Summary
这里介绍的是一种有效的方案，用于小鼠肢体肌肉卫星细胞的荧光激活细胞分选（FACS）分离，适用于研究肌肉纤维中的转录调控，方法是在靶标下切割并使用核酸酶（CUT&RUN）释放。
Abstract
小细胞群的全基因组分析是研究的主要制约因素，特别是在干细胞领域。这项工作描述了一种有效的协议，用于从肢体肌肉（一种结构蛋白含量高的组织）中分离卫星细胞的荧光激活细胞分选（FACS）。通过在补充有分散酶和 I 型胶原酶的培养基中切碎来机械地破坏成年小鼠的解剖肢体肌肉。消化后，匀浆通过细胞过滤器过滤，细胞悬浮在FACS缓冲液中。用可固定的活力染色测定活力，并通过FACS分离免疫染色的卫星细胞。用 Triton X-100 裂解细胞，释放的细胞核与刀豆球蛋白 A 磁珠结合。将细胞核/微珠复合物与针对目标转录因子或组蛋白修饰的抗体一起孵育。洗涤后，将细胞核/微珠复合物与蛋白 A-微球菌核酸酶一起孵育，并用 CaCl2 开始染色质裂解。提取DNA后，建立文库并进行测序，通过生物信息学分析获得全基因组转录因子结合和共价组蛋白修饰图谱。获得的各种组蛋白标记的峰表明，结合事件对卫星细胞具有特异性。此外，已知基序分析显示转录因子 通过其 同源反应元件与染色质结合。因此，该方案适用于研究成年小鼠肢体肌肉卫星细胞中的基因调控。
Introduction
骨骼横纹肌平均占人体总重量的 40%1。肌肉纤维在受伤时表现出显着的再生能力，这可以通过新形成的肌细胞的融合和取代受损肌纤维的新肌纤维的产生来描述2。1961年，亚历山大·毛罗（Alexander Mauro）报道了一组单核细胞，他称之为卫星细胞3。这些干细胞表达转录因子配对盒 7 （PAX7），位于基底层和肌纤维肌节之间4。据报道，它们表达分化簇 34（CD34;一种造血、内皮祖细胞和间充质干细胞标志物）、整合素 α7（ITGA7;一种平滑、心脏和骨骼肌标志物）以及 C-X-C 趋化因子受体 4 型（CXCR4;一种淋巴细胞、造血和卫星细胞标志物）5。在基础条件下，卫星细胞位于特定的微环境中，使它们保持静止状态6。肌肉损伤后，它们被激活、增殖并发生肌生成7。然而，它们只占肌肉细胞总数的一小部分，它们的全基因组分析特别具有挑战性，尤其是在生理环境下（占总细胞的<1%）。
已经描述了从卫星细胞中分离染色质的各种方法，包括染色质免疫沉淀，然后进行大规模平行测序 （ChIP-seq） 或靶标切割和标记 （CUT&Tag） 实验。然而，这两种技术存在一些重要的局限性，这些局限性仍然没有受到挑战。事实上，ChIP-seq 需要大量的起始材料来产生足够的染色质，其中很大一部分在超声处理步骤中丢失。CUT&Tag 更适合低细胞数，但由于 Tn5 转座酶活性，与 ChIP-seq 相比，CUT&Tag 产生更多的脱靶切割位点。此外，由于该酶对开放染色质区域具有高亲和力，因此 CUT&Tag 方法可能优先用于分析与基因组活跃转录区域相关的组蛋白修饰或转录因子，而不是沉默的异染色质 8,9。
这里介绍的是一个详细的方案，允许通过FACS分离小鼠肢体肌肉卫星细胞，以便在靶标下进行切割，并使用核酸酶（CUT&RUN）10,11分析释放。各个步骤涉及组织的机械破坏、细胞分选和细胞核分离。通过对共价组蛋白修饰和转录因子进行CUT&RUN分析，证明了该方法在制备活细胞悬液方面的效率。分离细胞的质量使得所描述的方法对于制备染色质特别有吸引力，该染色质可以忠实地捕获天然基因组占有状态，并且可能适用于捕获特定位点（4C-seq）或全基因组水平（Hi-C）的高通量测序。
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Protocol
小鼠被饲养在经认可的动物舍中，符合国家动物护理指南（欧盟委员会指令86/609/CEE;法国第87-848号法令）关于使用实验动物进行研究。根据 APAFIS 编号 #22281 下的 2010/63/EU 指令，将预期的操作提交给伦理委员会（Com'Eth，斯特拉斯堡，法国）和法国研究部 （MESR） 进行伦理评估和授权。
1.通过荧光激活细胞分选（FACS）制备用于分离卫星细胞的细胞悬液（图1）
- 肌肉组织的分离
- 使用清洁剂对肌肉解剖工具（包括镊子、手术刀和剪刀）进行去污（表 1），并用蒸馏水彻底冲洗。
- 准备两个 2 mL 管（表 1），每个管含有 1 mL 肌肉分离缓冲液，并将它们放在冰上以收集收获的肌肉。
- 通过CO2 窒息后宫颈脱位处死两只10周龄的C57 / Bl6J雄性小鼠。在每只小鼠上喷洒70%乙醇。用镊子从后肢剥离皮肤。解剖股骨，胫骨和腓骨周围的所有肢体肌肉（每只小鼠约1mg肌肉）。
注意：卫星细胞数量在 15 周龄后减少。 - 将收获的肢体肌肉放入含有1mL肌肉分离缓冲液的2mL管中，该管在步骤1.1.2中制备。按照相同的步骤从第二只鼠标收集肌肉。用剪刀在冰上切碎收获的肌肉，直到获得小于 1 毫米的3 个碎片。
注：肌肉主要按描述12收集和切碎。按照步骤1.2或1.3进行组织消化。
- 用胶原酶消化组织
- 通过将切碎的肌肉悬浮液倒入含有18mL肌肉分离缓冲液（补充有5mL [5U / mL]分散酶和5mg I型胶原酶）的50mL管（表1）中，转移两只小鼠的碎肌肉悬浮液（表1）。
- 紧紧关闭试管并用实验室薄膜密封（表1）。将其水平置于37°C，100rpm的振荡水浴（表1）中30分钟。
- 30分钟后，加入5mg的I型胶原酶。将试管在37°C，100rpm的振荡水浴中再搅拌30分钟。
- 消化后，用 10 mL 移液管上下移液肌肉悬液 10 次，以提高解离效率。在4°C下以400× g 离心5分钟。在管子底部可以看到一个透明的颗粒。使用 10 mL 移液管弃去上清液，在试管中留下 5 mL 培养基。
注意：离开培养基有助于避免对细胞造成压力。加入 10 mL 新鲜肌肉分离缓冲液，并用 10 mL 移液管上下移液，重悬沉淀。 - 将 100 μm、70 μm 和 40 μm 细胞过滤器（每种一种）（表 1）放在开放的 50 mL 管上。将悬浮液移液到连续的细胞过滤器（100μm，70μm，40μm）上，并将流出物收集到50mL管中，其中包含40μm以下的细胞。
- 将悬浮液在4°C下以400× g 离心5分钟。使用 10 mL 移液管弃去上清液，直到剩余 2 mL，然后使用 0.2-1 mL 移液管直到剩余 100-200 μL。将沉淀重悬于2mL红细胞裂解缓冲液中（表2）。在冰上孵育3分钟。
- 在4°C下以400× g 离心5分钟，并使用20-200μL移液管弃去上清液。将细胞重悬于100μL冷FACS缓冲液中（表2）。放在冰上。
- 使用 Liberase 低热溶素 （TL） 酶进行组织消化的替代方法
- 按照步骤 1.1 中的说明进行操作。用于组织分离。
- 对于Liberase介导的组织解聚，在2mL罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）分离缓冲液（表2）中收获肌肉，而不是步骤1.1.2中描述的肌肉分离缓冲液。
- 通过将切碎的肌肉悬浮液从两只小鼠倒入含有18mL RPMI分离缓冲液的50mL管（表1）中，补充有300或600μL的Liberase TL，浓度为5mg / mL（表1）（即，分别为0.083mg / mL和0.167mg / mL终浓度）13。
- 紧紧关闭试管并用实验室薄膜密封（表1）。将其水平置于37°C，100rpm的振荡水浴（表1）中30分钟。
- 消化后，用 10 mL 移液管将肌肉悬液上下移液 10 次，以解离并提高解离效率。
- 在4°C下以400× g 离心5分钟。在管子底部可以看到一个透明的颗粒。使用 10 mL 移液管弃去上清液，在试管中留下 5 mL 培养基。离开培养基有助于避免对细胞造成压力。加入 10 mL 新鲜的 RPMI 分离缓冲液，并用 10 mL 移液管上下移液，重悬沉淀。
- 将 100 μm、70 μm 和 40 μm 细胞过滤器（每种一种）（表 1）放在开放的 50 mL 管上。
- 将悬浮液移液到连续的细胞过滤器（100μm，70μm，40μm）上，并将流出物收集到50mL管中，其中含有40μm以下的细胞。
- 将悬浮液在4°C下以400× g 离心5分钟。使用 10 mL 移液管弃去上清液，直到剩余 2 mL，然后使用 0.2-1 mL 移液管直到剩余 100-200 μL。
- 将沉淀重悬于2mL红细胞裂解缓冲液中（表2）。在冰上孵育3分钟。
- 在4°C下以400× g 离心5分钟，并使用20-200μL移液管弃去上清液。
- 将细胞重悬于100μL冷FACS缓冲液中（表2）。放在冰上。
- 制备用于FACS分离的细胞悬液
- 将步骤 1.2.12 中获得的 10 μL 细胞悬液转移到新鲜的 1.5 mL 管中。该样品将构成未染色的对照或阴性对照（图2）。加入 190 μL FACS 缓冲液，转移到 5 mL 试管中（表 1），并储存在冰上。
- 将步骤1.2.12中获得的剩余90μL细胞悬液在4°C下以400× g 离心5分钟，并使用移液管（20-200μL吸头体积）弃去上清液。将细胞与在室温 （RT） 下在无血清 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 中稀释的 400 μL 可固定活力染色剂（表 3）孵育 15 分钟。
- 通过在4°C下以400× g 离心5分钟洗涤细胞，并加入100μLFACS缓冲液。轻轻地倒置试管三次，并在4°C下以400× g 再次离心5分钟。
- 在离心期间，制备 100 μL 与荧光基团偶联并针对 CD11b、CD31、CD45、TER119、CD34、ITGA7 和 CXCR4 的一抗预混液（表 3），在 FACS 缓冲液中稀释。
- 在4°C下以400× g 离心5分钟，使用移液管（20-200μL尖端体积）弃去细胞上清液，并加入100μL抗体混合物。轻轻地将管子倒置三次。不要涡旋。在黑暗的冰上孵育30分钟。
- 在4°C下以400× g 离心5分钟。 使用 20-200 μL 移液管弃去上清液，并加入 500 μL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞。轻轻地将管子倒置三次。在4°C下以400× g 重新离心5分钟，并使用20-200μL移液管弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于500μL流式细胞仪缓冲液中，并将悬浮液转移到5mL试管中。
注意：从Liberase消化获得的细胞悬液以相同的方式处理。
- 通过FACS选择卫星小区
- 短暂涡旋细胞悬液（2-5秒），并在配备100μm喷嘴的流式细胞仪上处理细胞（表1）。
- 根据步骤1.4.1中存储的未染色样品确定各种门尺寸（图2）。
- 用 1 mL 纯胎牛血清 （FCS） 包被 5 mL 试管以改善细胞收集，并加入 500 μL FACS 缓冲液。
- 将未染色的样品与抗体标记的样品交换。
- 根据前向散射区（FSC-A）和侧向散射区（SSC-A）选择感兴趣的群体（图3A），并去除具有FSC-A和前向散射高度（FSC-H）的双峰细胞（图3B）14。
- 鉴定具有可固定活力染色阴性染色的活细胞（图3C）。
- 选择CD31，CD45，TER119和CD11b的阴性细胞（图3D）。
- 为了鉴定卫星细胞，首先选择CD34和ITGA7阳性的细胞（图3E），然后在CD34和ITGA7选择的群体中选择CXCR4阳性细胞（图3F）。
- 将选定的细胞（40,000至80,000个细胞，根据制备质量）收集在含有500μLFACS缓冲液的5mL包被管中。
2. 组织培养中分离群体的验证
- 用水凝胶涂覆幻灯片
- 在 12 mL 无血清 DMEM/F12 培养基中稀释 280 μL 纯水凝胶人胚胎干细胞 （hESC） 合格基质（表 1）。
- 用水凝胶溶液涂覆腔室载玻片（表1），并在4°C下孵育过夜。
- 第二天，在细胞接种前将腔室载玻片在37°C和5%CO2 下孵育1小时。
- 细胞生长和分化
- 每孔铺出约20,000个细胞，从步骤1.5.9获得，并在生长培养基（表2）中生长5天。使用明场显微镜拍摄相差图像（图4A），然后对其进行处理以进行免疫荧光分析，以确保制备的质量（图4B）。
- 为了诱导肌生成，在肌源性培养基（表2）中再生长步骤2.2.1中扩增的卫星细胞7天。在处理它们进行免疫荧光分析之前，使用明场显微镜（图4C）拍摄相差图像，以确保制备的质量（图4D）。
- 免疫细胞荧光分析
- 轻轻除去培养基，用100μL的1x PBS洗涤在腔室载玻片上培养的细胞两次，并在室温下用100μL的4%多聚甲醛（PFA）固定1小时。
注意：此步骤应小心执行。腔室中应始终保留少量培养基，以防止对细胞施加压力，并且应将PBS倒入腔室壁。 - 用 100 μL 的 1x PBS 洗涤细胞 3 次，并补充有 0.1% 吐温 20 （PBST） 以透化细胞膜。
- 通过在室温下在补充有 5% FCS （PBST-FCS） 的 100 μL 1x PBST 中孵育 1 小时来阻断非特异性信号。
- 将细胞与100μL抗PAX7和抗肌萎缩蛋白（DMD）抗体（在1x PBST-FCS中稀释）的预混液在4°C下孵育过夜，以分别检测卫星细胞和肌纤维。
- 用 100 μL 的 1x PBST 洗涤细胞 3 次，并用 100 μL 山羊抗小鼠 Cy3 或山羊抗兔 Alexa 488 二抗（表 3）在室温下稀释在 1x PBST-FCS 中孵育 1 小时。
- 使用供应商提供的设备将腔室孔与载玻片分离，加入 20 μL 含 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的水性封固剂，并用盖玻片盖住载玻片（表 1）。
- 用共聚焦显微镜观察并捕获染色细胞的图像。
- 使用图像分析软件处理图像（图4B，D）。
- 轻轻除去培养基，用100μL的1x PBS洗涤在腔室载玻片上培养的细胞两次，并在室温下用100μL的4%多聚甲醛（PFA）固定1小时。
3. CUT&RUN分析
- 用于FACS分离卫星细胞的CUT&RUN分析的样品制备
注意：CUT&RUN基本上如所述执行10,15.缓冲液组成见 表2.- 对于CUT&RUN测定，使用方法1步骤1.5.9中获得的大约40,000个细胞，每个样品/抗体必须进行测试。
- 将FACS分离的卫星细胞在室温下以500× g 离心10分钟，然后使用移液管（20-200μL吸头体积）弃去上清液。
- 用1mL 1x PBS洗涤细胞，在室温下以500× g 离心5分钟，使用移液管（0.2-1mL尖端体积）弃去上清液，并将它们重悬于1mL冷核提取缓冲液中（表2）。在冰上孵育20分钟。
- 在孵育过程中，准备一个含有 850 μL 冷结合缓冲液的 1.5 mL 管（表 2），每个样品加入 20 μL 刀豆球蛋白 A 包被的磁珠（表 1）。
- 使用磁架用 1 mL 冷结合缓冲液洗涤珠子两次（表 1）。对于整个过程中的每次洗涤或缓冲液更换，让珠子在磁架上的管侧积聚5分钟，然后用移液管（0.2-1mL吸头体积）除去清除的上清液。然后，轻轻地重悬于 300 μL 冷结合缓冲液中。
- 将细胞核在4°C下以600× g 离心5分钟，并将其轻轻重悬于600μL核提取缓冲液中。将600μL提取的细胞核与300μL刀豆球A珠浆轻轻混合，并在4°C下孵育10分钟。
- 如步骤3.1.4所述，使用磁性架除去上清液，并用1mL冷封闭缓冲液轻轻重悬珠结合的细胞核（表2）。在室温下孵育 5 分钟。
- 使用磁性架除去上清液，并用 1 mL 冷洗缓冲液洗涤珠结合的细胞核两次（表 2）。在第二次洗涤过程中，将珠子结合的细胞核平均分成 1.5 mL 管。在以下步骤中，每根试管都将用特异性抗体处理。
注：在本例中，将 250 μL 微珠结合的细胞核分成四个 1.5 mL 试管。 - 如步骤3.1.4所述，使用磁性架分离上清液，并用移液管吸出。用特异性一抗（表3）或在250μL冷洗缓冲液中稀释的其他物种（此处为兔子）的IgG轻轻重悬细胞核/微珠复合物。在4°C孵育过夜，轻轻搅拌。
注意：此处使用的抗体针对 AR、H3K4me2 和 H3K27ac。 - 如步骤3.1.4所述，用磁性架除去上清液，用1mL冷洗缓冲液洗涤珠结合的细胞核两次，并重悬于100μL冷洗缓冲液中。
- 在每个冷洗缓冲液样品中，以 1.4 ng/μL 的浓度稀释蛋白 A-微球菌核酸酶，每份样品 100 μL。
- 将100μL蛋白A-微球菌核酸酶加入到3.1.11中获得的100μL样品中，并在4°C下搅拌孵育1小时。
- 如步骤3.1.4所述，用磁性架除去上清液，用1mL冷洗缓冲液洗涤两次，并将珠结合的细胞核重悬于150μL冷洗缓冲液中。
- 为了开始DNA切割，向150μL样品中加入3μL的100mM CaCl2 ，通过轻弹快速混合，并在冰上孵育30分钟。通过加入150μL终止缓冲液终止反应，并在37°C下孵育20分钟以消化RNA并释放DNA片段。
- 对于DNA提取，将样品在4°C下以16,000× g 离心5分钟。
- 将上清液转移到新的微量离心管中，弃去沉淀和珠子。
- 加入 3 μL 10% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 和 2.5 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K。在70°C孵育10分钟（不摇晃）。
- 加入300μL苯酚/氯仿/异戊醇，涡旋，转移到2mL锁相管中（在16,000×g下预纺5分钟），并在4°C下以16,000×g离心5分钟。
- 向同一管中加入300μL氯仿，并在4°C下以16,000× g 离心5分钟。 用移液管（0.2-1 mL 吸头体积）收集上清液 （~300 μL） 并转移到新的 1.5 mL 管中。
- 加入 1 μL 糖原（浓度为 20 mg/mL）。
- 加入750μL的100%乙醇，并在-20°C下沉淀过夜。
- 通过在4°C下以16,000×g离心15分钟来沉淀DNA。 用1mL 100%乙醇洗涤沉淀，以16,000×g离心5分钟，弃去上清液，以16,000×g离心30秒，并用移液管（20-200μL吸头体积）除去液体。
- 将沉淀风干~5分钟。重悬于 25 μL 1 mM Tris-HCl （pH 8） 和 0.1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA;pH 8） 中。
- 生物信息学分析
- 从免疫裂解的 DNA 制备文库，并在基因组平台的帮助下将它们测序为双端 100 bp reads，如所述16。
- 删除与 ENCODE 黑名单区域 （V2） 重叠的读段，并将剩余的读段分成两组：片段大小 <120 bp（无核小体，通常用于转录因子）和片段大小 >150 bp（有核小体，通常用于组蛋白标记）。使用 Bowtie 2 （v2.3.4.3）17 定位到 mm10 参考基因组。
- 使用 bamCoverage 生成 bigwig 文件（deeptools 3.3.0：bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20）。
- 保留唯一映射的读取以供进一步分析。
- 使用 genomeCoverageBed （bedtools v2.26.0） 生成原始床图文件。
- 使用 SEACR 1.3 算法（严格选项）进行峰值调用。以UCSC贝图格式加载目标数据基图文件，省略包含零信号的区域，并加载对照（IgG）数据基图文件，以生成峰调用18的经验阈值。
- 使用 deeptools 进行 Pearson 相关性分析，以确定样本之间的相似性19.使用命令行 multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz，后跟 plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle “Pearson Correlation of Read Counts” --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab。
- 使用床图文件和从SEACR获得的床文件峰，使用IGV20 可视化全基因组强度分布。
- 使用 HOMER 进行峰注释和基序搜索21.
- 最后，使用 ChIP-Atlas Peak 浏览器将数据集与先前发布的数据集进行比较，以在 IGV 上可视化它们，和/或使用 SEACR 生成的床文件作为输入数据集进行富集分析22。
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Representative Results
通过结合Gunther等人（以下简称方案1）12 和Liu等人23 （以下简称方案2）的方案从小鼠骨骼肌中分离卫星细胞。由于当使用方案1中提出的胶原酶和分散酶的浓度时，在消化后观察到未消化的肌纤维，因此增加酶的量以改善肌纤维解离，如步骤1.2.1和1.2.3所述。如方案2所示，将样品在水浴中轻轻搅拌以保持细胞活力。如方案1所述，我们通过细胞过滤器进行过滤，并与红细胞裂解缓冲液一起孵育（参见步骤1.2.7至1.2.10）。在方案 1 中，以 30%/70% 的 Percoll 密度梯度加载细胞，以在间期分离单核细胞，这可能导致目标细胞丢失。因此，正如第2号议定书所提议的那样，这一步骤被省略了。
FSC-A与SSC-A门控用于根据大小（FSC）和粒度（SSC）鉴定单核细胞（图3A）。通过忽略FSC-A轴上低于40 K的事件来排除碎片，并选择了38.8%±3.6%的细胞。FSC-A与前向散射高度（FSC-H）门控密度图用于双峰排除（图3B）。在选择可固定活力染色标记物阴性的细胞后，平均获得34.3%±7.7%的活细胞（图3C）。
图 3C点图中所示的百分比为75.4%，对应于单个活细胞的百分比，该百分比由亲本细胞群计算得出，在本例中为单个细胞群。95.7%的单个细胞来自现场事件，占总事件的35%。因此，平均获得的 34.3% 百分比是根据总事件而不是亲本总体计算得出的。
约3%的单个活细胞的白细胞（CD45）、单核细胞（CD11b）、内皮细胞（CD31）和红细胞特异性（TER119）标志物呈阴性（图3D）。然后根据CD34（造血、内皮祖细胞和间充质干细胞）和ITGA7（心脏、平滑肌和骨骼肌细胞）标志物的表达选择CD11b / CD45 / CD31 / TER119阴性细胞（图3E）。对CXCR4（淋巴细胞、造血细胞和卫星细胞）进行最终门控以选择推定的卫星细胞（图3F）。在CD34 + / ITGA7 +细胞中，发现~80%的CXCR4阳性，平均占单个活细胞总数的1%±0.15%，并且在14个独立实验中，每个小鼠四肢肌肉的绝对数量为60,000±14,000个假定的卫星细胞。对CXCR4+细胞组分的额外评估显示，约80%的活细胞是在分选后获得的，其中近70%是CXCR4+（图S1），显示了这种FACS分离的细胞群的高活力和纯度。
由于各种研究比较了胶原酶和 Liberase TL 酶对细胞分离的效率24,25，因此这两种酶切方法已并行处理。使用 300 μL Liberase TL 时，消化效率低于胶原酶，因为残留未消化的纤维。此外，观察到更多的细胞碎片和大事件（图S2A，B），在FVS 780选择后平均只有17.3%的单个活细胞（图S2C）。与胶原酶相比，Liberase消化的另一个问题是CD34 + / ITGA7 +细胞数量较少（图S2D-S2E），尽管CXCR4门控相似（图S2F）。使用 600 μL Liberase TL 时，消化效率更高。然而，细胞碎片的数量仍然升高，细胞活力低于标准（16.3%）（图S3）。因此，使用 Liberase TL 酶切的卫星细胞分离效率较低。
接种时，超过70%的CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 +细胞（图4A）表达PAX7（图4B），与PAX7阴性的CD34 + / ITGA7 / CXCR4-细胞相反（图4C）。CD34+/ITGA7+/CXCR4+细胞在肌源性培养基中生长7天后能够分化为肌纤维，如抗肌萎缩蛋白（DMD）染色所示（图4D），证实了它们的肌源性潜力。因此，组织培养和免疫荧光联合分析表明，FACS分离的CD34+/ITGA7+/CXCR4+细胞是卫星细胞。
为了确定分离的卫星细胞是否适合CUT&RUN分析，测定了组蛋白H3的乙酰化赖氨酸27（H3K27ac）和二甲基化赖氨酸4（H3K4me2）的基因组图谱，这两种组蛋白修饰在活性启动子和增强子区域发现。我们的数据分别发现了 H3K4me2 和 H3K27ac 的 68,694 个和 13,514 个峰，两个组蛋白标记之间具有相似的基因组重新分配（图 S4A）。具体而言，我们发现四分之一的峰位于距离最近基因的转录起始位点（TSS）±2 kb处，大多数位于距TSS的-100 kb至-10 kb或10 kb至100 kb处（图S4B）。值得注意的是，Pearson分析显示H3K27ac和H3K4me2读取曲线之间的相关性为80%（图S4C）。为了评估从上述方案制备的染色质是从卫星细胞中分离出来的，确定了卫星细胞特异性基因启动子处 H3K27ac 和 H3K4me2 的存在。H3K4me2 在 Pax7、Itga7、Lamb2、Cxcr4 和 Vcam1 的 TSS 周围富集（图 5A），但在 Itgam （CD11b） 和 Ptprc （CD45）（免疫细胞）、Pecam（CD31;内皮细胞）（图 5B）、Ckm（发育中的肌纤维）或 Myh3（肌球蛋白重链快速胚胎、肌纤维）的 TSS 周围富集（图 5C）。H3K27ac也获得了类似的结果（图5）。IgG样品几乎没有获得任何信号（图5）。此外，将 SEACR 获得的 H3K27ac 峰与已发表的 ChIP-seq 数据集中获得的 MACS2 峰检出结果进行比较，显示出高度相关性，如下图所示（ChIP-Atlas 跟踪;图5）。总之，这些结果表明，生物信息学分析后获得的读数来源于 FACS 分离的卫星细胞的染色质，并与先前通过 ChIP-seq 分析鉴定的读数相关。
虽然小鼠卫星细胞中的单细胞RNA测序研究显示由分离程序26引起的惊人的应激反应，但在应激反应基因上确定了H3K4me2或H3K27ac的存在，例如Atf3，Azin1，Gls和Elf2。结果提供了证据，证明H3K27ac标记没有沉积在这些基因的启动子上，并且与卫星细胞特异性基因相比，H3K4me2的水平仍然很低（图S5）。因此，这些数据凸显了隔离程序的温和程度。
接下来，检查了我们的转录因子分离方法的适用性。雄激素受体 （AR） 是一种转录因子，属于核受体超家族，在肌源性分化中起重要作用，对雄激素受体 （AR） 进行了 CUT&RUN 分析27，揭示了 7,840 个峰。这些峰主要位于内含子和基因间区域（图S4A），距离TSS为-100 kb至-10 kb，或为10 kb至100 kb（图S4B）。系统发育分析显示，AR 与糖皮质激素 （GR/Nr3c1）、盐皮质激素 （MR/Nr3c2） 和孕激素 （PR/Nr3c3） 受体一起，是氧质类固醇核受体亚家族28 的成员，其作为同源二聚体与 DNA 片段结合，DNA 片段由两个 5′-RGAACA-3′ 回文半位点组成，由三个碱基对隔开29.通过基序富集的超几何优化（HOMER，http://homer.ucsd.edu/homer/）搜索已知基序，发现AR与5′-RGRNCA-3′AR半位点基序、典型的5′-RGNACAnnnTGTNC-3′氧类固醇基序（图中称为PR）以及5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′AR共识基序结合在>32%、17%和2%的目标区域， 分别（图6A）。应该注意的是，骨骼肌中的糖皮质激素受体先前获得了类似的比例16。
SEACR分析揭示了近500个峰值得分为>50的峰值，其中200多个峰值得分为>100;其中一些如图6B所示。我们的分析还发现，在先前描述的参与多胺生物合成（Amd1、Oat 和 Smox）和前列腺癌（Acox1、Fkbp5 和 Tmprss2）的基因结合位点，AR 适度富集（图 S6）。有趣的是，AR是在参与卫星细胞干性的基因位点（Pax7，Cxcr4和Cd34）中发现的（图S7）。值得注意的是，在这些富含AR的区域中的每一个都发现了氧质类固醇反应元件（图S6和图S7），这表明在CUT&RUN数据中看到的AR信号具有高度特异性。
图 1：用于从小鼠肢体肌肉中分离卫星细胞的方案示意图。 该协议包括四个主要步骤。简而言之，处死小鼠，收获后肢肌肉（步骤1.1.1-1.1.3）并使用剪刀机械切碎（步骤1.4-1.5）。接下来是步骤1.2.1-1.2.4，在此期间，肌肉在水浴中使用胶原酶和分散酶解离。在步骤1.2.5-1.2.8中，连续通过100,70和40μm细胞过滤器过滤细胞悬液，并使用红细胞裂解缓冲液消除红细胞（步骤1.2.9-1.2.12）。在步骤1.3中用与荧光团偶联的抗体标记剩余的细胞群，荧光团针对特定的细胞表型标记物。步骤1.4包括通过FACS的样品，以收集卫星细胞以供进一步应用。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：未染色细胞制备物的流式细胞术分析。 （A） 根据 FSC-A 和 SSC-A 参数选择感兴趣的群体。（B） 基于FSC-A和FSC-H的单细胞鉴定。（C） 与标记死细胞的可固定活力染色剂 （FVS 780） 偶联的 APC-Cy7 收集细胞的自发荧光阈值的表征。（D-F）。对 CD11b 抗体偶联的 PE-Cy7 和 TER119/CD45/CD31 标记物偶联的 PE-Cy7，以及与 ITGA7 偶联的 Alexa fluor 488、与 CD34 偶联的 Alexa fluor 405 （E） 和与 CXCR4 偶联的 APC 荧光染料 （F） 进行自发荧光测量。门表示为黑匣子。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：用于卫星细胞分选的流式细胞仪设门策略。 （A） 根据 FSC-A 和 SSC-A 参数选择感兴趣的群体。（B） 基于FSC-A和FSC-H的单细胞鉴定。（C） 用 FVS 780 鉴定活细胞。（D） 基于 CD11b、CD31、CD45 和 TER119 抗原的阴性细胞选择。（东至下）基于 CD34 和 ITGA7 （E） 以及 CXCR4 （F） 抗原的阳性细胞选择。门表示为黑匣子。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：FACS 分离的 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 和 CD34+/ITGA7-/CXCR4- 细胞的分析。 （A） 在生长培养基中培养的 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 和 CD34+/ITGA7-/CXCR4- 细胞的相差图像。（B） 使用针对 PAX7（红色）和抗肌萎缩蛋白（DMD，绿色）的抗体对在生长培养基中培养的 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 和 CD34+/ITGA7-/CXCR4- 细胞进行免疫荧光分析。细胞核用DAPI（蓝色）染色。洋红色箭头表示 PAX7 阳性细胞。（C） CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 细胞在生长培养基中生长 5 天（左图）和在肌源性培养基中再生长 7 天（右图）的相差图像。（D） 使用针对 PAX7（红色）和抗肌萎缩蛋白（DMD，绿色）的抗体在生长培养基（左图）和肌源性培养基（右图）中生长 7 天的 CD34+/ITGA7+/CXCR4+ 细胞的免疫荧光分析图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。洋红色箭头表示 PAX7 阳性细胞。绿色箭头表示DMD阳性细胞。比例尺：明场面板 = 25 μm;免疫荧光检测组合 = 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：卫星细胞染色质的基因组图谱。 H3K4me2 和 H3K27ac 在卫星细胞染色质上的卫星细胞特异性基因 （A）、免疫和内皮细胞特异性基因 （B） 以及肌纤维特异性基因 （C） 的定位。活性启动子用绿色框装，而非活性启动子用棕色框装。使用 IgG 进行的 CUT&RUN 用作阴性对照。组蛋白标记的 H3K27ac 富集分析显示在每个轨道下方。显示已发布数据集置信度的扩充分数被描述为热图。棕色星形 （*） 是指在肌肉卫星细胞中发现的 H3K27ac ChIP-seq 峰，蓝色星形是指 H3K4me3，粉红色星形是指 H4K16me1。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：卫星细胞染色质上的 AR 基因组分布。 （A） 卫星细胞中AR峰的HOMER已知基序分析。PR：黄体酮受体。Nb靶标是指呈现特定基序的峰数。（B） H3K4me2 和 AR 在卫星细胞染色质上指定基因的定位，由 CUT&RUN 确定。使用 IgG 进行的 CUT&RUN 用作阴性对照。请点击这里查看此图的较大版本.
表 1：材料、试剂和软件清单。请按此下载此表格。
表2：缓冲液组成。请按此下载此表格。
表3：抗体参比和浓度。请按此下载此表格。
补充图1：流式细胞术分析分选后的细胞制备。 （A） 根据 FSC-A 和 SSC-A 参数选择感兴趣的人群。（B） 基于FSC-A和FSC-H的单细胞鉴定。（C） 鉴定具有可固定活力染色剂的活细胞 （FVS 780）。（D） 基于 CD11b、CD31、CD45 和 TER119 抗原的阴性细胞选择。（东至下）基于 CD34 和 ITGA7 （E） 以及 CXCR4 （F） 抗原的阳性细胞选择。门表示为黑匣子。 请点击这里下载此文件。
补充图 2：用 300 μL Liberase TL 酶切后卫星细胞分选的流式细胞仪设门策略。 （A） 根据 FSC-A 和 SSC-A 参数选择感兴趣的人群。（B） 基于FSC-A和FSC-H的单细胞鉴定。（C） 用 FVS 780 鉴定活细胞。（D） 基于 CD11b、CD31、CD45 和 TER119 抗原的阴性细胞选择。（东至下）基于 CD34 和 ITGA7 （E） 以及 CXCR4 （F） 抗原的阳性细胞选择。门表示为黑匣子。 请点击这里下载此文件。
补充图 3：用 600 μL Liberase TL 酶解后卫星细胞分选的流式细胞仪设门策略。 （A） 根据 FSC-A 和 SSC-A 参数选择感兴趣的人群。（B） 基于FSC-A和FSC-H的单细胞鉴定。（C） 用 FVS 780 鉴定活细胞。（D） 基于 CD11b、CD31、CD45 和 TER119 抗原的阴性细胞选择。（东至下）基于 CD34 和 ITGA7 （E） 以及 CXCR4 （F） 抗原的阳性细胞选择。门表示为黑匣子。 请点击这里下载此文件。
补充图 4：H3K4me2、H3K27ac 和 AR 基因组位置的表征。 （A） 根据卫星细胞的基因组特征描绘 H3K4me2、H3K27ac 和 AR 峰分布的饼图。（B） 描绘H3K4me2、H3K27ac和AR在卫星小区中与最近TSS的距离的峰值分布的饼图。（C） 显示 H3K4me2、H3K27ac 和 IgG 对照之间的 Pearson 相关性的热图。 请点击这里下载此文件。
补充图5：应激反应诱导基因的卫星细胞染色质的基因组图谱。 H3K4me2 和 H3K27ac 在卫星细胞染色质上的指示基因上的定位。免疫沉淀与IgG作为阴性对照。 请点击这里下载此文件。
补充图6：已知AR靶基因的卫星细胞染色质基因组图谱。 H3K4me2、H3K27ac 和 AR 在卫星细胞染色质上的指示基因的定位，由 CUT&RUN 确定。AR 峰值以蓝色框框表示，相应的 AR 响应元素如下所示。使用 IgG 进行的 CUT&RUN 用作阴性对照。 请点击这里下载此文件。
补充图7：卫星细胞染色质选择性表达基因的基因组图谱。 H3K4me2、H3K27ac 和 AR 在卫星细胞染色质上的指示基因的定位，由 CUT&RUN 确定。AR 峰值以蓝色框框表示，相应的 AR 响应元素如下所示。使用 IgG 进行的 CUT&RUN 用作阴性对照。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
本研究报告了一种标准化、可靠且易于执行的小鼠卫星细胞分离和培养方法，以及通过 CUT&RUN 方法评估转录调控。
该协议涉及几个关键步骤。首先是肌肉破坏和纤维消化，以确保收集到的大量细胞。尽管酶浓度增加，但获得的活细胞比使用方案 1 更多。卫星细胞表达各种膜蛋白的特定模式。为了提高分选的严格性，我们使用了先前描述的阴性（CD31、TER119、CD45 和 CD11b）和阳性（CD34、ITGA7 和 CXCR4）卫星细胞标志物的组合30,31。使用这种策略，平均获得了1%的活体推定卫星单元。这一结果在预期的范围内，因为卫星细胞占小鼠成年期肌肉细胞群的 2%-7%32。作为卫星细胞选择标志物的对照，分离出CD34+/ITGA7-/CXCR4-细胞。免疫荧光染色表明，虽然CD34+/ITGA7-/CXCR4-细胞不表达PAX7，但70%的CD34+/ITGA7+/CXCR4+分选细胞对该卫星细胞特异性标志物呈阳性，从而证明FACS分离群体对应于卫星细胞。此外，免疫染色显示，在肌源性培养基中生长7天的卫星细胞中，有70%为PAX7-/DMD+，并形成细长的多核肌纤维，表明分离的卫星细胞保留了其干性潜力。
样品制备的主要限制可能是使用高浓度的酶，这会导致大量解离的生物材料，但可能导致细胞死亡增加。为了解决这个问题，测试了一种需要较低酶量的测定方法。在这种情况下，测试了传统胶原酶33 的纯化形式 Liberase TL。尽管这种酶的消化效率明显更高，但细胞碎片的数量仍然很高，细胞活力略有降低。这些观察结果与先前的报告一致，这些报告将 Liberase 介导的组织消化与重组胶原酶或定制胶原酶24,25 进行了比较。此外，尽管胶原酶和Liberase消化的内皮细胞和免疫细胞比例相似，但Liberase处理的样品中卫星细胞的百分比较低，总体上表明Liberase不推荐用于卫星细胞分离。该酶的使用适用于免疫细胞的表型和定量分析，最终可以推荐用于肌肉和/或其他组织。这与Liberase TL的报道一致，Liberase TL最适合有效分离活的免疫细胞34,35,36。
另一个潜在的问题是卫星细胞的解离和分选引起的压力。然而，在小鼠卫星细胞中通过单细胞 RNA 测序鉴定的应激反应基因启动子区域的 H3K27ac 缺失和低 H3K4me2 水平表明该过程足够温和，不会诱导应激反应转录库。其他需要注意的局限性是保持经验性的选定抗原。然而，研究表明，富含骨骼肌卫星细胞的独特表面标志物组合之间存在高度重叠30,31。
另一个关键步骤是从分选的细胞中纯化细胞核。为此，分选速度保持在较低水平，以免损坏细胞，但速度足够快，以免它们在FACS缓冲液中储存太久。事实上，CUT&RUN细胞核不是固定的，较长的孵育时间可能会影响从方案中获得的读数。从一只小鼠的两个后肢制备的典型制剂允许使用一种抗体和一种 IgG 对照进行 CUT&RUN，每种抗体和 IgG 对照的量为 2.5 ng。
CUT&RUN实验旨在评估转录因子结合和表观遗传修饰，为H3K4me2和H3K27ac提供了强大而稳健的读取信号。与在免疫细胞或内皮细胞以及肌纤维中表达的基因相比，已知在卫星细胞中表达的基因上 H3K4me2 和 H3K27ac 的高读取水平表明信号主要从卫星细胞核放大。此外，该协议使得在肌肉干细胞中鉴定AR的cistrome成为可能，迄今为止，这仍然是小鼠AR抗体质量差和雄激素不高度敏感的细胞（如上皮前列腺细胞）中AR表达水平低所固有的技术问题。这里提供的数据揭示了具有高置信度峰值得分的 AR 绑定区域。由于最初只对每种抗体评估了一个重复，因此通过在每个条件下至少增加两个额外的生物学重复，我们的数据集的稳健性将得到提高。然而，AR已知的靶基因和各自的组蛋白标记，最初被描述为在其他组织环境（如前列腺）中高度表达和/或易于检测到，呈现出较低的表达水平，并且在卫星细胞中检测非常具有挑战性。
CUT&RUN方法的一个局限性是它是在未固定的单元中执行的。因此，由于转录因子与其结合位点之间相互作用的不稳定性，我们可能错过了一些 AR 靶标。同样，一些翻译后修饰，如乙酰化，也可能相当不稳定。因此，可以考虑在FACS分选之后和分离细胞核之前，包括用甲醛或多聚甲醛进行轻度固定步骤，以稳定蛋白质/DNA相互作用和组蛋白修饰。
尽管本文表明可以在FACS分离的卫星细胞上进行CUT&RUN测定，但也可以进行其他使用非固定染色质的分析，例如ATAC-seq。此外，即使这里的肌肉是在基础生理条件下收获的，该协议也可以应用于损伤或衰老等病理环境。所有这些协议的使用将允许详细了解卫星细胞中的基因调控机制，并可能有助于理解这些机制如何被病理生理条件改变。
总之，这种低成本且省时的方案为研究骨骼肌前体细胞中的转录因子募集和染色质景观提供了有效的实验环境。通过该协议制备的染色质提供了卫星细胞中AR雌性细胞的首次全基因组分析，并将促进未来基因调控的研究。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢阿纳斯塔西娅·班沃斯（Anastasia Bannwarth）提供出色的技术援助。我们感谢IGBMC动物舍设施、细胞培养、小鼠临床研究所（ICS，Illkirch，法国）、成像、电子显微镜、流式细胞术和GenomEast平台，“法国Génomique”联盟（ANR-10-INBS-0009）的成员。
作为斯特拉斯堡大学、CNRS 和 Inserm 的 ITI 2021-2028 计划的一部分，跨学科专题研究所 IMCBio 的这项工作得到了 IdEx Unistra （ANR-10-IDEX-0002） 和 SFRI-STRAT'US 项目 （ANR 20-SFRI-0012） 和 EUR IMCBio （ANR-17-EURE-0023） 在法国未来投资计划的框架下的支持。INSERM、CNRS、Unistra、IGBMC、Agence Nationale de la Recherche （ANR-16-CE11-0009， AR2GR）、AFM-Téléthon 战略计划 24376（给 D.D.）、INSERM 青年研究员补助金（给 D.D.）、ANR-10-LABX-0030-INRT 和由 ANR 根据 Investissements d'Avenir 框架计划 （ANR-10-IDEX-0002-02） 管理的法国国家基金提供了额外的资金。J.R.得到了法国阿莱曼德大学和高等研究与创新部的CDFA-07-22计划的支持，以及IGBMC研究协会（ARI）的K.G.支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
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