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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Un protocole efficace pour l’analyse CUT&RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole efficace pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est présenté ici des cellules satellites musculaires des membres de souris, adapté à l’étude de la régulation de la transcription dans les fibres musculaires par clivage sous cibles et libération par nucléase (CUT&RUN).

Abstract

Les analyses à l’échelle du génome avec des populations de petites cellules constituent une contrainte majeure pour les études, en particulier dans le domaine des cellules souches. Ce travail décrit un protocole efficace pour l’isolement des cellules satellites du muscle du membre, un tissu à haute teneur en protéines structurelles. Les muscles des membres disséqués de souris adultes ont été perturbés mécaniquement par hachage dans un milieu complété par de la dispase et de la collagénase de type I. Lors de la digestion, l’homogénat a été filtré à travers des tamis cellulaires et les cellules ont été mises en suspension dans un tampon FACS. La viabilité a été déterminée à l’aide d’une coloration de viabilité réparable, et les cellules satellites immunocolorées ont été isolées par FACS. Les cellules ont été lysées avec Triton X-100 et les noyaux libérés ont été liés à des billes magnétiques de concanavaline A. Des complexes noyau/billes ont été incubés avec des anticorps contre le facteur de transcription ou les modifications d’histones d’intérêt. Après les lavages, les complexes noyau/billes ont été incubés avec la protéine A-micrococcique nucléase, et le clivage de la chromatine a été initié avec CaCl2. Après l’extraction de l’ADN, des banques ont été générées et séquencées, et les profils de liaison aux facteurs de transcription à l’échelle du génome et de modifications des histones covalentes ont été obtenus par analyse bioinformatique. Les pics obtenus pour les différentes marques d’histones ont montré que les événements de liaison étaient spécifiques aux cellules satellites. De plus, l’analyse des motifs connus a révélé que le facteur de transcription était lié à la chromatine via son élément de réponse apparenté. Ce protocole est donc adapté pour étudier la régulation des gènes dans les cellules satellites musculaires des membres de souris adultes.

Introduction

Les muscles striés squelettiques représentent en moyenne 40 % du poids de l’ensemble du corps humain1. Les fibres musculaires présentent une capacité remarquable de régénération en cas de blessure, qui est décrite par la fusion des myocytes nouvellement formés et la génération de nouvelles myofibres qui remplacent celles endommagées2. En 1961, Alexander Mauro a signalé une population de cellules mononucléées qu’il a appelées cellules satellites3. Ces cellules souches expriment le facteur de transcription apparié boîte 7 (PAX7), et sont situées entre la lame basale et le sarcolemme des fibres musculaires4. Il a été rapporté qu’ils exprimaient le cluster de différenciation 34 (CD34 ; un marqueur hématopoïétique, progéniteur endothélial et marqueur de cellules souches mésenchymateuses), l’intégrine alpha 7 (ITGA7 ; un marqueur de muscles lisses, cardiaques et squelettiques), ainsi que le récepteur de chimiokines C-X-C de type 4 (CXCR4 ; un marqueur lymphocytaire, hématopoïétique et de cellules satellites)5. Dans des conditions basales, les cellules satellites résident dans un microenvironnement particulier qui les maintient dans un état de repos6. Lors d’une lésion musculaire, ils s’activent, prolifèrent et subissent une myogenèse7. Cependant, ne contribuant qu’à une fraction mineure du nombre total de cellules musculaires, leurs analyses à l’échelle du génome sont particulièrement difficiles, en particulier dans des contextes physiologiques (<1% du nombre total de cellules).

Diverses méthodes d’isolement de la chromatine à partir de cellules satellites ont été décrites, qui impliquent l’immunoprécipitation de la chromatine suivie d’expériences de séquençage parallèle massif (ChIP-seq) ou de clivage sous cibles et marquage (CUT&Tag). Néanmoins, ces deux techniques présentent des limites importantes qui restent incontestées. En effet, le ChIP-seq nécessite une grande quantité de matière première pour générer suffisamment de chromatine, dont une grande partie est perdue lors de l’étape de sonication. CUT&Tag est plus approprié pour un faible nombre de cellules, mais génère plus de sites de clivage hors cible que ChIP-seq en raison de l’activité de la transposase Tn5. De plus, étant donné que cette enzyme a une forte affinité pour les régions ouvertes de la chromatine, l’approche CUT&Tag pourrait être utilisée préférentiellement pour analyser les modifications des histones ou les facteurs de transcription associés à des régions du génome activement transcrites, au lieu de l’hétérochromatine réduite au silence 8,9.

Nous présentons ici un protocole détaillé qui permet l’isolement des cellules satellites musculaires des membres de souris par FACS pour le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de l’analyse de nucléase (CUT&RUN)10,11. Les différentes étapes impliquent la perturbation mécanique des tissus, le tri cellulaire et l’isolement des noyaux. L’efficacité de la méthode, en ce qui concerne la préparation d’une suspension cellulaire viable, a été démontrée par la réalisation d’une analyse CUT&RUN pour les modifications covalentes des histones et les facteurs de transcription. La qualité des cellules isolées rend la méthode décrite particulièrement intéressante pour la préparation de la chromatine qui capture fidèlement l’état d’occupation génomique natif, et est susceptible d’être adaptée pour capturer la conformation chromosomique en combinaison avec le séquençage à haut débit à des loci spécifiques (4C-seq) ou à des niveaux à l’échelle du génome (Hi-C).

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Protocol

Les souris ont été gardées dans un bâtiment d’élevage accrédité, conformément aux directives nationales en matière de soins aux animaux (directive 86/609/CEE de la Commission européenne ; Décret n°87-848) relatif à l’utilisation d’animaux de laboratoire pour la recherche. Les manipulations envisagées ont été soumises au comité d’éthique (Com’Eth, Strasbourg, France) et au Ministère de la Recherche (MESR) pour évaluation éthique et autorisation conformément à la directive 2010/63/UE sous le numéro APAFIS #22281.

1. Préparation d’une suspension cellulaire pour l’isolement de cellules satellites par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (Figure 1)

