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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Se presenta aquí un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón con aislamiento de células satélite de células satélite de células satélite de músculo de extremidades de ratón adaptado al estudio de la regulación de la transcripción en fibras musculares por escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN).

Abstract

Los análisis de todo el genoma con poblaciones de células pequeñas son una limitación importante para los estudios, particularmente en el campo de las células madre. En este trabajo se describe un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite del músculo de la extremidad, un tejido con un alto contenido de proteínas estructurales. Los músculos disecados de las extremidades de ratones adultos se interrumpieron mecánicamente mediante la picadura en medio suplementado con dispasa y colagenasa tipo I. Tras la digestión, el homogeneizado se filtró a través de filtros celulares y las células se suspendieron en tampón FACS. La viabilidad se determinó con tinción de viabilidad fijable y las células satélite inmunoteñidas se aislaron mediante FACS. Las células se lisaron con Triton X-100 y los núcleos liberados se unieron a perlas magnéticas de concanavalina A. Los complejos núcleo/perla se incubaron con anticuerpos contra el factor de transcripción o las modificaciones de histonas de interés. Después de los lavados, los complejos núcleo/perlas se incubaron con la proteína A-microcócica nucleasa y se inició la escisión de la cromatina con CaCl2. Después de la extracción del ADN, se generaron y secuenciaron bibliotecas, y se obtuvieron los perfiles de unión al factor de transcripción de todo el genoma y modificaciones de histonas covalentes mediante análisis bioinformático. Los picos obtenidos para las diversas marcas de histonas mostraron que los eventos de unión eran específicos para las células satélite. Además, el análisis de motivos conocidos reveló que el factor de transcripción estaba unido a la cromatina a través de su elemento de respuesta afín. Por lo tanto, este protocolo está adaptado para estudiar la regulación génica en células satélite musculares de extremidades de ratones adultos.

Introduction

Los músculos estriados esqueléticos representan en promedio el 40% del peso total del cuerpo humano1. Las fibras musculares exhiben una notable capacidad de regeneración ante una lesión, que se describe por la fusión de miocitos recién formados y la generación de nuevas miofibras que reemplazan a las dañadas2. En 1961, Alexander Mauro reportó una población de células mononucleares a las que denominó células satélite3. Estas células madre expresan el factor de transcripción pareado box 7 (PAX7), y se localizan entre la lámina basal y el sarcolema de las fibras musculares4. Se informó que expresan el grupo de diferenciación 34 (CD34; un marcador hematopoyético, progenitor endotelial y de células madre mesenquimales), la integrina alfa 7 (ITGA7; un marcador del músculo liso, cardíaco y esquelético), así como el receptor de quimiocinas C-X-C tipo 4 (CXCR4; un marcador linfocítico, hematopoyético y de células satélite)5. En condiciones basales, las células satélite residen en un microambiente particular que las mantiene en un estado de reposo6. Tras el daño muscular, se activan, proliferan y sufren miogénesis7. Sin embargo, al contribuir solo a una pequeña fracción del número total de células musculares, sus análisis de todo el genoma son particularmente desafiantes, especialmente en entornos fisiológicos (<1% del total de células).

Se han descrito varios métodos para el aislamiento de la cromatina a partir de células satélite, que implican la inmunoprecipitación de la cromatina seguida de la secuenciación paralela masiva (ChIP-seq) o los experimentos de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag). Sin embargo, estas dos técnicas presentan algunas limitaciones significativas que permanecen incuestionables. De hecho, ChIP-seq requiere una gran cantidad de material de partida para generar suficiente cromatina, una gran parte de la cual se pierde durante la etapa de sonicación. CUT&Tag es más apropiado para un número bajo de células, pero genera más sitios de escisión fuera del objetivo que ChIP-seq debido a la actividad de la transposasa Tn5. Además, dado que esta enzima tiene una alta afinidad por las regiones de cromatina abierta, el enfoque CUT&Tag podría utilizarse preferentemente para analizar las modificaciones de histonas o los factores de transcripción asociados con regiones del genoma transcritas activamente, en lugar de la heterocromatina silenciada 8,9.

A continuación se presenta un protocolo detallado que permite el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón mediante FACS para su escisión bajo dianas y su liberación mediante el análisis de nucleasa (CUT&RUN)10,11. Los diversos pasos implican la alteración mecánica del tejido, la clasificación celular y el aislamiento de núcleos. La eficacia del método, en cuanto a la preparación de una suspensión celular viable, se demostró mediante la realización de análisis CUT&RUN para modificaciones covalentes de histonas y factores de transcripción. La calidad de las células aisladas hace que el método descrito sea particularmente atractivo para preparar cromatina que capture fielmente el estado de ocupación genómica nativa, y es probable que sea adecuado para capturar la conformación cromosómica en combinación con la secuenciación de alto rendimiento en loci específicos (4C-seq) o a niveles de todo el genoma (Hi-C).

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Protocol

Los ratones se mantuvieron en un animalario acreditado, de acuerdo con las Directrices Nacionales de Cuidado de los Animales (Directiva 86/609/CEE de la Comisión Europea; Decreto francés nº 87-848) sobre la utilización de animales de laboratorio para la investigación. Las manipulaciones previstas se presentaron al Comité de Ética (Com'Eth, Estrasburgo, Francia) y al Ministerio de Investigación francés (MESR) para su evaluación ética y autorización de acuerdo con la directiva 2010/63/UE bajo el número APAFIS #22281.

1. Preparación de la suspensión celular para el aislamiento de células satélite mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (Figura 1)

