Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN).

Abstract

ניתוחים גנומיים עם אוכלוסיות תאים קטנות הם אילוץ מרכזי למחקרים, במיוחד בתחום תאי הגזע. עבודה זו מתארת פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין משריר הגפיים, רקמה עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי גפיים מנותחים מעכברים בוגרים שובשו מכנית על ידי טחינה במדיום בתוספת דיספאס וקולגנאז מסוג I. עם העיכול, ההומוגנט סונן דרך מסננות תאים, והתאים הושעו במאגר FACS. הכדאיות נקבעה עם כתם כדאיות הניתן לתיקון, ותאי לוויין מוכתמים חיסונית בודדו על ידי FACS. התאים עברו ליזה עם Triton X-100 וגרעינים ששוחררו נקשרו לחרוזים מגנטיים מסוג concanavalin A. קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם נוגדנים כנגד גורם השעתוק או שינויי ההיסטון המעניינים. לאחר השטיפה, קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם חלבון A-micrococcal nuclease, ומחשוף הכרומטין החל עם CaCl2. לאחר מיצוי הדנ"א נוצרו ורוצפו ספריות, והפרופילים לקשירת פקטורי שעתוק ברחבי הגנום ושינויים קוולנטיים בהיסטון התקבלו על ידי אנליזה ביואינפורמטית. הפסגות שהתקבלו עבור סימני ההיסטון השונים הראו כי אירועי הקישור היו ספציפיים לתאי לוויין. יתר על כן, ניתוח מוטיב ידוע גילה כי גורם השעתוק קשור לכרומטין באמצעות אלמנט התגובה הקוגנטית שלו. פרוטוקול זה מותאם אפוא לחקר בקרת גנים בתאי לוויין של שרירי גפיים של עכברים בוגרים.

Introduction

שרירי השלד המפוספסים מייצגים בממוצע 40% ממשקל גוף האדם הכולל1. סיבי שריר מפגינים יכולת יוצאת דופן להתחדשות בעת פציעה, המתוארת על ידי איחוי של מיוציטים חדשים שנוצרו ויצירת מיוסיבים חדשים המחליפים את הפגועים2. בשנת 1961 דיווח אלכסנדר מאורו על אוכלוסייה של תאים חד-גרעיניים שאותם כינה תאי לוויין3. תאי גזע אלה מבטאים את פקטור השעתוק בתיבה 7 (PAX7), וממוקמים בין הלמינה הבסיסית לבין הסרקולמה של סיבי שריר4. הם דווחו כמבטאים את אשכול ההתמיינות 34 (CD34; אב המטופוייטי, אנדותל וסמן תאי גזע מזנכימליים), אינטגרין אלפא 7 (ITGA7; סמן שרירי לב ושלד חלקים), כמו גם קולטן כימוקין C-X-C מסוג 4 (CXCR4; סמן לימפוציטים, המטופויטים ותאי לוויין)5. בתנאי בסיס, תאי לוויין שוכנים במיקרו-סביבה מסוימת השומרת אותם במצב שקט6. עם פגיעה בשרירים, הם הופכים מופעלים, מתרבים ועוברים מיוגנזה7. עם זאת, הם תורמים רק לחלק קטן מכלל תאי השריר, והניתוחים הכלל-גנומיים שלהם מאתגרים במיוחד, במיוחד בתנאים פיזיולוגיים (<1% מכלל התאים).

תוארו שיטות שונות לבידוד כרומטין מתאי לוויין, הכוללות משקעים חיסוניים של כרומטין ואחריו ריצוף מקבילי מסיבי (ChIP-seq) או מחשוף תחת ניסויי מטרות ותיוג (CUT&Tag). עם זאת, שתי טכניקות אלה מציגות כמה מגבלות משמעותיות שנותרו ללא עוררין. ואכן, ChIP-seq דורש כמות גבוהה של חומר מוצא כדי לייצר מספיק כרומטין, שחלק גדול ממנו הולך לאיבוד במהלך שלב הסוניקציה. CUT&Tag מתאים יותר למספר תאים נמוך, אך מייצר יותר אתרי מחשוף מחוץ למטרה מאשר ChIP-seq בשל פעילות טרנספוזאז Tn5. בנוסף, מאחר שלאנזים זה יש זיקה גבוהה לאזורים עם כרומטין פתוח, גישת CUT&Tag עשויה לשמש לניתוח שינויים בהיסטון או גורמי שעתוק הקשורים לאזורים משועתקים באופן פעיל של הגנום, במקום הטרוכרומטיןמושתק 8,9.

מוצג כאן פרוטוקול מפורט המאפשר בידוד של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים על ידי FACS עבור מחשוף מתחת למטרות ושחרור באמצעות ניתוח נוקלאז (CUT&RUN)10,11. השלבים השונים כרוכים בשיבוש מכני של רקמות, מיון תאים ובידוד גרעינים. יעילות השיטה, בכל הנוגע להכנת תרחיף תאים בר קיימא, הודגמה על ידי ביצוע ניתוח CUT&RUN עבור שינויים קוולנטיים בהיסטון וגורמי שעתוק. איכותם של התאים המבודדים הופכת את השיטה המתוארת לאטרקטיבית במיוחד להכנת כרומטין הלוכד נאמנה את מצב התפוסה הגנומי הטבעי, ועשוי להתאים ללכידת קונפורמציית הכרומוזומים בשילוב עם ריצוף בתפוקה גבוהה במוקדים ספציפיים (4C-seq) או ברמות רחבות גנום (Hi-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עכברים הוחזקו בבית חיות מוכר, בהתאם להנחיות הלאומיות לטיפול בבעלי חיים (הנחיה 86/609/CEE של הנציבות האירופית; צו צרפתי מס '87-848) על השימוש בחיות מעבדה למחקר. מניפולציות מכוונות הוגשו לוועדה האתית (Com'Eth, שטרסבורג, צרפת) ולמשרד המחקר הצרפתי (MESR) להערכה ואישור אתיים בהתאם להנחיית 2010/63/EU תחת מספר APAFIS #22281.

1. הכנת תרחיף תאים לבידוד תאי לוויין באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) (איור 1)

  1. בידוד רקמת שריר
    1. יש לטהר את הכלים לנתיחת שרירים, כולל מלקחיים, אזמלים ומספריים, באמצעות חומר ניקוי (טבלה 1), ולשטוף היטב במים מזוקקים.
    2. הכינו שני צינורות של 2 מ"ל (טבלה 1), שכל אחד מהם מכיל 1 מ"ל של חיץ בידוד שרירים, והניחו אותם על קרח לאיסוף שרירים שנקטפו.
    3. הקריבו שני עכברים זכרים בני 10 שבועות C57/Bl6J על ידי חנק CO2 ואחריו נקע צוואר הרחם. יש לרסס 70% אתנול על כל עכבר שלם. יש לקלף את העור מהגפה האחורית באמצעות מלקחיים. נתחו החוצה את כל שרירי הגפיים המקיפים את עצם הירך, השוקה והפיבולה (כ-1 מ"ג שרירים לעכבר).
      הערה: מספר תאי הלוויין יורד לאחר גיל 15 שבועות.
    4. הניחו את שרירי הגפיים שנקטפו לתוך 2 צינורות מ"ל המכילים 1 מ"ל של חיץ בידוד שרירים שהוכן בשלב 1.1.2. לאסוף את השרירים מן העכבר השני בעקבות אותו הליך. טוחנים את השרירים שנקטפו עם מספריים על קרח עד קטנים מ 1 מ"מ3 שברים מתקבלים.
      הערה: השרירים נאספו ונכרכו בעיקר כמתואר12. בצע עיכול רקמות לאחר שלב 1.2 או 1.3.
  2. עיכול רקמות עם אנזים collagenase
    1. העבירו את מתלה השריר הטחון משני העכברים על-ידי שפכתם לתוך צינור של 50 מ"ל (טבלה 1) המכיל 18 מ"ל של חיץ בידוד שרירים (בתוספת 5 מ"ל [5 U/mL] של דיספאס ו-5 מ"ג של קולגן מסוג I) (טבלה 1).
    2. סגור את הצינור בחוזקה ואטם אותו בסרט מעבדה (טבלה 1). הניחו אותו אופקית באמבט מים רועד (טבלה 1) בטמפרטורה של 37°C ב-100 סל"ד למשך 30 דקות.
    3. לאחר 30 דקות, להוסיף 5 מ"ג של סוג I collagenase. שמור צינורות במשך 30 דקות נוספות תחת תסיסה באמבט מים רועד ב 37 ° C ב 100 סל"ד.
    4. עם העיכול, פיפטה את השריר השעיה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל כדי לשפר את היעילות של דיסוציאציה. צנטריפוגה ב-4°C ב-400 x גרם למשך 5 דקות. גלולה שקופה תיראה בתחתית הצינור. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, ולהשאיר 5 מ"ל של תווך בצינור.
      הערה: עזיבת המדיום מסייעת למנוע לחץ על התאים. הוסף 10 מ"ל של חיץ בידוד שרירים טרי והשהה מחדש את הגלולה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטה של 10 מ"ל.
    5. הניחו מסננות תאים של 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר (אחת מכל סוג) (טבלה 1) על צינורות פתוחים של 50 מ"ל. פיפטפו את התרחיף על מסננות התאים העוקבות (100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר, 40 מיקרומטר) ואספו את הזרימה לתוך צינורות 50 מ"ל, המכילים תאים מתחת ל -40 מיקרומטר.
    6. צנטריפוגה את המתלה ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל עד שיישארו 2 מ"ל, ולאחר מכן להשתמש בפיפט של 0.2-1 מ"ל עד שיישארו 100-200 מיקרוליטר. השהה מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים (טבלה 2). דוגרים על קרח במשך 3 דקות.
    7. צנטריפוגה ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant באמצעות פיפטה 20-200 μL. השהה מחדש את התאים ב- 100 μL של מאגר FACS קר (טבלה 2). מניחים על קרח.
  3. שיטה חלופית לעיכול רקמות עם אנזים Liberase thermolysin low (TL)
    1. בצע את התיאורים בשלב 1.1. לבידוד רקמות.
    2. עבור פירוק רקמות בתיווך ליבראז, קצרו שרירים ב-2 מ"ל של מאגר הבידוד של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) (טבלה 2), במקום חיץ בידוד השרירים המתואר בשלב 1.1.2.
    3. העבירו את מתלה השריר הטחון משני העכברים על ידי שפכתם לתוך צינור של 50 מ"ל (טבלה 1) המכיל 18 מ"ל של חיץ בידוד RPMI בתוספת 300 או 600 מיקרוליטר של Liberase TL בריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל (טבלה 1) (כלומר, 0.083 מ"ג/מ"ל ו-0.167 מ"ג/מ"ל בריכוזים הסופיים, בהתאמה)13.
    4. סגור את הצינור בחוזקה ואטם אותו בסרט מעבדה (טבלה 1). הניחו אותו אופקית באמבט מים רועד (טבלה 1) בטמפרטורה של 37°C ב-100 סל"ד למשך 30 דקות.
    5. עם העיכול, פיפטה את השריר השעיה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל כדי לנתק ולשפר את היעילות של דיסוציאציה.
    6. צנטריפוגה ב-4°C ב-400 x גרם למשך 5 דקות. גלולה שקופה תיראה בתחתית הצינור. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, ולהשאיר 5 מ"ל של תווך בצינור. עזיבת המדיום מסייעת למנוע לחץ על התאים. הוסף 10 מ"ל של חיץ בידוד RPMI טרי, והשהה מחדש את הגלולה על ידי פיפט למעלה ולמטה עם פיפטה 10 מ"ל.
    7. הניחו מסננות תאים של 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר (אחת מכל סוג) (טבלה 1) על צינורות פתוחים של 50 מ"ל.
    8. פיפטפו את התרחיף על מסננות תאים עוקבות (100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר, 40 מיקרומטר) ואספו את הזרימה לתוך צינורות 50 מ"ל, המכילים תאים מתחת ל -40 מיקרומטר.
    9. צנטריפוגה את המתלה ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל עד שיישארו 2 מ"ל, ולאחר מכן להשתמש בפיפט של 0.2-1 מ"ל עד שיישארו 100-200 מיקרוליטר.
    10. השהה מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים (טבלה 2). דוגרים על קרח במשך 3 דקות.
    11. צנטריפוגה ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant באמצעות פיפטה 20-200 μL.
    12. השהה מחדש את התאים ב- 100 μL של מאגר FACS קר (טבלה 2). מניחים על קרח.
  4. הכנת תרחיף תאים לבידוד FACS
    1. העבר 10 μL של תרחיף התא שהושג בשלב 1.2.12 לתוך צינור טרי 1.5 מ"ל. דגימה זו תהווה את הבקרה הלא מוכתמת או את הבקרה השלילית (איור 2). הוסף 190 μL של מאגר FACS, העבר לצינור 5 מ"ל (טבלה 1), ואחסן על קרח.
    2. צנטריפוגה את 90 μL הנותרים של תרחיף התא המתקבל בשלב 1.2.12 ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant באמצעות פיפטה (20-200 μL קצה נפח). דגרו על התאים עם 400 μL של כתם כדאיות הניתן לתיקון (טבלה 3) מדולל בתווך הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco ללא סרום למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. שטפו את התאים באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות והוסיפו 100 μL של מאגר FACS. הפוך בעדינות את הצינורות שלוש פעמים וצנטריפוגה שוב ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות.
    4. בזמן הצנטריפוגה, הכינו 100 μL של תערובת אב של נוגדנים ראשוניים המצומדים לפלואורופורים ומכוונים נגד CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 ו-CXCR4 (טבלה 3), מדוללים במאגר FACS.
    5. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant התא באמצעות פיפטה (20-200 μL קצה נפח), ולהוסיף את תערובת נוגדנים 100 μL. הפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים. אין לערבל. דוגרים בחושך על קרח במשך 30 דקות.
    6. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 20-200 μL ולהוסיף 500 μL של 1x פוספט-חוצץ מלוחים (PBS) כדי לשטוף את התאים. הפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים. צנטריפוגה מחדש ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה 20-200 μL.
    7. השהה מחדש את גלולת התא ב 500 מיקרוליטר של חיץ FACS והעבר את המתלה לצינור 5 מ"ל.
      הערה: תרחיף התאים המתקבל מעיכול Liberase מעובד באותו אופן.
  5. בחירת תאי לוויין על-ידי FACS
    1. מערבלים לזמן קצר את תרחיף התא (2-5 שניות) ומעבדים את התאים על ציטומטר זרימה המצויד בפייה של 100 מיקרומטר (טבלה 1).
    2. קבעו את גדלי השערים השונים בהתבסס על הדגימה הלא מוכתמת שאוחסנה בשלב 1.4.1 (איור 2).
    3. צפה צינור 5 מ"ל עם 1 מ"ל של סרום עגל עוברי טהור (FCS) כדי לשפר את איסוף התאים ולהוסיף 500 μL של חיץ FACS.
    4. החליפו את הדגימה הלא מוכתמת בדגימה המסומנת בנוגדנים.
    5. בחר את אוכלוסיית העניין לפי אזור הפיזור קדימה (FSC-A) ואזור הפיזור הצדדי (SSC-A) (איור 3A), והסר תאים כפולים עם FSC-A וגובה פיזור קדימה (FSC-H) (איור 3B)14.
    6. זהו תאים חיים עם כתמים שליליים הניתנים לקיבוע (איור 3C).
    7. בחר תאים שליליים עבור CD31, CD45, TER119 ו- CD11b (איור 3D).
    8. כדי לזהות תאי לוויין, בחרו תחילה את התאים החיוביים ל-CD34 ול-ITGA7 (איור 3E), ולאחר מכן בחרו את התאים החיוביים ל-CXCR4 באוכלוסייה שנבחרה ב-CD34 וב-ITGA7 (איור 3F).
    9. לאסוף את התאים שנבחרו (בין 40,000 ל 80,000 תאים, על פי איכות ההכנה) בצינור 5 מ"ל מצופה המכיל 500 μL של חיץ FACS.

2. תיקוף האוכלוסייה המבודדת בתרבית רקמה

  1. ציפוי שקופיות עם הידרוג'ל
    1. לדלל 280 μL של מטריצה טהורה של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) (טבלה 1) ב-12 מ"ל של מדיום DMEM/F12 ללא סרום.
    2. מצפים מגלשה קאמרית (טבלה 1) בתמיסת הידרוג'ל, ודגרים עליה למשך הלילה ב-4°C.
    3. למחרת, לדגור על מגלשת התא ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 1 שעה לפני זריעת התא.
  2. גדילה והתמיינות של תאים
    1. צלחו החוצה כ-20,000 תאים, שהתקבלו משלב 1.5.9, לכל באר, וגדלו אותם במדיום גידול (טבלה 2) במשך 5 ימים. צלמו תמונות עם ניגודיות פאזה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 4A), לפני עיבודן לצורך ניתוח אימונופלואורסנציה כדי להבטיח את איכות ההכנה (איור 4B).
    2. כדי לגרום למיוגנזה, גדל תאי לוויין מוגברים משלב 2.2.1 בתווך מיוגני (טבלה 2) למשך 7 ימים נוספים. צלמו תמונות עם ניגודיות פאזה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 4C) לפני עיבודן לצורך ניתוח אימונופלואורסנציה כדי להבטיח את איכות ההכנה (איור 4D).
  3. ניתוח אימונוציטופלואורסצנטיות
    1. הסר בעדינות את המדיום, שטוף את התאים שהיו בתרבית על שקופית התא עם 100 μL של 1x PBS פעמיים, ולתקן אותם עם 100 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) ב RT במשך 1 שעות.
      הערה: שלב זה צריך להתבצע בזהירות. נפח קטן של מדיום צריך תמיד להישמר בחדר כדי למנוע לחץ על התאים, ואת PBS יש לשפוך דרך קירות החדר.
    2. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 100 μL של 1x PBS, בתוספת 0.1% Tween 20 (PBST) כדי לחדור את קרום התא.
    3. חסום אותות לא ספציפיים על ידי דגירה ב- 100 μL של 1x PBST בתוספת 5% FCS (PBST-FCS) ב- RT למשך שעה אחת.
    4. לדגור על התאים עם 100 μL של תערובת אב של נוגדנים נגד PAX7 ואנטי-דיסטרופין (DMD) (מדוללים ב-1x PBST-FCS) ב-4°C למשך הלילה, כדי לזהות תאי לוויין ומיופייבר, בהתאמה.
    5. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 100 μL של 1x PBST, ודגרו עליהם עם 100 μL של נוגדנים משניים נגד עכבר עז Cy3 או נגד ארנב עז Alexa 488 (טבלה 3) מדוללים ב-1x PBST-FCS ב-RT למשך שעה אחת.
    6. נתק את בארות התא מהשקף באמצעות הציוד שסופק על ידי הספק, הוסף 20 μL של אמצעי הרכבה מימי עם 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), וכסה את השקופית עם כיסוי (טבלה 1).
    7. התבונן וללכוד את התמונה של התאים המוכתמים עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
    8. עבד את התמונות באמצעות תוכנה לניתוח תמונות (איורים 4B,D).