  1. Isolement du tissu musculaire
    1. Décontaminer les outils de dissection musculaire, y compris les forceps, les scalpels et les ciseaux, à l’aide d’un produit de nettoyage (tableau 1), et rincer abondamment à l’eau distillée.
    2. Préparez deux tubes de 2 mL (tableau 1), contenant chacun 1 mL de tampon d’isolation musculaire, et placez-les sur de la glace pour recueillir les muscles prélevés.
    3. Sacrifier deux souris mâles C57/Bl6J âgées de 10 semaines par asphyxie au CO2 suivie d’une luxation cervicale. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur chaque souris entière. Décollez la peau du membre postérieur à l’aide d’une pince. Disséquez tous les muscles des membres entourant le fémur, le tibia et le péroné (environ 1 mg de muscles par souris).
      REMARQUE : Le nombre de cellules satellites diminue après l’âge de 15 semaines.
    4. Placer les muscles des membres prélevés dans des tubes de 2 mL contenant 1 mL de tampon d’isolement musculaire préparé à l’étape 1.1.2. Collectez les muscles de la deuxième souris en suivant la même procédure. Hacher les muscles récoltés avec des ciseaux sur de la glace jusqu’à l’obtention de3 fragments inférieurs à 1 mm.
      REMARQUE : Les muscles ont été prélevés et hachés principalement comme décrit12. Effectuez la digestion des tissus en suivant l’étape 1.2 ou 1.3.
  2. Digestion des tissus avec l’enzyme collagénase
    1. Transférez la suspension musculaire hachée des deux souris en la versant dans un tube de 50 mL (tableau 1) contenant 18 mL de tampon d’isolement musculaire (complété par 5 mL [5 U/mL] de dispase et 5 mg de collagénase de type I) (tableau 1).
    2. Fermez hermétiquement le tube et scellez-le avec un film de laboratoire (tableau 1). Placez-le horizontalement dans un bain-marie agité (tableau 1) à 37 °C à 100 tr/min pendant 30 min.
    3. Après 30 min, ajoutez 5 mg de collagénase de type I. Maintenir les tubes encore 30 minutes sous agitation dans un bain-marie à agitation à 37 °C à 100 tr/min.
    4. Lors de la digestion, pipetez la suspension musculaire de haut en bas 10 fois avec une pipette de 10 ml pour améliorer l’efficacité de la dissociation. Centrifuger à 4 °C à 400 x g pendant 5 min. Une pastille transparente sera visible au fond du tube. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL, en laissant 5 mL de milieu dans le tube.
      REMARQUE : Quitter le milieu permet d’éviter de stresser les cellules. Ajouter 10 mL de tampon d’isolation musculaire frais et remettre la pastille en suspension en pipetant de haut en bas avec une pipette de 10 mL.
    5. Placer des crépines de 100 μm, 70 μm et 40 μm (une de chaque type) (tableau 1) sur des tubes ouverts de 50 ml. Pipeter la suspension sur les crépines successives (100 μm, 70 μm, 40 μm) et recueillir l’écoulement dans les tubes de 50 mL, contenant des cellules inférieures à 40 μm.
    6. Centrifuger la suspension à 4 °C à 400 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL jusqu’à ce qu’il reste 2 mL, puis utiliser une pipette de 0,2 à 1 mL jusqu’à ce qu’il reste 100 à 200 μL. Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges (tableau 2). Incuber sur glace pendant 3 min.
    7. Centrifuger à 4 °C à 400 x g pendant 5 min et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 20 à 200 μL. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon FACS froid (tableau 2). Déposer sur de la glace.
  3. Méthode alternative pour la digestion des tissus avec l’enzyme Liberase thermolysine low (TL)
    1. Suivez les descriptions de l’étape 1.1. pour l’isolement des tissus.
    2. Pour la désagrégation tissulaire médiée par la Liberase, prélever les muscles dans 2 mL de tampon d’isolement du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (tableau 2), au lieu du tampon d’isolement musculaire décrit à l’étape 1.1.2.
    3. Transférez la suspension musculaire hachée des deux souris en la versant dans un tube de 50 mL (tableau 1) contenant 18 mL de tampon d’isolement RPMI complété par 300 ou 600 μL de Liberase TL à 5 mg/mL (tableau 1) (c.-à-d. 0,083 mg/mL et 0,167 mg/mL de concentrations finales, respectivement)13.
    4. Fermez hermétiquement le tube et scellez-le avec un film de laboratoire (tableau 1). Placez-le horizontalement dans un bain-marie agité (tableau 1) à 37 °C à 100 tr/min pendant 30 min.
    5. Lors de la digestion, pipetez la suspension musculaire de haut en bas 10 fois avec une pipette de 10 ml pour la dissocier et améliorer l’efficacité de la dissociation.
    6. Centrifuger à 4 °C à 400 x g pendant 5 min. Une pastille transparente sera visible au fond du tube. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL, en laissant 5 mL de milieu dans le tube. Quitter le milieu permet d’éviter de stresser les cellules. Ajouter 10 mL de tampon d’isolement RPMI frais et remettre la pastille en suspension en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 10 mL.
    7. Placer des crépines de 100 μm, 70 μm et 40 μm (une de chaque type) (tableau 1) sur des tubes ouverts de 50 ml.
    8. Pipeter la suspension sur des crépines successives (100 μm, 70 μm, 40 μm) et recueillir l’écoulement dans les tubes de 50 mL, contenant des cellules inférieures à 40 μm.
    9. Centrifuger la suspension à 4 °C à 400 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL jusqu’à ce qu’il reste 2 mL, puis utiliser une pipette de 0,2 à 1 mL jusqu’à ce qu’il reste 100 à 200 μL.
    10. Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges (tableau 2). Incuber sur glace pendant 3 min.
    11. Centrifuger à 4 °C à 400 x g pendant 5 min et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 20 à 200 μL.
    12. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon FACS froid (tableau 2). Déposer sur de la glace.
  4. Préparation de la suspension cellulaire pour l’isolement du FACS
    1. Transférer 10 μL de la suspension cellulaire obtenue à l’étape 1.2.12 dans un tube neuf de 1,5 mL. Cet échantillon constituera le témoin non coloré ou le témoin négatif (figure 2). Ajouter 190 μL de tampon FACS, transférer dans un tube de 5 mL (tableau 1) et conserver sur de la glace.
    2. Centrifuger les 90 μL restants de la suspension cellulaire obtenue à l’étape 1.2.12 à 4 °C à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 20 à 200 μL). Incuber les cellules avec 400 μL de colorant de viabilité fixable (tableau 3) dilué dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) sans sérum pendant 15 minutes à température ambiante (RT).
    3. Laver les cellules par centrifugation à 4 °C à 400 x g pendant 5 min et ajouter 100 μL de tampon FACS. Retournez doucement les tubes trois fois et centrifugez à nouveau à 4 °C à 400 x g pendant 5 min.
    4. Pendant le temps de centrifugation, préparer 100 μL d’un mélange maître d’anticorps primaires couplés à des fluorophores et dirigés contre CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 et CXCR4 (tableau 3), dilués dans un tampon FACS.
    5. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant cellulaire à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 20 à 200 μL) et ajouter le mélange d’anticorps de 100 μL. Retournez doucement le tube trois fois. Ne pas vortex. Incuber dans l’obscurité sur de la glace pendant 30 min.
    6. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Éliminez le surnageant à l’aide d’une pipette de 20 à 200 μL et ajoutez 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x pour laver les cellules. Retournez doucement le tube trois fois. Recentrer à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 20 à 200 μL.
    7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon FACS et transférer la suspension dans un tube de 5 mL.
      REMARQUE : la suspension cellulaire obtenue à partir de la digestion de Liberase est traitée de la même manière.
  5. Sélection des cellules satellites par FACS
    1. Faire vortex brièvement la suspension cellulaire (2 à 5 secondes) et traiter les cellules sur un cytomètre en flux équipé d’une buse de 100 μm (Tableau 1).
    2. Déterminer les différentes tailles de porte en fonction de l’échantillon non coloré stocké à l’étape 1.4.1 (Figure 2).
    3. Enduisez un tube de 5 ml de 1 mL de sérum fœtal pur pour veau (FCS) pour améliorer la collecte de cellules et ajoutez 500 μL de tampon FACS.
    4. Remplacez l’échantillon non coloré par l’échantillon marqué par des anticorps.
    5. Sélectionnez la population d’intérêt en fonction de la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) et de la zone de diffusion latérale (SSC-A) (Figure 3A), et supprimez les cellules de doublet avec le FSC-A et la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) (Figure 3B)14.
    6. Identifier les cellules vivantes présentant une coloration négative à la viabilité réparable (Figure 3C).
    7. Sélectionnez les cellules négatives pour CD31, CD45, TER119 et CD11b (Figure 3D).
    8. Pour identifier les cellules satellites, sélectionnez d’abord les cellules positives pour CD34 et ITGA7 (Figure 3E), puis sélectionnez les cellules CXCR4 positives sur la population sélectionnée pour CD34 et ITGA7 (Figure 3F).
    9. Prélever les cellules sélectionnées (entre 40 000 et 80 000 cellules, selon la qualité de la préparation) dans le tube enrobé de 5 mL contenant 500 μL de tampon FACS.

2. Validation de la population isolée en culture tissulaire

  1. Revêtement de lame avec hydrogel
    1. Diluer 280 μL d’une matrice qualifiée pour les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à base d’hydrogel pur (tableau 1) dans 12 mL de milieu DMEM/F12 sans sérum.
    2. Enduisez une lame de chambre (tableau 1) avec la solution d’hydrogel et incubez-la toute la nuit à 4 °C.
    3. Le lendemain, incuber la lame de chambre à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 1 h avant l’ensemencement des cellules.
  2. Croissance et différenciation cellulaires
    1. Plaquer environ 20 000 cellules, obtenues à partir de l’étape 1.5.9, par puits, et les cultiver dans un milieu de culture (tableau 2) pendant 5 jours. Prendre des images à contraste de phase à l’aide d’un microscope à fond clair (Figure 4A), avant de les traiter pour l’analyse par immunofluorescence afin de s’assurer de la qualité de la préparation (Figure 4B).
    2. Pour induire la myogenèse, cultiver des cellules satellites amplifiées à partir de l’étape 2.2.1 dans un milieu myogénique (tableau 2) pendant 7 jours supplémentaires. Prendre des images à contraste de phase à l’aide d’un microscope à fond clair (Figure 4C) avant de les traiter pour l’analyse par immunofluorescence afin de garantir la qualité de la préparation (Figure 4D).
  3. Analyse par immunocytofluorescence
    1. Retirez délicatement le milieu, lavez deux fois les cellules qui ont été cultivées sur lame de chambre avec 100 μL de 1x PBS et fixez-les avec 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à RT pendant 1 h.
      REMARQUE : Cette étape doit être effectuée avec soin. Un petit volume de milieu doit toujours être conservé dans la chambre pour éviter de stresser les cellules, et le PBS doit être versé à travers les parois de la chambre.
    2. Lavez les cellules trois fois avec 100 μL de PBS 1x, complété par 0,1 % de Tween 20 (PBST) pour perméabiliser les membranes cellulaires.
    3. Bloquer les signaux non spécifiques par incubation dans 100 μL de 1x PBST complété par 5% de FCS (PBST-FCS) à RT pendant 1 h.
    4. Incuber les cellules avec 100 μL d’un mélange maître d’anticorps anti-PAX7 et anti-dystrophine (DMD) (dilués dans 1x PBST-FCS) à 4 °C pendant la nuit, pour détecter les cellules satellites et les myofibres, respectivement.
    5. Laver les cellules trois fois avec 100 μL de PBST 1x et les incuber avec 100 μL d’anticorps secondaires anti-souris Cy3 de chèvre ou anti-lapin de chèvre Alexa 488 (tableau 3) dilués dans 1x PBST-FCS à RT pendant 1 h.
    6. Dissocier les puits de la chambre de la lame à l’aide de l’équipement fourni par le fournisseur, ajouter 20 μL de milieu de montage aqueux avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et recouvrir la lame d’une lamelle (tableau 1).
    7. Observez et capturez l’image des cellules colorées à l’aide d’un microscope confocal.
    8. Traiter les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (figures 4B, D).

3. Analyse CUT&RUN

  1. Préparation d’échantillons pour l’analyse CUT&RUN sur des cellules satellites isolées de FACS
    REMARQUE : CUT&RUN a été exécuté essentiellement comme décrit10,15. La composition du tampon est présentée en Tableau 2.
    1. Pour le test CUT&RUN, utiliser environ 40 000 des cellules obtenues à l’étape 1.5.9 de la méthode 1, par échantillon/anticorps à tester.
    2. Centrifuger les cellules satellites isolées par FACS à RT à 500 x g pendant 10 min, puis jeter le surnageant à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 20 à 200 μL).
    3. Laver les cellules avec 1 mL de PBS 1x, centrifuger à RT à 500 x g pendant 5 min, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 0,2 à 1 mL) et les remettre en suspension dans 1 mL de tampon d’extraction nucléaire à froid (tableau 2). Incuber sur glace pendant 20 min.
    4. Pendant l’incubation, préparer un tube de 1,5 mL contenant 850 μL de tampon de liaison à froid (tableau 2) et ajouter 20 μL de billes magnétiques enrobées de concanavaline A par échantillon (tableau 1).
    5. Lavez les billes deux fois avec 1 mL de tampon de liaison à froid à l’aide d’une grille magnétique (tableau 1). Pour chaque lavage ou changement de tampon tout au long de la procédure, laissez les billes s’accumuler sur le côté du tube sur la grille magnétique pendant 5 minutes avant de retirer le surnageant dégagé avec une pipette (volume de pointe de 0,2 à 1 ml). Ensuite, remettre délicatement en suspension dans 300 μL de tampon de liaison à froid.
    6. Centrifuger les noyaux à 4 °C à 600 x g pendant 5 min et les remettre en suspension délicatement dans 600 μL de tampon d’extraction nucléaire. Mélanger délicatement les 600 μL de noyaux extraits avec les 300 μL de bouillie de concanavaline A et incuber à 4 °C pendant 10 min.
    7. Retirer le surnageant à l’aide d’une grille magnétique, comme décrit à l’étape 3.1.4, et remettre doucement en suspension les noyaux liés aux billes avec 1 mL de tampon bloquant le froid (tableau 2). Incuber à RT pendant 5 min.
    8. Retirer le surnageant à l’aide d’une grille magnétique et laver deux fois les noyaux liés aux billes avec 1 mL de tampon de lavage à froid (tableau 2). Lors du deuxième lavage, divisez également les noyaux liés aux billes en tubes de 1,5 ml. Chaque tube sera traité avec un anticorps spécifique à l’étape suivante.
      REMARQUE : Dans cet exemple, 250 μL de noyaux liés aux billes ont été divisés en quatre tubes de 1,5 mL.
    9. Séparez le surnageant à l’aide d’une grille magnétique, comme décrit à l’étape 3.1.4, et aspirez à l’aide d’une pipette. Remettre doucement en suspension les complexes noyau/billes avec un anticorps primaire spécifique (tableau 3), ou une IgG d’une autre espèce (ici lapin) diluée dans 250 μL de tampon de lavage à froid. Incuber à 4 °C pendant la nuit en agitant doucement.
      REMARQUE : Les anticorps utilisés ici sont dirigés contre AR, H3K4me2 et H3K27ac.
    10. Retirer le surnageant à l’aide d’une grille magnétique, comme décrit à l’étape 3.1.4, laver deux fois les noyaux liés aux billes avec 1 mL de tampon de lavage à froid et remettre en suspension 100 μL de tampon de lavage à froid.
    11. Diluer la nucléase de la protéine A-micrococcique à 1,4 ng/μL dans 100 μL par échantillon de tampon de lavage à froid.
    12. Ajouter 100 μL de nucléase micrococcique de protéine A aux 100 μL d’échantillon obtenus en 3.1.11 et incuber à 4 °C pendant 1 h avec agitation.
    13. Retirer le surnageant à l’aide d’une grille magnétique, comme décrit à l’étape 3.1.4, laver deux fois avec 1 mL de tampon de lavage à froid et remettre en suspension les noyaux liés aux billes dans 150 μL de tampon de lavage à froid.
    14. Pour amorcer le clivage de l’ADN, ajouter 3 μL de 100 mM de CaCl2 aux 150 μL de l’échantillon, mélanger rapidement par effleurement et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Arrêtez la réaction en ajoutant 150 μL de tampon d’arrêt et incubez à 37 °C pendant 20 min pour digérer l’ARN et libérer les fragments d’ADN.
    15. Pour l’extraction de l’ADN, centrifugez les échantillons à 16 000 x g à 4 °C pendant 5 min.
    16. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microfuge et jetez la pastille et les billes.
    17. Ajouter 3 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % et 2,5 μL de protéinase K à 20 mg/mL. Mélanger par inversion. Incuber pendant 10 min à 70 °C (sans agitation).
    18. Ajouter 300 μL de phénol/chloroforme/alcool isoamylique, le vortex, transférer dans des tubes à verrouillage de phase de 2 mL (pré-essorés pendant 5 min à 16 000 x g) et centrifuger pendant 5 min à 16 000 x g à 4 °C.
    19. Ajouter 300 μL de chloroforme dans le même tube et centrifuger pendant 5 min à 16 000 x g à 4 °C. Prélever le surnageant (~300 μL) à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 0,2 à 1 mL) et transférer dans un nouveau tube de 1,5 mL.
    20. Ajouter 1 μL de glycogène (concentration de 20 mg/mL).
    21. Ajouter 750 μL d’éthanol à 100 % et précipiter pendant la nuit à -20 °C.
    22. Granuler l’ADN par centrifugation pendant 15 min à 16 000 x g à 4 °C. Lavez la pastille avec 1 mL d’éthanol à 100 %, centrifugez pendant 5 min à 16 000 x g, jetez le surnageant, centrifugez pendant 30 s à 16 000 x g et retirez le liquide à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 20 à 200 μL).
    23. Séchez le granulé à l’air libre pendant ~5 min. Remettre en suspension dans 25 μL de 1 mM de Tris-HCl (pH 8) et de 0,1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA ; pH 8).
  2. Analyse bioinformatique
    1. Préparez des banques à partir d’ADN clivé et séquencez-les sous forme de lectures appariées de 100 pb à l’aide de la plate-forme génomique décrite16.
    2. Supprimez les lectures qui se chevauchent avec la région de la liste noire ENCODE (V2) et séparez les lectures restantes en deux groupes : la taille des fragments <120 pb (sans nucléosome, en général pour les facteurs de transcription) et la taille des fragments >150 pb (avec les nucléosomes, normalement pour les marques d’histones). Cartographier le génome de référence mm10 à l’aide de Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Générez des fichiers bigwig avec bamCoverage (deeptools 3.3.0 : bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Conservez les lectures mappées de manière unique pour une analyse plus approfondie.
    5. Générez des fichiers bedgraph bruts avec genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Utilisez l’algorithme SEACR 1.3 (option stricte) pour les pics d’appel. Chargez le fichier de bedgraph de données cible au format de bedgraph UCSC qui omet les régions contenant un signal nul, et le fichier de bedgraph de données de contrôle (IgG) pour générer un seuil empirique pour l’appel de crête18.
    7. Effectuer une analyse de corrélation de Pearson à l’aide de deeptools pour déterminer la similarité entre les échantillons19. Utilisez la ligne de commande multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, suivie de plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle « Pearson Correlation of Read Counts » --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualisez les profils d’intensité à l’échelle du génome avec IGV20 à l’aide de fichiers bedgraph et des pics de bed file obtenus à partir de SEACR.
    9. Utilisez HOMER pour l’annotation des pics et la recherche de motifs21.
    10. Enfin, comparez les jeux de données avec ceux précédemment publiés avec le navigateur ChIP-Atlas Peak pour les visualiser sur IGV, et/ou l’analyse d’enrichissement en utilisant les fichiers bed générés par SEASCR comme jeu de données d’entrée22.

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Representative Results

Des cellules satellites provenant de muscles squelettiques de souris ont été isolées en combinant les protocoles de Gunther et al. (ci-après le Protocole 1)12 et de Liu et al.23 (ci-après le Protocole 2). Étant donné que des fibres musculaires non digérées ont été observées après la digestion lors de l’utilisation de la concentration de collagénase et de dispase proposée dans le protocole 1, la quantité d’enzymes a été augmentée pour améliorer la dissociation des fibres musculaires, comme décrit aux étapes 1.2.1 et 1.2.3. Comme indiqué dans le protocole 2, les échantillons ont été soumis à une légère agitation dans un bain-marie pour maintenir la viabilité cellulaire. Nous avons effectué la filtration à travers des tamis cellulaires, comme mentionné dans le protocole 1, et l’incubation avec un tampon de lyse des globules rouges (voir les étapes 1.2.7 à 1.2.10). Dans le protocole 1, les cellules ont été chargées sur un gradient de densité de Percoll de 30 %/70 % pour isoler les cellules mononucléées à l’interphase, ce qui a pu entraîner la perte de cellules d’intérêt. Cette étape a donc été omise, comme le propose le Protocole n° 2.

Le contrôle FSC-A par rapport au SSC-A a été utilisé pour identifier les cellules mononucléées en fonction de leur taille (FSC) et de leur granularité (SSC) (Figure 3A). Les débris ont été exclus en ignorant les événements inférieurs à 40 K sur l’axe FSC-A, et 38,8 % ± 3,6 % des cellules ont été sélectionnées. Des diagrammes de densité de contrôle FSC-A par rapport à la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) ont été utilisés pour l’exclusion des doublets (figure 3B). Après avoir sélectionné les cellules négatives pour le marqueur de coloration de viabilité fixable, une moyenne de 34,3 % ± 7,7 % de cellules vivantes a été obtenue (Figure 3C).

Le pourcentage indiqué dans le diagramme à points de la figure 3C, soit 75,4 %, correspond au pourcentage de cellules vivantes individuelles, calculé à partir de la population de cellules mères, qui est dans ce cas les cellules uniques. 95,7 % des cellules individuelles sont obtenues à partir des événements en direct, qui représentent 35 % du total des événements. Ainsi, le pourcentage de 34,3 % obtenu en moyenne est calculé à partir de l’ensemble des événements et non des populations parentes.

Environ 3 % des cellules vivantes individuelles étaient négatives pour les marqueurs leucocytaires (CD45), monocytaires (CD11b), endothéliales (CD31) et érythroïdes spécifiques (TER119) (Figure 3D). Les cellules CD11b/CD45/CD31/TER119 négatives ont ensuite été sélectionnées en fonction de leur expression des marqueurs CD34 (cellules souches hématopoïétiques, progénitrices endothéliales et mésenchymateuses) et ITGA7 (cellules musculaires cardiaques, lisses et squelettiques) (Figure 3E). Un dernier contrôle pour CXCR4 (lymphocytes, cellules hématopoïétiques et satellites) a été effectué pour sélectionner les cellules satellites putatives (Figure 3F). Parmi les cellules CD34+/ITGA7+, ~80 % se sont avérées positives pour CXCR4, ce qui représente en moyenne 1 % ± 0,15 % du total des cellules vivantes individuelles, et un nombre absolu de 60 000 ± 14 000 cellules satellites putatives par muscle des membres de souris parmi 14 expériences indépendantes. Une évaluation complémentaire de la fraction cellulaire CXCR4+ a révélé qu’environ 80 % des cellules vivantes ont été obtenues après post-tri, dont près de 70 % étaient CXCR4+ (Figure S1), ce qui montre la viabilité et la pureté élevées de cette population cellulaire isolée de FACS.

Depuis que diverses études ont comparé l’efficacité des enzymes collagénase et Liberase TL pour l’isolement cellulaire24,25, ces deux méthodes de digestion ont été traitées en parallèle. Avec 300 μL de Liberase TL, la digestion était moins efficace qu’avec la collagénase, car il restait des fibres non digérées. De plus, un plus grand nombre de débris cellulaires et d’événements de grande taille ont été observés (figures S2A et B), et seulement 17,3 % des cellules vivantes uniques en moyenne ont été obtenues après la sélection de FVS 780 (figure S2C). Une autre préoccupation concernant la digestion de la Liberase était le faible nombre de cellules CD34+/ITGA7+ par rapport à la collagénase (figures S2D-S2E), même si le déclenchement CXCR4 était similaire (figure S2F). Avec 600 μL de Liberase TL, la digestion a été plus efficace. Cependant, la quantité de débris cellulaires est demeurée élevée et la viabilité cellulaire inférieure à la norme (16,3 %) (figure S3). Ainsi, la digestion avec Liberase TL s’est avérée moins efficace pour l’isolement des cellules satellites.

Au moment de l’ensemencement, plus de 70 % des cellules CD34+/ITGA7+/CXCR4+ (Figure 4A) exprimaient PAX7 (Figure 4B), contrairement aux cellules CD34+/ITGA7-/CXCR4- qui étaient PAX7-négatives (Figure 4C). Les cellules CD34+/ITGA7+/CXCR4+ ont été capables de se différencier en myofibres lorsqu’elles ont été cultivées dans un milieu myogénique pendant 7 jours supplémentaires, comme le montre la coloration à la dystrophine (DMD) (Figure 4D), confirmant leur potentiel myogénique. Ainsi, la culture tissulaire combinée et les analyses d’immunofluorescence ont montré que les cellules CD34+/ITGA7+/CXCR4+ isolées de FACS sont des cellules satellites.

Afin de déterminer si les cellules satellites isolées conviennent à l’analyse CUT&RUN, le profil génomique de la lysine acétylée 27 (H3K27ac) et de la lysine diméthylée 4 (H3K4me2) de l’histone H3, deux modifications des histones trouvées dans les régions actives du promoteur et de l’enhancer, a été déterminé. Nos données ont permis de découvrir 68 694 et 13 514 pics pour H3K4me2 et H3K27ac, respectivement, avec une répartition génomique similaire entre les deux marques d’histones (Figure S4A). Dans le détail, nous avons constaté qu’un quart des pics étaient situés ± 2 kb du site de départ de la transcription (TSS) du gène le plus proche, la majorité étant située soit entre -100 kb et -10 kb, soit entre 10 kb et 100 kb du TSS (Figure S4B). Il convient de noter que l’analyse de Pearson a montré une corrélation de 80 % entre les profils de lecture H3K27ac et H3K4me2 (figure S4C). Afin d’évaluer que la chromatine préparée à partir du protocole susmentionné a été isolée à partir de cellules satellites, la présence de H3K27ac et H3K4me2 au niveau du promoteur de gènes spécifiques aux cellules satellites a été déterminée. H3K4me2 a été enrichi autour des MES de Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 et Vcam1 (Figure 5A), mais pas autour de ceux d’Itgam (CD11b) et de Ptprc (CD45) (cellules immunitaires), de Pecam (CD31 ; cellules endothéliales) (Figure 5B), de Ckm (fibres musculaires en développement) ou de Myh3 (myosine embryonnaire rapide à chaîne lourde, myofibres) (Figure 5C). Des résultats similaires ont été obtenus avec H3K27ac (Figure 5). Presque aucun signal n’a été obtenu avec l’échantillon d’IgG (Figure 5). De plus, la comparaison des pics de H3K27ac obtenus à partir de SEACR avec ceux résultant de l’appel des pics MACS2 à partir des ensembles de données ChIP-seq publiés a montré une forte corrélation, comme indiqué sous chaque panneau (ChIP-Atlas track ; Graphique 5). L’ensemble de ces résultats indique que les lectures obtenues après l’analyse bioinformatique proviennent de la chromatine des cellules satellites isolées de FACS et sont corrélées avec celles précédemment identifiées par les analyses ChIP-seq.

Alors que les études de séquençage de l’ARN unicellulaire dans des cellules satellites de souris ont montré une réponse au stress frappante, causée par la procédure d’isolement26, la présence de H3K4me2 ou H3K27ac a été déterminée au niveau des gènes de réponse au stress, comme illustré par Atf3, Azin1, Gls et Elf2. Les résultats fournissent la preuve que la marque H3K27ac n’est pas déposée au niveau du promoteur de ces gènes, et que les niveaux de H3K4me2 restent faibles par rapport à ceux obtenus pour les gènes spécifiques des cellules satellites (Figure S5). Ainsi, ces données mettent en évidence la douceur de la procédure d’isolement.

Ensuite, l’adéquation de notre méthode d’isolement pour les facteurs de transcription a été examinée. L’analyse CUT&RUN du récepteur des androgènes (AR), un facteur de transcription qui appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires et qui joue un rôle important dans la différenciation myogénique27, a permis de démêler 7 840 pics. Ces pics étaient principalement situés dans les régions d’intron et d’intergénique (Figure S4A), soit entre -100 kb et -10 kb, soit entre 10 kb et 100 kb à partir du TSS (Figure S4B). Les analyses phylogénétiques ont révélé que l’AR, aux côtés des récepteurs des glucocorticoïdes (GR/Nr3c1), des minéralocorticoïdes (MR/Nr3c2) et de la progestérone (PR/Nr3c3), fait partie de la sous-famille des récepteurs nucléaires des oxostéroïdes 28, qui se lient en tant qu’homodimères à des segments d’ADN constitués de deux demi-sites palindromiques 5′-RGAACA-3′ séparés par trois paires de bases 29. La recherche d’un motif connu au moyen de l’optimisation hypergéométrique de l’enrichissement des motifs (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) a révélé que l’AR est lié au motif de demi-site 5′-RGRNCA-3′ AR, au motif typique de l’oxostéroïde 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ (appelé PR dans la figure), et au motif consensuel 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR dans >32%, 17% et 2% des régions ciblées, respectivement (figure 6A). Il est à noter que des proportions similaires ont été précédemment obtenues pour le récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle squelettique16.

L’analyse de la SEACR a révélé près de 500 pics avec un score maximal de >50, dont plus de 200 avec un score >100 ; certains d’entre eux sont illustrés à la figure 6B. Notre analyse a également révélé un enrichissement modeste de l’AR au niveau des sites de liaison précédemment décrits des gènes impliqués dans la biosynthèse des polyamines (Amd1, Oat et Smox) et dans le cancer de la prostate (Acox1, Fkbp5 et Tmprss2) (Figure S6). Il est intéressant de noter que l’AR a été trouvé aux loci des gènes impliqués dans la souche des cellules satellites (Pax7, Cxcr4 et Cd34) (Figure S7). Il convient de noter que l’élément de réponse aux oxostéroïdes a été trouvé dans chacune de ces régions enrichies en AR (Figure S6 et Figure S7), ce qui démontre que le signal AR observé dans les données CUT&RUN est très spécifique.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique du protocole utilisé pour l’isolement des cellules satellites à partir des muscles des membres de souris. Le protocole comprend quatre étapes principales. Brièvement, les souris sont sacrifiées et les muscles des membres postérieurs sont prélevés (étapes 1.1.1-1.1.3) et hachés mécaniquement à l’aide de ciseaux (étapes 1.4-1.5). Viennent ensuite les étapes 1.2.1 à 1.2.4, au cours desquelles les muscles sont dissociés dans un bain-marie à l’aide de collagénase et de dispase. Aux étapes 1.2.5 à 1.2.8, la suspension cellulaire est filtrée consécutivement à travers des tamis cellulaires de 100, 70 et 40 μm, et les érythrocytes sont éliminés à l’aide d’un tampon de lyse des globules rouges (étapes 1.2.9-1.2.12). Les populations cellulaires restantes sont marquées à l’étape 1.3 avec des anticorps couplés à des fluorophores, qui sont dirigés contre des marqueurs phénotypiques cellulaires spécifiques. L’étape 1.4 comprend le passage d’échantillons dans le FACS pour recueillir des cellules satellites en vue d’une application ultérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse par cytométrie en flux d’une préparation cellulaire non colorée. (A) Sélection de la population d’intérêt sur la base des paramètres FSC-A et SSC-A. (B) Identification d’une cellule unique basée sur les normes FSC-A et FSC-H. (C) Caractérisation du seuil d’auto-fluorescence des cellules collectées pour l’APC-Cy7 conjuguées au marquage des cellules mortes par coloration de viabilité fixable (FVS 780). (D-F). Mesure de l’auto-fluorescence pour le PE-Cy7 conjugué à l’anticorps CD11b et le PE-conjugué aux marqueurs TER119/CD45/CD31 (D), ainsi que pour le fluor Alexa 488 conjugué à ITGA7, le fluor Alexa 405 conjugué au CD34 (E) et le fluorochrome APC conjugué au CXCR4 (F). Les portes sont représentées par des boîtes noires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Stratégie de déclenchement du cytomètre en flux pour le tri cellulaire par satellite. (A) Sélection de la population d’intérêt sur la base des paramètres FSC-A et SSC-A. (B) Identification d’une cellule unique basée sur les normes FSC-A et FSC-H. (C) Identification de cellules vivantes avec FVS 780. (D) Sélection de cellules négatives basée sur les antigènes CD11b, CD31, CD45 et TER119. (E-F) Sélection cellulaire positive basée sur les antigènes CD34 et ITGA7 (E), ainsi que sur les antigènes CXCR4 (F). Les portes sont représentées par des boîtes noires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse de cellules CD34+/ITGA7+/CXCR4+ et CD34+/ITGA7-/CXCR4- isolées par FACS. (A) Images à contraste de phase de cellules CD34+/ITGA7+/CXCR4+ et CD34+/ITGA7-/CXCR4- cultivées dans un milieu de culture. (B) Analyse par immunofluorescence de cellules CD34+/ITGA7+/CXCR4+ et CD34+/ITGA7-/CXCR4- cultivées dans un milieu de culture à l’aide d’anticorps dirigés contre PAX7 (rouge) et la dystrophine (DMD, vert). Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Les flèches magenta indiquent les cellules PAX7 positives. (C) Images à contraste de phase de cellules CD34+/ITGA7+/CXCR4+ cultivées pendant 5 jours dans un milieu de culture (panneau de gauche) et pendant 7 jours supplémentaires dans un milieu myogénique (panneau de droite). (D) Images d’analyse par immunofluorescence de cellules CD34+/ITGA7+/CXCR4+ cultivées pendant 5 jours dans un milieu de culture (panneau de gauche) et pendant 7 jours supplémentaires dans un milieu myogénique (panneau de droite) utilisant des anticorps dirigés contre PAX7 (rouge) et la dystrophine (DMD, vert). Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Les flèches magenta indiquent les cellules PAX7 positives. Les flèches vertes indiquent les cellules DMD positives. Barres d’échelle : panneaux à fond clair = 25 μm ; Panneaux d’immunofluorescence = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Profils génomiques de la chromatine des cellules satellites. Localisation de H3K4me2 et H3K27ac au niveau des gènes spécifiques des cellules satellites (A), des gènes spécifiques des cellules immunitaires et endothéliales (B) et des gènes spécifiques des myofibres (C) sur la chromatine des cellules satellites par CUT&RUN. Les promoteurs actifs sont encadrés en vert, tandis que les promoteurs inactifs sont encadrés en marron. CUT&RUN réalisé avec des IgG a été utilisé comme témoin négatif. L’analyse de l’enrichissement en H3K27ac pour les marques d’histones est présentée sous chaque piste. Le score d’enrichissement indiquant les niveaux de confiance des jeux de données publiés est représenté sous la forme d’une carte thermique. Les étoiles brunes (*) font référence aux pics de ChIP-seq H3K27ac réalisés dans les cellules satellites musculaires, les étoiles bleues à H3K4me3 et les étoiles roses à H4K16me1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Distribution génomique de l’AR sur la chromatine des cellules satellites. (A) Analyse des motifs connus par HOMER des pics d’AR dans les cellules satellites. PR : récepteur de la progestérone. La cible Nb fait référence au nombre de pics présentant un motif particulier. (B) Localisation de H3K4me2 et d’AR au niveau des gènes indiqués sur la chromatine des cellules satellites déterminée par CUT&RUN. CUT&RUN réalisé avec des IgG a été utilisé comme témoin négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des matériaux, réactifs et logiciels. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Composition des tampons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Références et concentrations d’anticorps. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1 supplémentaire : Analyse par cytométrie en flux de la préparation cellulaire post-tri. (A) Sélection de la population d’intérêt sur la base des paramètres FSC-A et SSC-A. (B) Identification d’une cellule unique basée sur les normes FSC-A et FSC-H. (C) Identification des cellules vivantes présentant une coloration de viabilité fixable (FVS 780). (D) Sélection de cellules négatives basée sur les antigènes CD11b, CD31, CD45 et TER119. (E-F) Sélection cellulaire positive basée sur les antigènes CD34 et ITGA7 (E) ainsi que CXCR4 (F). Les portes sont représentées par des boîtes noires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Stratégie de déclenchement du cytomètre en flux pour le tri des cellules satellites après digestion avec 300 μL de Liberase TL. (A) Sélection de la population d’intérêt sur la base des paramètres FSC-A et SSC-A. (B) Identification d’une cellule unique basée sur les normes FSC-A et FSC-H. (C) Identification de cellules vivantes avec FVS 780. (D) Sélection de cellules négatives basée sur les antigènes CD11b, CD31, CD45 et TER119. (E-F) Sélection cellulaire positive basée sur les antigènes CD34 et ITGA7 (E) ainsi que CXCR4 (F). Les portes sont représentées par des boîtes noires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 3 supplémentaire : Stratégie de déclenchement du cytomètre en flux pour le tri des cellules satellites après digestion avec 600 μL de Liberase TL. (A) Sélection de la population d’intérêt sur la base des paramètres FSC-A et SSC-A. (B) Identification d’une cellule unique basée sur les normes FSC-A et FSC-H. (C) Identification de cellules vivantes avec FVS 780. (D) Sélection de cellules négatives basée sur les antigènes CD11b, CD31, CD45 et TER119. (E-F) Sélection cellulaire positive basée sur les antigènes CD34 et ITGA7 (E) ainsi que CXCR4 (F). Les portes sont représentées par des boîtes noires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Caractérisation des localisations génomiques H3K4me2, H3K27ac et AR. (A) Diagrammes circulaires illustrant la distribution maximale de H3K4me2, H3K27ac et AR en fonction des caractéristiques du génome dans les cellules satellites. (B) Diagrammes circulaires illustrant la distribution maximale de H3K4me2, H3K27ac et AR en fonction de leur distance au TSS le plus proche dans les cellules satellites. (C) Carte thermique montrant la corrélation de Pearson entre H3K4me2, H3K27ac et le contrôle des IgG. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 5 supplémentaire : Profils génomiques de la chromatine des cellules satellites au niveau des gènes induits par la réponse au stress. Localisation de H3K4me2 et H3K27ac au niveau des gènes indiqués sur la chromatine des cellules satellites. L’immunoprécipitation avec des IgG a été utilisée comme témoin négatif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 6 supplémentaire : Profils génomiques de la chromatine des cellules satellites sur des gènes cibles AR connus. Localisation de H3K4me2, H3K27ac et AR au niveau des gènes indiqués sur la chromatine des cellules satellites déterminés par CUT&RUN. Les pics de RA sont encadrés en bleu, et les éléments correspondants sont présentés ci-dessous. CUT&RUN réalisé avec des IgG a été utilisé comme témoin négatif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 7 supplémentaire : Profils génomiques de la chromatine des cellules satellites à leurs gènes exprimés sélectivement. Localisation de H3K4me2, H3K27ac et AR au niveau des gènes indiqués sur la chromatine des cellules satellites déterminés par CUT&RUN. Les pics de RA sont encadrés en bleu, et les éléments correspondants sont présentés ci-dessous. CUT&RUN réalisé avec des IgG a été utilisé comme témoin négatif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La présente étude fait état d’une méthode standardisée, fiable et facile à réaliser pour l’isolement et la culture de cellules satellites de souris, ainsi que l’évaluation de la régulation transcriptionnelle par la méthode CUT&RUN.

Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est la perturbation musculaire et la digestion des fibres pour assurer un nombre élevé de cellules collectées. Malgré l’augmentation de la concentration enzymatique, plus de cellules vivantes ont été obtenues qu’en utilisant le protocole 1. Les cellules satellites expriment un motif spécifique de diverses protéines membranaires. Pour augmenter la rigueur de notre tri, nous avons utilisé une combinaison de marqueurs de cellules satellites négatifs (CD31, TER119, CD45 et CD11b) et positifs (CD34, ITGA7 et CXCR4)30,31 décrits précédemment. En utilisant cette stratégie, une moyenne de 1% de cellules satellites putatives vivantes a été obtenue. Ce résultat est dans la fourchette de ce qui était attendu, puisque les cellules satellites représentent 2 à 7 % de la population de cellules musculaires à l’âge adulte chez la souris32. Pour contrôler les marqueurs de sélection des cellules satellites, les cellules CD34+/ITGA7-/CXCR4- ont été isolées. La coloration immunofluorescente a démontré que, alors que les cellules CD34+/ITGA7-/CXCR4- n’exprimaient pas PAX7, 70 % des cellules triées CD34+/ITGA7+/CXCR4+ étaient positives pour ce marqueur spécifique des cellules satellites, démontrant ainsi que la population isolée de FACS correspond aux cellules satellites. De plus, 70 % des cellules satellites cultivées en milieu myogénique pendant 7 jours étaient PAX7-/DMD+, comme l’a montré l’immunomarquage, et formaient une myofibre multinucléée allongée, démontrant que les cellules satellites isolées conservaient leur potentiel de souche.

La principale limite dans la préparation des échantillons pourrait être l’utilisation d’une forte concentration d’enzymes, ce qui entraîne une grande quantité de matériel biologique dissocié, mais peut contribuer à une augmentation de la mort cellulaire. Pour résoudre ce problème, un test nécessitant une quantité d’enzyme plus faible a été testé. Dans ce contexte, la Liberase TL, une forme purifiée de la collagénase33 traditionnelle, a été testée. Bien que la digestion ait apparemment été plus efficace avec cette enzyme, la quantité de débris cellulaires est restée élevée et la viabilité cellulaire a été légèrement réduite. Ces observations sont en accord avec des rapports antérieurs qui comparaient la digestion tissulaire médiée par la Liberase à celle-ci avec la collagénase recombinante ou la collagénase personnalisée24,25. De plus, même si la proportion de cellules endothéliales et immunitaires était similaire entre la collagénase et la digestion de la Liberase, le pourcentage de cellules satellites était plus faible dans l’échantillon traité par la Liberase, ce qui montre globalement que la Liberase n’est pas recommandée pour l’isolement des cellules satellites. L’utilisation de cette enzyme est adaptée à l’analyse phénotypique et quantitative des cellules immunitaires et pourrait éventuellement être recommandée dans le cadre de tissus musculaires et/ou autres. Ceci est en concordance avec ce qui a été rapporté sur Liberase TL comme le plus adapté pour isoler efficacement les cellules immunitaires viables34,35,36.

Un autre problème potentiel est le stress causé par la dissociation et le tri des cellules satellites. Cependant, l’absence de H3K27ac et les faibles niveaux de H3K4me2 dans la région promotrice des gènes de réponse au stress identifiés par séquençage de l’ARN unicellulaire dans les cellules satellites de souris26 montrent que la procédure est suffisamment légère pour ne pas induire le répertoire transcriptionnel de la réponse au stress. D’autres limites sont à noter : les antigènes sélectionnés qui restent empiriques. Cependant, des études montrent un chevauchement élevé entre les combinaisons uniques de marqueurs de surface qui sont enrichies pour les cellules satellites du muscle squelettique30,31.

Une autre étape critique est la purification des noyaux à partir de cellules triées. Pour cela, la vitesse de tri est maintenue faible afin de ne pas endommager les cellules, mais suffisamment rapide pour qu’elles ne soient pas stockées trop longtemps dans le tampon FACS. En effet, les noyaux CUT&RUN ne sont pas fixes, et un temps d’incubation plus long pourrait influencer la lecture obtenue à partir du protocole. Une préparation typique à partir des deux membres postérieurs d’une souris permet de CUT&RUN avec un anticorps et un contrôle IgG, avec une quantité de 2,5 ng de chromatine pour chacun.

Les expériences CUT&RUN, conçues pour évaluer la liaison des facteurs de transcription et les modifications épigénétiques, ont fourni des signaux de lecture forts et robustes pour H3K4me2 et H3K27ac. Les niveaux élevés de lecture de H3K4me2 et H3K27ac sur les gènes connus pour être exprimés dans les cellules satellites, par rapport aux gènes exprimés dans les cellules immunitaires ou endothéliales ainsi que dans les myofibres, ont montré que le signal était amplifié principalement à partir des noyaux des cellules satellites. De plus, ce protocole a permis d’identifier le cistrome de l’AR dans les cellules souches musculaires, ce qui reste à ce jour un problème technique inhérent à la mauvaise qualité des anticorps AR de souris et aux faibles niveaux d’expression de l’AR dans les cellules peu sensibles aux androgènes, comme les cellules épithéliales de la prostate. Les données présentées ici ont révélé des régions liées à la RA avec des scores de confiance élevés et des scores de pointe. Étant donné qu’une seule répétition a été évaluée à l’origine par anticorps, la robustesse de nos ensembles de données sera améliorée par l’ajout d’au moins deux répétitions biologiques supplémentaires par condition. Cependant, les gènes cibles connus de l’AR et les marques d’histones respectives, décrits à l’origine comme hautement exprimés et/ou facilement détectables dans d’autres contextes tissulaires tels que la prostate, présentent des niveaux d’expression plus faibles et sont très difficiles à détecter dans les cellules satellites.

L’une des limites de l’approche CUT&RUN est qu’elle est réalisée dans des cellules non fixées. Ainsi, nous avons peut-être manqué certaines cibles AR en raison de la nature labile des interactions entre les facteurs de transcription et leur site de liaison. De même, certaines modifications post-traductionnelles, comme l’acétylation, peuvent aussi être plutôt labiles. Par conséquent, l’inclusion d’une étape de fixation de la lumière avec du formaldéhyde ou du paraformaldéhyde, après le tri FACS, et avant l’isolement des noyaux, pourrait être envisagée pour stabiliser les interactions protéine/ADN et les modifications des histones.

Bien que cet article montre que les tests CUT&RUN peuvent être effectués sur des cellules satellites isolées de FACS, d’autres analyses utilisant de la chromatine non fixée telles que l’ATAC-seq pourraient également être effectuées. De plus, même si ici les muscles ont été prélevés dans des conditions physiologiques basales, ce protocole peut être appliqué à des contextes pathologiques tels que les blessures ou le vieillissement. L’utilisation de tous ces protocoles permettra de comprendre en détail les mécanismes de régulation des gènes dans les cellules satellites et de comprendre comment ces mécanismes pourraient être modifiés par des conditions physiopathologiques.

En résumé, ce protocole peu coûteux et rapide fournit un cadre expérimental efficace pour étudier le recrutement des facteurs de transcription et le paysage de la chromatine dans les cellules précurseurs du muscle squelettique. La chromatine préparée par ce protocole a fourni la première analyse à l’échelle du génome du cistrome AR dans les cellules satellites et facilitera les futures études sur la régulation des gènes.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Anastasia Bannwarth pour son excellente assistance technique. Nous remercions l’animalerie de l’IGBMC, la culture cellulaire, l’Institut Clinique de la Souris (ICS, Illkirch, France), l’imagerie, la microscopie électronique, la cytométrie en flux, et la plateforme GenomEast, membre du consortium France Génomique (ANR-10-INBS-0009).

Ces travaux de l’Institut Thématique Interdisciplinaire IMCBio, dans le cadre du programme ITI 2021-2028 de l’Université de Strasbourg, du CNRS et de l’Inserm, ont été soutenus par l’IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) et par le projet SFRI-STRAT’US (ANR 20-SFRI-0012) et l’EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) dans le cadre du Programme Français d’Investissements d’Avenir. Des financements complémentaires ont été apportés par l’INSERM, le CNRS, l’Unistra, l’IGBMC, l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), le programme stratégique AFM-Téléthon 24376 (à D.D.), la bourse Jeunes chercheurs de l’Inserm (à la D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, et un fonds d’Etat géré par l’ANR dans le cadre du programme-cadre Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. a bénéficié du soutien du Programme CDFA-07-22 de l’Université franco-allemande et du Ministère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’Innovation, et K.G. de l’Association pour la Recherche à l’IGBMC (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

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References

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Analyse CUT&RUN Cellules satellites de souris isolées par FACS Champ de cellules souches Populations de petites cellules Protocole efficace Tri cellulaire activé par fluorescence Muscle des membres Protéines structurelles Hayage Moyen Dispase Collagénase de type I Crépines cellulaires Tampon FACS Coloration de viabilité Cellules satellites immunocolorées Triton X-100 Perles magnétiques Concanavalin A Facteur de transcription Modifications des histones Nucléase micrococcique de la protéine A Clivage de la chromatine CaCl2 Extraction d’ADN Bibliothèques Analyse bioinformatique
Un protocole efficace pour l’analyse CUT&amp;RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS
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Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

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