  1. Aislamiento del tejido muscular
    1. Descontamine las herramientas para la disección muscular, incluidas las pinzas, los bisturíes y las tijeras, con un agente de limpieza (Tabla 1) y enjuague bien con agua destilada.
    2. Prepare dos tubos de 2 ml (Tabla 1), cada uno con 1 ml de tampón de aislamiento muscular, y colóquelos en hielo para recolectar los músculos extraídos.
    3. Sacrificar dos ratones machos C57/Bl6J de 10 semanas de edad por asfixia con CO2 seguida de luxación cervical. Rocíe etanol al 70% sobre cada ratón entero. Retire la piel de la extremidad posterior con fórceps. Disecciona todos los músculos de las extremidades que rodean el fémur, la tibia y el peroné (aproximadamente 1 mg de músculos por ratón).
      NOTA: El número de células satélite disminuye después de las 15 semanas de edad.
    4. Coloque los músculos de las extremidades extraídos en tubos de 2 ml que contengan 1 ml de tampón de aislamiento muscular preparado en el paso 1.1.2. Recoja los músculos del segundo ratón siguiendo el mismo procedimiento. Picar los músculos cosechados con unas tijeras sobre hielo hasta obtener fragmentos menores de 1 mm3 .
      NOTA: Los músculos fueron recolectados y picados principalmente como se describe12. Realice la digestión de los tejidos siguiendo el paso 1.2 o 1.3.
  2. Digestión tisular con enzima colagenasa
    1. Transfiera la suspensión muscular picada de los dos ratones vertiéndola en un tubo de 50 ml (Tabla 1) que contenga 18 ml de tampón de aislamiento muscular (suplementado con 5 ml [5 U/mL] de dispasa y 5 mg de colagenasa tipo I) (Tabla 1).
    2. Cierre bien el tubo y séllelo con una película de laboratorio (Tabla 1). Colóquelo horizontalmente en un baño de agua agitado (Tabla 1) a 37 °C a 100 rpm durante 30 min.
    3. Después de 30 minutos, agregue 5 mg de colagenasa tipo I. Mantenga los tubos durante otros 30 minutos bajo agitación en un baño de agua agitado a 37 °C a 100 rpm.
    4. Tras la digestión, pipetee la suspensión muscular hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de 10 ml para mejorar la eficiencia de la disociación. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Un gránulo transparente será visible en la parte inferior del tubo. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml, dejando 5 ml de medio en el tubo.
      NOTA: Dejar el medio ayuda a evitar estresar las células. Agregue 10 ml de tampón de aislamiento muscular fresco y vuelva a suspender el gránulo pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 ml.
    5. Coloque filtros celulares de 100 μm, 70 μm y 40 μm (uno de cada tipo) (Tabla 1) en tubos abiertos de 50 ml. Pipetear la suspensión en los filtros celulares sucesivos (100 μm, 70 μm, 40 μm) y recoger el flujo en los tubos de 50 ml, que contienen células por debajo de 40 μm.
    6. Centrifugar la suspensión a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml hasta que queden 2 ml y, a continuación, utilice una pipeta de 0,2-1 ml hasta que queden 100-200 μl. Resuspender el gránulo en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (Tabla 2). Incubar en hielo durante 3 min.
    7. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta de 20-200 μL. Resuspender las células en 100 μL de tampón FACS frío (Tabla 2). Colocar sobre hielo.
  3. Método alternativo para la digestión tisular con la enzima Liberasa termolisina baja (TL)
    1. Siga las descripciones del paso 1.1. para el aislamiento de tejidos.
    2. Para la desagregación tisular mediada por Liberase, extraiga los músculos en 2 ml de tampón de aislamiento del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Tabla 2), en lugar del tampón de aislamiento muscular descrito en el paso 1.1.2.
    3. Transfiera la suspensión muscular picada de los dos ratones vertiéndola en un tubo de 50 mL (Tabla 1) que contenga 18 mL de tampón de aislamiento RPMI suplementado con 300 o 600 μL de Liberasa TL a 5 mg/mL (Tabla 1) (es decir, concentraciones finales de 0,083 mg/mL y 0,167 mg/mL, respectivamente)13.
    4. Cierre bien el tubo y séllelo con una película de laboratorio (Tabla 1). Colóquelo horizontalmente en un baño de agua agitado (Tabla 1) a 37 °C a 100 rpm durante 30 min.
    5. Tras la digestión, pipetee la suspensión muscular hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de 10 ml para disociar y mejorar la eficiencia de la disociación.
    6. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Un gránulo transparente será visible en la parte inferior del tubo. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml, dejando 5 ml de medio en el tubo. Dejar el medio ayuda a evitar estresar las células. Agregue 10 ml de tampón de aislamiento RPMI nuevo y vuelva a suspender el gránulo pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 ml.
    7. Coloque filtros celulares de 100 μm, 70 μm y 40 μm (uno de cada tipo) (Tabla 1) en tubos abiertos de 50 ml.
    8. Pipetear la suspensión en filtros celulares sucesivos (100 μm, 70 μm, 40 μm) y recoger el flujo en los tubos de 50 ml, que contienen células por debajo de 40 μm.
    9. Centrifugar la suspensión a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml hasta que queden 2 ml y, a continuación, utilice una pipeta de 0,2-1 ml hasta que queden 100-200 μl.
    10. Resuspender el gránulo en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (Tabla 2). Incubar en hielo durante 3 min.
    11. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta de 20-200 μL.
    12. Resuspender las células en 100 μL de tampón FACS frío (Tabla 2). Colocar sobre hielo.
  4. Preparación de la suspensión celular para el aislamiento de FACS
    1. Transferir 10 μL de la suspensión celular obtenida en el paso 1.2.12 a un tubo nuevo de 1,5 mL. Esta muestra constituirá el testigo no teñido o el testigo negativo (Figura 2). Agregue 190 μL de tampón FACS, transfiéralo a un tubo de 5 mL (Tabla 1) y guárdelo en hielo.
    2. Centrifugar los 90 μL restantes de la suspensión celular obtenida en el paso 1.2.12 a 4 °C a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta (volumen de punta de 20-200 μL). Incubar las células con 400 μL de tinción de viabilidad fijable (Tabla 3) diluidas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin suero durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Lavar las células por centrifugación a 4 °C a 400 x g durante 5 min y añadir 100 μL de tampón FACS. Invierta suavemente los tubos tres veces y vuelva a centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min.
    4. Durante el tiempo de centrifugación, preparar 100 μL de una mezcla maestra de anticuerpos primarios acoplados a fluoróforos y dirigidos contra CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 y CXCR4 (Tabla 3), diluida en tampón FACS.
    5. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante celular con una pipeta (volumen de punta de 20-200 μL) y añadir la mezcla de anticuerpos de 100 μL. Invierta suavemente el tubo tres veces. No haga vórtices. Incubar en la oscuridad sobre hielo durante 30 min.
    6. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 20-200 μL y agregue 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x para lavar las células. Invierta suavemente el tubo tres veces. Vuelva a centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante con una pipeta de 20-200 μL.
    7. Vuelva a suspender el gránulo celular en 500 μL de tampón FACS y transfiera la suspensión a un tubo de 5 mL.
      NOTA: la suspensión celular obtenida de la digestión de Liberase se procesa de la misma manera.
  5. Selección de celdas satélite por FACS
    1. Agitar brevemente la suspensión celular (2-5 segundos) y procesar las células en un citómetro de flujo equipado con una boquilla de 100 μm (Tabla 1).
    2. Determine los distintos tamaños de compuerta en función de la muestra no teñida almacenada en el paso 1.4.1 (Figura 2).
    3. Cubra un tubo de 5 ml con 1 ml de suero fetal puro (FCS) para mejorar la recolección de células y agregue 500 μl de tampón FACS.
    4. Intercambie la muestra no teñida con la muestra marcada con anticuerpos.
    5. Seleccione la población de interés de acuerdo con el área de dispersión directa (FSC-A) y el área de dispersión lateral (SSC-A) (Figura 3A), y elimine las celdas dobletes con el FSC-A y la altura de dispersión directa (FSC-H) (Figura 3B)14.
    6. Identifique las células vivas con tinción negativa de viabilidad fijable (Figura 3C).
    7. Seleccione celdas negativas para CD31, CD45, TER119 y CD11b (Figura 3D).
    8. Para identificar las células satélite, seleccione primero las células positivas para CD34 e ITGA7 (Figura 3E) y, a continuación, seleccione las células positivas para CXCR4 en la población seleccionada para CD34 e ITGA7 (Figura 3F).
    9. Recoger las células seleccionadas (entre 40.000 y 80.000 células, según la calidad de la preparación) en el tubo recubierto de 5 mL que contiene 500 μL de tampón FACS.

2. Validación de la población aislada en cultivo de tejidos

  1. Recubrimiento deslizante con hidrogel
    1. Diluir 280 μL de una matriz calificada para células madre embrionarias humanas de hidrogel puro (hESC) (Tabla 1) en 12 mL de medio DMEM/F12 libre de suero.
    2. Cubrir un portaobjetos de cámara (Tabla 1) con la solución de hidrogel e incubarlo durante la noche a 4 °C.
    3. Al día siguiente, incubar el portaobjetos de la cámara a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 h antes de la siembra celular.
  2. Crecimiento y diferenciación celular
    1. Extraer aproximadamente 20.000 células, obtenidas del paso 1.5.9, por pocillo, y cultivarlas en medio de cultivo (Tabla 2) durante 5 días. Tome imágenes de contraste de fase con un microscopio de campo claro (Figura 4A), antes de procesarlas para el análisis de inmunofluorescencia para garantizar la calidad de la preparación (Figura 4B).
    2. Para inducir la miogénesis, cultive células satélite amplificadas del paso 2.2.1 en medio miogénico (Tabla 2) durante 7 días adicionales. Tome imágenes de contraste de fase con un microscopio de campo claro (Figura 4C) antes de procesarlas para el análisis de inmunofluorescencia para garantizar la calidad de la preparación (Figura 4D).
  3. Análisis de inmunocitofluorescencia
    1. Retirar suavemente el medio, lavar las células cultivadas en portaobjetos de cámara con 100 μL de PBS 1x dos veces y fijarlas con 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 4 % a RT durante 1 h.
      NOTA: Este paso debe realizarse con cuidado. Siempre se debe mantener un pequeño volumen de medio en la cámara para evitar estresar las células, y el PBS debe verterse a través de las paredes de la cámara.
    2. Lavar las células tres veces con 100 μL de 1x PBS, suplementado con 0,1% de Tween 20 (PBST) para permeabilizar las membranas celulares.
    3. Bloquear las señales inespecíficas mediante incubación en 100 μL de 1x PBST suplementado con 5% FCS (PBST-FCS) a RT durante 1 h.
    4. Incubar las células con 100 μL de una mezcla maestra de anticuerpos anti-PAX7 y anti-distrofina (DMD) (diluidos en 1x PBST-FCS) a 4 °C durante la noche, para detectar células satélite y miofibras, respectivamente.
    5. Lavar las células tres veces con 100 μL de 1x PBST, e incubarlas con 100 μL de anticuerpos secundarios anti-ratón de cabra Cy3 o Alexa 488 anti-conejo de cabra (Tabla 3) diluidos en 1x PBST-FCS a RT durante 1 h.
    6. Disocie los pocillos de la cámara del portaobjetos utilizando el equipo proporcionado por el proveedor, agregue 20 μL de medio de montaje acuoso con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y cubra el portaobjetos con un cubreobjetos (Tabla 1).
    7. Observe y capture la imagen de las células teñidas con un microscopio confocal.
    8. Procese las imágenes utilizando un software de análisis de imágenes (Figuras 4B, D).

3. Análisis CUT&RUN

  1. Preparación de muestras para el análisis CUT&RUN en células satélite aisladas de FACS
    NOTA: CUT&RUN se realizó esencialmente como se describe10,15. La composición del tampón se presenta en Cuadro 2.
    1. Para el ensayo CUT&RUN, utilice aproximadamente 40.000 de las células obtenidas en el método 1, paso 1.5.9, por muestra/anticuerpo que deba analizarse.
    2. Centrifugar las células satélite aisladas en FACS a RT a 500 x g durante 10 min, luego desechar el sobrenadante con una pipeta (volumen de punta de 20-200 μL).
    3. Lavar las células con 1 mL de PBS 1x, centrifugar a RT a 500 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante con una pipeta (volumen de punta de 0,2-1 mL) y volver a suspenderlas en 1 mL de tampón de extracción nuclear en frío (Tabla 2). Incubar en hielo durante 20 min.
    4. Durante la incubación, prepare un tubo de 1,5 ml que contenga 850 μl de tampón de unión en frío (Tabla 2) y agregue 20 μL de perlas magnéticas recubiertas de concanavalina A por muestra (Tabla 1).
    5. Lave las perlas dos veces con 1 ml de tampón de encuadernación en frío utilizando una rejilla magnética (Tabla 1). Para cada lavado o cambio de tampón a lo largo del procedimiento, deje que las perlas se acumulen en el costado del tubo en la rejilla magnética durante 5 minutos antes de retirar el sobrenadante aclarado con una pipeta (volumen de punta de 0,2-1 ml). A continuación, vuelva a suspender suavemente en 300 μL de tampón de unión en frío.
    6. Centrifugar los núcleos a 4 °C a 600 x g durante 5 min y resuspenderlos suavemente en 600 μL de tampón de extracción nuclear. Mezclar suavemente los 600 μL de núcleos extraídos con los 300 μL de lodo de perlas de concanavalina A e incubar a 4 °C durante 10 min.
    7. Retire el sobrenadante utilizando una rejilla magnética, como se describe en el paso 3.1.4, y vuelva a suspender suavemente los núcleos unidos a las perlas con 1 ml de tampón de bloqueo frío (Tabla 2). Incubar a RT durante 5 min.
    8. Retire el sobrenadante con una rejilla magnética y lave los núcleos unidos a las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lavado en frío (Tabla 2). Durante el segundo lavado, divida equitativamente los núcleos unidos a las perlas en tubos de 1,5 ml. Cada tubo se tratará con un anticuerpo específico en el siguiente paso.
      NOTA: En este ejemplo, 250 μL de núcleos unidos a perlas se dividieron en cuatro tubos de 1,5 mL.
    9. Separe el sobrenadante con una gradilla magnética, como se describe en el paso 3.1.4, y aspire con una pipeta. Resuspender suavemente los complejos núcleo/perla con un anticuerpo primario específico (Tabla 3), o una IgG de otra especie (en este caso, conejo) diluida en 250 μL de tampón de lavado en frío. Incubar a 4 °C durante la noche con una suave agitación.
      NOTA: Los anticuerpos utilizados aquí están dirigidos contra AR, H3K4me2 y H3K27ac.
    10. Retire el sobrenadante con una rejilla magnética, como se describe en el paso 3.1.4, lave los núcleos unidos a las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lavado en frío y vuelva a suspender en 100 μL de tampón de lavado en frío.
    11. Diluir la proteína A-micrococo nucleasa a 1,4 ng/μL en 100 μL por muestra de tampón de lavado en frío.
    12. Añadir 100 μL de nucleasa de proteína A-microcócica a los 100 μL de muestra obtenidos en 3.1.11 e incubar a 4 °C durante 1 h con agitación.
    13. Retire el sobrenadante con una rejilla magnética, como se describe en el paso 3.1.4, lave dos veces con 1 ml de tampón de lavado en frío y vuelva a suspender los núcleos unidos a las perlas en 150 μL de tampón de lavado en frío.
    14. Para iniciar la escisión del ADN, agregue 3 μL de 100 mM de CaCl2 a los 150 μL de muestra, mezcle rápidamente y mezcle en hielo durante 30 min. Detenga la reacción añadiendo 150 μL de tampón de parada e incube a 37 °C durante 20 minutos para digerir el ARN y liberar los fragmentos de ADN.
    15. Para la extracción de ADN, centrifugar las muestras a 16.000 x g a 4 °C durante 5 min.
    16. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microfuga y deseche el gránulo y las perlas.
    17. Añadir 3 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% y 2,5 μL de 20 mg/ml de proteinasa K. Mezclar por inversión. Incubar durante 10 min a 70 °C (sin agitar).
    18. Añadir 300 μL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, vórtice, transferir a tubos de bloqueo de fase de 2 ml (precentrifugados durante 5 min a 16.000 x g) y centrifugar durante 5 min a 16.000 x g a 4 °C.
    19. Añadir 300 μL de cloroformo al mismo tubo y centrifugar durante 5 min a 16.000 x g a 4 °C. Recoja el sobrenadante (~300 μL) con una pipeta (volumen de punta de 0,2-1 mL) y transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 mL.
    20. Añadir 1 μL de glucógeno (concentración de 20 mg/mL).
    21. Añadir 750 μL de etanol al 100% y precipitar durante la noche a -20 °C.
    22. Granular el ADN por centrifugación durante 15 min a 16.000 x g a 4 °C. Lavar el pellet con 1 mL de etanol al 100%, centrifugar durante 5 min a 16.000 x g, desechar el sobrenadante, centrifugar durante 30 s a 16.000 x g y retirar el líquido con una pipeta (volumen de punta de 20-200 μL).
    23. Seque al aire el gránulo durante ~5 min. Resuspender en 25 μL de 1 mM de Tris-HCl (pH 8) y 0,1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; pH 8).
  2. Análisis bioinformático
    1. Preparar bibliotecas a partir de ADN inmunoescindido y secuenciarlas como lecturas de 100 pb de extremo emparejado con la ayuda de la plataforma genómica como se describe16.
    2. Elimine las lecturas que se superponen con la región de la lista negra ENCODE (V2) y separe las lecturas restantes en dos grupos: tamaño de fragmento <120 pb (sin nucleosoma, en general para factores de transcripción) y tamaño de fragmento >150 pb (con nucleosomas, normalmente para marcas de histonas). Mapeo al genoma de referencia mm10 usando Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Genere archivos bigwig con bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Conserve las lecturas asignadas de forma única para su posterior análisis.
    5. Genere archivos de bedgraph sin procesar con genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Utilice el algoritmo SEACR 1.3 (opción estricta) para la llamada máxima. Cargue el archivo de gráfico de base de datos de destino en formato de gráfico de cama UCSC que omite las regiones que contienen señal cero y el archivo de gráfico de base de datos de control (IgG) para generar un umbral empírico para la llamada máxima18.
    7. Realizar un análisis de correlación de Pearson con deeptools para determinar la similitud entre las muestras19. Utilice la línea de comandos multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, seguido de plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Correlación de Pearson de recuentos de lectura" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualice los perfiles de intensidad de todo el genoma con IGV20 utilizando archivos de gráficos de lecho y los picos de archivo de lecho obtenidos de SEACR.
    9. Utilice HOMER para la anotación de picos y la búsqueda de motivos21.
    10. Por último, comparar los conjuntos de datos con los publicados previamente con el navegador ChIP-Atlas Peak para visualizarlos en IGV, y/o análisis de enriquecimiento utilizando los archivos de lecho generados por SEACR como conjunto de datos de entrada22.

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Representative Results

Las células satélite de los músculos esqueléticos de ratón se aislaron combinando los protocolos de Gunther et al. (en adelante Protocolo 1)12 y de Liu et al.23 (en adelante Protocolo 2). Dado que se observaron fibras musculares no digeridas después de la digestión cuando se utilizó la concentración de colagenasa y dispasa propuesta en el Protocolo 1, se aumentó la cantidad de enzimas para mejorar la disociación de las fibras musculares, como se describe en los pasos 1.2.1 y 1.2.3. Como se indica en el Protocolo 2, las muestras se sometieron a una agitación suave en un baño de agua para mantener la viabilidad celular. Se realizó la filtración a través de filtros celulares, como se menciona en el Protocolo 1, y la incubación con tampón de lisis de glóbulos rojos (ver pasos 1.2.7 a 1.2.10). En el Protocolo 1, las células se cargaron en un gradiente de densidad de Percoll del 30%/70% para aislar células mononucleadas en la interfase, lo que puede haber llevado a la pérdida de células de interés. Por lo tanto, se omitió este paso, como se propone en el Protocolo 2.

Se utilizó la compuerta FSC-A frente a SSC-A para identificar las células mononucleadas en función del tamaño (FSC) y la granularidad (SSC) (Figura 3A). Los residuos se excluyeron ignorando los eventos por debajo de 40 K en el eje FSC-A, y se seleccionaron el 38,8% ± el 3,6% de las células. Para la exclusión de dobletes se utilizaron gráficos de densidad de compuerta FSC-A frente a altura de dispersión directa (FSC-H) (Figura 3B). Después de seleccionar las células negativas para el marcador de tinción de viabilidad fijable, se obtuvo una media del 34,3% ± 7,7% de células vivas (Figura 3C).

El porcentaje que se muestra en el diagrama de puntos de la Figura 3C, 75,4%, corresponde al porcentaje de células vivas individuales, calculado a partir de la población de células madre, que en este caso son las individuales. El 95,7% de las células individuales se obtienen de los eventos en vivo, que representan el 35% del total de eventos. Así, el porcentaje 34.3% obtenido en promedio, se calcula a partir del total de eventos y no de las poblaciones parentales.

Alrededor del 3% de las células vivas individuales fueron negativas para los marcadores leucocitarios (CD45), monocitos (CD11b), endoteliales (CD31) y eritroides específicos (TER119) (Figura 3D). A continuación, se seleccionaron las células negativas CD11b/CD45/CD31/TER119 en función de su expresión de marcadores CD34 (progenitores hematopoyéticos, endoteliales y células madre mesenquimales) e ITGA7 (células musculares cardíacas, lisas y esqueléticas) (Figura 3E). Se realizó una activación final para CXCR4 (linfocitos, células hematopoyéticas y satélites) para seleccionar células satélite putativas (Figura 3F). De las células CD34+/ITGA7+, se encontró que ~80% eran positivas para CXCR4, lo que representa un promedio del 1% ± 0.15% del total de células vivas individuales, y un número absoluto de 60,000 ± 14,000 células satélite putativas por músculos de la extremidad del ratón entre 14 experimentos independientes. Una evaluación adicional de la fracción celular CXCR4+ reveló que alrededor del 80% de las células vivas se obtuvieron después de la clasificación posterior, de las cuales casi el 70% eran CXCR4+ (Figura S1), lo que demuestra la alta viabilidad y pureza de esta población celular aislada en FACS.

Dado que diversos estudios compararon la eficiencia de las enzimas colagenasa y liberasa TL para el aislamiento celular24,25, estos dos métodos de digestión han sido procesados en paralelo. Con 300 μL de Liberase TL, la digestión fue menos eficiente que con la colagenasa, ya que quedaron fibras no digeridas. Además, se observaron más restos celulares y grandes eventos (Figuras S2A, B), y solo el 17,3% de las células vivas individuales en promedio se obtuvieron después de la selección de FVS 780 (Figura S2C). Una preocupación adicional con la digestión de Liberasa fue el bajo número de células CD34+/ITGA7+ en comparación con la colagenasa (Figuras S2D-S2E), a pesar de que la activación de CXCR4 fue similar (Figura S2F). Con 600 μL de Liberase TL, la digestión fue más eficiente. Sin embargo, la cantidad de restos celulares se mantuvo elevada y la viabilidad celular deficiente (16,3%) (Figura S3). Por lo tanto, la digestión con Liberase TL fue menos eficiente para el aislamiento de células satélite.

Cuando se sembraron, más del 70% de las células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ (Figura 4A) expresaron PAX7 (Figura 4B), a diferencia de las células CD34+/ITGA7-/CXCR4- que fueron PAX7 negativas (Figura 4C). Las células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ fueron capaces de diferenciarse en miofibras cuando crecieron en un medio miogénico durante 7 días adicionales, como lo demuestra la tinción con distrofina (DMD) (Figura 4D), lo que confirma su potencial miogénico. Por lo tanto, los análisis combinados de cultivo de tejidos e inmunofluorescencia mostraron que las células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ aisladas en FACS son células satélite.

Para determinar si las células satélite aisladas son adecuadas para el análisis CUT&RUN, se determinó el perfil genómico de la lisina acetilada 27 (H3K27ac) y la lisina dimetilada 4 (H3K4me2) de la histona H3, dos modificaciones de histonas encontradas en las regiones promotoras y potenciadoras activas. Nuestros datos revelaron 68.694 y 13.514 picos para H3K4me2 y H3K27ac, respectivamente, con una repartición genómica similar entre las dos marcas de histonas (Figura S4A). En detalle, encontramos que una cuarta parte de los picos se localizaron ± 2 kb del sitio de inicio de la transcripción (SST) del gen más cercano, la mayoría se ubicó entre -100 kb y -10 kb, o entre 10 kb y 100 kb del SST (Figura S4B). Cabe destacar que el análisis de Pearson mostró una correlación del 80% entre los perfiles de lectura H3K27ac y H3K4me2 (Figura S4C). Para evaluar que la cromatina preparada a partir del protocolo mencionado anteriormente se aisló de células satélite, se determinó la presencia de H3K27ac y H3K4me2 en el promotor de genes específicos de células satélite. H3K4me2 se enriqueció alrededor de los SST de Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 y Vcam1 (Figura 5A), pero no en los de Itgam (CD11b) y Ptprc (CD45) (células inmunitarias), Pecam (CD31; células endoteliales) (Figura 5B), Ckm (fibras musculares en desarrollo) o Myh3 (miofibras embrionarias rápidas de cadena pesada de miosina) (Figura 5C). Resultados similares se obtuvieron con H3K27ac (Figura 5). Casi no se obtuvo ninguna señal con la muestra de IgG (Figura 5). Además, la comparación de los picos de H3K27ac obtenidos de SEACR con los resultantes de la llamada de picos de MACS2 a partir de conjuntos de datos ChIP-seq publicados mostró una alta correlación, como se indica debajo de cada panel (pista ChIP-Atlas; Figura 5). En conjunto, estos resultados indican que las lecturas obtenidas después del análisis bioinformático se originan en la cromatina de células satélite aisladas de FACS y se correlacionan con las identificadas previamente por los análisis ChIP-seq.

Mientras que los estudios de secuenciación de ARN de una sola célula en células satélite de ratón mostraron una sorprendente respuesta al estrés, causada por el procedimiento de aislamiento26, se determinó la presencia de H3K4me2 o H3K27ac en los genes de respuesta al estrés, como se ejemplifica con Atf3, Azin1, Gls y Elf2. Los resultados proporcionan evidencia de que la marca H3K27ac no se deposita en el promotor de dichos genes, y que los niveles de H3K4me2 siguen siendo bajos en comparación con los obtenidos para genes específicos de células satélite (Figura S5). Por lo tanto, estos datos ponen de manifiesto lo leve que es el procedimiento de aislamiento.

A continuación, se examinó la idoneidad de nuestro método de aislamiento para los factores de transcripción. El análisis CUT&RUN para el receptor de andrógenos (AR), un factor de transcripción que pertenece a la superfamilia de los receptores nucleares y que juega un papel importante en la diferenciación miogénica27, desentrañó 7.840 picos. Estos picos se localizaron principalmente en las regiones de intrones e intergénicos (Figura S4A), ya sea de -100 kb a -10 kb, o de 10 kb a 100 kb del SST (Figura S4B). Los análisis filogenéticos revelaron que AR, junto con los receptores de glucocorticoides (GR/Nr3c1), mineralocorticoides (MR/Nr3c2) y progesterona (PR/Nr3c3), es un miembro de la subfamilia de receptores nucleares de oxoesteroides28, que se unen como homodímeros a segmentos de ADN que están formados por dos semisitios palindrómicos 5′-RGAACA-3′ separados por tres pares de bases29. La búsqueda de un motivo conocido por medio de la optimización hipergeométrica del enriquecimiento de motivos (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) reveló que AR está unido al motivo de medio sitio 5′-RGRNCA-3′ AR, al típico motivo oxosteroide 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ (referido en la figura como PR) y al motivo consenso 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR en el >32%, 17% y 2% de las regiones objetivo, respectivamente (Figura 6A). Cabe destacar que previamente se obtuvieron proporciones similares para el receptor de glucocorticoides en el músculo esquelético16.

El análisis del SEACR reveló casi 500 picos con una puntuación máxima >50, con más de 200 de ellos con una puntuación >100; algunos de los cuales se ejemplifican en la Figura 6B. Nuestro análisis también descubrió un modesto enriquecimiento de AR en los sitios de unión previamente descritos de genes implicados en la biosíntesis de poliaminas (Amd1, Avena y Smox) y en el cáncer de próstata (Acox1, Fkbp5 y Tmprss2) (Figura S6). Curiosamente, el RA se encontró en los loci de los genes implicados en la madre de las células satélite (Pax7, Cxcr4 y Cd34) (Figura S7). Cabe destacar que el elemento de respuesta oxoesteroide se encontró en cada una de estas regiones enriquecidas con AR (Figura S6 y Figura S7), lo que demuestra que la señal de RA observada en los datos de CUT&RUN es altamente específica.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del protocolo utilizado para el aislamiento de células satélite de los músculos de las extremidades de ratón. El protocolo consta de cuatro pasos principales. Brevemente, se sacrifican ratones y se extraen los músculos de las extremidades traseras (pasos 1.1.1-1.1.3) y se pican mecánicamente con tijeras (pasos 1.4-1.5). A esto le siguen los pasos 1.2.1-1.2.4, durante los cuales los músculos se disocian en un baño de agua utilizando colagenasa y dispasa. En los pasos 1.2.5-1.2.8, la suspensión celular se filtra a través de filtros celulares de 100, 70 y 40 μm, consecutivamente, y los eritrocitos se eliminan utilizando un tampón de lisis de glóbulos rojos (pasos 1.2.9-1.2.12). Las poblaciones celulares restantes se marcan en el paso 1.3 con anticuerpos acoplados a fluoróforos, que se dirigen contra marcadores fenotípicos celulares específicos. El paso 1.4 incluye muestras que pasan a través de FACS para recolectar células satélite para su posterior aplicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis de citometría de flujo de una preparación celular no teñida. (A) Selección de la población de interés en función de los parámetros FSC-A y SSC-A. (B) Identificación de una sola célula basada en FSC-A y FSC-H. (C) Caracterización del umbral de autofluorescencia de las células recogidas para APC-Cy7 conjugado con la tinción de viabilidad fijable (FVS 780) que marca las células muertas. (D-F). Medición de autofluorescencia para PE-Cy7 conjugado con el anticuerpo CD11b y PE conjugado con los marcadores TER119/CD45/CD31 (D), así como para Alexa fluor 488 conjugado con ITGA7, Alexa fluor 405 conjugado con CD34 (E) y fluorocromo APC conjugado con CXCR4 (F). Las puertas se representan como cajas negras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Estrategia de activación del citómetro de flujo para la clasificación de células satélite. (A) Selección de la población de interés en función de los parámetros FSC-A y SSC-A. (B) Identificación de una sola célula basada en FSC-A y FSC-H. (C) Identificación de células vivas con FVS 780. (D) Selección de células negativas basada en los antígenos CD11b, CD31, CD45 y TER119. (E-F) Selección celular positiva basada en antígenos CD34 e ITGA7 (E), así como en CXCR4 (F). Las puertas se representan como cajas negras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ y CD34+/ITGA7-/CXCR4- aisladas en FACS. (A) Imágenes de contraste de fase de células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ y CD34+/ITGA7-/CXCR4- cultivadas en medio de crecimiento. (B) Análisis de inmunofluorescencia de células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ y CD34+/ITGA7-/CXCR4- cultivadas en medio de cultivo utilizando anticuerpos dirigidos contra PAX7 (rojo) y distrofina (DMD, verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las flechas magentas indican células PAX7 positivas. (C) Imágenes de contraste de fase de células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ cultivadas durante 5 días en medio de crecimiento (panel izquierdo) y durante 7 días adicionales en medio miogénico (panel derecho). (D) Imágenes de análisis de inmunofluorescencia de células CD34+/ITGA7+/CXCR4+ cultivadas durante 5 días en medio de crecimiento (panel izquierdo) y durante 7 días adicionales en medio miogénico (panel derecho) utilizando anticuerpos dirigidos contra PAX7 (rojo) y distrofina (DMD, verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las flechas magentas indican células PAX7 positivas. Las flechas verdes indican células DMD positivas. Barras de escala: paneles de campo claro = 25 μm; Paneles de inmunofluorescencia = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Perfiles genómicos de la cromatina celular satélite. Localización de H3K4me2 y H3K27ac en genes específicos de células satélite (A), genes específicos de células inmunes y endoteliales (B) y genes específicos de miofibras (C) en la cromatina de células satélite mediante CUT&RUN. Los promotores activos están encuadrados en verde, mientras que los promotores inactivos están encuadrados en marrón. Se utilizó como control negativo el CUT&RUN realizado con IgG. El análisis de enriquecimiento de H3K27ac para marcas de histonas se presenta debajo de cada pista. La puntuación de enriquecimiento que muestra los niveles de confianza de los conjuntos de datos publicados se representa como un mapa de calor. Las estrellas marrones (*) se refieren a los picos de H3K27ac ChIP-seq realizados en células satélite musculares, las estrellas azules a H3K4me3 y las rosas a H4K16me1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Distribución genómica de RA en la cromatina de células satélite. (A) Análisis de motivos conocidos por HOMER de picos de RA en células satélite. PR: receptor de progesterona. El objetivo NB se refiere al número de picos que presentan un motivo particular. (B) Localización de H3K4me2 y AR en genes indicados en la cromatina de células satélite determinada por CUT&RUN. Se utilizó como control negativo el CUT&RUN realizado con IgG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de materiales, reactivos y software. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Composiciones de los tampones. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Referencias y concentraciones de anticuerpos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria 1: Análisis por citometría de flujo de la preparación celular después de la clasificación. (A) Selección de la población de interés en base a los parámetros FSC-A y SSC-A. (B) Identificación de una sola célula basada en FSC-A y FSC-H. (C) Identificación de células vivas con tinción de viabilidad fijable (FVS 780). (D) Selección de células negativas basada en los antígenos CD11b, CD31, CD45 y TER119. (E-F) Selección celular positiva basada en antígenos CD34 e ITGA7 (E), así como CXCR4 (F). Las puertas se representan como cajas negras. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Estrategia de activación del citómetro de flujo para la clasificación de células satélite después de la digestión con 300 μL de Liberase TL. (A) Selección de la población de interés en base a los parámetros FSC-A y SSC-A. (B) Identificación de una sola célula basada en FSC-A y FSC-H. (C) Identificación de células vivas con FVS 780. (D) Selección de células negativas basada en los antígenos CD11b, CD31, CD45 y TER119. (E-F) Selección celular positiva basada en antígenos CD34 e ITGA7 (E), así como CXCR4 (F). Las puertas se representan como cajas negras. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Estrategia de activación del citómetro de flujo para la clasificación de células satélite después de la digestión con 600 μL de Liberase TL. (A) Selección de la población de interés en base a los parámetros FSC-A y SSC-A. (B) Identificación de una sola célula basada en FSC-A y FSC-H. (C) Identificación de células vivas con FVS 780. (D) Selección de células negativas basada en los antígenos CD11b, CD31, CD45 y TER119. (E-F) Selección celular positiva basada en antígenos CD34 e ITGA7 (E), así como CXCR4 (F). Las puertas se representan como cajas negras. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Caracterización de las localizaciones genómicas de H3K4me2, H3K27ac y AR. (A) Gráficos circulares que representan la distribución máxima de H3K4me2, H3K27ac y AR de acuerdo con las características del genoma en células satélite. (B) Gráficos circulares que representan la distribución de picos de H3K4me2, H3K27ac y AR de acuerdo con su distancia al SST más cercano en las celdas de satélite. (C) Mapa de calor que muestra la correlación de Pearson entre H3K4me2, H3K27ac y el control de IgG. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 5: Perfiles genómicos de la cromatina celular satélite en genes inducidos por respuesta al estrés. Localización de H3K4me2 y H3K27ac en genes indicados en la cromatina de células satélite. Se utilizó inmunoprecipitación con IgG como control negativo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 6 suplementaria: Perfiles genómicos de la cromatina de las células satélite en genes diana de RA conocidos. Localización de H3K4me2, H3K27ac y AR en genes indicados en la cromatina de células satélite determinada por CUT&RUN. Los picos de RA están representados en azul, y a continuación se presentan los elementos correspondientes que responden a la RA. Se utilizó como control negativo el CUT&RUN realizado con IgG. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 7: Perfiles genómicos de la cromatina celular satélite en sus genes expresados selectivamente. Localización de H3K4me2, H3K27ac y AR en genes indicados en la cromatina de células satélite determinada por CUT&RUN. Los picos de RA están representados en azul, y a continuación se presentan los elementos correspondientes que responden a la RA. Se utilizó como control negativo el CUT&RUN realizado con IgG. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El presente estudio reporta un método estandarizado, confiable y fácil de realizar para el aislamiento y cultivo de células satélite de ratón, así como la evaluación de la regulación transcripcional por el método CUT&RUN.

Este protocolo implica varios pasos críticos. La primera es la disrupción muscular y la digestión de la fibra para garantizar un alto número de células recolectadas. A pesar del aumento de la concentración de enzimas, se obtuvieron más células vivas que utilizando el Protocolo 1. Las células satélite expresan un patrón específico de varias proteínas de membrana. Para aumentar la rigurosidad de nuestra clasificación, utilizamos una combinación de marcadores celulares satélite negativos (CD31, TER119, CD45 y CD11b) y positivos (CD34, ITGA7 y CXCR4) previamente descritos30,31. Con esta estrategia, se obtuvo un promedio del 1% de células satélite putativas vivas. Este resultado está en el rango de lo esperado, ya que las células satélite representan entre el 2% y el 7% de la población de células musculares en la edad adulta en ratones32. Como control de los marcadores de selección de células satélite, se aislaron las células CD34+/ITGA7-/CXCR4-. La tinción inmunofluorescente demostró que, mientras que las células CD34+/ITGA7-/CXCR4- no expresaban PAX7, el 70% de las células clasificadas por CD34+/ITGA7+/CXCR4+ eran positivas para este marcador específico de células satélite, lo que demuestra que la población aislada de FACS corresponde a células satélite. Además, el 70% de las células satélite cultivadas en medio miogénico durante 7 días fueron PAX7-/DMD+, como se demostró mediante inmunotinción, y formaron una miofibra multinucleada alargada, lo que demuestra que las células satélite aisladas conservaron su potencial madre.

La principal limitación en la preparación de muestras podría ser el uso de una alta concentración de enzimas, lo que da lugar a una gran cantidad de material biológico disociado, pero puede contribuir a un aumento de la muerte celular. Para resolver este problema, se probó un ensayo que requería una menor cantidad de enzimas. En este contexto, se probó Liberase TL, una forma purificada de la colagenasa33 tradicional. Aunque la digestión fue aparentemente más eficiente con esta enzima, la cantidad de restos celulares permaneció elevada y la viabilidad celular se redujo ligeramente. Estas observaciones concuerdan con informes previos que compararon la digestión tisular mediada por Liberasa con esta con colagenasa recombinante o colagenasa personalizada24,25. Además, a pesar de que la proporción de células endoteliales e inmunitarias fue similar entre la colagenasa y la digestión de la Liberasa, el porcentaje de células satélite fue menor en la muestra procesada con Liberase, lo que demuestra en general que la Liberasa no se recomienda para el aislamiento de células satélite. El uso de esta enzima es adecuado para el análisis fenotípico y cuantitativo de las células inmunitarias y, eventualmente, podría recomendarse en el contexto del músculo y/u otros tejidos. Esto está en concordancia con lo reportado sobre Liberase TL como el más adecuado para aislar eficazmente células inmunes viables34,35,36.

Otro problema potencial es el estrés causado por la disociación y clasificación de las celdas satélite. Sin embargo, la ausencia de H3K27ac y los bajos niveles de H3K4me2 en la región promotora de los genes de respuesta al estrés identificados por secuenciación de ARN de una sola célula en células satélite de ratón26 muestran que el procedimiento es lo suficientemente suave como para no inducir el repertorio transcripcional de respuesta al estrés. Otras limitaciones a tener en cuenta son los antígenos seleccionados que siguen siendo empíricos. Sin embargo, los estudios muestran una alta superposición entre combinaciones únicas de marcadores de superficie que están enriquecidos para las células satélite del músculo esquelético30,31.

Un paso crítico adicional es la purificación de los núcleos de las células clasificadas. Para ello, la velocidad de clasificación se mantiene baja para no dañar las células, pero lo suficientemente rápida como para que no se almacenen durante demasiado tiempo en el búfer FACS. De hecho, los núcleos CUT&RUN no son fijos, y un tiempo de incubación más largo podría influir en la lectura obtenida del protocolo. Una preparación típica de las dos extremidades traseras de un ratón permite CUT&RUN con un anticuerpo y un control de IgG, con una cantidad de 2,5 ng de cromatina para cada uno.

Los experimentos CUT&RUN, diseñados para evaluar la unión de factores de transcripción y las modificaciones epigenéticas, proporcionaron señales de lectura fuertes y robustas para H3K4me2 y H3K27ac. Los altos niveles de lectura de H3K4me2 y H3K27ac en genes que se sabe que se expresan en células satélite, en comparación con genes expresados en células inmunitarias o endoteliales, así como en miofibras, mostraron que la señal se amplificaba predominantemente desde los núcleos de las células satélite. Además, este protocolo hizo posible la identificación del cistroma del RA en células madre musculares, que hasta la fecha sigue siendo un problema técnico inherente a la mala calidad de los anticuerpos RA de ratón y a los bajos niveles de expresión de RA en células que no son altamente sensibles a los andrógenos, como las células epiteliales de próstata. Los datos presentados aquí revelaron regiones vinculadas a AR con puntuaciones máximas de alta confianza. Dado que originalmente solo se evaluó una réplica por anticuerpo, la solidez de nuestros conjuntos de datos mejorará mediante la adición de al menos dos réplicas biológicas adicionales por afección. Sin embargo, los genes diana conocidos de AR y las respectivas marcas de histonas, descritas originalmente como altamente expresadas y/o fácilmente detectables en otros contextos tisulares como la próstata, presentan niveles de expresión más bajos y son muy difíciles de detectar en células satélite.

Una limitación del enfoque CUT&RUN es que se realiza en celdas no fijas. Por lo tanto, es posible que hayamos pasado por alto algunas dianas de RA debido a la naturaleza lábil de las interacciones entre los factores de transcripción y su sitio de unión. Del mismo modo, algunas modificaciones postraduccionales, como la acetilación, también pueden ser bastante lábiles. Por lo tanto, se podría considerar la inclusión de un paso de fijación ligera con formaldehído o paraformaldehído, después de la clasificación de FACS y antes de aislar los núcleos, para estabilizar las interacciones proteína/ADN y las modificaciones de las histonas.

Aunque este artículo muestra que los ensayos CUT&RUN se pueden realizar en células satélite aisladas de FACS, también se pueden realizar otros análisis que utilizan cromatina no fija, como ATAC-seq. Además, a pesar de que aquí los músculos fueron cosechados en condiciones fisiológicas basales, este protocolo puede aplicarse a contextos patológicos como lesiones o envejecimiento. Todos estos usos del protocolo permitirán una comprensión detallada de los mecanismos reguladores de los genes en las células satélite, y pueden ayudar a comprender cómo estos mecanismos pueden verse alterados por las condiciones fisiopatológicas.

En resumen, este protocolo de bajo costo y eficiente en el tiempo proporciona un entorno experimental eficaz para estudiar el reclutamiento de factores de transcripción y el panorama de la cromatina en células precursoras del músculo esquelético. La cromatina preparada por este protocolo ha proporcionado el primer análisis de todo el genoma del cistromo AR en células satélite y facilitará futuros estudios sobre la regulación génica.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Agradecemos a Anastasia Bannwarth por brindar una excelente asistencia técnica. Agradecemos a las instalaciones del IGBMC, al cultivo celular, al Instituto Clínico del Ratón (ICS, Illkirch, Francia), a las imágenes, a la microscopía electrónica, a la citometría de flujo y a la plataforma GenomEast, miembro del consorcio 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

Este trabajo del Instituto Temático Interdisciplinario IMCBio, en el marco del programa ITI 2021-2028 de la Universidad de Estrasburgo, el CNRS y el Inserm, contó con el apoyo de IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) y del proyecto SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) y EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) en el marco del Programa Francés de Inversiones para el Futuro. El INSERM, el CNRS, Unistra, el IGBMC, la Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), el programa estratégico AFM-Téléthon 24376 (a D.D.), INSERM recibió una beca para jóvenes investigadores (a D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT y un fondo estatal francés gestionado por la ANR en el marco del programa marco Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. contó con el apoyo del Programa CDFA-07-22 de la Université franco-allemande y el Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, y K.G. de la Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

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References

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Análisis CUT&RUN Células satélite de ratón aisladas en FACS Campo de células madre Poblaciones de células pequeñas Protocolo eficiente Clasificación celular activada por fluorescencia Músculo de la extremidad Proteínas estructurales Picado Medio Dispasa Colgenasa tipo I Filtros celulares Tampón FACS Tinción de viabilidad Células satélite inmunoteñidas Tritón X-100 Perlas magnéticas de concanavalina A Factor de transcripción Modificaciones de histonas Nucleasa de proteína A-microcócica Escisión de cromatina CaCl2 Extracción de ADN Bibliotecas Análisis Bioinformático
Un protocolo eficiente para el análisis CUT&amp;RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS
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Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

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