3. ניתוח CUT&RUN

  1. הכנת דגימה לניתוח CUT&RUN על תאי לוויין מבודדים ב-FAC
    הערה: CUT&RUN בוצע בעיקרו כמתואר10,15. הרכב החיץ מוצג ב טבלה 2.
    1. עבור בדיקת CUT&RUN, השתמש בכ -40,000 תאים שהתקבלו בשיטה 1, שלב 1.5.9, לכל דגימה/נוגדן שיש לבדוק.
    2. צנטריפוגו את תאי הלוויין שבודדו ב-FAC ב-RT ב-500 x גרם למשך 10 דקות, ואז השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה (20-200 μL tip volume).
    3. שטפו את התאים עם 1 מ"ל של 1x PBS, צנטריפוגה ב-RT ב-500 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה (0.2-1 מ"ל נפח קצה), והשעו אותם מחדש ב-1 מ"ל של חיץ מיצוי גרעיני קר (טבלה 2). דוגרים על קרח במשך 20 דקות.
    4. במהלך הדגירה, הכינו צינור אחד של 1.5 מ"ל המכיל 850 מיקרוליטר של חיץ קשירה קר (טבלה 2) והוסיפו 20 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצופים A של קונקנבלין לכל דגימה (טבלה 1).
    5. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ קשירה קר באמצעות מדף מגנטי (טבלה 1). עבור כל שטיפה או שינוי חיץ במהלך ההליך, תן לחרוזים להצטבר בצד הצינור על המדף המגנטי במשך 5 דקות לפני הסרת supernatant מפונה עם פיפטה (0.2-1 מ"ל נפח חוד). לאחר מכן, יש להשהות מחדש בעדינות ב-300 מיקרוליטר של חיץ קשירה קר.
    6. צנטריפוגו את הגרעינים בטמפרטורה של 4°C בטמפרטורה של 600 x g למשך 5 דקות והשעו אותם מחדש בעדינות במאגר מיצוי גרעיני של 600 מיקרוליטר. ערבבו בעדינות את 600 μL של גרעינים שחולצו עם 300 μL של תמיסת חרוזים concanavalin A, ודגרו בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.
    7. הסר את הסופרנאטנט באמצעות מדף מגנטי, כמתואר בשלב 3.1.4, והשהה מחדש את הגרעינים הקשורים לחרוזים בעדינות עם 1 מ"ל של חיץ חוסם קור (טבלה 2). יש לדגור ב-RT במשך 5 דקות.
    8. הסר את הסופרנאטנט באמצעות מתלה מגנטי ושטוף את הגרעינים הקשורים לחרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ כביסה קרה (טבלה 2). במהלך השטיפה השנייה, פצלו באופן שווה את הגרעינים הקשורים לחרוזים לצינורות של 1.5 מ"ל. כל צינורית תטופל בנוגדן ספציפי בשלב הבא.
      הערה: בדוגמה זו, 250 μL של גרעינים הקשורים לחרוזים פוצלו לארבעה צינורות של 1.5 מ"ל.
    9. להפריד את supernatant באמצעות מדף מגנטי, כמתואר בשלב 3.1.4, ולשאוף עם פיפטה. השהה מחדש בעדינות את קומפלקסי הגרעין/חרוז עם נוגדן ראשוני ספציפי (טבלה 3), או IgG של מין אחר (כאן ארנב) מדולל ב-250 מיקרוליטר של חיץ לשטיפה קרה. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה עם תסיסה עדינה.
      הערה: הנוגדנים המשמשים כאן מכוונים נגד AR, H3K4me2 ו- H3K27ac.
    10. הסר את הסופרנאטנט עם מדף מגנטי, כמתואר בשלב 3.1.4, שטוף את הגרעינים הקשורים לחרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ שטיפה קרה, והשהה מחדש ב 100 מיקרוליטר של חיץ כביסה קרה.
    11. לדלל חלבון A-micrococcal nuclease ב 1.4 ng/μL ב 100 μL לכל דגימה של חיץ כביסה קרה.
    12. הוסף 100 μL של חלבון A-micrococcal nuclease ל 100 μL של הדגימה המתקבלת ב 3.1.11 ולדגור ב 4 ° C במשך 1 שעה עם תסיסה.
    13. הסר את הסופרנאטנט עם מדף מגנטי, כמתואר בשלב 3.1.4, שטוף פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ כביסה קרה, והשהה מחדש את גרעיני החרוזים ב 150 מיקרוליטר של חיץ כביסה קרה.
    14. כדי להתחיל מחשוף DNA, הוסף 3 μL של 100 mM של CaCl2 ל 150 μL של דגימה, לערבב במהירות על ידי הבהוב, ולדגור על קרח במשך 30 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 150 μL של חיץ עצירה ודגור ב 37 ° C במשך 20 דקות כדי לעכל את RNA ולשחרר את קטעי DNA.
    15. עבור מיצוי DNA, צנטריפוגה את הדגימות ב 16,000 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
    16. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרופוגה חדש ומשליכים את הגלולה והחרוזים.
    17. יש להוסיף 3 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) ו-2.5 μL של 20 מ"ג/מ"ל פרוטאינאז K. מערבבים בהיפוך. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 70°C (ללא רעידות).
    18. הוסף 300 μL של פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול, מערבולת, העברה לצינורות נעילת פאזה של 2 מ"ל (מסובבים מראש למשך 5 דקות ב-16,000 x גרם), וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-16,000 x גרם ב-4°C.
    19. הוסף 300 מיקרוליטר כלורופורם לאותו צינור וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 16,000 x גרם ב- 4 ° C. לאסוף את supernatant (~ 300 μL) עם פיפטה (0.2-1 מ"ל נפח קצה) ולהעביר לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל.
    20. הוסף 1 μL של גליקוגן (ריכוז 20 מ"ג / מ"ל).
    21. הוסף 750 μL של 100% אתנול ושקע לילה ב -20 ° C.
    22. גלול את הדנ"א על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 16,000 x גרם ב 4 ° C. לשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של 100% אתנול, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 16,000 x גרם, להשליך את supernatant, צנטריפוגה במשך 30 s ב 16,000 x גרם, ולהסיר את הנוזל עם פיפטה (20-200 μL קצה נפח).
    23. יבש את הגלולה באוויר למשך ~5 דקות. השהיה מחדש ב 25 μL של 1 mM Tris-HCl (pH 8) ו 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA; pH 8).
  2. ניתוח ביואינפורמטיקה
    1. הכינו ספריות מדנ"א חיסוני וריצפו אותן כקריאות 100 bp בעזרת הפלטפורמה הגנומית כמתואר16.
    2. הסר קריאות החופפות לאזור הרשימה השחורה של ENCODE (V2) והפרד את שאר הקריאות לשתי קבוצות: גודל קטע <120 bp (ללא נוקלאוזום, באופן כללי עבור גורמי שעתוק) וגודל מקטע >150 bp (עם נוקלאוזומים, בדרך כלל עבור סימני היסטון). מפה לגנום הייחוס mm10 באמצעות Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. צור קבצים bigwig עם bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. שמור קריאות ממופות באופן ייחודי לצורך ניתוח נוסף.
    5. צור קבצי bedgraph גולמיים עם genomeCoverageBed (v2.26.0 bedtools).
    6. השתמש באלגוריתם SEACR 1.3 (אפשרות מחמירה) עבור שיחות שיא. טען את קובץ Bedgraph של נתוני היעד בתבנית Bedgraph של UCSC המשמיטה אזורים המכילים אות אפס, וקובץ Bedgraph של נתוני בקרה (IgG) כדי ליצור סף אמפירי עבור חיוג שיא18.
    7. בצע ניתוח מתאם פירסון עם כלים עמוקים כדי לקבוע את הדמיון בין הדגימות19. השתמש בשורת הפקודה multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, ואחריו plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. דמיינו את פרופילי העוצמה הכלל-גנומיים עם IGV20 באמצעות קובצי בדגרף ושיאי קובץ המיטה שהתקבלו מ-SEACR.
    9. השתמש ב- HOMER לביאור שיא ולחיפוש מוטיבים21.
    10. לבסוף, השווה את מערכי הנתונים עם אלה שפורסמו בעבר באמצעות דפדפן ChIP-Atlas Peak כדי להמחיש אותם ב- IGV, ו / או ניתוח העשרה באמצעות קבצי המיטה שנוצרו על ידי SEACR כערכת נתוני קלט22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי לוויין משרירי השלד של עכבר בודדו על ידי שילוב הפרוטוקולים של Gunther et al. (להלן פרוטוקול 1)12 ושל Liu et al.23 (להלן פרוטוקול 2). מאחר שנצפו סיבי שריר לא מעוכלים לאחר העיכול בעת שימוש בריכוז של collagenase ו-dispase שהוצע בפרוטוקול 1, כמות האנזימים הוגדלה כדי לשפר את הדיסוציאציה של סיבי השריר, כפי שמתואר בשלבים 1.2.1 ו-1.2.3. כפי שצוין בפרוטוקול 2, הדגימות היו נתונות לתסיסה עדינה באמבט מים כדי לשמור על כדאיות התא. ביצענו סינון באמצעות מסננות תאים, כפי שהוזכר בפרוטוקול 1, ודגירה באמצעות חיץ ליזה של תאי דם אדומים (ראה שלבים 1.2.7 עד 1.2.10). בפרוטוקול 1, תאים הועמסו על שיפוע צפיפות פרקול של 30%/70% כדי לבודד תאים חד-גרעיניים בשלב הביניים, מה שאולי הוביל לאובדן תאים. לפיכך, צעד זה הושמט, כפי שהוצע בפרוטוקול 2.

FSC-A לעומת SSC-A gating שימש לזיהוי תאים חד-גרעיניים בהתבסס על גודל (FSC) וגרעיניות (SSC) (איור 3A). פסולת נשללה על ידי התעלמות מאירועים מתחת ל-40K על ציר FSC-A, ונבחרו 38.8% ±-3.6% מהתאים. תרשימי צפיפות גיטינג FSC-A לעומת גובה פיזור קדמי (FSC-H) שימשו להרחקה כפולה (איור 3B). לאחר בחירת התאים השליליים עבור סמן כתם הכדאיות הניתן לקיבוע, התקבלו בממוצע 34.3% ± 7.7% מהתאים החיים (איור 3C).

האחוז המוצג בתרשים הנקודות באיור 3C, 75.4%, מתאים לאחוז התאים החיים הבודדים, המחושב מאוכלוסיית תאי האב, שהיא במקרה זה הרווקים. 95.7% מהתאים הבודדים מתקבלים מהאירועים החיים המהווים 35% מכלל האירועים. לפיכך, אחוז 34.3% המתקבלים בממוצע, מחושב מסך האירועים ולא מאוכלוסיות ההורים.

כ-3% מהתאים החיים הבודדים היו שליליים עבור לויקוציטים (CD45), מונוציטים (CD11b), אנדותל (CD31) וסמנים ספציפיים לאריתרואידים (TER119) (איור 3D). לאחר מכן נבחרו תאים שליליים CD11b/CD45/CD31/TER119 על פי הביטוי שלהם של CD34 (אבות המטופויטיים, אנדותליים ותאי גזע מזנכימליים) ו-ITGA7 (תאי שריר לבביים, חלקים ושלדיים) (איור 3E). בדיקה סופית של CXCR4 (לימפוציטים, המטופויטים ותאי לוויין) בוצעה כדי לבחור תאי לוויין משוערים (איור 3F). מתאי CD34+/ITGA7+, ~80% נמצאו חיוביים עבור CXCR4, המייצג בממוצע 1% ± 0.15% מכלל התאים החיים הבודדים, ומספר מוחלט של 60,000 ± 14,000 תאי לוויין משוערים לכל שרירי גפיים של עכבר בקרב 14 ניסויים עצמאיים. הערכה נוספת של שימוש במקטע התאים CXCR4+ גילתה שכ-80% מהתאים החיים התקבלו לאחר המיון, מתוכם כמעט 70% היו CXCR4+ (איור S1), מה שמראה את הכדאיות והטוהר הגבוהים של אוכלוסיית תאים זו שבודדה באמצעות FACS.

מאז שמחקרים שונים השוו את היעילות של אנזימי collagenase ו-Liberase TL לבידוד תאים24,25, שתי שיטות העיכול הללו עובדו במקביל. עם 300 μL של Liberase TL, העיכול היה פחות יעיל מאשר עם collagenase, כמו סיבים מעוכלים נשארו. נוסף על כך, נצפו יותר פסולת תאים ואירועים גדולים (איורים S2A,B), ורק 17.3% מהתאים החיים הבודדים בממוצע התקבלו לאחר בחירת FVS 780 (איור S2C). דאגה נוספת לגבי עיכול ליבראז הייתה המספר הנמוך של תאי CD34+/ITGA7+ בהשוואה לקולגנאז (איורים S2D-S2E), אף על פי ש-CXCR4 היה דומה (איור S2F). עם 600 μL של Liberase TL, העיכול היה יעיל יותר. עם זאת, כמות פסולת התאים נותרה גבוהה ויכולת הקיום של התא הייתה ירודה (16.3%) (איור S3). לפיכך, העיכול עם Liberase TL היה פחות יעיל לבידוד תאי לוויין.

כאשר נזרעו, יותר מ-70% מתאי CD34+/ITGA7+/CXCR4+ (איור 4A) ביטאו PAX7 (איור 4B), בניגוד לתאי CD34+/ITGA7-/CXCR4 שהיו שליליים ל-PAX7 (איור 4C). תאי CD34+/ITGA7+/CXCR4+ הצליחו להתמיין למיוסיבים כאשר גדלו בתווך מיוגני במשך 7 ימים נוספים, כפי שמוצג על-ידי צביעת דיסטרופין (DMD) (איור 4D), מה שמאשר את הפוטנציאל המיוגני שלהם. לפיכך, תרבית רקמה משולבת וניתוח אימונופלואורסצנטי הראו כי תאי CD34+/ITGA7+/CXCR4+ שבודדו ב-FAC הם תאי לוויין.

כדי לקבוע אם תאי לוויין מבודדים מתאימים לניתוח CUT&RUN, נקבע הפרופיל הגנומי של ליזין 27 (H3K27ac) וליזין דימתילציה 4 (H3K4me2) של היסטון H3, שני שינויים בהיסטון שנמצאו באזורי מקדם ומשפר פעיל. הנתונים שלנו חשפו 68,694 ו-13,514 שיאים עבור H3K4me2 ו-H3K27ac, בהתאמה, עם חלוקה גנומית דומה בין שני סימני ההיסטון (איור S4A). בפירוט, מצאנו שרבע מהפסגות היו ממוקמות ± 2 קילו-בתים מאתר התחלת השעתוק (TSS) של הגן הקרוב ביותר, כאשר רובן היו ממוקמות בין -100 קילו-בתים ל-10 קילו-בתים, או 10 קילו-בתים עד 100 קילו-בתים מה-TSS (איור S4B). יש לציין כי ניתוח פירסון הראה מתאם של 80% בין פרופילי קריאה של H3K27ac ו-H3K4me2 (איור S4C). כדי להעריך שהכרומטין שהוכן מהפרוטוקול הנ"ל בודד מתאי לוויין, נקבעה נוכחותם של H3K27ac ו-H3K4me2 במקדם גנים ספציפיים לתאי לוויין. H3K4me2 הועשר סביב ה-TSS של Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 ו-Vcam1 (איור 5A), אבל לא סביב אלה של Itgam (CD11b) ו-Ptprc (CD45) (תאי מערכת החיסון), פקאם (CD31; תאי אנדותל) (איור 5B), Ckm (סיבי שריר מתפתחים), או Myh3 (מיוסיבים עובריים מהירים בעלי שרשרת כבדה מיוזין) (איור 5C). תוצאות דומות התקבלו עם H3K27ac (איור 5). כמעט ולא התקבל אות בדגימת IgG (איור 5). יתר על כן, השוואה בין פסגות H3K27ac שהתקבלו מ- SEACR לאלה הנובעות מקריאות שיא MACS2 ממערכי נתונים ChIP-seq שפורסמו הראתה מתאם גבוה, כפי שצוין מתחת לכל פאנל (מסלול ChIP-Atlas; איור 5). יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שהקריאות המתקבלות לאחר ניתוח הביואינפורמטיקה מקורן בכרומטין של תאי לוויין שבודדו ב-FACS ומתאמות עם אלה שזוהו בעבר על ידי ניתוחי ChIP-seq.

בעוד שמחקרי ריצוף RNA חד-תאי בתאי לוויין של עכברים הראו תגובת עקה מרשימה, שנגרמה על ידי הליך בידוד26, נוכחותם של H3K4me2 או H3K27ac נקבעה בגנים של תגובת לחץ, כפי שהודגם עם Atf3, Azin1, Gls ו-Elf2. התוצאות מספקות ראיות לכך שהסימן H3K27ac אינו מופקד במקדם של גנים כאלה, ושרמות H3K4me2 נשארות נמוכות בהשוואה לאלה שהתקבלו עבור גנים ספציפיים לתאי לוויין (איור S5). לפיכך, נתונים אלה מדגישים עד כמה הליך הבידוד מתון.

לאחר מכן, נבדקה התאמת שיטת הבידוד שלנו לגורמי שעתוק. ניתוח CUT&RUN עבור קולטן אנדרוגן (AR), גורם שעתוק השייך למשפחת קולטני הגרעין וממלא תפקיד חשוב בהתמיינות מיוגנית27, חשף 7,840 פסגות. הפסגות האלה היו ממוקמות בעיקר באזורים אינטרונים ואינטרגניים (איור S4A), בין 100 ל-10 קילו-בתים, או 10 קילו-בתים עד 100 קילו-בתים מה-TSS (איור S4B). ניתוחים פילוגנטיים גילו כי AR, לצד גלוקוקורטיקואיד (GR/Nr3c1), המינרלוקורטיקואיד (MR/Nr3c2) וקולטני פרוגסטרון (PR/Nr3c3), הוא חבר בתת-משפחת קולטני הגרעין אוקסוסטרואידים 28, הנקשרים כהומודימרים למקטעי DNA המורכבים משני חצאי אתרים פלינדרומיים 5′-RGAACA-3′ המופרדים על ידי שלושה זוגות בסיסים 29. חיפוש מוטיב ידוע באמצעות אופטימיזציה היפרגאומטרית של העשרת מוטיב (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) גילה כי AR קשור למוטיב חצי האתר 5′-RGRNCA-3′ AR, למוטיב האוקסוסטרואיד הטיפוסי 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ (המכונה באיור PR), ולמוטיב הקונצנזוס 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ AR ב->32%, 17% ו-2% מאזורי היעד, בהתאמה (איור 6A). יש לציין כי פרופורציות דומות התקבלו בעבר עבור קולטן glucocorticoid בשרירי השלד16.

ניתוח SEACR חשף כמעט 500 פסגות עם ציון שיא >50, כאשר יותר מ -200 מהן עם ציון >100; חלקם מודגמים באיור 6B. הניתוח שלנו גילה גם העשרה צנועה של AR באתרי הקישור שתוארו קודם לכן של גנים המעורבים בביוסינתזה של פוליאמין (Amd1, שיבולת שועל ו-Smox) ובסרטן הערמונית (Acox1, Fkbp5 ו-Tmprss2) (איור S6). באופן מעניין, מציאות רבודה נמצאה במוקדים של גנים המעורבים בגזע תאי לוויין (Pax7, Cxcr4 ו-Cd34) (איור S7). יש לציין שאלמנט תגובת האוקסוסטרואיד נמצא בכל אחד מהאזורים המועשרים ב-AR (איור S6 ואיור S7), מה שמדגים שאות ה-AR שנראה בנתוני CUT&RUN הוא ספציפי מאוד.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המשמש לבידוד תאי לוויין משרירי הגפיים של עכבר. הפרוטוקול כולל ארבעה שלבים עיקריים. בקצרה, עכברים מוקרבים, ושרירי הגפיים האחוריות נקצרים (שלבים 1.1.1-1.1.3) וטחונים מכנית באמצעות מספריים (שלבים 1.4-1.5). זה ואחריו שלבים 1.2.1-1.2.4, שבמהלכם השרירים מנותקים באמבט מים באמצעות collagenase ו dispase. בשלבים 1.2.5-1.2.8, תרחיף התאים מסונן דרך מסננות תאים של 100, 70 ו-40 מיקרומטר, ברצף, ואריתרוציטים מסולקים באמצעות חיץ ליזה של תאי דם אדומים (שלבים 1.2.9-1.2.12). שאר אוכלוסיות התאים מסומנות בשלב 1.3 בנוגדנים המוצמדים לפלואורופורים, המכוונים נגד סמנים פנוטיפיים תאיים ספציפיים. שלב 1.4 כולל דגימות העוברות דרך FACS כדי לאסוף תאי לוויין ליישום נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח ציטומטריית זרימה של הכנת תאים לא מוכתמים. (A) בחירת אוכלוסיית העניין בהתבסס על פרמטרים FSC-A ו-SSC-A. (B) זיהוי תא בודד המבוסס על FSC-A ו-FSC-H. (C) אפיון סף הפלואורסצנטיות האוטומטי של תאים שנאספו עבור APC-Cy7 מצומד לכתם הכדאיות הניתן לתיקון (FVS 780) המסמן תאים מתים. (ד-ו). מדידת פלואורסצנטיות אוטומטית עבור PE-Cy7 מצומד לנוגדן CD11b ו-PE מצומד לסמנים TER119/CD45/CD31 (D), כמו גם עבור פלואור Alexa 488 מצומד ל-ITGA7, פלואור Alexa 405 מצומד ל-CD34 (E) ופלואורוכרום APC מצומד ל-CXCR4 (F). שערים מיוצגים כקופסאות שחורות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אסטרטגיית גיטוט ציטומטר זרימה למיון תאי לוויין. (A) בחירת אוכלוסיית העניין על בסיס פרמטרים FSC-A ו-SSC-A. (B) זיהוי תא בודד המבוסס על FSC-A ו-FSC-H. (C) זיהוי תאים חיים עם FVS 780. (D) בחירת תאים שלילית מבוססת על אנטיגנים CD11b, CD31, CD45 ו-TER119. (ה-ו) בחירת תאים חיובית מבוססת על CD34 ו- ITGA7 (E), כמו גם אנטיגנים CXCR4 (F). שערים מיוצגים כקופסאות שחורות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח תאי CD34+/ITGA7+/CXCR4+ ו-CD34+/ITGA7-/CXCR4 מבודדים. (A) תמונות ניגודיות פאזה של תאים CD34+/ITGA7+/CXCR4+ ו-CD34+/ITGA7-/CXCR4 שגודלו בתרבית במדיום גידול. (B) ניתוח אימונופלואורסצנטי של CD34+/ITGA7+/CXCR4+ ו-CD34+/ITGA7-/CXCR4 - תאים שגודלו בתרבית במדיום גדילה באמצעות נוגדנים המכוונים נגד PAX7 (אדום) ודיסטרופין (DMD, ירוק). גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). חיצי מגנטה מציינים תאים חיוביים ל-PAX7. (C) תמונות ניגודיות פאזה של תאי CD34+/ITGA7+/CXCR4+ שגדלו במשך 5 ימים במדיום גידול (פאנל שמאלי) ובמשך 7 ימים נוספים בתווך מיוגני (פאנל ימני). (D) תמונות ניתוח אימונופלואורסנציה של תאי CD34+/ITGA7+/CXCR4+ שגודלו במשך 5 ימים במדיום גדילה (פאנל שמאלי) ובמשך 7 ימים נוספים בתווך מיוגני (פאנל ימני) באמצעות נוגדנים המכוונים נגד PAX7 (אדום) ודיסטרופין (DMD, ירוק). גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). חיצי מגנטה מציינים תאים חיוביים ל-PAX7. חיצים ירוקים מציינים תאים חיוביים למחלת הדושן. פסי קנה מידה: לוחות brightfield = 25 מיקרומטר; לוחות immunofluorescence = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: פרופילים גנומיים של כרומטין. לוקליזציה של H3K4me2 ו-H3K27ac בגנים ספציפיים לתאי לוויין (A), גנים ספציפיים לתאי חיסון ואנדותל (B), וגנים ספציפיים למיוסיבים (C) על הכרומטין של תאי לוויין על ידי CUT&RUN. מקדמים פעילים מסומנים בירוק, בעוד שמקדמים לא פעילים מסומנים בחום. CUT&RUN שבוצע עם IgG שימש כבקרה שלילית. ניתוח העשרה H3K27ac עבור סימני היסטון מוצג מתחת לכל רצועה. ציון העשרה המציג את רמות הביטחון של מערכי הנתונים שפורסמו מתואר כמפת חום. כוכבים חומים (*) מתייחסים לפסגות H3K27ac ChIP-seq המבוצעות בתאי לוויין שריר, כוכבים כחולים ל-H3K4me3 והוורודים ל-H4K16me1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: התפלגות גנומית של AR על כרומטין של תאי לוויין. (A) ניתוח מוטיב ידוע של HOMER של שיאי AR בתאי לוויין. יחסי ציבור: קולטן פרוגסטרון. יעד Nb מתייחס למספר הפסגות המציגות מוטיב מסוים. (B) לוקליזציה של H3K4me2 ו-AR בגנים המצוינים על הכרומטין של תאי לוויין שנקבעו על ידי CUT&RUN. CUT&RUN שבוצע עם IgG שימש כבקרה שלילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימת חומרים, ריאגנטים ותוכנות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: הרכבי חיץ. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: הפניות וריכוזי נוגדנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור משלים 1: ניתוח ציטומטריית זרימה של הכנת התא לאחר המיון. (A) בחירת אוכלוסיית העניין על בסיס פרמטרים FSC-A ו- SSC-A. (B) זיהוי תא בודד המבוסס על FSC-A ו-FSC-H. (C) זיהוי תאים חיים עם כתם כדאיות הניתן לתיקון (FVS 780). (D) בחירת תאים שלילית מבוססת על אנטיגנים CD11b, CD31, CD45 ו-TER119. (ה-ו) בחירת תאים חיובית מבוססת על CD34 ו- ITGA7 (E) וכן על אנטיגנים CXCR4 (F). שערים מיוצגים כקופסאות שחורות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: אסטרטגיית ציטומטר זרימה למיון תאי לוויין לאחר עיכול עם 300 μL של Liberase TL. (A) בחירת אוכלוסיית העניין על בסיס פרמטרים FSC-A ו- SSC-A. (B) זיהוי תא בודד המבוסס על FSC-A ו-FSC-H. (C) זיהוי תאים חיים עם FVS 780. (D) בחירת תאים שלילית מבוססת על אנטיגנים CD11b, CD31, CD45 ו-TER119. (ה-ו) בחירת תאים חיובית מבוססת על CD34 ו- ITGA7 (E) וכן על אנטיגנים CXCR4 (F). שערים מיוצגים כקופסאות שחורות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: אסטרטגיית גיטוט ציטומטר זרימה למיון תאי לוויין לאחר עיכול עם 600 מיקרוליטר של Liberase TL. (A) בחירת אוכלוסיית העניין על בסיס פרמטרים FSC-A ו- SSC-A. (B) זיהוי תא בודד המבוסס על FSC-A ו-FSC-H. (C) זיהוי תאים חיים עם FVS 780. (D) בחירת תאים שלילית מבוססת על אנטיגנים CD11b, CD31, CD45 ו-TER119. (ה-ו) בחירת תאים חיובית מבוססת על CD34 ו- ITGA7 (E) וכן על אנטיגנים CXCR4 (F). שערים מיוצגים כקופסאות שחורות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: אפיון מיקומים גנומיים של H3K4me2, H3K27ac ו-AR. (A) תרשימי עוגה המתארים את התפלגות השיא של H3K4me2, H3K27ac ו-AR בהתאם לתכונות הגנום בתאי לוויין. (B) תרשימי עוגה המתארים את התפלגות השיא של H3K4me2, H3K27ac ו-AR לפי המרחק שלהם ל-TSS הקרוב ביותר בתאי לוויין. (C) מפת חום המציגה את מתאם פירסון בין H3K4me2, H3K27ac ובקרת IgG. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: פרופילים גנומיים של כרומטין תאי לוויין בגנים המושרים על ידי תגובת עקה. לוקליזציה של H3K4me2 ו-H3K27ac בגנים המצוינים על הכרומטין של תאי לוויין. Immunoprecipitation עם IgG שימש כבקרה שלילית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 6: פרופילים גנומיים של כרומטין של תאי לוויין בגנים ידועים של מטרות AR. לוקליזציה של H3K4me2, H3K27ac ו- AR בגנים המצוינים על הכרומטין של תאי לוויין שנקבעו על ידי CUT&RUN. פסגות AR מסומנות בכחול, ואלמנטים מקבילים המגיבים למציאות רבודה מוצגים להלן. CUT&RUN שבוצע עם IgG שימש כבקרה שלילית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 7: פרופילים גנומיים של כרומטין תאי לוויין בגנים המבוטאים באופן סלקטיבי שלהם. לוקליזציה של H3K4me2, H3K27ac ו- AR בגנים המצוינים על הכרומטין של תאי לוויין שנקבעו על ידי CUT&RUN. פסגות AR מסומנות בכחול, ואלמנטים מקבילים המגיבים למציאות רבודה מוצגים להלן. CUT&RUN שבוצע עם IgG שימש כבקרה שלילית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המחקר הנוכחי מדווח על שיטה סטנדרטית, אמינה וקלה לביצוע לבידוד ותרבית של תאי לוויין עכברים, כמו גם על הערכת ויסות שעתוק בשיטת CUT&RUN.

פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים. הראשון הוא הפרעה בשרירים ועיכול סיבים כדי להבטיח מספר גבוה של תאים שנאספו. למרות ריכוז האנזימים המוגבר, התקבלו יותר תאים חיים מאשר באמצעות פרוטוקול 1. תאי לוויין מבטאים תבנית מסוימת של חלבוני ממברנה שונים. כדי להגביר את חומרת המיון שלנו, השתמשנו בשילוב של סמני תאי לוויין שליליים (CD31, TER119, CD45 ו-CD11b) וחיוביים (CD34, ITGA7 ו-CXCR4)30,31. באמצעות אסטרטגיה זו, התקבל בממוצע 1% מתאי הלוויין המשוערים החיים. תוצאה זו היא בטווח של מה שהיה צפוי, שכן תאי לוויין מייצגים 2%-7% מאוכלוסיית תאי השריר בבגרות בעכברים32. כבקרה על סמני בחירת תאי הלוויין, בודדו תאי CD34+/ITGA7-/CXCR4. צביעה אימונופלואורסצנטית הראתה כי בעוד שתאי CD34+/ITGA7-/CXCR4 לא ביטאו PAX7, 70% מהתאים הממוינים CD34+/ITGA7+/CXCR4+ היו חיוביים לסמן ספציפי לתא לוויין זה, ובכך הוכיחו כי האוכלוסייה המבודדת FACS מתאימה לתאי לוויין. בנוסף, 70% מתאי הלוויין שגדלו בתווך מיוגני במשך 7 ימים היו PAX7-/DMD+, כפי שמוצג על ידי אימונוסטיין, ויצרו מיופייבר מרובה גרעינים מוארך, מה שמדגים כי תאי לוויין מבודדים שמרו על פוטנציאל הגבעול שלהם.

המגבלה העיקרית בהכנת הדגימות עשויה להיות שימוש בריכוז גבוה של אנזימים, הגורם לכמות גדולה של חומר ביולוגי מנותק, אך עשוי לתרום למוות מוגבר של תאים. כדי לפתור בעיה זו, נבדקה בדיקה הדורשת כמות אנזימים נמוכה יותר. בהקשר זה נבדק Liberase TL, צורה מטוהרת של collagenase33 מסורתי. למרות שהעיכול היה כנראה יעיל יותר עם אנזים זה, כמות פסולת התאים נותרה גבוהה, ויכולת הקיום של התא ירדה מעט. תצפיות אלה תואמות דוחות קודמים שהשוו את עיכול הרקמה בתיווך ליבראז לזה עם collagenase רקומביננטי או collagenase מותאם אישית24,25. בנוסף, אף על פי ששיעור תאי האנדותל ומערכת החיסון היה דומה בין קולגן לעיכול ליבראז, אחוז תאי הלוויין היה נמוך יותר במדגם המעובד של ליבראז, מה שהראה באופן כללי כי ליבראז אינו מומלץ לבידוד תאי לוויין. השימוש באנזים זה מתאים לאנליזה פנוטיפית וכמותית של תאי מערכת החיסון ובסופו של דבר עשוי להיות מומלץ בהקשר של שריר ו/או רקמות אחרות. זה עולה בקנה אחד עם מה שדווח על Liberase TL כמתאים ביותר לבודד ביעילות תאי חיסון קיימא34,35,36.

בעיה אפשרית נוספת היא הלחץ הנגרם הן על ידי ניתוק ומיון תאי לוויין. עם זאת, היעדרו של H3K27ac ורמות H3K4me2 הנמוכות באזור המקדם של גנים לתגובת דחק שזוהו על ידי ריצוף RNA חד-תאי בתאי לוויין של עכבר26 מראים כי ההליך מתון מספיק כדי לא לגרום לרפרטואר השעתוק של תגובת הלחץ. מגבלות נוספות שיש לציין הן האנטיגנים שנבחרו שנותרו אמפיריים. עם זאת, מחקרים מראים חפיפה גבוהה בין שילובי סמני פני שטח ייחודיים המועשרים עבור תאי לוויין שרירי השלד30,31.

שלב קריטי נוסף הוא טיהור גרעינים מתאים ממוינים. לשם כך, מהירות המיון נשמרת נמוכה כדי לא לפגוע בתאים, אך מהירה מספיק כדי שהם לא יאוחסנו זמן רב מדי במאגר FACS. ואכן, גרעיני CUT&RUN אינם קבועים, וזמן דגירה ארוך יותר עשוי להשפיע על הקריאה המתקבלת מהפרוטוקול. תכשיר אופייני משתי הגפיים האחוריות של עכבר אחד מאפשר CUT&RUN עם נוגדן אחד ובקרת IgG אחת, עם כמות של 2.5 ננוגרם כרומטין לכל אחד.

ניסויי CUT&RUN, שנועדו להעריך קשירת גורמי שעתוק ושינויים אפיגנטיים, סיפקו אותות קריאה חזקים וחזקים עבור H3K4me2 ו- H3K27ac. רמות הקריאה הגבוהות של H3K4me2 ו-H3K27ac בגנים הידועים כמתבטאים בתאי לוויין, בהשוואה לגנים המבוטאים בתאי מערכת החיסון או האנדותל, כמו גם במיוסיבים, הראו כי האות הוגבר בעיקר מגרעיני תאי הלוויין. בנוסף, פרוטוקול זה איפשר את זיהוי הציסטרומה של AR בתאי גזע שריריים, מה שנותר עד היום בעיה טכנית הטבועה באיכות הירודה של נוגדני AR בעכברים וברמות ביטוי AR נמוכות בתאים שאינם רגישים מאוד לאנדרוגן, כגון תאי ערמונית אפיתל. הנתונים המוצגים כאן חשפו אזורים הקשורים למציאות רבודה עם ציוני שיא ביטחון גבוהים. מכיוון שרק שכפול אחד הוערך במקור לכל נוגדן, החוסן של מערכי הנתונים שלנו ישתפר על ידי הוספת לפחות שני משכפלים ביולוגיים נוספים לכל מצב. עם זאת, גני המטרה הידועים של AR וסימני ההיסטון המתאימים, שתוארו במקור כבעלי ביטוי גבוה ו / או ניתנים לזיהוי בקלות בהקשרים רקמתיים אחרים כגון הערמונית, מציגים רמות ביטוי נמוכות יותר ומאתגרים מאוד לגילוי בתאי לוויין.

מגבלה אחת של גישת CUT&RUN היא שהיא מבוצעת בתאים לא קבועים. לכן, ייתכן שהחמצנו כמה מטרות AR בגלל האופי העלוב של האינטראקציות בין גורמי שעתוק לאתר הקישור שלהם. באופן דומה, כמה שינויים שלאחר התרגום, כגון אצטילציה, יכול גם להיות labile למדי. לכן, כולל שלב קיבוע קל עם פורמלדהיד או פרפורמלדהיד, לאחר מיון FACS, ולפני בידוד הגרעינים, ניתן לשקול לייצב את אינטראקציות החלבון/דנ"א ושינויים בהיסטון.

למרות שמאמר זה מראה כי ניתן לבצע מבחני CUT&RUN על תאי לוויין מבודדים של FACS, ניתוחים אחרים המשתמשים בכרומטין לא קבוע כגון ATAC-seq עשויים להתבצע גם כן. בנוסף, למרות שכאן השרירים נקצרו בתנאים פיזיולוגיים בסיסיים, פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם בהקשרים פתולוגיים כגון פציעה או הזדקנות. כל השימושים הללו בפרוטוקולים יאפשרו הבנה מפורטת של מנגנוני הבקרה של גנים בתאי לוויין, ועשויים לסייע בהבנת האופן שבו מנגנונים אלה עשויים להשתנות על ידי תנאים פתופיזיולוגיים.

לסיכום, פרוטוקול זול וחסכוני בזמן זה מספק סביבה ניסיונית יעילה לחקר גיוס פקטורי שעתוק ונוף הכרומטין בתאים מבשרי שרירי השלד. כרומטין שהוכן על ידי פרוטוקול זה סיפק את הניתוח הגנומי הראשון של ציסטרומה AR בתאי לוויין ויקל על מחקרים עתידיים על בקרת גנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לאנסטסיה באנווארת על מתן סיוע טכני מעולה. אנו מודים למתקן בית החיות IGBMC, לתרבית התא, למכון הקליני לעכברים (ICS, אילקירך, צרפת), להדמיה, למיקרוסקופ האלקטרונים, לציטומטריית הזרימה ולפלטפורמת GenomEast, חברה בקונסורציום 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

עבודה זו של המכון התמטי הבינתחומי IMCBio, כחלק מתוכנית ITI 2021-2028 של אוניברסיטת שטרסבורג, CNRS ו- Inserm, נתמכה על ידי IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ועל ידי פרויקט SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) ו- EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) במסגרת תוכנית ההשקעות הצרפתית לעתיד. מימון נוסף הועבר על ידי INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), התוכנית האסטרטגית AFM-Téléthon 24376 (ל- D.D.), INSERM מענק חוקר צעיר (ל- D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, וקרן ממשלתית צרפתית המנוהלת על ידי ANR במסגרת תוכנית Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. נתמך על ידי התוכנית CDFA-07-22 של אוניברסיטת פרנקו-אלמנדה ו Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, ו K.G. על ידי האגודה pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Tags

ניתוח CUT&RUN תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FACS שדה תאי גזע אוכלוסיות תאים קטנים פרוטוקול יעיל מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות שרירי גפיים חלבונים מבניים טחינה בינונית דיספאז סוג I Collagenase מסננת תאים חיץ FACS כתם כדאיות תאי לוויין מוכתמים חיסוניים Triton X-100 Concanavalin A חרוזים מגנטיים גורם שעתוק שינויים היסטון חלבון A-micrococcal Nuclease מחשוף כרומטין CaCl2 מיצוי DNA ספריות אנליזה ביואינפורמטית
פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter