Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

بروتوكول فعال لتحليل CUT&RUN لخلايا الأقمار الصناعية للفأر المعزولة FACS

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

يظهر هنا بروتوكول فعال لعزل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفأر التي تم تكييفها لدراسة تنظيم النسخ في ألياف العضلات عن طريق الانقسام تحت الأهداف وإطلاقها باستخدام النيوكلياز (CUT &RUN).

Abstract

تشكل التحليلات على مستوى الجينوم مع مجموعات الخلايا الصغيرة عائقا رئيسيا للدراسات ، لا سيما في مجال الخلايا الجذعية. يصف هذا العمل بروتوكولا فعالا لعزل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية من عضلة الأطراف ، وهي نسيج يحتوي على نسبة عالية من البروتينات الهيكلية. تم تعطيل عضلات الأطراف المشرحة من الفئران البالغة ميكانيكيا عن طريق الفرم في وسط مكمل بالكولاجين من النوع الأول. عند الهضم ، تم ترشيح التجانس من خلال مصافي الخلايا ، وتم تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS. تم تحديد الصلاحية مع صبغة قابلة للتثبيت ، وتم عزل الخلايا الساتلية الملطخة بالمناعة بواسطة FACS. تم تحليل الخلايا باستخدام Triton X-100 وكانت النوى المنبعثة مرتبطة بخرز كونكانافالين أ المغناطيسي. تم تحضين معقدات النواة / الخرز بأجسام مضادة ضد عامل النسخ أو تعديلات الهستون ذات الأهمية. بعد الغسلات ، تم تحضين معقدات النواة / الخرز ببروتين A-micrococcal nuclease ، وبدأ انقسام الكروماتين باستخدام CaCl2. بعد استخراج الحمض النووي ، تم إنشاء المكتبات وتسلسلها ، وتم الحصول على ملفات تعريف ارتباط عامل النسخ على مستوى الجينوم وتعديلات الهستون التساهمي عن طريق التحليل المعلوماتي الحيوي. أظهرت القمم التي تم الحصول عليها لمختلف علامات الهستون أن أحداث الارتباط كانت خاصة بالخلايا الساتلية. علاوة على ذلك ، كشف تحليل الزخارف المعروف أن عامل النسخ كان مرتبطا بالكروماتين عبر عنصر الاستجابة المماثل. لذلك تم تكييف هذا البروتوكول لدراسة التنظيم الجيني في الخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفئران البالغة.

Introduction

تمثل العضلات المخططة الهيكلية في المتوسط 40٪ من وزن إجمالي جسم الإنسان1. تظهر ألياف العضلات قدرة ملحوظة على التجدد عند الإصابة ، والتي توصف باندماج الخلايا العضلية المشكلة حديثا وتوليد ألياف عضلية جديدة تحل محل الخلايا التالفة2. في عام 1961 ، أبلغ ألكسندر ماورو عن مجموعة من الخلايا أحادية النواة التي أطلق عليها اسم خلايا الأقمار الصناعية3. تعبر هذه الخلايا الجذعية عن عامل النسخ المقترن بالمربع 7 (PAX7) ، وتقع بين الصفيحة القاعدية وساركوليما الألياف العضلية4. تم الإبلاغ عن أنها تعبر عن مجموعة التمايز 34 (CD34 ؛ علامة الخلايا الجذعية المكونة للدم ، البطانية ، وعلامة الخلايا الجذعية الوسيطة) ، و integrin alpha 7 (ITGA7 ؛ علامة العضلات الملساء والقلبية والهيكل العظمي) ، بالإضافة إلى مستقبلات chemokine من النوع 4 (CXCR4 ؛ علامة الخلايا الليمفاوية ، المكونة للدم ، والخلايا الساتلية)5. في الظروف القاعدية ، توجد الخلايا الساتلية في بيئة دقيقة معينة تبقيها في حالة هادئة6. عند تلف العضلات ، يتم تنشيطها وتكاثرها وتخضع لتكوين العضلات7. ومع ذلك ، لا تساهم سوى جزء صغير من إجمالي عدد خلايا العضلات ، فإن تحليلاتها على مستوى الجينوم تمثل تحديا خاصا ، خاصة في ظل الإعدادات الفسيولوجية (<1٪ من إجمالي الخلايا).

تم وصف طرق مختلفة لعزل الكروماتين من الخلايا الساتلية ، والتي تنطوي على الترسيب المناعي للكروماتين متبوعا بالتسلسل المتوازي الهائل (ChIP-seq) أو الانقسام تحت تجارب الأهداف ووضع العلامات (CUT &Tag). ومع ذلك ، فإن هاتين التقنيتين تمثلان بعض القيود المهمة التي لا تزال دون منازع. في الواقع ، يتطلب ChIP-seq كمية كبيرة من مواد البدء لتوليد ما يكفي من الكروماتين ، حيث يتم فقد نسبة كبيرة منه أثناء خطوة الصوتنة. يعد CUT &Tag أكثر ملاءمة لعدد الخلايا المنخفض ، ولكنه يولد مواقع انقسام خارج الهدف أكثر من ChIP-seq بسبب نشاط ترانسبوزاز Tn5. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هذا الإنزيم له تقارب كبير لمناطق الكروماتين المفتوحة ، يمكن استخدام نهج CUT &Tag بشكل تفضيلي لتحليل تعديلات الهستون أو عوامل النسخ المرتبطة بالمناطق المنسوخة بنشاط من الجينوم ، بدلا من تغاير كروماتين 8,9 الصامت.

يظهر هنا بروتوكول مفصل يسمح بعزل الخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفأر بواسطة FACS للانقسام تحت الأهداف وإطلاقها باستخدام تحليل nuclease (CUT &RUN) 10,11. تتضمن الخطوات المختلفة الاضطراب الميكانيكي للأنسجة وفرز الخلايا وعزل النوى. تم إثبات كفاءة الطريقة ، فيما يتعلق بإعداد تعليق خلية قابل للحياة ، من خلال إجراء تحليل CUT &RUN لتعديلات الهستون التساهمي وعوامل النسخ. تجعل جودة الخلايا المعزولة الطريقة الموصوفة جذابة بشكل خاص لإعداد الكروماتين الذي يلتقط حالة الإشغال الجينومي الأصلية بأمانة ، ومن المحتمل أن يكون مناسبا لالتقاط تشكل الكروموسوم مع التسلسل عالي الإنتاجية في مواقع محددة (4C-seq) أو على مستويات الجينوم على نطاق واسع (Hi-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الاحتفاظ بالفئران في بيت معتمد ، وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية لرعاية (توجيه المفوضية الأوروبية 86/609 / CEE; المرسوم الفرنسي رقم 87-848) بشأن استخدام المختبر للبحث. تم تقديم التلاعبات المقصودة إلى اللجنة الأخلاقية (Com'Eth ، ستراسبورغ ، فرنسا) وإلى وزارة الأبحاث الفرنسية (MESR) للتقييم الأخلاقي والتفويض وفقا لتوجيه 2010/63 / EU بموجب رقم APAFIS # 22281.

1. تحضير معلق الخلية لعزل الخلايا الساتلية عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (الشكل 1)

  1. عزل الأنسجة العضلية
    1. قم بتطهير أدوات تشريح العضلات ، بما في ذلك الملقط والمشارط والمقص ، باستخدام عامل تنظيف (الجدول 1) ، واشطفها جيدا بالماء المقطر.
    2. قم بإعداد أنبوبين سعة 2 مل (الجدول 1) ، يحتوي كل منهما على 1 مل من محلول عزل العضلات ، وضعهما على الثلج لجمع العضلات المحصودة.
    3. التضحية باثنين من الفئران الذكور C57 / Bl6J البالغة من العمر 10 أسابيع عن طريق اختناق CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم. رش 70٪ من الإيثانول على كل فأر كامل. تقشر الجلد من الطرف الخلفي باستخدام ملقط. تشريح جميع عضلات الأطراف المحيطة بعظم الفخذ والساق والشظية (حوالي 1 ملغ من العضلات لكل فأر).
      ملاحظة: ينخفض عدد خلايا الأقمار الصناعية بعد 15 أسبوعا من العمر.
    4. ضع عضلات الأطراف المحصودة في أنبوبين سعة 2 مل يحتويان على 1 مل من محلول عزل العضلات المحضر في الخطوة 1.1.2. جمع العضلات من الماوس الثاني باتباع نفس الإجراء. فرم العضلات المحصودة بالمقص على الجليد حتى يتم الحصول على أصغر من 1 مم3 شظايا.
      ملاحظة: تم جمع العضلات وفرمها بشكل أساسي كما هو موضح12. قم بإجراء عملية هضم الأنسجة إما باتباع الخطوة 1.2 أو 1.3.
  2. هضم الأنسجة مع إنزيم كولاجيناز
    1. نقل معلق العضلات المفرومة من الفأرين عن طريق سكبها في أنبوب 50 مل (الجدول 1) يحتوي على 18 مل من عازلة عزل العضلات (تستكمل مع 5 مل [5 وحدة / مل] من dispase و 5 ملغ من الكولاجين من النوع الأول) (الجدول 1).
    2. أغلق الأنبوب بإحكام وأغلقه بفيلم المختبر (الجدول 1). ضعه أفقيا في حمام مائي مهتز (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
    3. بعد 30 دقيقة ، أضف 5 ملغ من الكولاجين من النوع الأول. احتفظ بالأنابيب لمدة 30 دقيقة أخرى تحت التحريك في حمام مائي مهتز عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة.
    4. عند الهضم ، ماصة تعليق العضلات صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة 10 مل لتحسين كفاءة التفكك. أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. ستظهر حبيبات شفافة في الجزء السفلي من الأنبوب. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل ، مع ترك 5 مل من الوسط في الأنبوب.
      ملاحظة: ترك الوسط يساعد على تجنب إجهاد الخلايا. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لعزل العضلات الطازج وأعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 10 مل.
    5. ضع مصافي خلايا 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر (واحدة من كل نوع) (الجدول 1) على أنابيب مفتوحة سعة 50 مل. ماصة التعليق على مصافي الخلايا المتتالية (100 ميكرومتر ، 70 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر) وجمع التدفق في أنابيب 50 مل ، تحتوي على خلايا أقل من 40 ميكرومتر.
    6. جهاز طرد مركزي التعليق عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل حتى يتبقى 2 مل ، ثم استخدم ماصة 0.2-1 مل حتى يتبقى 100-200 ميكرولتر. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (الجدول 2). احتضان على الجليد لمدة 3 دقائق.
    7. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة 20-200 ميكرولتر. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد FACS (الجدول 2). مكان على الجليد.
  3. طريقة بديلة لهضم الأنسجة مع إنزيم ليبراز ثيرموليسين منخفض (TL)
    1. اتبع الأوصاف الواردة في الخطوة 1.1. لعزل الأنسجة.
    2. لتصنيف الأنسجة بوساطة Liberase ، احصد العضلات في 2 مل من مخزن عزل معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) (الجدول 2) ، بدلا من مخزن عزل العضلات الموصوف في الخطوة 1.1.2.
    3. نقل معلق العضلات المفرومة من الفأرين عن طريق سكبهما في أنبوب سعة 50 مل (الجدول 1) يحتوي على 18 مل من محلول عزل RPMI المكمل ب 300 أو 600 ميكرولتر من Liberase TL عند 5 مجم / مل (الجدول 1) (أي 0.083 مجم / مل و 0.167 مجم / مل تركيزات نهائية ، على التوالي)13.
    4. أغلق الأنبوب بإحكام وأغلقه بفيلم المختبر (الجدول 1). ضعه أفقيا في حمام مائي مهتز (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
    5. عند الهضم ، ماصة تعليق العضلات صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة 10 مل لفصل وتحسين كفاءة التفكك.
    6. أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. ستظهر حبيبات شفافة في الجزء السفلي من الأنبوب. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل ، مع ترك 5 مل من الوسط في الأنبوب. ترك الوسط يساعد على تجنب إجهاد الخلايا. أضف 10 مل من المخزن المؤقت الجديد لعزل RPMI ، وأعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 10 مل.
    7. ضع مصافي خلايا 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر (واحدة من كل نوع) (الجدول 1) على أنابيب مفتوحة سعة 50 مل.
    8. ماصة التعليق على مصافي الخلايا المتتالية (100 ميكرومتر ، 70 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر) وجمع التدفق في أنابيب 50 مل ، تحتوي على خلايا أقل من 40 ميكرومتر.
    9. جهاز طرد مركزي التعليق عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل حتى يتبقى 2 مل ، ثم استخدم ماصة 0.2-1 مل حتى يتبقى 100-200 ميكرولتر.
    10. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (الجدول 2). احتضان على الجليد لمدة 3 دقائق.
    11. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة 20-200 ميكرولتر.
    12. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد FACS (الجدول 2). مكان على الجليد.
  4. تحضير معلق الخلية لعزل FACS
    1. انقل 10 ميكرولتر من معلق الخلية الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.2.12 إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. ستشكل هذه العينة عنصر التحكم غير الملوث أو التحكم السلبي (الشكل 2). أضف 190 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وانقله إلى أنبوب سعة 5 مل (الجدول 1) ، واحفظه على الثلج.
    2. أجهزة الطرد المركزي 90 ميكرولتر المتبقية من معلق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2.12 عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة (حجم طرف 20-200 ميكرولتر). احتضان الخلايا ب 400 ميكرولتر من صبغة الصلاحية القابلة للتثبيت (الجدول 3) المخففة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الخالي من المصل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. اغسل الخلايا بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. اقلب الأنابيب برفق ثلاث مرات وطرد مركزي مرة أخرى عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. خلال وقت الطرد المركزي ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من مزيج رئيسي من الأجسام المضادة الأولية المقترنة بالفلوروفورات والموجهة ضد CD11b و CD31 و CD45 و TER119 و CD34 و ITGA7 و CXCR4 (الجدول 3) ، مخففة في المخزن المؤقت FACS.
    5. أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من طافي الخلية باستخدام ماصة (حجم طرف 20-200 ميكرولتر) ، وأضف مزيج الأجسام المضادة 100 ميكرولتر. اقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات. لا دوامة. احتضان في الظلام على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    6. أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة 20-200 ميكرولتر وأضف 500 ميكرولتر من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لغسل الخلايا. اقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات. أعد الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة 20-200 ميكرولتر.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وانقل التعليق إلى أنبوب سعة 5 مل.
      ملاحظة: تتم معالجة تعليق الخلية الذي تم الحصول عليه من هضم Liberase بنفس الطريقة.
  5. اختيار الخلايا الساتلية بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية
    1. دوامة لفترة وجيزة تعليق الخلية (2-5 ثانية) ومعالجة الخلايا على مقياس التدفق الخلوي مجهزة بفوهة 100 ميكرومتر (الجدول 1).
    2. حدد أحجام البوابات المختلفة بناء على العينة غير الملوثة المخزنة في الخطوة 1.4.1 (الشكل 2).
    3. قم بتغطية أنبوب سعة 5 مل ب 1 مل من مصل عجل الجنين النقي (FCS) لتحسين جمع الخلايا وإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
    4. تبادل العينة غير الملوثة مع العينة الموسومة بالأجسام المضادة.
    5. حدد السكان محل الاهتمام وفقا لمنطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبي (SSC-A) (الشكل 3A) ، وقم بإزالة الخلايا المزدوجة باستخدام FSC-A وارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) (الشكل 3B)14.
    6. تحديد الخلايا الحية ذات الصبغة السلبية القابلة للتثبيت (الشكل 3C).
    7. حدد الخلايا السالبة ل CD31 و CD45 و TER119 و CD11b (الشكل 3D).
    8. لتحديد الخلايا الساتلية ، حدد أولا الخلايا الموجبة ل CD34 و ITGA7 (الشكل 3E) ، ثم حدد الخلايا الموجبة CXCR4 على السكان المختارين CD34 و ITGA7 (الشكل 3F).
    9. اجمع الخلايا المختارة (بين 40000 و 80000 خلية ، وفقا لجودة المستحضر) في أنبوب مطلي سعة 5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.

2. التحقق من صحة السكان المعزولين في زراعة الأنسجة

  1. طلاء الشريحة مع هيدروجيل
    1. تمييع 280 ميكرولتر من مصفوفة مؤهلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية الهيدروجيل النقي (hESC) (الجدول 1) في 12 مل من وسط DMEM / F12 الخالي من المصل.
    2. قم بتغطية شريحة حجرة (الجدول 1) بمحلول الهيدروجيل ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    3. في اليوم التالي ، احتضان شريحة الغرفة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة قبل بذر الخلية.
  2. نمو الخلايا والتمايز
    1. قم بإخراج ما يقرب من 20000 خلية ، تم الحصول عليها من الخطوة 1.5.9 ، لكل بئر ، وقم بزراعتها في وسط النمو (الجدول 2) لمدة 5 أيام. التقط صورا لتباين الطور باستخدام مجهر برايت فيلد (الشكل 4 أ) ، قبل معالجتها لتحليل التألق المناعي لضمان جودة التحضير (الشكل 4 ب).
    2. للحث على تكوين العضلات ، قم بزراعة خلايا الأقمار الصناعية المضخمة من الخطوة 2.2.1 في الوسط العضلي (الجدول 2) لمدة 7 أيام إضافية. التقط صورا لتباين الطور باستخدام مجهر برايت فيلد (الشكل 4 ج) قبل معالجتها لتحليل التألق المناعي لضمان جودة التحضير (الشكل 4 د).
  3. تحليل التألق المناعي
    1. قم بإزالة الوسط برفق ، واغسل الخلايا التي تم زرعها على شريحة الغرفة ب 100 ميكرولتر من 1x PBS مرتين ، وقم بإصلاحها ب 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في RT لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية. يجب دائما الاحتفاظ بحجم صغير من الوسط في الغرفة لمنع إجهاد الخلايا ، ويجب سكب PBS عبر جدران الغرفة.
    2. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من 1x PBS ، مع استكمال 0.1٪ Tween 20 (PBST) لاختراق أغشية الخلايا.
    3. حجب الإشارات غير المحددة عن طريق الحضانة في 100 ميكرولتر من 1x PBST مع 5٪ FCS (PBST-FCS) في RT لمدة 1 ساعة.
    4. احتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من مزيج رئيسي من الأجسام المضادة ل PAX7 ومضاد الديستروفين (DMD) (مخفف في 1x PBST-FCS) عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، للكشف عن الخلايا الساتلية والألياف العضلية ، على التوالي.
    5. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من 1x PBST ، واحتضانها ب 100 ميكرولتر من الماعز المضاد للفأر Cy3 أو الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب Alexa 488 (الجدول 3) المخففة في 1x PBST-FCS في RT لمدة 1 ساعة.
    6. افصل آبار الغرفة عن الشريحة باستخدام المعدات التي يوفرها المورد ، وأضف 20 ميكرولتر من وسط التركيب المائي مع 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، وقم بتغطية الشريحة بغطاء (الجدول 1).
    7. مراقبة والتقاط صورة الخلايا الملطخة باستخدام مجهر متحد البؤر.
    8. معالجة الصور باستخدام برنامج تحليل الصور (الأشكال 4B ، D).

3. تحليل القص والتشغيل

  1. تحضير العينات لتحليل CUT&RUN على الخلايا الساتلية المعزولة بواسطة FACS
    ملاحظة: تم تنفيذ CUT &RUN بشكل أساسي كما هو موضح10,15. يتم تقديم تكوين المخزن المؤقت في الجدول 2.
    1. بالنسبة لمقايسة CUT &RUN ، استخدم ما يقرب من 40000 خلية تم الحصول عليها في الطريقة 1 ، الخطوة 1.5.9 ، لكل عينة / جسم مضاد يجب اختباره.
    2. قم بطرد الخلايا الساتلية المعزولة بواسطة FACS في RT بسرعة 500 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة (حجم طرف 20-200 ميكرولتر).
    3. اغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS ، وأجهزة الطرد المركزي في RT عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة (حجم طرف 0.2-1 مل) ، وأعد تعليقها في 1 مل من المخزن المؤقت لاستخراج النواة الباردة (الجدول 2). احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    4. أثناء الحضانة ، قم بإعداد أنبوب واحد سعة 1.5 مل يحتوي على 850 ميكرولتر من محلول الربط البارد (الجدول 2) وأضف 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المطلي بالكونكانافالين A لكل عينة (الجدول 1).
    5. اغسل الخرزات مرتين ب 1 مل من محلول الربط البارد باستخدام رف مغناطيسي (الجدول 1). لكل غسل أو تغيير في المخزن المؤقت طوال العملية ، اترك الخرزات تتراكم على جانب الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة 5 دقائق قبل إزالة المادة الطافية التي تم تطهيرها باستخدام ماصة (حجم طرف 0.2-1 مل). ثم أعد التعليق برفق في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط على البارد.
    6. قم بطرد النوى عند 4 درجات مئوية عند 600 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها برفق في 600 ميكرولتر من محلول الاستخراج النووي. امزج برفق 600 ميكرولتر من النوى المستخرجة مع 300 ميكرولتر من ملاط حبة كونكانافالين أ ، واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    7. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.4 ، وأعد تعليق النوى المرتبطة بالخرز برفق باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للحجب البارد (الجدول 2). احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    8. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي واغسل النوى المرتبطة بالخرز مرتين باستخدام 1 مل من محلول الغسيل البارد (الجدول 2). أثناء الغسيل الثاني ، قسم النوى المرتبطة بالخرز بالتساوي إلى أنابيب سعة 1.5 مل. سيتم التعامل مع كل أنبوب بجسم مضاد محدد في الخطوة التالية.
      ملاحظة: في هذا المثال، تم تقسيم 250 ميكرولتر من النوى المرتبطة بالخرز إلى أربعة أنابيب سعة 1.5 مل.
    9. افصل المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.4 ، وانضح باستخدام ماصة. أعد تعليق مجمعات النواة / الخرز برفق بجسم مضاد أولي محدد (الجدول 3) ، أو IgG من نوع آخر (هنا أرنب) مخفف في 250 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد. احتضان في 4 درجة مئوية طوال الليل مع تحريض لطيف.
      ملاحظة: يتم توجيه الأجسام المضادة المستخدمة هنا ضد AR و H3K4me2 و H3K27ac.
    10. قم بإزالة المادة الطافية بحامل مغناطيسي ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.4 ، واغسل النوى المرتبطة بالخرز مرتين باستخدام 1 مل من محلول الغسيل البارد ، وأعد التعليق في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد.
    11. تمييع بروتين A-micrococcal nuclease عند 1.4 نانوغرام / ميكرولتر في 100 ميكرولتر لكل عينة من محلول الغسيل البارد.
    12. أضف 100 ميكرولتر من بروتين A-micrococcal nuclease إلى 100 ميكرولتر من العينة التي تم الحصول عليها في 3.1.11 واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة مع التقليب.
    13. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.4 ، واغسلها مرتين باستخدام 1 مل من محلول الغسيل البارد ، وأعد تعليق النوى المرتبطة بالخرز في 150 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد.
    14. لبدء انقسام الحمض النووي ، أضف 3 ميكرولتر من 100 مللي مول من CaCl2 إلى 150 ميكرولتر من العينة ، واخلطها بسرعة عن طريق النقر ، واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. أوقف التفاعل عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لهضم الحمض النووي الريبي وإطلاق شظايا الحمض النووي.
    15. لاستخراج الحمض النووي ، قم بطرد العينات عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    16. انقل المادة الطافية إلى أنبوب microfuge جديد وتخلص من الحبيبات والخرز.
    17. أضف 3 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) و 2.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل بروتيناز K. امزج عن طريق الانقلاب. احتضان لمدة 10 دقائق على 70 درجة مئوية (لا رج).
    18. أضف 300 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / كحول الأيزو أميل ، دوامة ، انقلها إلى أنابيب قفل الطور سعة 2 مل (تدور مسبقا لمدة 5 دقائق عند 16000 × جم) ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    19. أضف 300 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى نفس الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية (~ 300 ميكرولتر) باستخدام ماصة (حجم طرف 0.2-1 مل) وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
    20. أضف 1 ميكرولتر من الجليكوجين (تركيز 20 مجم / مل).
    21. أضف 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ وترسب طوال الليل عند -20 درجة مئوية.
    22. حبيبات الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية. اغسل الحبيبات ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 16000 × جم ، وتخلص من المادة الطافية ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 16000 × جم ، وقم بإزالة السائل باستخدام ماصة (حجم طرف 20-200 ميكرولتر).
    23. جفف الحبيبات بالهواء لمدة ~ 5 دقائق. إعادة التعليق في 25 ميكرولتر من 1 مللي مول Tris-HCl (درجة الحموضة 8) و 0.1 مليمتر حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA ؛ درجة الحموضة 8).
  2. تحليل المعلوماتية الحيوية
    1. قم بإعداد مكتبات من الحمض النووي المشقوق المناعي وتسلسلها كقراءات مزدوجة النهاية 100 bp بمساعدة النظام الأساسي الجينومي كما هو موضح16.
    2. قم بإزالة القراءات المتداخلة مع منطقة القائمة السوداء ENCODE (V2) وافصل القراءات المتبقية إلى مجموعتين: حجم الشظية <120 bp (بدون نيوكليوسوم ، بشكل عام لعوامل النسخ) وحجم الشظية >150 bp (مع النيوكليوسومات ، عادة لعلامات الهستون). قم بتعيين الجينوم المرجعي mm10 باستخدام Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. قم بإنشاء ملفات bigwig باستخدام bamCoverage (أدوات عميقة 3.3.0: bamCoverage - تطبيع باستخدام RPKM - binSize 20).
    4. احتفظ بالقراءات المعينة بشكل فريد لمزيد من التحليل.
    5. قم بإنشاء ملفات bedgraph خام باستخدام genomeCoverageBed (أدوات السرير v2.26.0).
    6. استخدم خوارزمية SEACR 1.3 (خيار صارم) لذروة الاتصال. قم بتحميل ملف bedgraph للبيانات الهدف بتنسيق bedgraph UCSC الذي يحذف المناطق التي تحتوي على إشارة صفرية ، وملف bedgraph بيانات التحكم (IgG) لإنشاء عتبة تجريبية لاستدعاءالذروة 18.
    7. قم بإجراء تحليل ارتباط بيرسون باستخدام الأدوات العميقة لتحديد التشابه بين العينات19. استخدم سطر الأوامر multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz ، متبوعا ب plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "ارتباط بيرسون بأعداد القراءة" - whatToPlot خريطة الحرارة - خريطة الألوان RdYlBu - plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. تصور ملفات تعريف الكثافة على مستوى الجينوم باستخدام IGV20 باستخدام ملفات bedgraph وقمم ملف السرير التي تم الحصول عليها من SEACR.
    9. استخدم HOMER للتعليق التوضيحي الذروة والبحث عن الزخارف21.
    10. أخيرا ، قارن مجموعات البيانات بالمجموعات المنشورة مسبقا باستخدام متصفح ChIP-Atlas Peak لتصورها على IGV و / أو تحليل الإثراء باستخدام ملفات السرير التي تم إنشاؤها بواسطة SEACR كمجموعة بياناتإدخال 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم عزل الخلايا الساتلية من عضلات الهيكل العظمي للفأر عن طريق الجمع بين بروتوكولات Gunther et al. (المشار إليها فيما يلي بالبروتوكول 1)12 و Liu et al.23 (المشار إليها فيما يلي بالبروتوكول 2). نظرا لملاحظة الألياف العضلية غير المهضومة بعد الهضم عند استخدام تركيز كولاجيناز وديباز المقترح في البروتوكول 1 ، فقد زادت كمية الإنزيمات لتحسين تفكك الألياف العضلية ، كما هو موضح في الخطوتين 1.2.1 و 1.2.3. كما هو مبين في البروتوكول 2 ، تعرضت العينات لإثارة لطيفة في حمام مائي للحفاظ على صلاحية الخلية. أجرينا الترشيح من خلال مصافي الخلايا ، كما هو مذكور في البروتوكول 1 ، والحضانة باستخدام محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (انظر الخطوات 1.2.7 إلى 1.2.10). في البروتوكول 1 ، تم تحميل الخلايا على تدرج كثافة Percoll بنسبة 30٪ / 70٪ لعزل الخلايا أحادية النواة عند الطور البيني ، مما قد يؤدي إلى فقدان الخلايا ذات الأهمية. وبالتالي، حذفت هذه الخطوة، على النحو المقترح في البروتوكول 2.

تم استخدام بوابة FSC-A مقابل SSC-A لتحديد الخلايا أحادية النواة بناء على الحجم (FSC) والدقة (SSC) (الشكل 3A). تم استبعاد الحطام من خلال تجاهل الأحداث التي تقل عن 40 كلفن على محور FSC-A ، وتم اختيار 38.8٪ ± 3.6٪ من الخلايا. تم استخدام مخططات كثافة بوابات FSC-A مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) لاستبعاد المضاعفة (الشكل 3B). بعد اختيار الخلايا السلبية لعلامة البقع القابلة للتثبيت ، تم الحصول على متوسط 34.3٪ ± 7.7٪ من الخلايا الحية (الشكل 3C).

النسبة المئوية الموضحة في الرسم النقطي في الشكل 3C ، 75.4٪ ، تتوافق مع النسبة المئوية للخلايا الحية المفردة ، المحسوبة من مجموعة الخلايا الأم ، وهي في هذه الحالة الفردي. يتم الحصول على 95.7٪ من الخلايا المفردة من الأحداث الحية التي تشكل 35٪ من إجمالي الأحداث. وبالتالي ، فإن النسبة المئوية 34.3٪ التي تم الحصول عليها في المتوسط ، يتم حسابها من إجمالي الأحداث وليس السكان الأصليين.

حوالي 3٪ من الخلايا الحية المفردة كانت سلبية لكريات الدم البيضاء (CD45) ، وحيدات الخلايا (CD11b) ، البطانية (CD31) ، وعلامات خاصة بالكريات الحمر (TER119) (الشكل 3D). ثم تم اختيار الخلايا السلبية CD11b / CD45 / CD31 / TER119 وفقا لتعبيرها عن CD34 (الخلايا المكونة للدم ، والأسلاف البطانية ، والخلايا الجذعية الوسيطة) و ITGA7 (خلايا العضلات القلبية والملساء والهيكل العظمي) (الشكل 3E). تم إجراء بوابة أخيرة ل CXCR4 (الخلايا الليمفاوية ، المكونة للدم ، والخلايا الساتلية) لاختيار خلايا الأقمار الصناعية المفترضة (الشكل 3F). من خلايا CD34 + / ITGA7 + ، تم العثور على ~ 80٪ لتكون إيجابية ل CXCR4 ، والتي تمثل في المتوسط 1٪ ± 0.15٪ من إجمالي الخلايا الحية المفردة ، وعدد مطلق يبلغ 60000 ± 14000 خلية ساتلية مفترضة لكل عضلات أطراف الفأر من بين 14 تجربة مستقلة. كشف تقييم إضافي للجوء على جزء خلية CXCR4 + أن حوالي 80٪ من الخلايا الحية تم الحصول عليها بعد الفرز اللاحق ، منها ما يقرب من 70٪ كانت CXCR4 + (الشكل S1) ، مما يدل على الجدوى العالية والنقاء لهذه المجموعة من الخلايا المعزولة FACS.

منذ دراسات مختلفة قارنت كفاءة إنزيمات كولاجيناز وليبراز TL لعزل الخلايا24,25 ، تمت معالجة هاتين الطريقتين للهضم بالتوازي. مع 300 ميكرولتر من Liberase TL ، كان الهضم أقل كفاءة من الكولاجيناز ، حيث بقيت الألياف غير المهضومة. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ المزيد من حطام الخلايا والأحداث الكبيرة (الشكلان S2A ، B) ، وتم الحصول على 17.3٪ فقط من الخلايا الحية المفردة في المتوسط بعد اختيار FVS 780 (الشكل S2C). كان مصدر قلق إضافي مع هضم Liberase هو انخفاض عدد خلايا CD34 + / ITGA7 + مقارنة بالكولاجيناز (الأشكال S2D-S2E) ، على الرغم من أن بوابة CXCR4 كانت متشابهة (الشكل S2F). مع 600 ميكرولتر من Liberase TL ، كان الهضم أكثر كفاءة. ومع ذلك، ظلت كمية حطام الخلايا مرتفعة وبقاء الخلية دون المستوى المطلوب (16.3٪) (الشكل S3). وبالتالي ، كان الهضم باستخدام Liberase TL أقل كفاءة لعزل الخلايا الساتلية.

عند البذر ، عبر أكثر من 70٪ من خلايا CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + (الشكل 4A) عن PAX7 (الشكل 4B) ، على عكس خلايا CD34 + / ITGA7- / CXCR4- التي كانت سلبية PAX7 (الشكل 4C). تمكنت خلايا CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + من التمايز إلى ألياف عضلية عند نموها في وسط عضلي المنشأ لمدة 7 أيام إضافية ، كما هو موضح في تلطيخ الديستروفين (DMD) (الشكل 4D) ، مما يؤكد إمكاناتها العضلية. وهكذا، أظهرت تحليلات زراعة الأنسجة والتألق المناعي مجتمعة أن خلايا CD34+/ITGA7+/CXCR4+ المعزولة بواسطة FACS هي خلايا ساتلية.

لتحديد ما إذا كانت الخلايا الساتلية المعزولة مناسبة لتحليل CUT&RUN ، تم تحديد المظهر الجينومي لليسين الأسيتيل 27 (H3K27ac) والليسين ثنائي الميثيل 4 (H3K4me2) للهيستون H3 ، وهما تعديلان هيستون موجودان في مناطق المروج النشط والمعزز. كشفت بياناتنا عن 68,694 و 13,514 قمة ل H3K4me2 و H3K27ac ، على التوالي ، مع إعادة تقسيم جينومي مماثل بين علامتي هيستون (الشكل S4A). بالتفصيل ، وجدنا أن ربع القمم تقع ± 2 كيلو بايت من موقع بدء النسخ (TSS) لأقرب جين ، وتقع الغالبية إما -100 كيلو بايت إلى -10 كيلو بايت ، أو 10 كيلو بايت إلى 100 كيلو بايت من TSS (الشكل S4B). وتجدر الإشارة إلى أن تحليل بيرسون أظهر وجود ارتباط بنسبة 80٪ بين ملفات تعريف قراءة H3K27ac و H3K4me2 (الشكل S4C). لتقييم أن الكروماتين المحضر من البروتوكول المذكور أعلاه قد تم عزله من الخلايا الساتلية ، تم تحديد وجود H3K27ac و H3K4me2 في محفز الجينات الخاصة بالخلايا الساتلية. تم إثراء H3K4me2 حول TSS ل Pax7 و Itga7 و Lamb2 و Cxcr4 و Vcam1 (الشكل 5A) ، ولكن ليس في تلك الموجودة في Itgam (CD11b) و Ptprc (CD45) (الخلايا المناعية) ، Pecam (CD31 ؛ الخلايا البطانية) (الشكل 5B) ، Ckm (تطوير ألياف العضلات) ، أو Myh3 (الميوسين الثقيل سلسلة جنينية سريعة ، ألياف عضلية) (الشكل 5C). تم الحصول على نتائج مماثلة مع H3K27ac (الشكل 5). لم يتم الحصول على أي إشارة تقريبا باستخدام عينة IgG (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، أظهرت مقارنة قمم H3K27ac التي تم الحصول عليها من SEACR مع تلك الناتجة عن نداء الذروة MACS2 من مجموعات بيانات ChIP-seq المنشورة وجود ارتباط عال، كما هو مذكور أدناه كل لوحة (مسار ChIP-Atlas; الشكل 5). وتشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن القراءات التي تم الحصول عليها بعد تحليل المعلوماتية الأحيائية تنشأ من كروماتين الخلايا الساتلية المعزولة ب FACS وترتبط بتلك التي سبق تحديدها بواسطة تحليلات ChIP-seq.

بينما أظهرت دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية في خلايا الأقمار الصناعية للفأر استجابة إجهاد مذهلة ، ناتجة عن إجراءالعزل 26 ، تم تحديد وجود H3K4me2 أو H3K27ac في جينات الاستجابة للإجهاد ، كما يتضح من Atf3 و Azin1 و Gls و Elf2. تقدم النتائج دليلا على أن علامة H3K27ac لا تترسب عند مروج هذه الجينات ، وأن مستويات H3K4me2 تظل منخفضة مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها للجينات الخاصة بالخلايا الساتلية (الشكل S5). وبالتالي ، فإن هذه البيانات تسلط الضوء على مدى اعتدال إجراء العزل.

بعد ذلك ، تم فحص مدى ملاءمة طريقة العزل الخاصة بنا لعوامل النسخ. كشف تحليل CUT &RUN لمستقبلات الأندروجين (AR) ، وهو عامل نسخ ينتمي إلى عائلة المستقبلات النووية الفائقة والذي يلعب دورا مهما في التمايز العضلي27 ، عن 7840 قمة. كانت هذه القمم تقع بشكل رئيسي في المناطق الداخلية والجينية (الشكل S4A) ، إما -100 كيلو بايت إلى -10 كيلو بايت ، أو 10 كيلو بايت إلى 100 كيلو بايت من TSS (الشكل S4B). كشفت التحليلات التطورية أن AR ، جنبا إلى جنب مع الجلوكوكورتيكويد (GR / Nr3c1) ، والقشرانيات المعدنية (MR / Nr3c2) ، ومستقبلات البروجسترون (PR / Nr3c3) ، هو عضو في الفصيلة الفرعية لمستقبلات الأوكسستيرويدالنووية 28 ، التي ترتبط كمتجانسات بشرائح الحمض النووي التي تتكون من موقعين نصفيين 5′-RGAACA-3 مفصولين بثلاثة أزواج أساسية29. كشف البحث عن فكرة معروفة عن طريق التحسين الهندسي الفائق لإثراء الشكل (HOMER ، http://homer.ucsd.edu/homer/) أن AR مرتبط بفكرة نصف موقع 5′-RGRNCA-3′ AR ، إلى شكل oxosteroid النموذجي 5′-RGNACAnnnTGTNC-3 (المشار إليه في الشكل باسم PR) ، وإلى شكل إجماع 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR في >32٪ و 17٪ و 2٪ من المناطق المستهدفة ، على التوالي (الشكل 6 أ). تجدر الإشارة إلى أنه تم الحصول على نسب مماثلة سابقا لمستقبلات الجلوكوكورتيكويد في العضلات الهيكلية16.

كشف تحليل SEACR النقاب عن ما يقرب من 500 قمة بدرجة ذروة >50 ، مع أكثر من 200 منها بدرجة >100 ؛ وبعضها موضح في الشكل 6 ب. كشف تحليلنا أيضا عن إثراء متواضع للواقع المعزز في مواقع الربط الموصوفة سابقا للجينات المشاركة في التخليق الحيوي للبوليامين (Amd1 و Oat و Smox) وفي سرطان البروستاتا (Acox1 و Fkbp5 و Tmprss2) (الشكل S6). ومن المثير للاهتمام ، تم العثور على AR في مواقع الجينات المشاركة في جذع الخلايا الساتلية (Pax7 و Cxcr4 و Cd34) (الشكل S7). وتجدر الإشارة إلى أنه تم العثور على عنصر استجابة الأوكسوستيرويد في كل من هذه المناطق المخصبة بالواقع المعزز (الشكل S6 والشكل S7) ، مما يدل على أن إشارة AR التي شوهدت في بيانات CUT &RUN محددة للغاية.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول المستخدم لعزل الخلايا الساتلية عن عضلات أطراف الفأر. يتكون البروتوكول من أربع خطوات رئيسية. باختصار ، يتم التضحية بالفئران ، ويتم حصاد عضلات الأطراف الخلفية (الخطوات 1.1.1-1.1.3) والمفروم ميكانيكيا باستخدام المقص (الخطوات 1.4-1.5). يتبع ذلك الخطوات 1.2.1-1.2.4 ، حيث يتم فصل العضلات في حمام مائي باستخدام كولاجيناز و dispase. في الخطوات 1.2.5-1.2.8 ، يتم ترشيح تعليق الخلية من خلال مصافي الخلايا 100 و 70 و 40 ميكرومتر ، على التوالي ، ويتم التخلص من كريات الدم الحمراء باستخدام محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (الخطوات 1.2.9-1.2.12). يتم تمييز مجموعات الخلايا المتبقية في الخطوة 1.3 بالأجسام المضادة المقترنة بالفلوروفورات ، والتي يتم توجيهها ضد علامات النمط الظاهري الخلوي المحددة. وتشمل الخطوة 1-4 عينات تمر عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية لجمع الخلايا الساتلية لمواصلة تطبيقها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل قياس التدفق الخلوي لتحضير خلية غير ملوثة. (أ) اختيار السكان محل الاهتمام بناء على بارامترات FSC-A و SSC-A. (ب) تحديد الخلية المفردة على أساس FSC-A و FSC-H. (ج) توصيف عتبة التألق التلقائي للخلايا المجمعة ل APC-Cy7 المترافقة مع صبغة الصلاحية القابلة للتثبيت (FVS 780) التي تميز الخلايا الميتة. (D-F). قياس التألق التلقائي ل PE-Cy7 المترافق مع الجسم المضاد CD11b و PE المترافق مع علامات TER119 / CD45 / CD31 (D) ، وكذلك لفلور Alexa 488 المترافق مع ITGA7 ، وفلور Alexa 405 المترافق مع CD34 (E) ، وفلوروكروم APC المترافق مع CXCR4 (F). يتم تمثيل البوابات كصناديق سوداء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: استراتيجية بوابات مقياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا الساتلية. (أ) اختيار السكان محل الاهتمام على أساس بارامترات FSC-A و SSC-A. (ب) تحديد الخلية المفردة على أساس FSC-A و FSC-H. ج: تحديد الخلايا الحية باستخدام FVS 780. د: اختيار الخلايا السالبة بناء على مولدات الضد CD11b وCD31 وCD45 وTER119. (إ-و) اختيار الخلايا الإيجابية على أساس CD34 و ITGA7 (E) ، وكذلك مستضدات CXCR4 (F). يتم تمثيل البوابات كصناديق سوداء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل خلايا CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + و CD34 + / ITGA7- / CXCR4- المعزولة بواسطة FACS. (أ) صور تباين الطور لخلايا CD34+/ITGA7+/CXCR4+ وCD34+/ITGA7-/CXCR4- المزروعة في وسط النمو. (ب) تحليل التألق المناعي لخلايا CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + و CD34 + / ITGA7- / CXCR4- المزروعة في وسط النمو باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد PAX7 (أحمر) وديستروفين (DMD ، أخضر). كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). تشير الأسهم الأرجوانية إلى الخلايا الإيجابية PAX7. (C) صور تباين الطور لخلايا CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + نمت لمدة 5 أيام في وسط النمو (اللوحة اليسرى) ولمدة 7 أيام إضافية في وسط عضلي المنشأ (اللوحة اليمنى). (د) صور تحليل التألق المناعي لخلايا CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + المزروعة لمدة 5 أيام في وسط النمو (اللوحة اليسرى) ولمدة 7 أيام إضافية في وسط عضلي المنشأ (اللوحة اليمنى) باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد PAX7 (أحمر) وديستروفين (DMD ، أخضر). كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). تشير الأسهم الأرجوانية إلى الخلايا الإيجابية PAX7. تشير الأسهم الخضراء إلى خلايا إيجابية DMD. قضبان المقياس: ألواح برايتفيلد = 25 ميكرومتر ؛ لوحات التألق المناعي = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الملامح الجينومية لكروماتين الخلية الساتلية. توطين H3K4me2 و H3K27ac في الجينات الخاصة بالخلايا الساتلية (A) ، والجينات الخاصة بالخلايا المناعية والبطانية (B) ، والجينات الخاصة بالألياف العضلية (C) على كروماتين الخلايا الساتلية بواسطة CUT &RUN. المروجون النشطون محاصرون باللون الأخضر ، بينما المروجون غير النشطين محاصرون باللون البني. تم استخدام CUT &RUN الذي تم إجراؤه باستخدام IgG كعنصر تحكم سلبي. يتم عرض تحليل التخصيب H3K27ac لعلامات الهستون أسفل كل مسار. يتم تصوير درجة الإثراء التي توضح مستويات الثقة في مجموعات البيانات المنشورة كخريطة حرارية. تشير النجوم البنية (*) إلى قمم H3K27ac ChIP-seq التي يتم إجراؤها في خلايا الأقمار الصناعية العضلية ، والنجوم الزرقاء إلى H3K4me3 ، والنجوم الوردية إلى H4K16me1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التوزيع الجيني للواقع المعزز على كروماتين الخلايا الساتلية . (أ) تحليل الزخارف المعروف هوميروس لقمم الواقع المعزز في الخلايا الساتلية. العلاقات العامة: مستقبلات هرمون البروجسترون. يشير هدف ملحوظة إلى عدد القمم التي تقدم فكرة معينة. (ب) توطين H3K4me2 و AR في الجينات المشار إليها على كروماتين الخلايا الساتلية التي تحددها CUT &RUN. تم استخدام CUT &RUN الذي تم إجراؤه باستخدام IgG كعنصر تحكم سلبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قائمة المواد والكواشف والبرمجيات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: التراكيب العازلة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: مراجع الأجسام المضادة وتركيزاتها. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الشكل التكميلي 1: تحليل قياس التدفق الخلوي لإعداد الخلية بعد الفرز. (أ) اختيار السكان محل الاهتمام بناء على بارامترات FSC-A و SSC-A. (ب) تحديد الخلية المفردة على أساس FSC-A و FSC-H. (ج) تحديد الخلايا الحية ذات صبغة الصلاحية القابلة للتثبيت (FVS 780). د: اختيار الخلايا السالبة بناء على مولدات الضد CD11b وCD31 وCD45 وTER119. (إ-و) اختيار الخلايا الإيجابية على أساس CD34 و ITGA7 (E) وكذلك مستضدات CXCR4 (F). يتم تمثيل البوابات كصناديق سوداء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: استراتيجية بوابة مقياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا الساتلية بعد الهضم باستخدام 300 ميكرولتر من Liberase TL. (أ) اختيار السكان محل الاهتمام بناء على بارامترات FSC-A و SSC-A. (ب) تحديد الخلية المفردة على أساس FSC-A و FSC-H. ج: تحديد الخلايا الحية باستخدام FVS 780. د: اختيار الخلايا السالبة بناء على مولدات الضد CD11b وCD31 وCD45 وTER119. (إ-و) اختيار الخلايا الإيجابية على أساس CD34 و ITGA7 (E) وكذلك مستضدات CXCR4 (F). يتم تمثيل البوابات كصناديق سوداء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: استراتيجية بوابات مقياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا الساتلية بعد الهضم باستخدام 600 ميكرولتر من Liberase TL. (أ) اختيار السكان محل الاهتمام بناء على بارامترات FSC-A و SSC-A. (ب) تحديد الخلية المفردة على أساس FSC-A و FSC-H. ج: تحديد الخلايا الحية باستخدام FVS 780. د: اختيار الخلايا السالبة بناء على مولدات الضد CD11b وCD31 وCD45 وTER119. (إ-و) اختيار الخلايا الإيجابية على أساس CD34 و ITGA7 (E) وكذلك مستضدات CXCR4 (F). يتم تمثيل البوابات كصناديق سوداء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: توصيف المواقع الجينومية H3K4me2 و H3K27ac و AR. (أ) مخططات دائرية توضح ذروة توزيع H3K4me2 و H3K27ac و AR وفقا لخصائص الجينوم في الخلايا الساتلية. (ب) مخططات دائرية تصور ذروة توزيع H3K4me2 و H3K27ac و AR وفقا لبعدها عن أقرب TSS في الخلايا الساتلية. (C) خريطة حرارية توضح ارتباط بيرسون بين عنصر التحكم H3K4me2 و H3K27ac و IgG. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: الملامح الجينومية لكروماتين الخلايا الساتلية في الجينات المستحثة بالاستجابة للإجهاد. توطين H3K4me2 و H3K27ac في الجينات المشار إليها على كروماتين الخلايا الساتلية. تم استخدام الترسيب المناعي مع IgG كعنصر تحكم سلبي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: الملامح الجينومية لكروماتين الخلايا الساتلية في الجينات المستهدفة المعروفة بالواقع المعزز. توطين H3K4me2 و H3K27ac و AR في الجينات المشار إليها على كروماتين خلايا الأقمار الصناعية التي تحددها CUT &RUN. قمم AR محاصرة باللون الأزرق ، ويتم عرض العناصر المقابلة للواقع المعزز أدناه. تم استخدام CUT &RUN الذي تم إجراؤه باستخدام IgG كعنصر تحكم سلبي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 7: الملامح الجينومية لكروماتين الخلايا الساتلية في جيناتها المعبر عنها بشكل انتقائي. توطين H3K4me2 و H3K27ac و AR في الجينات المشار إليها على كروماتين خلايا الأقمار الصناعية التي تحددها CUT &RUN. قمم AR محاصرة باللون الأزرق ، ويتم عرض العناصر المقابلة للواقع المعزز أدناه. تم استخدام CUT &RUN الذي تم إجراؤه باستخدام IgG كعنصر تحكم سلبي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تشير الدراسة الحالية إلى طريقة موحدة وموثوقة وسهلة الأداء لعزل وثقافة خلايا الأقمار الصناعية للفأر ، بالإضافة إلى تقييم تنظيم النسخ بواسطة طريقة CUT &RUN.

يتضمن هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الأول هو اضطراب العضلات وهضم الألياف لضمان وجود عدد كبير من الخلايا المجمعة. على الرغم من زيادة تركيز الإنزيم ، تم الحصول على خلايا حية أكثر من استخدام البروتوكول 1. تعبر الخلايا الساتلية عن نمط محدد من البروتينات الغشائية المختلفة. لزيادة صرامة الفرز لدينا ، استخدمنا مزيجا من علامات الخلايا الساتلية السلبية الموصوفة سابقا (CD31 و TER119 و CD45 و CD11b) والإيجابية (CD34 و ITGA7 و CXCR4)30,31. باستخدام هذه الاستراتيجية ، تم الحصول على ما معدله 1٪ من الخلايا الساتلية الحية المفترضة. هذه النتيجة في نطاق ما كان متوقعا ، لأن الخلايا الساتلية تمثل 2٪ -7٪ من عدد الخلايا العضلية في مرحلة البلوغ في الفئران32. كعنصر تحكم لعلامات اختيار الخلايا الساتلية ، تم عزل خلايا CD34 + / ITGA7- / CXCR4. وأظهر التلوين المناعي أنه في حين أن خلايا CD34+/ITGA7-/CXCR4- لم تعبر عن PAX7، فإن 70٪ من الخلايا المصنفة CD34+/ITGA7+/CXCR4+ كانت إيجابية لهذه العلامة الخاصة بالخلايا الساتلية، مما يدل على أن مجموعة المواد المعزولة من نظام مراقبة الأصول الميدانية تتوافق مع الخلايا الساتلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن 70٪ من الخلايا الساتلية التي نمت في وسط عضلي المنشأ لمدة 7 أيام كانت PAX7- / DMD + ، كما هو موضح في التلوين المناعي ، وشكلت ليفا عضليا ممدودا متعدد النوى ، مما يدل على أن الخلايا الساتلية المعزولة حافظت على إمكاناتها الجذعية.

قد يكون القيد الرئيسي في تحضير العينة هو استخدام تركيز عال من الإنزيمات ، مما يؤدي إلى كمية كبيرة من المواد البيولوجية المنفصلة ، ولكنه قد يساهم في زيادة موت الخلايا. لحل هذه المشكلة ، تم اختبار اختبار يتطلب كمية إنزيم أقل. في هذا السياق ، تم اختبار Liberase TL ، وهو شكل منقى من الكولاجين التقليدي33. على الرغم من أن الهضم كان على ما يبدو أكثر كفاءة مع هذا الإنزيم ، إلا أن كمية حطام الخلايا ظلت مرتفعة ، وانخفضت صلاحية الخلية قليلا. تتفق هذه الملاحظات مع التقارير السابقة التي قارنت هضم الأنسجة بوساطة Liberase بهذا مع كولاجيناز المؤتلف أو كولاجينازمخصص 24,25. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن نسبة الخلايا البطانية والمناعية كانت متشابهة بين هضم الكولاجيناز والليبيراز ، إلا أن النسبة المئوية للخلايا الساتلية كانت أقل في العينة المعالجة ب Liberase ، مما يدل بشكل عام على أن Liberase غير موصى به لعزل الخلايا الساتلية. استخدام هذا الإنزيم مناسب للتحليل الظاهري والكمي للخلايا المناعية ويمكن التوصية به في نهاية المطاف في سياق العضلات و / أو الأنسجة الأخرى. هذا يتوافق مع ما تم الإبلاغ عنه على Liberase TL باعتباره الأنسب لعزل الخلايا المناعية القابلة للحياة بشكل فعال34،35،36.

مشكلة أخرى محتملة هي الإجهاد الناجم عن كل من فصل وفرز خلايا الأقمار الصناعية. ومع ذلك ، فإن غياب H3K27ac ومستويات H3K4me2 المنخفضة في منطقة المروج لجينات الاستجابة للإجهاد التي تم تحديدها بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية في خلايا الأقمار الصناعيةللفأر 26 تظهر أن الإجراء خفيف بما يكفي لعدم تحفيز ذخيرة نسخ استجابة الإجهاد. القيود الأخرى التي يجب ملاحظتها هي المستضدات المختارة التي تظل تجريبية. ومع ذلك ، تظهر الدراسات تداخلا كبيرا بين مجموعات علامات السطح الفريدة التي يتم تخصيبها لخلايا الأقمار الصناعية للعضلات الهيكلية30,31.

خطوة حاسمة إضافية هي تنقية النوى من الخلايا المصنفة. لهذا ، يتم الحفاظ على سرعة الفرز منخفضة حتى لا تتلف الخلايا ، ولكن بسرعة كافية بحيث لا يتم تخزينها لفترة طويلة في المخزن المؤقت FACS. في الواقع ، نوى CUT &RUN ليست ثابتة ، وقد يؤثر وقت الحضانة الأطول على القراءة التي تم الحصول عليها من البروتوكول. يسمح التحضير النموذجي من الطرفين الخلفيين لفأر واحد ب CUT &RUN بجسم مضاد واحد وتحكم IgG واحد ، بكمية 2.5 نانوغرام من الكروماتين لكل منهما.

قدمت تجارب CUT &RUN ، المصممة لتقييم ارتباط عامل النسخ والتعديلات اللاجينية ، إشارات قراءة قوية وقوية ل H3K4me2 و H3K27ac. أظهرت مستويات القراءة العالية ل H3K4me2 و H3K27ac على الجينات المعروفة بالتعبير عنها في الخلايا الساتلية ، مقارنة بالجينات المعبر عنها في الخلايا المناعية أو البطانية وكذلك في الألياف العضلية ، أن الإشارة تم تضخيمها في الغالب من نوى الخلايا الساتلية. بالإضافة إلى ذلك ، جعل هذا البروتوكول تحديد cistrome من AR في الخلايا الجذعية العضلية ممكنا ، والتي لا تزال حتى الآن مشكلة فنية متأصلة في الجودة الرديئة للأجسام المضادة AR للفأر ومستويات تعبير AR المنخفضة في الخلايا التي ليست شديدة الحساسية للأندروجين ، مثل خلايا البروستاتا الظهارية. كشفت البيانات المقدمة هنا النقاب عن مناطق مرتبطة بالواقع المعزز ذات درجات ذروة ثقة عالية. نظرا لأنه تم تقييم نسخة متماثلة واحدة فقط في الأصل لكل جسم مضاد ، تحسين متانة مجموعات البيانات الخاصة بنا عن طريق إضافة نسختين بيولوجيتين إضافيتين على الأقل لكل حالة. ومع ذلك ، فإن الجينات المستهدفة المعروفة بالواقع المعزز وعلامات الهستون ذات الصلة ، والتي وصفت في الأصل بأنها عالية التعبير و / أو يمكن اكتشافها بسهولة في سياقات الأنسجة الأخرى مثل البروستاتا ، تقدم مستويات تعبير أقل ويصعب اكتشافها في خلايا الأقمار الصناعية.

أحد قيود نهج CUT &RUN هو أنه يتم تنفيذه في خلايا غير ثابتة. وبالتالي ، ربما فاتنا بعض أهداف AR بسبب الطبيعة المرنة للتفاعلات بين عوامل النسخ وموقع ارتباطها. وبالمثل ، فإن بعض التعديلات اللاحقة للترجمة ، مثل أستلة ، يمكن أن تكون أيضا قابلة للتغيير إلى حد ما. ولذلك، فإن إدراج خطوة تثبيت ضوئي مع الفورمالديهايد أو بارافورمالدهايد، بعد فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية، وقبل عزل النوى، يمكن النظر فيه لتثبيت تفاعلات البروتين/الحمض النووي وتعديلات الهستون.

على الرغم من أن هذه الورقة تبين أنه يمكن إجراء فحوصات CUT &RUN على الخلايا الساتلية المعزولة بواسطة FACS ، إلا أنه يمكن أيضا إجراء تحليلات أخرى تستخدم الكروماتين غير الثابت مثل ATAC-seq. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن العضلات هنا تم حصادها في الظروف الفسيولوجية القاعدية ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على السياقات المرضية مثل الإصابة أو الشيخوخة. ستسمح جميع استخدامات البروتوكول هذه بفهم مفصل للآليات التنظيمية الجينية في الخلايا الساتلية ، وقد تساعد في فهم كيفية تغيير هذه الآليات بسبب الظروف الفيزيولوجية المرضية.

باختصار ، يوفر هذا البروتوكول منخفض التكلفة والفعال من حيث الوقت بيئة تجريبية فعالة لدراسة توظيف عامل النسخ ومشهد الكروماتين في خلايا سلائف العضلات الهيكلية. قدم الكروماتين الذي أعده هذا البروتوكول أول تحليل على مستوى الجينوم لسيستروم AR في الخلايا الساتلية وسيسهل الدراسات المستقبلية حول تنظيم الجينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نشكر أناستازيا بانوارث على تقديم المساعدة الفنية الممتازة. نشكر مرفق بيت IGBMC ، وثقافة الخلايا ، ومعهد الماوس السريري (ICS ، Illkirch ، فرنسا) ، والتصوير ، والمجهر الإلكتروني ، وقياس التدفق الخلوي ، ومنصة GenomEast ، وهي عضو في اتحاد "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).

تم دعم هذا العمل للمعهد المواضيعي متعدد التخصصات IMCBio ، كجزء من برنامج ITI 2021-2028 لجامعة ستراسبورغ و CNRS و Inserm ، من قبل IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ومشروع SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) و EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) في إطار برنامج الاستثمارات الفرنسية من أجل المستقبل. تم تقديم تمويل إضافي من قبل INSERM و CNRS و Unistra و IGBMC والوكالة الوطنية للبحوث (ANR-16-CE11-0009 ، AR2GR) والبرنامج الاستراتيجي AFM-Téléthon 24376 (إلى D.D.) ومنحة INSERM للباحثين الشباب (إلى D.D.) و ANR-10-LABX-0030-INRT وصندوق حكومي فرنسي تديره ANR في إطار برنامج Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). وتلقى ج. ر. الدعم من برنامج CDFA-07-22 من الجامعة الفرنسية ووزارة التعليم العالي للبحوث والابتكار، ومن قبل جمعية البحوث والبحوث والابتكار (IGBMC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Tags

تحليل CUT &RUN ، خلايا الأقمار الصناعية للفأر المعزولة FACS ، مجال الخلايا الجذعية ، مجموعات الخلايا الصغيرة ، البروتوكول الفعال ، فرز الخلايا المنشط بالتألق ، عضلات الأطراف ، البروتينات الهيكلية ، الفرم ، المتوسط ، الفاصل ، الكولاجين من النوع الأول ، مصافي الخلايا ، المخزن المؤقت FACS ، صبغة الصلاحية ، خلايا الأقمار الصناعية الملطخة بالمناعة ، Triton X-100 ، حبات Concanavalin A المغناطيسية ، عامل النسخ ، تعديلات هيستون ، نوكلياز البروتين A-micrococcal ، انشقاق الكروماتين ، CaCl2 ، استخراج الحمض النووي ، المكتبات تحليل المعلوماتية الحيوية
بروتوكول فعال لتحليل CUT&amp;RUN لخلايا الأقمار الصناعية للفأر المعزولة FACS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter