter en 0,2-1 ml pipette til det gjenstår 100-200 μL.
    10. Resuspender pelleten i 2 ml lysisbuffer for røde blodceller (tabell 2). Inkuber på is i 3 min.
    11. Sentrifuge ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter og kast supernatanten med en 20-200 μL pipette.
    12. Resuspender cellene i 100 μL kald FACS-buffer (tabell 2). Plasser på is.
  4. Fremstilling av cellesuspensjon for FACS-isolasjon
    1. Overfør 10 μL av cellesuspensjonen oppnådd i trinn 1.2.12 til et nytt 1,5 ml rør. Dette utvalget vil utgjøre den ufargede kontrollen eller den negative kontrollen (figur 2). Tilsett 190 μL FACS-buffer, overfør til et 5 ml rør (tabell 1), og lagre på is.
    2. Sentrifuger de resterende 90 μl av cellesuspensjonen oppnådd i trinn 1.2.12 ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter og kast supernatanten med en pipette (20-200 μL spissvolum). Inkuber cellene med 400 μL fikserbar levedyktighetsflekk (tabell 3) fortynnet i serumfri Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
    3. Vask cellene ved sentrifugering ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter og tilsett 100 μL FACS-buffer. Snu rørene forsiktig tre ganger og sentrifuge igjen ved 4 °C ved 400 x g i 5 minutter.
    4. I løpet av sentrifugeringstiden, lag 100 μL av en masterblanding av primære antistoffer koblet til fluoroforer og rettet mot CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 og CXCR4 (tabell 3), fortynnet i FACS-buffer.
    5. Sentrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, kast cellesupernatanten med en pipette (20-200 μL spissvolum), og tilsett 100 μL antistoffblandingen. Snu forsiktig røret tre ganger. Ikke virvel. Rug i mørket på is i 30 min.
    6. Sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten med en 20-200 μL pipette og tilsett 500 μL 1x fosfatbufret saltvann (PBS) for å vaske cellene. Snu forsiktig røret tre ganger. Resentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten med en 20-200 μL pipette.
    7. Resuspender cellepelleten i 500 μL FACS-buffer og overfør suspensjonen til et 5 ml rør.
      MERK: cellesuspensjonen oppnådd fra Liberase fordøyelse behandles på samme måte.
  5. Valg av satellittceller fra FACS
    1. Virv kort cellesuspensjonen (2-5 sek) og behandle cellene på et strømningscytometer utstyrt med en 100 μm dyse (tabell 1).
    2. Bestem de forskjellige portstørrelsene basert på den ufargede prøven som er lagret i trinn 1.4.1 (figur 2).
    3. Belegg et 5 ml rør med 1 ml rent føtalkalveserum (FCS) for å forbedre celleinnsamlingen og tilsett 500 μL FACS-buffer.
    4. Bytt ut den ufargede prøven med den antistoffmerkede prøven.
    5. Velg populasjonen av interesse i henhold til foroverspredningsområdet (FSC-A) og sidespredningsområdet (SSC-A) (figur 3A), og fjern dublettceller med FSC-A og fremoverspredningshøyde (FSC-H) (figur 3B)14.
    6. Identifiser levende celler med fikserbar levedyktighetsflekk negativ farging (figur 3C).
    7. Velg negative celler for CD31, CD45, TER119 og CD11b (figur 3D).
    8. For å identifisere satellittceller velger du først cellene som er positive for CD34 og ITGA7 (figur 3E), og deretter velger du de CXCR4-positive cellene i den CD34- og ITGA7-selekterte populasjonen (figur 3F).
    9. Samle de valgte cellene (mellom 40.000 og 80.000 celler, i henhold til kvaliteten på preparatet) i det 5 ml belagte røret som inneholder 500 μl FACS-buffer.

2. Validering av den isolerte populasjonen i vevskultur

  1. Glidebelegg med hydrogel
    1. Fortynn 280 mikrol av en ren hydrogel human embryonal stamcelle (hESC) kvalifisert matrise (tabell 1) i 12 ml serumfritt DMEM / F12 medium.
    2. Belegg et kammerglass (tabell 1) med hydrogeloppløsningen, og inkuber det over natten ved 4 °C.
    3. Neste dag ruger du kammersliden ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time før cellesåing.
  2. Cellevekst og differensiering
    1. Plate ut ca. 20 000 celler, hentet fra trinn 1.5.9, per brønn, og dyrk dem i vekstmedium (tabell 2) i 5 dager. Ta fasekontrastbilder ved hjelp av et lysfeltmikroskop (figur 4A), før du behandler dem for immunfluorescensanalyse for å sikre kvaliteten på preparatet (figur 4B).
    2. For å indusere myogenese, vokse forsterkede satellittceller fra trinn 2.2.1 i myogent medium (tabell 2) i ytterligere 7 dager. Ta fasekontrastbilder ved hjelp av lysfeltmikroskop (figur 4C) før du behandler dem for immunfluorescensanalyse for å sikre kvaliteten på preparatet (figur 4D).
  3. Analyse av immuncytofluorescens
    1. Fjern mediet forsiktig, vask cellene som ble dyrket på kammerlysbildet med 100 μL 1x PBS to ganger, og fest dem med 100 μL 4 % paraformaldehyd (PFA) ved RT i 1 time.
      MERK: Dette trinnet bør utføres med forsiktighet. Et lite volum av medium bør alltid holdes i kammeret for å forhindre belastning av cellene, og PBS skal helles gjennom veggene i kammeret.
    2. Vask cellene tre ganger med 100 μL 1x PBS, supplert med 0,1% Tween 20 (PBST) for å permeabilisere cellemembranene.
    3. Blokker uspesifikke signaler ved inkubasjon i 100 μL 1x PBST supplert med 5% FCS (PBST-FCS) ved RT i 1 time.
    4. Inkuber cellene med 100 μL av en masterblanding av anti-PAX7 og anti-dystrofin (DMD) antistoffer (fortynnet i 1x PBST-FCS) ved 4 °C over natten, for å oppdage satellittceller og myofibre, henholdsvis.
    5. Vask cellene tre ganger med 100 μL 1x PBST, og inkuber dem med 100 μL geit-anti-mus Cy3 eller geit-antikanin Alexa 488 sekundære antistoffer (tabell 3) fortynnet i 1x PBST-FCS ved RT i 1 time.
    6. Dissocier kammerbrønnene fra lysbildet ved hjelp av utstyret som leveres av leverandøren, tilsett 20 μL vandig monteringsmedium med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), og dekk lysbildet med en deksel (tabell 1).
    7. Observer og ta bildet av de fargede cellene med et konfokalmikroskop.
    8. Behandle bildene ved hjelp av bildeanalyseprogramvare (figur 4B,D).

3. KLIPP &KJØR-analyse

  1. Prøveklargjøring for CUT&RUN-analyse på FACS-isolerte satellittceller
    MERK: CUT&RUN ble utført i hovedsak som beskrevet10,15. Buffersammensetningen er presentert i Tabell 2.
    1. For CUT&RUN-analysen, bruk omtrent 40 000 av cellene oppnådd i metode 1, trinn 1.5.9, per prøve / antistoff som må testes.
    2. Sentrifuge de FACS-isolerte satellittcellene ved RT ved 500 x g i 10 minutter, og kast deretter supernatanten ved hjelp av en pipette (20-200 μL spissvolum).
    3. Vask cellene med 1 ml 1x PBS, sentrifuge ved RT ved 500 x g i 5 minutter, kast supernatanten med en pipette (0,2-1 ml spissvolum) og resuspender dem i 1 ml kald kjernekraftbuffer (tabell 2). Inkuber på is i 20 min.
    4. Under inkubasjon, klargjør ett 1,5 ml rør inneholdende 850 μL kaldbindingsbuffer (tabell 2) og tilsett 20 μL concanavalin A-belagte magnetiske perler per prøve (tabell 1).
    5. Vask kulene to ganger med 1 ml kaldbindingsbuffer ved hjelp av et magnetstativ (tabell 1). For hver vask eller bufferendring gjennom hele prosedyren, la kulene samle seg på siden av røret på magnetstativet i 5 minutter før du fjerner den ryddede supernatanten med en pipette (0,2-1 ml spissvolum). Deretter resuspenderes forsiktig i 300 μL kaldbindingsbuffer.
    6. Sentrifuger kjernene ved 4 °C ved 600 x g i 5 minutter og resuspender dem forsiktig i 600 μL kjernekraftbuffer. Bland forsiktig 600 μL ekstraherte kjerner med 300 μL concanavalin A perleoppslemming, og inkuber ved 4 °C i 10 minutter.
    7. Fjern supernatanten ved hjelp av et magnetstativ, som beskrevet i trinn 3.1.4, og resuspender de perlebundne kjernene forsiktig med 1 ml kaldblokkerende buffer (tabell 2). Inkuber ved RT i 5 min.
    8. Fjern supernatanten ved hjelp av et magnetstativ og vask de perlebundne kjernene to ganger med 1 ml kaldvaskbuffer (tabell 2). Under den andre vasken, del de perlebundne kjernene likt i 1,5 ml rør. Hvert rør vil bli behandlet med et spesifikt antistoff i det følgende trinnet.
      MERK: I dette eksemplet ble 250 μL perlebundne kjerner delt i fire 1,5 ml rør.
    9. Separer supernatanten ved hjelp av et magnetstativ, som beskrevet i trinn 3.1.4, og aspirer med en pipette. Resuspender forsiktig kjerne-/perlekompleksene med et spesifikt primært antistoff (tabell 3), eller en IgG av en annen art (her kanin) fortynnet i 250 μL kaldvaskbuffer. Inkuber ved 4 °C over natten med lett omrøring.
      MERK: Antistoffene som brukes her er rettet mot AR, H3K4me2 og H3K27ac.
    10. Fjern supernatanten med et magnetstativ, som beskrevet i trinn 3.1.4, vask de perlebundne kjernene to ganger med 1 ml kaldvaskbuffer og resuspender i 100 μL kaldvaskbuffer.
    11. Fortynnet protein A-mikrokokknuklease ved 1,4 ng / μL i 100 μL per prøve av kaldvaskbuffer.
    12. Tilsett 100 μL protein A-mikrokokknuklease til 100 μL av prøven oppnådd i 3.1.11 og inkuber ved 4 ° C i 1 time med omrøring.
    13. Fjern supernatanten med et magnetstativ, som beskrevet i trinn 3.1.4, vask to ganger med 1 ml kaldvaskbuffer, og resuspender de perlebundne kjernene i 150 μL kaldvaskbuffer.
    14. For å initiere DNA-spaltning, tilsett 3 μL av 100 mM CaCl2 til 150 μL prøven, bland raskt ved å bla og inkuber på is i 30 minutter. Stopp reaksjonen ved å tilsette 150 μL stoppbuffer og inkuber ved 37 °C i 20 minutter for å fordøye RNA og frigjøre DNA-fragmentene.
    15. For DNA-ekstraksjon, sentrifuger prøvene ved 16 000 x g ved 4 °C i 5 minutter.
    16. Overfør supernatanten til et nytt mikrofugerør og kast pelleten og perlene.
    17. Tilsett 3 μL natriumdodecylsulfat (SDS) og 2,5 μL 20 mg/ml proteinase K. Bland ved inversjon. Inkuber i 10 minutter ved 70 °C (ingen risting).
    18. Tilsett 300 μL fenol/kloroform/isoamylalkohol, virvel, overfør til 2 ml faselåsrør (forspinnet i 5 minutter ved 16 000 x g) og sentrifuge i 5 minutter ved 16 000 x g ved 4 °C.
    19. Tilsett 300 μL kloroform til samme rør og sentrifuge i 5 minutter ved 16 000 x g ved 4 °C. Samle supernatanten (~300 μL) med en pipette (0,2-1 ml spissvolum) og overfør til et nytt 1,5 ml rør.
    20. Tilsett 1 μL glykogen (20 mg/ml konsentrasjon).
    21. Tilsett 750 μL 100 % etanol og felles ut over natten ved -20 °C.
    22. Pellet DNA ved sentrifugering i 15 min ved 16 000 x g ved 4 °C. Vask pelleten med 1 ml 100 % etanol, sentrifuge i 5 minutter ved 16 000 x g, kast supernatanten, sentrifugen i 30 s ved 16 000 x g, og fjern væsken med en pipette (20-200 μL spissvolum).
    23. Lufttørk pelleten i ~5 min. Resuspendert i 25 μL 1 mM Tris-HCl (pH 8) og 0,1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA; pH 8).
  2. Bioinformatikk analyse
    1. Forbered biblioteker fra immunspaltet DNA og sekvenser dem som parede 100 bp-avlesninger ved hjelp av den genomiske plattformen som beskrevet16.
    2. Fjern lesinger som overlapper med ENCODE-svartelisteområdet (V2) og skill de resterende lesningene i to grupper: fragmentstørrelse <120 bp (uten nukleosom, generelt for transkripsjonsfaktorer) og fragmentstørrelse >150 bp (med nukleosomer, normalt for histonmerker). Kart til mm10-referansegenomet ved hjelp av Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Generer bigwig filer med bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeBruke RPKM --binSize 20).
    4. Behold unikt tilordnede lesinger for videre analyse.
    5. Generer rå bedgraph-filer med genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Bruk SEACR 1.3-algoritmen (strengt alternativ) for toppanrop. Last inn måldata-sengegraffilen i UCSC-sengegrafformat som utelater områder som inneholder nullsignal, og kontrolldata (IgG) for å generere en empirisk terskel for toppanrop18.
    7. Utfør en Pearson-korrelasjonsanalyse med deeptools for å bestemme likheten mellom prøvene19. Bruk kommandolinjen multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, etterfulgt av plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualiser de genombrede intensitetsprofilene med IGV20 ved hjelp av sengegraffiler og sengefiltoppene hentet fra SEACR.
    9. Bruk HOMER til toppkommentar og motivsøk21.
    10. Til slutt, sammenlign datasettene med tidligere publiserte med ChIP-Atlas Peak-nettleseren for å visualisere dem på IGV, og / eller berikelsesanalyse ved hjelp av SEACR-genererte sengefiler som et inngangsdatasett22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Satellittceller fra museskjelettmuskler ble isolert ved å kombinere protokollene til Gunther et al. (heretter protokoll 1)12 og Liu et al.23 (heretter protokoll 2). Siden ikke-fordøyde muskelfibre ble observert etter fordøyelsen ved bruk av konsentrasjonen av kollagenase og dispase foreslått i protokoll 1, ble mengden enzymer økt for å forbedre muskelfiberdissosiasjonen, som beskrevet i trinn 1.2.1 og 1.2.3. Som angitt i protokoll 2 ble prøvene utsatt for en mild omrøring i et vannbad for å opprettholde cellens levedyktighet. Vi utførte filtrering gjennom cellesiler, som nevnt i protokoll 1, og inkubasjon med erytrocyttlysbuffer (se trinn 1.2.7 til 1.2.10). I protokoll 1 ble celler lastet på en Percoll-tetthetsgradient på 30%/70% for å isolere mononukleerte celler i interfasen, noe som kan ha ført til tap av celler av interesse. Dermed ble dette trinnet utelatt, som foreslått i protokoll 2.

FSC-A versus SSC-A gating ble brukt til å identifisere mononukleerte celler basert på størrelse (FSC) og granularitet (SSC) (figur 3A). Rusk ble ekskludert ved å ignorere hendelser under 40 K på FSC-A-aksen, og 38,8 % ± 3,6 % av cellene ble valgt. FSC-A versus forward scatter height (FSC-H) gating density plots ble brukt for dublett eksklusjon (figur 3B). Etter å ha valgt cellene som var negative for den fikserbare levedyktighetsflekkmarkøren, ble det oppnådd et gjennomsnitt på 34,3% ± 7,7% av levende celler (figur 3C).

Prosentandelen vist i punktplottet i figur 3C, 75,4%, tilsvarer prosentandelen av enkeltlevende celler, beregnet fra foreldrecellepopulasjonen, som i dette tilfellet er singlene. 95,7% av enkeltceller er hentet fra live-arrangementene som utgjør 35% av de totale hendelsene. Dermed beregnes prosentandelen 34,3% oppnådd i gjennomsnitt fra de totale hendelsene og ikke foreldrepopulasjonene.

Omtrent 3 % av enkeltlevende celler var negative for leukocytt- (CD45), monocytt- (CD11b), endotel- (CD31) og erytroidspesifikke (TER119) markører (figur 3D). CD11b / CD45 / CD31 / TER119 negative celler ble deretter valgt i henhold til deres uttrykk for CD34 (hematopoietiske, endotelprogenitorer og mesenkymale stamceller) og ITGA7 (hjerte-, glatt- og skjelettmuskelceller) markører (figur 3E). Endelig gating for CXCR4 (lymfocytter, hematopoietiske celler og satellittceller) ble utført for å selektere antatte satellittceller (figur 3F). Fra CD34 + / ITGA7 + -cellene ble ~ 80% funnet å være positive for CXCR4, noe som representerer et gjennomsnitt på 1% ± 0.15% av totale enkeltlevende celler, og et absolutt antall 60.000 ± 14.000 antatte satellittceller per muselem muskler blant 14 uavhengige eksperimenter. En ytterligere vurdering av CXCR4+-cellefraksjonen viste at ca. 80 % av levende celler ble oppnådd etter ettersortering, hvorav nesten 70 % var CXCR4+ (figur S1), noe som viser den høye levedyktigheten og renheten til denne FACS-isolerte cellepopulasjonen.

Siden ulike studier sammenlignet effektiviteten av kollagenase og Liberase TL-enzymer for celleisolasjon24,25, har disse to fordøyelsesmetodene blitt behandlet parallelt. Med 300 μL Liberase TL var fordøyelsen mindre effektiv enn med kollagenase, da ufordøyde fibre forble. I tillegg ble det observert mer celleavfall og store hendelser (figur S2A, B), og bare 17, 3% av enkeltlevende celler ble oppnådd etter FVS 780-valg (figur S2C). En ytterligere bekymring med Liberase fordøyelse var det lave antallet CD34 + / ITGA7 + celler sammenlignet med kollagenase (figur S2D-S2E), selv om CXCR4 gating var lik (figur S2F). Med 600 μL Liberase TL var fordøyelsen mer effektiv. Imidlertid forble mengden celleavfall forhøyet og cellens levedyktighet substandard (16, 3%) (figur S3). Dermed var fordøyelsen med Liberase TL mindre effektiv for satellittcelleisolering.

Når de frøs, uttrykte mer enn 70 % av CD34+/ITGA7+/CXCR4+-cellene (figur 4A) PAX7 (figur 4B), i motsetning til CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler som var PAX7-negative (figur 4C). CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler var i stand til å differensiere til myofibre når de ble dyrket i et myogent medium i ytterligere 7 dager, som vist ved dystrofin (DMD) farging (figur 4D), som bekrefter deres myogene potensial. Dermed viste kombinerte vevskultur- og immunfluorescensanalyser at FACS-isolerte CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler er satellittceller.

For å avgjøre om isolerte satellittceller er egnet for CUT&RUN-analyse, ble den genomiske profilen til acetylert lysin 27 (H3K27ac) og dimetylert lysin 4 (H3K4me2) av histon H3, to histonmodifikasjoner funnet ved aktive promotor- og forsterkerregioner, bestemt. Våre data avdekket 68 694 og 13 514 topper for henholdsvis H3K4me2 og H3K27ac, med en lignende genomisk repartisjon mellom de to histonmerkene (figur S4A). I detalj fant vi at en fjerdedel av toppene var lokalisert ± 2 kb fra transkripsjonsstartstedet (TSS) til nærmeste gen, flertallet ligger enten -100 kb til -10 kb, eller 10 kb til 100 kb fra TSS (figur S4B). Merk at Pearson-analysen viste en 80% korrelasjon mellom H3K27ac og H3K4me2 leseprofiler (figur S4C). For å vurdere at kromatin fremstilt fra ovennevnte protokoll ble isolert fra satellittceller, ble tilstedeværelsen av H3K27ac og H3K4me2 ved promotoren av satellittcellespesifikke gener bestemt. H3K4me2 ble anriket rundt TSS av Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 og Vcam1 (figur 5A), men ikke ved Itgam (CD11b) og Ptprc (CD45) (immunceller), Pecam (CD31; endotelceller) (figur 5B), Ckm (utviklende muskelfibre) eller Myh3 (myosin tungkjede rask embryonal, myofibre) (figur 5C). Lignende resultater ble oppnådd med H3K27ac (figur 5). Nesten ingen signaler ble oppnådd med IgG-prøven (figur 5). Videre viste sammenligning av H3K27ac-toppene hentet fra SEACR med de som følge av MACS2-toppanrop fra publiserte ChIP-seq-datasett en høy korrelasjon, som nevnt under hvert panel (ChIP-Atlas-spor; Figur 5). Sammen indikerer disse resultatene at avlesningene oppnådd etter bioinformatikkanalysen stammer fra kromatinet til FACS-isolerte satellittceller og korrelerer med de som tidligere er identifisert ved ChIP-seq-analyser.

Mens enkeltcellede RNA-sekvenseringsstudier i musesatellittceller viste en slående stressrespons, forårsaket av isolasjonsprosedyren26, ble tilstedeværelsen av H3K4me2 eller H3K27ac bestemt ved stressresponsgener, som eksemplifisert med Atf3, Azin1, Gls og Elf2. Resultatene gir bevis for at H3K27ac-merket ikke er avsatt ved promotoren av slike gener, og at nivåene av H3K4me2 forblir lave sammenlignet med de som er oppnådd for satellittcellespesifikke gener (figur S5). Dermed fremhever disse dataene hvor mild isolasjonsprosedyren er.

Deretter ble isolasjonsmetodens egnethet for transkripsjonsfaktorer undersøkt. CUT&RUN-analyse for androgenreseptoren (AR), en transkripsjonsfaktor som tilhører superfamilien nukleære reseptorer og som spiller en viktig rolle i myogen differensiering27, raknet 7.840 topper. Disse toppene var hovedsakelig lokalisert ved intron og intergeniske regioner (figur S4A), enten -100 kb til -10 kb, eller 10 kb til 100 kb fra TSS (figur S4B). Fylogenetiske analyser viste at AR, sammen med glukokortikoid (GR / Nr3c1), mineralkortikoid (MR / Nr3c2) og progesteron (PR / Nr3c3) reseptorer, er medlem av oksosteroidkjernereseptorunderfamilien 28, som binder seg som homodimerer til DNA-segmenter som består av to 5'-RGAACA-3' palindromiske halvsteder atskilt av tre basepar 29. Søk etter et kjent motiv ved hjelp av hypergeometrisk optimalisering av motivberikelse (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) avslørte at AR er bundet til 5'-RGRNCA-3' AR-halvstedsmotivet, til det typiske 5'-RGNACAnnnTGTNC-3'-oksosteroidmotivet (referert i figuren som PR), og til 5'-RGNACAnnnTGTNCY-3' AR-konsensusmotivet i >32%, 17% og 2% av de målrettede regionene, henholdsvis (figur 6A). Det skal bemerkes at lignende proporsjoner tidligere ble oppnådd for glukokortikoidreseptoren i skjelettmuskulatur16.

SEACR-analyse avdekket nesten 500 topper med en toppscore >50, med mer enn 200 av dem med en score >100; noen av disse er eksemplifisert i figur 6B. Vår analyse avdekket også en beskjeden anrikning av AR på de tidligere beskrevne bindingsstedene for gener involvert i polyaminbiosyntese (Amd1, Havre og Smox) og i prostatakreft (Acox1, Fkbp5 og Tmprss2) (figur S6). Interessant nok ble AR funnet på stedet av gener involvert i satellittcellestamme (Pax7, Cxcr4 og Cd34) (figur S7). Merk at oksosteroidresponselementet ble funnet i hver av disse AR-berikede regionene (figur S6 og figur S7), noe som viser at AR-signalet sett i CUT&RUN-dataene er svært spesifikt.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av protokollen som brukes til satellittcelleisolering fra musemuskler. Protokollen består av fire hovedtrinn. Kort fortalt ofres mus, og baklemmuskulaturen høstes (trinn 1.1.1-1.1.3) og hakkes mekanisk ved hjelp av saks (trinn 1.4-1.5). Dette etterfølges av trinn 1.2.1-1.2.4, hvor muskler dissosieres i et vannbad ved hjelp av kollagenase og dispase. I trinn 1.2.5-1.2.8 filtreres cellesuspensjonen gjennom 100, 70 og 40 μm cellesiler, fortløpende, og erytrocytter elimineres ved hjelp av lysisbuffer for røde blodlegemer (trinn 1.2.9-1.2.12). De resterende cellepopulasjonene er merket i trinn 1.3 med antistoffer koblet til fluoroforer, som er rettet mot spesifikke cellulære fenotypiske markører. Trinn 1.4 inkluderer prøver som passerer gjennom FACS for å samle satellittceller for videre bruk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Flowcytometrianalyse av ufarget cellepreparering. (A) Seleksjon av populasjonen av interesse basert på FSC-A og SSC-A parametere. (B) Enkeltcelleidentifikasjon basert på FSC-A og FSC-H. (C) Karakterisering av autofluorescensterskelen for innsamlede celler for APC-Cy7 konjugert til den fikserbare levedyktighetsflekken (FVS 780) som markerer døde celler. (D-F). Autofluorescensmåling for PE-Cy7 konjugert til CD11b-antistoff og PE-konjugert til TER119/CD45/CD31-markører (D), samt for Alexa-fluor 488 konjugert til ITGA7, Alexa fluor 405 konjugert til CD34 (E) og APC-fluorokrom konjugert til CXCR4 (F). Gates er representert som svarte bokser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Strømningscytometer gating strategi for satellittcellesortering. (A) Seleksjon av populasjonen av interesse basert på FSC-A og SSC-A parametere. (B) Enkeltcelleidentifikasjon basert på FSC-A og FSC-H. (C) Identifisering av levende celler med FVS 780. (D) Negativ celleseleksjon basert på CD11b-, CD31-, CD45- og TER119-antigener. (VG Nett) Positiv celleseleksjon basert på CD34 og ITGA7 (E), samt CXCR4 (F) antigener. Gates er representert som svarte bokser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Analyse av FACS-isolerte CD34+/ITGA7+/CXCR4+- og CD34+/ITGA7-/CXCR4- celler. (A) Fasekontrastbilder av CD34+/ITGA7+/CXCR4+ og CD34+/ITGA7-/CXCR4- celler dyrket i vekstmedium. (B) Immunfluorescensanalyse av CD34+/ITGA7+/CXCR4+ og CD34+/ITGA7-/CXCR4- celler dyrket i vekstmedium ved bruk av antistoffer rettet mot PAX7 (rød) og dystrofin (DMD, grønn). Kjerner ble farget med DAPI (blå). Magenta piler indikerer PAX7-positive celler. (C) Fasekontrastbilder av CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler dyrket i 5 dager i vekstmedium (venstre panel) og i ytterligere 7 dager i myogent medium (høyre panel). (D) Immunfluorescensanalysebilder av CD34+/ITGA7+/CXCR4+-celler dyrket i 5 dager i vekstmedium (venstre panel) og i ytterligere 7 dager i myogent medium (høyre panel) ved bruk av antistoffer rettet mot PAX7 (rødt) og dystrofin (DMD, grønt). Kjerner ble farget med DAPI (blå). Magenta piler indikerer PAX7-positive celler. Grønne piler indikerer DMD-positive celler. Skalastenger: brightfield-paneler = 25 μm; immunfluorescenspaneler = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Genomiske profiler av satellittcellekromatin. Lokalisering av H3K4me2 og H3K27ac ved satellittcellespesifikke gener (A), immun- og endotelcellespesifikke gener (B) og myofiberspesifikke gener (C) på kromatin av satellittceller ved CUT&RUN. Aktive promotører er bokset i grønt, mens inaktive promotører er bokset i brunt. CUT&RUN utført med IgG ble brukt som negativ kontroll. H3K27ac anrikningsanalyse for histonmerker presenteres under hvert spor. Berikelsespoengsum som viser konfidensnivåene for publiserte datasett, vises som et varmekart. Brune stjerner (*) refererer til H3K27ac ChIP-seq-topper utført i muskelsatellittceller, blå stjerner til H3K4me3, og den rosa til H4K16me1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: AR-genomisk fordeling på satellittcellekromatin . (A) HOMER-kjent motivanalyse av AR-topper i satellittceller. PR: progesteronreseptor. Nb-mål refererer til antall topper som presenterer et bestemt motiv. (B) Lokalisering av H3K4me2 og AR ved indikerte gener på kromatin av satellittceller bestemt av CUT&RUN. CUT&RUN utført med IgG ble brukt som negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Liste over materialer, reagenser og programvare. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Buffersammensetninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Antistoffreferanser og konsentrasjoner. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfigur 1: Flowcytometrianalyse av celleprepareringen etter sortering. (A) Seleksjon av populasjonen av interesse basert på FSC-A og SSC-A parametere. (B) Enkeltcelleidentifikasjon basert på FSC-A og FSC-H. (C) Identifisering av levende celler med fikserbar levedyktighetsflekk (FVS 780). (D) Negativ celleseleksjon basert på CD11b-, CD31-, CD45- og TER119-antigener. (VG Nett) Positiv celleseleksjon basert på CD34 og ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Gates er representert som svarte bokser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Flow cytometer gating strategi for satellittcellesortering etter fordøyelse med 300 μL Liberase TL. (A) Seleksjon av populasjonen av interesse basert på FSC-A og SSC-A parametere. (B) Enkeltcelleidentifikasjon basert på FSC-A og FSC-H. (C) Identifisering av levende celler med FVS 780. (D) Negativ celleseleksjon basert på CD11b-, CD31-, CD45- og TER119-antigener. (VG Nett) Positiv celleseleksjon basert på CD34 og ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Gates er representert som svarte bokser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: Flow cytometer gating strategi for satellittcellesortering etter fordøyelse med 600 μL Liberase TL. (A) Seleksjon av populasjonen av interesse basert på FSC-A og SSC-A parametere. (B) Enkeltcelleidentifikasjon basert på FSC-A og FSC-H. (C) Identifisering av levende celler med FVS 780. (D) Negativ celleseleksjon basert på CD11b-, CD31-, CD45- og TER119-antigener. (VG Nett) Positiv celleseleksjon basert på CD34 og ITGA7 (E) samt CXCR4 (F) antigener. Gates er representert som svarte bokser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 4: Karakterisering av H3K4me2, H3K27ac og AR genomiske steder. (A) Kakediagrammer som viser toppfordelingen av H3K4me2, H3K27ac og AR i henhold til genomegenskaper i satellittceller. (B) Kakediagrammer som viser toppfordelingen av H3K4me2, H3K27ac og AR i henhold til deres avstand til nærmeste TSS i satellittceller. (C) Varmekart som viser Pearson-korrelasjonen mellom H3K4me2, H3K27ac og IgG-kontroll. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 5: Genomiske profiler av satellittcellekromatin ved stressresponsinduserte gener. Lokalisering av H3K4me2 og H3K27ac ved indikerte gener på kromatin av satellittceller. Immunpresipitasjon med IgG ble brukt som negativ kontroll. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 6: Genomiske profiler av satellittcellekromatin ved kjente AR-målgener. Lokalisering av H3K4me2, H3K27ac og AR ved indikerte gener på kromatinet til satellittceller bestemt av CUT&RUN. AR-topper er bokset i blått, og tilsvarende AR-responsive elementer presenteres nedenfor. CUT&RUN utført med IgG ble brukt som negativ kontroll. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 7: Genomiske profiler av satellittcellekromatin ved deres selektivt uttrykte gener. Lokalisering av H3K4me2, H3K27ac og AR ved indikerte gener på kromatinet til satellittceller bestemt av CUT&RUN. AR-topper er bokset i blått, og tilsvarende AR-responsive elementer presenteres nedenfor. CUT&RUN utført med IgG ble brukt som negativ kontroll. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den foreliggende studien rapporterer en standardisert, pålitelig og enkel å utføre metode for isolering og kultur av musesatellittceller, samt vurdering av transkripsjonsregulering ved CUT&RUN-metoden.

Denne protokollen innebærer flere kritiske trinn. Den første er muskelforstyrrelser og fiberfordøyelse for å sikre et høyt antall innsamlede celler. Til tross for den økte enzymkonsentrasjonen ble det oppnådd flere levende celler enn ved bruk av protokoll 1. Satellittceller uttrykker et spesifikt mønster av forskjellige membranproteiner. For å øke strengheten i sorteringen brukte vi en kombinasjon av tidligere beskrevne negative (CD31, TER119, CD45 og CD11b) og positive (CD34, ITGA7 og CXCR4) satellittcellemarkører30,31. Ved hjelp av denne strategien ble gjennomsnittlig 1% av levende antatte satellittceller oppnådd. Dette resultatet er i området av det som var forventet, siden satellittceller representerer 2% -7% av muskelcellepopulasjonen i voksen alder hos mus32. Som kontroll for satellittcelleseleksjonsmarkørene ble CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler isolert. Immunfluorescerende farging viste at mens CD34+/ITGA7-/CXCR4-celler ikke uttrykte PAX7, var 70 % av CD34+/ITGA7+/CXCR4+-sorterte celler positive for denne satellittcellespesifikke markøren, og demonstrerte dermed at den isolerte FACS-populasjonen tilsvarer satellittceller. I tillegg var 70% av satellittceller dyrket i myogen medium i 7 dager PAX7-/DMD+, som vist ved immunfarging, og dannet en langstrakt multinukleær myofiber, noe som viser at isolerte satellittceller bevarte deres stamhetspotensial.

Den største begrensningen ved prøvepreparering kan være bruk av høy konsentrasjon av enzymer, noe som gir mye dissosiert biologisk materiale, men kan bidra til økt celledød. For å løse dette problemet ble en analyse som krever lavere enzymmengde testet. I denne sammenheng ble Liberase TL, en renset form av den tradisjonelle kollagenase33, testet. Selv om fordøyelsen tilsynelatende var mer effektiv med dette enzymet, forble mengden celleavfall forhøyet, og cellens levedyktighet ble litt senket. Disse observasjonene er i samsvar med tidligere rapporter som sammenlignet Liberase-mediert vevsfordøyelse med dette med rekombinant kollagenase eller tilpasset kollagenase24,25. I tillegg, selv om andelen endotel- og immunceller var lik mellom kollagenase og liberasefordøyelse, var prosentandelen satellittceller lavere i den liberasebehandlede prøven, som samlet viser at liberase ikke anbefales for satellittcelleisolasjon. Bruken av dette enzymet er egnet for fenotypisk og kvantitativ analyse av immunceller og kan etter hvert anbefales i sammenheng med muskel og/eller annet vev. Dette er i samsvar med det som har blitt rapportert om Liberase TL som den mest egnede til effektivt å isolere levedyktige immunceller34,35,36.

Et annet potensielt problem er stresset forårsaket av både dissosiering og sortering av satellittceller. Imidlertid viser fraværet av H3K27ac og de lave H3K4me2-nivåene i promotorregionen av stressresponsgener identifisert ved enkeltcelle-RNA-sekvensering i musesatellittceller26 at prosedyren er mild nok til ikke å indusere stressresponstranskripsjonsrepertoaret. Andre begrensninger som skal noteres er de valgte antigenene som forblir empiriske. Studier viser imidlertid en høy overlapping mellom unike overflatemarkørkombinasjoner som er beriket for skjelettmuskulatursatellittceller30,31.

Et ekstra kritisk trinn er rensing av kjerner fra sorterte celler. For dette holdes sorteringshastigheten lav for ikke å skade cellene, men raskt nok til at de ikke lagres for lenge i FACS-buffer. Faktisk er CUT&RUN-kjerner ikke faste, og en lengre inkubasjonstid kan påvirke lesingen hentet fra protokollen. Et typisk preparat fra de to bakre lemmene til en mus tillater CUT&RUN med ett antistoff og en IgG-kontroll, med en mengde på 2,5 ng kromatin for hver.

CUT&RUN-eksperimenter, designet for å vurdere transkripsjonsfaktorbinding og epigenetiske modifikasjoner, ga sterke og robuste lesesignaler for H3K4me2 og H3K27ac. De høye lesenivåene av H3K4me2 og H3K27ac på gener som er kjent for å bli uttrykt i satellittceller, sammenlignet med gener uttrykt i immun- eller endotelceller så vel som i myofibre, viste at signalet ble forsterket hovedsakelig fra satellittcellekjernene. I tillegg gjorde denne protokollen identifiseringen av cistromen til AR i muskelstamceller mulig, som til dags dato fortsatt er et teknisk problem som er forbundet med den dårlige kvaliteten på musens AR-antistoffer og de lave AR-uttrykksnivåene i celler som ikke er svært androgenfølsomme, for eksempel epiteliale prostataceller. Dataene som presenteres her, avdekket AR-bundne regioner med høy konfidenstoppscore. Siden bare en replikat opprinnelig ble vurdert per antistoff, vil robustheten til datasettene våre forbedres ved å legge til minst to ekstra biologiske replikater per tilstand. Imidlertid har AR-kjente målgener og respektive histonmerker, opprinnelig beskrevet som høyt uttrykt og / eller lett påviselig i andre vevssammenhenger som prostata, lavere ekspresjonsnivåer og er svært utfordrende å oppdage i satellittceller.

En begrensning ved CUT&RUN-tilnærmingen er at den utføres i ufaste celler. Dermed kan vi ha gått glipp av noen AR-mål på grunn av den labile karakteren av samspillet mellom transkripsjonsfaktorer og deres bindingssted. På samme måte kan noen posttranslasjonelle modifikasjoner, som acetylering, også være ganske labile. Derfor, inkludert et lysfikseringstrinn med formaldehyd eller paraformaldehyd, etter FACS-sortering, og før isolering av kjernene, kan vurderes for å stabilisere protein / DNA-interaksjonene og histonmodifikasjonene.

Selv om denne artikkelen viser at CUT&RUN-analyser kan utføres på FACS-isolerte satellittceller, kan andre analyser som bruker ikke-fiksert kromatin som ATAC-seq også utføres. I tillegg, selv om musklene her ble høstet under basale fysiologiske forhold, kan denne protokollen brukes på patologiske sammenhenger som skade eller aldring. Alle disse protokollene bruker vil tillate en detaljert forståelse av genreguleringsmekanismer i satellittceller, og kan bidra til å forstå hvordan disse mekanismene kan endres av patofysiologiske forhold.

Oppsummert gir denne rimelige og tidseffektive protokollen en effektiv eksperimentell setting for å studere transkripsjonsfaktorrekruttering og kromatinlandskap i skjelettmuskulaturforløperceller. Kromatin utarbeidet av denne protokollen har gitt den første genombrede analysen av AR-cistrome i satellittceller og vil lette fremtidige studier på genregulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Anastasia Bannwarth for å gi utmerket teknisk assistanse. Vi takker IGBMCs dyrehusanlegg, cellekulturen, Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrike), avbildningen, elektronmikroskopien, flowcytometrien og GenomEast-plattformen, et medlem av konsortiet 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

Dette arbeidet fra det tverrfaglige tematiske instituttet IMCBio, som en del av ITI 2021-2028-programmet ved Universitetet i Strasbourg, CNRS og Inserm, ble støttet av IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) og av SFRI-STRAT'US-prosjektet (ANR 20-SFRI-0012) og EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) innenfor rammen av det franske Investments for the Future-programmet. Ytterligere finansiering ble levert av INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategisk program 24376 (til DD), inserm ung forskerstipend (til DD), ANR-10-LABX-0030-INRT, og et fransk statsfond forvaltet av ANR under rammeprogrammet Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). JR ble støttet av programmet CDFA-07-22 fra Université franco-allemande og Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, og KG av Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Tags

CUT&RUN-analyse FACS-isolerte musesatellittceller stamcellefelt småcellepopulasjoner effektiv protokoll fluorescensaktivert cellesortering lemmemuskel strukturelle proteiner hakking medium dispase type I kollagenase cellesiler FACS-buffer levedyktighetsflekk immunfargede satellittceller Triton X-100 concanavalin A-magnetiske perler transkripsjonsfaktor histonmodifikasjoner protein A-mikrokokknuklease kromatinspaltning CaCl2 DNA-ekstraksjon biblioteker bioinformatisk analyse
En effektiv protokoll for CUT&amp;RUN-analyse av FACS-isolerte musesatellittceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter