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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Di seguito viene presentato un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti di cellule di arto di topo (FACS) attivato dalla fluorescenza, adattato allo studio della regolazione della trascrizione nelle fibre muscolari mediante scissione sotto bersagli e rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN).

Abstract

Le analisi dell'intero genoma con popolazioni di piccole cellule sono un vincolo importante per gli studi, in particolare nel campo delle cellule staminali. Questo lavoro descrive un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti dal muscolo dell'arto, un tessuto con un alto contenuto di proteine strutturali. I muscoli degli arti sezionati da topi adulti sono stati interrotti meccanicamente tritando in mezzo integrato con dispasi e collagenasi di tipo I. Al momento della digestione, l'omogenato è stato filtrato attraverso filtri cellulari e le cellule sono state sospese in un tampone FACS. La vitalità è stata determinata con una colorazione di vitalità fissabile e le cellule satelliti immunocolorate sono state isolate mediante FACS. Le cellule sono state lisate con Triton X-100 e i nuclei rilasciati sono stati legati a perle magnetiche di concanavalina A. I complessi nucleo/perla sono stati incubati con anticorpi contro il fattore di trascrizione o le modificazioni istoniche di interesse. Dopo i lavaggi, i complessi nucleo/microperla sono stati incubati con la proteina A-micrococcica nucleasi e la scissione della cromatina è stata iniziata con CaCl2. Dopo l'estrazione del DNA, sono state generate e sequenziate librerie e i profili per il legame del fattore di trascrizione a livello di genoma e le modifiche covalenti degli istoni sono stati ottenuti mediante analisi bioinformatica. I picchi ottenuti per i vari marcatori istonici hanno mostrato che gli eventi di legame erano specifici per le cellule satelliti. Inoltre, l'analisi dei motivi noti ha rivelato che il fattore di trascrizione era legato alla cromatina attraverso il suo elemento di risposta affine. Questo protocollo è quindi adattato per studiare la regolazione genica nelle cellule satelliti dei muscoli degli arti dei topi adulti.

Introduction

I muscoli striati scheletrici rappresentano in media il 40% del peso totale del corpo umano1. Le fibre muscolari mostrano una notevole capacità di rigenerazione in caso di lesione, che è descritta dalla fusione di miociti di nuova formazione e dalla generazione di nuove miofibre che sostituiscono quelle danneggiate2. Nel 1961, Alexander Mauro riportò una popolazione di cellule mononucleate che definì cellule satelliti3. Queste cellule staminali esprimono il fattore di trascrizione 7 (PAX7) e si trovano tra la lamina basale e il sarcolemma delle fibre muscolari4. È stato riportato che esprimono il cluster di differenziazione 34 (CD34; un marcatore ematopoietico, progenitore endoteliale e delle cellule staminali mesenchimali), l'integrina alfa 7 (ITGA7; un marcatore del muscolo liscio, cardiaco e scheletrico), nonché il recettore delle chemochine C-X-C di tipo 4 (CXCR4; un marcatore linfocitario, ematopoietico e di cellule satelliti)5. In condizioni basali, le cellule satelliti risiedono in un particolare microambiente che le mantiene in uno stato di quiescenza6. In caso di danno muscolare, si attivano, proliferano e vanno incontro a miogenesi7. Tuttavia, contribuendo solo a una frazione minore del numero totale di cellule muscolari, le loro analisi dell'intero genoma sono particolarmente impegnative, specialmente in contesti fisiologici (<1% delle cellule totali).

Sono stati descritti vari metodi per l'isolamento della cromatina dalle cellule satelliti, che coinvolgono l'immunoprecipitazione della cromatina seguita da massicci esperimenti di sequenziamento parallelo (ChIP-seq) o di scissione sotto bersagli e tagmentazione (CUT&Tag). Tuttavia, queste due tecniche presentano alcuni limiti significativi che rimangono incontestati. Infatti, ChIP-seq richiede un'elevata quantità di materiale di partenza per generare una quantità sufficiente di cromatina, gran parte della quale viene persa durante la fase di sonicazione. CUT&Tag è più appropriato per un basso numero di cellule, ma genera più siti di clivaggio fuori bersaglio rispetto a ChIP-seq a causa dell'attività della trasposasi Tn5. Inoltre, poiché questo enzima ha un'elevata affinità per le regioni a cromatina aperta, l'approccio CUT&Tag potrebbe essere utilizzato preferenzialmente per analizzare le modificazioni istoniche o i fattori di trascrizione associati a regioni del genoma attivamente trascritte, invece dell'eterocromatinasilenziata 8,9.

Di seguito viene presentato un protocollo dettagliato che consente l'isolamento delle cellule satelliti muscolari degli arti di topo mediante FACS per la scissione sotto i bersagli e il rilascio utilizzando l'analisi della nucleasi (CUT&RUN)10,11. Le varie fasi comportano l'interruzione meccanica del tessuto, l'ordinamento cellulare e l'isolamento dei nuclei. L'efficacia del metodo, per quanto riguarda la preparazione di una sospensione cellulare vitale, è stata dimostrata eseguendo l'analisi CUT&RUN per le modificazioni degli istoni covalenti e i fattori di trascrizione. La qualità delle cellule isolate rende il metodo descritto particolarmente interessante per la preparazione della cromatina che cattura fedelmente lo stato di occupazione genomica nativa ed è probabile che sia adatta per catturare la conformazione cromosomica in combinazione con il sequenziamento ad alto rendimento in loci specifici (4C-seq) o a livelli a livello di genoma (Hi-C).

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Protocol

I topi sono stati tenuti in un ricovero accreditato, in conformità con le Linee Guida Nazionali per la Cura degli Animali (direttiva 86/609/CEE della Commissione Europea; Decreto francese n. 87-848) sull'uso di animali da laboratorio a fini di ricerca. Le manipolazioni previste sono state presentate al Comitato Etico (Com'Eth, Strasburgo, Francia) e al Ministero della Ricerca Francese (MESR) per la valutazione etica e l'autorizzazione secondo la direttiva 2010/63/UE con il numero APAFIS #22281.

1. Preparazione della sospensione cellulare per l'isolamento di cellule satelliti mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) (Figura 1)

  1. Isolamento del tessuto muscolare
    1. Decontaminare gli strumenti per la dissezione muscolare, comprese pinze, bisturi e forbici, utilizzando un detergente (Tabella 1) e risciacquare abbondantemente con acqua distillata.
    2. Preparare due provette da 2 mL (Tabella 1), ciascuna contenente 1 mL di tampone per l'isolamento muscolare, e posizionarle sul ghiaccio per raccogliere i muscoli prelevati.
    3. Sacrificare due topi maschi C57/Bl6J di 10 settimane con asfissia da CO2 seguita da lussazione cervicale. Spruzzare etanolo al 70% su ogni topo intero. Staccare la pelle dall'arto posteriore usando una pinza. Sezionare tutti i muscoli degli arti che circondano il femore, la tibia e il perone (circa 1 mg di muscoli per topo).
      NOTA: Il numero di cellule satelliti diminuisce dopo 15 settimane di età.
    4. Mettere i muscoli degli arti prelevati in provette da 2 mL contenenti 1 mL di tampone di isolamento muscolare preparato al punto 1.1.2. Raccogli i muscoli del secondo topo seguendo la stessa procedura. Tritare i muscoli raccolti con le forbici su ghiaccio fino ad ottenere frammenti più piccoli di 1 mm3 .
      NOTA: I muscoli sono stati raccolti e tritati principalmente come descritto12. Eseguire la digestione dei tessuti seguendo il passaggio 1.2 o 1.3.
  2. Digestione tissutale con l'enzima collagenasi
    1. Trasferire la sospensione muscolare tritata dai due topi versandoli in una provetta da 50 mL (Tabella 1) contenente 18 mL di tampone di isolamento muscolare (integrato con 5 mL [5 U/mL] di dispasi e 5 mg di collagenasi di tipo I) (Tabella 1).
    2. Chiudere bene la provetta e sigillarla con pellicola da laboratorio (Tabella 1). Immergerlo orizzontalmente a bagnomaria agitato (Tabella 1) a 37 °C a 100 giri/min per 30 min.
    3. Dopo 30 minuti, aggiungere 5 mg di collagenasi di tipo I. Tenere le provette per altri 30 minuti sotto agitazione in un bagnomaria agitato a 37 °C a 100 giri/min.
    4. Dopo la digestione, pipettare la sospensione muscolare su e giù 10 volte con una pipetta da 10 ml per migliorare l'efficienza della dissociazione. Centrifugare a 4 °C a 400 x g per 5 min. Un pellet trasparente sarà visibile sul fondo del tubo. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta da 10 mL, lasciando 5 mL di terreno nella provetta.
      NOTA: Lasciare il terreno aiuta a evitare di stressare le cellule. Aggiungere 10 mL di tampone per l'isolamento muscolare fresco e risospendere il pellet pipettando su e giù con una pipetta da 10 mL.
    5. Posizionare i filtri cellulari da 100 μm, 70 μm e 40 μm (uno per ogni tipo) (Tabella 1) su provette aperte da 50 mL. Pipettare la sospensione sui filtri cellulari successivi (100 μm, 70 μm, 40 μm) e raccogliere il flusso nelle provette da 50 mL, contenenti cellule inferiori a 40 μm.
    6. Centrifugare la sospensione a 4 °C a 400 x g per 5 min. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta da 10 mL fino a quando rimangono 2 mL, quindi utilizzare una pipetta da 0,2-1 mL fino a quando rimangono 100-200 μL. Risospendere il pellet in 2 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (Tabella 2). Incubare su ghiaccio per 3 min.
    7. Centrifugare a 4 °C a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta da 20-200 μL. Risospendere le cellule in 100 μL di tampone FACS freddo (Tabella 2). Mettere sul ghiaccio.
  3. Metodo alternativo per la digestione dei tessuti con l'enzima Liberase thermolysin low (TL)
    1. Seguire le descrizioni nel passaggio 1.1. per l'isolamento dei tessuti.
    2. Per la disaggregazione tissutale mediata da Liberase, prelevare i muscoli in 2 mL di tampone di isolamento del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Tabella 2), invece del tampone di isolamento muscolare descritto nel passaggio 1.1.2.
    3. Trasferire la sospensione muscolare tritata dai due topi versandoli in una provetta da 50 mL (Tabella 1) contenente 18 mL di tampone di isolamento RPMI integrato con 300 o 600 μL di Liberase TL a 5 mg/mL (Tabella 1) (cioè, 0,083 mg/mL e 0,167 mg/mL concentrazioni finali, rispettivamente)13.
    4. Chiudere bene la provetta e sigillarla con pellicola da laboratorio (Tabella 1). Immergerlo orizzontalmente a bagnomaria agitato (Tabella 1) a 37 °C a 100 giri/min per 30 min.
    5. Dopo la digestione, pipettare la sospensione muscolare su e giù 10 volte con una pipetta da 10 ml per dissociare e migliorare l'efficienza della dissociazione.
    6. Centrifugare a 4 °C a 400 x g per 5 min. Un pellet trasparente sarà visibile sul fondo del tubo. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta da 10 mL, lasciando 5 mL di terreno nella provetta. Lasciare il terreno aiuta a evitare di stressare le cellule. Aggiungere 10 mL di tampone di isolamento RPMI fresco e risospendere il pellet pipettando su e giù con una pipetta da 10 mL.
    7. Posizionare i filtri cellulari da 100 μm, 70 μm e 40 μm (uno per ogni tipo) (Tabella 1) su provette aperte da 50 mL.
    8. Pipettare la sospensione su filtri cellulari successivi (100 μm, 70 μm, 40 μm) e raccogliere il flusso nelle provette da 50 mL, contenenti cellule inferiori a 40 μm.
    9. Centrifugare la sospensione a 4 °C a 400 x g per 5 min. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta da 10 mL fino a quando rimangono 2 mL, quindi utilizzare una pipetta da 0,2-1 mL fino a quando rimangono 100-200 μL.
    10. Risospendere il pellet in 2 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (Tabella 2). Incubare su ghiaccio per 3 min.
    11. Centrifugare a 4 °C a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta da 20-200 μL.
    12. Risospendere le cellule in 100 μL di tampone FACS freddo (Tabella 2). Mettere sul ghiaccio.
  4. Preparazione della sospensione cellulare per l'isolamento FACS
    1. Trasferire 10 μL della sospensione cellulare ottenuta nella fase 1.2.12 in una provetta fresca da 1,5 mL. Questo campione costituirà il controllo non colorato o il controllo negativo (Figura 2). Aggiungere 190 μL di tampone FACS, trasferire in una provetta da 5 mL (Tabella 1) e conservare su ghiaccio.
    2. Centrifugare i restanti 90 μL della sospensione cellulare ottenuta nella fase 1.2.12 a 4 °C a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante con una pipetta (volume di punta di 20-200 μL). Incubare le cellule con 400 μL di colorante di vitalità fissabile (Tabella 3) diluito in terreno Eagle modificato (DMEM) privo di siero per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
    3. Lavare le cellule mediante centrifugazione a 4 °C a 400 x g per 5 minuti e aggiungere 100 μL di tampone FACS. Capovolgere delicatamente le provette tre volte e centrifugare di nuovo a 4 °C a 400 x g per 5 min.
    4. Durante il tempo di centrifugazione, preparare 100 μL di una miscela principale di anticorpi primari accoppiati a fluorofori e diretti contro CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 e CXCR4 (Tabella 3), diluiti in tampone FACS.
    5. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante cellulare utilizzando una pipetta (volume della punta di 20-200 μL) e aggiungere la miscela di anticorpi da 100 μL. Capovolgere delicatamente il tubo tre volte. Non vorticare. Incubare al buio su ghiaccio per 30 min.
    6. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta da 20-200 μL e aggiungere 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x per lavare le cellule. Capovolgere delicatamente il tubo tre volte. Ripetere la centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante con una pipetta da 20-200 μL.
    7. Risospendere il pellet cellulare in 500 μL di tampone FACS e trasferire la sospensione in una provetta da 5 mL.
      NOTA: la sospensione cellulare ottenuta dalla digestione di Liberase viene lavorata allo stesso modo.
  5. Selezione delle cellule satelliti da parte di FACS
    1. Ruotare brevemente la sospensione cellulare (2-5 sec) ed elaborare le cellule su un citometro a flusso dotato di un ugello da 100 μm (Tabella 1).
    2. Determinare le varie dimensioni del gate in base al campione non colorato conservato al punto 1.4.1 (Figura 2).
    3. Rivestire una provetta da 5 mL con 1 mL di siero fetale puro di vitello (FCS) per migliorare la raccolta cellulare e aggiungere 500 μL di tampone FACS.
    4. Sostituire il campione non colorato con il campione marcato con anticorpi.
    5. Selezionare la popolazione di interesse in base all'area di dispersione diretta (FSC-A) e all'area di dispersione laterale (SSC-A) (Figura 3A) e rimuovere le celle doppiette con l'FSC-A e l'altezza di dispersione diretta (FSC-H) (Figura 3B)14.
    6. Identificare le cellule viventi con colorazione negativa alla vitalità fissabile (Figura 3C).
    7. Selezionare le celle negative per CD31, CD45, TER119 e CD11b (Figura 3D).
    8. Per identificare le cellule satelliti, selezionare prima le cellule positive per CD34 e ITGA7 (Figura 3E), quindi selezionare le cellule CXCR4 positive sulla popolazione selezionata per CD34 e ITGA7 (Figura 3F).
    9. Raccogliere le cellule selezionate (tra 40.000 e 80.000 cellule, a seconda della qualità del preparato) nella provetta rivestita da 5 mL contenente 500 μL di tampone FACS.

2. Validazione della popolazione isolata in coltura tissutale

  1. Rivestimento vetrino con idrogel
    1. Diluire 280 μL di una matrice qualificata con cellule staminali embrionali umane (hESC) idrogel puro (Tabella 1) in 12 mL di terreno DMEM/F12 privo di siero.
    2. Rivestire un vetrino della camera (Tabella 1) con la soluzione di idrogel e incubarlo per una notte a 4 °C.
    3. Il giorno successivo, incubare il vetrino della camera a 37 °C e 5% di CO2 per 1 ora prima della semina cellulare.
  2. Crescita e differenziamento cellulare
    1. Placcare circa 20.000 cellule, ottenute dalla fase 1.5.9, per pozzetto, e farle crescere nel terreno di coltura (Tabella 2) per 5 giorni. Acquisire immagini a contrasto di fase utilizzando un microscopio in campo chiaro (Figura 4A), prima di elaborarle per l'analisi in immunofluorescenza per garantire la qualità della preparazione (Figura 4B).
    2. Per indurre la miogenesi, far crescere cellule satelliti amplificate dal punto 2.2.1 in mezzo miogenico (Tabella 2) per altri 7 giorni. Acquisire immagini a contrasto di fase utilizzando il microscopio in campo chiaro (Figura 4C) prima di elaborarle per l'analisi in immunofluorescenza per garantire la qualità della preparazione (Figura 4D).
  3. Analisi di immunocitofluorescenza
    1. Rimuovere delicatamente il terreno, lavare le cellule che sono state coltivate sul vetrino della camera con 100 μL di PBS 1x due volte e fissarle con 100 μL di paraformaldeide al 4 % (PFA) a RT per 1 ora.
      NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con cura. Un piccolo volume di terreno deve essere sempre tenuto nella camera per evitare di stressare le cellule e il PBS deve essere versato attraverso le pareti della camera.
    2. Lavare le cellule tre volte con 100 μL di PBS 1x, integrato con lo 0,1% di Tween 20 (PBST) per permeabilizzare le membrane cellulari.
    3. Bloccare i segnali aspecifici mediante incubazione in 100 μL di 1x PBST integrato con 5% di FCS (PBST-FCS) a RT per 1 ora.
    4. Incubare le cellule con 100 μL di una miscela principale di anticorpi anti-PAX7 e anti-distrofina (DMD) (diluiti in 1x PBST-FCS) a 4 °C durante la notte, per rilevare rispettivamente le cellule satelliti e le miofibre.
    5. Lavare le cellule tre volte con 100 μL di 1x PBST e incubarle con 100 μL di anticorpi secondari di capra anti-topo Cy3 o di capra anti-coniglio Alexa 488 (Tabella 3) diluiti in 1x PBST-FCS a RT per 1 ora.
    6. Dissociare i pozzetti della camera dal vetrino utilizzando l'attrezzatura fornita dal fornitore, aggiungere 20 μL di mezzo di montaggio acquoso con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e coprire il vetrino con un vetrino coprioggetto (Tabella 1).
    7. Osservare e catturare l'immagine delle cellule colorate con un microscopio confocale.
    8. Elaborare le immagini utilizzando un software di analisi delle immagini (Figure 4B,D).

3. Analisi CUT&RUN

  1. Preparazione del campione per l'analisi CUT&RUN su celle satelliti isolate da FACS
    NOTA: CUT&RUN è stato eseguito essenzialmente come descritto10,15. La composizione del buffer è presentata in Tabella 2.
    1. Per il test CUT&RUN, utilizzare circa 40.000 cellule ottenute nel metodo 1, fase 1.5.9, per campione/anticorpo che deve essere testato.
    2. Centrifugare le cellule satelliti isolate da FACS a RT a 500 x g per 10 minuti, quindi scartare il surnatante utilizzando una pipetta (volume del puntale di 20-200 μL).
    3. Lavare le cellule con 1 mL di PBS 1x, centrifugarle a RT a 500 x g per 5 minuti, scartare il surnatante utilizzando una pipetta (volume del puntale 0,2-1 mL) e risospenderle in 1 mL di tampone per estrazione nucleare a freddo (Tabella 2). Incubare su ghiaccio per 20 min.
    4. Durante l'incubazione, preparare una provetta da 1,5 mL contenente 850 μL di tampone per legante a freddo (Tabella 2) e aggiungere 20 μL di microsfere magnetiche rivestite di concanavalina A per campione (Tabella 1).
    5. Lavare le perline due volte con 1 mL di tampone per legatura a freddo utilizzando una griglia magnetica (Tabella 1). Per ogni lavaggio o sostituzione del tampone durante la procedura, lasciare che le perle si accumulino sul lato della provetta sul rack magnetico per 5 minuti prima di rimuovere il surnatante eliminato con una pipetta (volume del puntale di 0,2-1 mL). Quindi, risospendere delicatamente in 300 μL di tampone di legame a freddo.
    6. Centrifugare i nuclei a 4 °C a 600 x g per 5 minuti e risospenderli delicatamente in 600 μL di tampone di estrazione nucleare. Miscelare delicatamente i 600 μL di nuclei estratti con i 300 μL di liquame di concanavalina A e incubare a 4 °C per 10 min.
    7. Rimuovere il surnatante utilizzando un rack magnetico, come descritto al punto 3.1.4, e risospendere delicatamente i nuclei legati alle microsfere con 1 mL di tampone bloccante a freddo (Tabella 2). Incubare a RT per 5 min.
    8. Rimuovere il surnatante utilizzando una rastrelliera magnetica e lavare due volte i nuclei legati alle microsfere con 1 mL di tampone di lavaggio a freddo (Tabella 2). Durante il secondo lavaggio, dividere equamente i nuclei legati alle microsfere in provette da 1,5 mL. Ogni provetta verrà trattata con un anticorpo specifico nella fase successiva.
      NOTA: In questo esempio, 250 μL di nuclei legati a microsfere sono stati divisi in quattro provette da 1,5 mL.
    9. Separare il surnatante utilizzando un rack magnetico, come descritto al punto 3.1.4, e aspirare con una pipetta. Risospendere delicatamente i complessi nucleo/microsfere con un anticorpo primario specifico (Tabella 3), o una IgG di un'altra specie (in questo caso coniglio) diluita in 250 μL di tampone di lavaggio a freddo. Incubare a 4 °C per una notte agitando delicatamente.
      NOTA: Gli anticorpi utilizzati in questo caso sono diretti contro AR, H3K4me2 e H3K27ac.
    10. Rimuovere il surnatante con un rack magnetico, come descritto al punto 3.1.4, lavare due volte i nuclei legati alle microsfere con 1 mL di tampone di lavaggio a freddo e risospendere in 100 μL di tampone di lavaggio a freddo.
    11. Diluire la proteina A-micrococcica nucleasi a 1,4 ng/μL in 100 μL per campione di tampone di lavaggio a freddo.
    12. Aggiungere 100 μL di proteina A-micrococcica nucleasi ai 100 μL di campione ottenuti al punto 3.1.11 e incubare a 4 °C per 1 h agitando.
    13. Rimuovere il surnatante con una rastrelliera magnetica, come descritto al punto 3.1.4, lavare due volte con 1 mL di tampone di lavaggio a freddo e risospendere i nuclei legati alle microsfere in 150 μL di tampone di lavaggio a freddo.
    14. Per avviare la scissione del DNA, aggiungere 3 μL di 100 mM di CaCl2 ai 150 μL di campione, mescolare rapidamente con un gesto e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Arrestare la reazione aggiungendo 150 μL di tampone di arresto e incubare a 37 °C per 20 minuti per digerire l'RNA e rilasciare i frammenti di DNA.
    15. Per l'estrazione del DNA, centrifugare i campioni a 16.000 x g a 4 °C per 5 minuti.
    16. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microfuge e scartare il pellet e le perline.
    17. Aggiungere 3 μL di sodio dodecil solfato (SDS) al 10% e 2,5 μL di proteinasi K. 20 mg/mL Miscelare per inversione. Incubare per 10 minuti a 70 °C (senza agitazione).
    18. Aggiungere 300 μL di alcool fenolo/cloroformio/isoamilico, vortex, trasferire in provette ad aggancio di fase da 2 mL (pre-centrifugate per 5 minuti a 16.000 x g) e centrifugare per 5 minuti a 16.000 x g a 4 °C.
    19. Aggiungere 300 μL di cloroformio nella stessa provetta e centrifugare per 5 minuti a 16.000 x g a 4 °C. Prelevare il surnatante (~300 μL) con una pipetta (volume del puntale di 0,2-1 mL) e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 mL.
    20. Aggiungere 1 μL di glicogeno (concentrazione di 20 mg/mL).
    21. Aggiungere 750 μL di etanolo al 100% e precipitare per una notte a -20 °C.
    22. Pellet il DNA mediante centrifugazione per 15 minuti a 16.000 x g a 4 °C. Lavare il pellet con 1 mL di etanolo al 100%, centrifugare per 5 minuti a 16.000 x g, scartare il surnatante, centrifugare per 30 s a 16.000 x g e rimuovere il liquido con una pipetta (volume del puntale 20-200 μL).
    23. Asciugare il pellet all'aria per ~5 min. Risospendere in 25 μL di 1 mM di Tris-HCl (pH 8) e 0,1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; pH 8).
  2. Analisi bioinformatica
    1. Preparare librerie da DNA immunoclivato e sequenziarle come letture a 100 bp con l'aiuto della piattaforma genomica come descritto16.
    2. Rimuovere le letture che si sovrappongono alla regione della blacklist ENCODE (V2) e separare le letture rimanenti in due gruppi: dimensione del frammento <120 bp (senza nucleosoma, in generale per i fattori di trascrizione) e dimensione del frammento >150 bp (con nucleosomi, normalmente per i marcatori istonici). Mappare il genoma di riferimento mm10 usando Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Genera file di grandi dimensioni con bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Conserva le letture mappate in modo univoco per ulteriori analisi.
    5. Genera file bedgraph grezzi con genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Utilizzare l'algoritmo SEACR 1.3 (opzione rigorosa) per la chiamata di picco. Caricare il file del bedgraph dei dati di destinazione in formato bedgraph UCSC che omette le regioni contenenti il segnale zero e il file del bedgraph dei dati di controllo (IgG) per generare una soglia empirica per il picco di chiamata18.
    7. Eseguire un'analisi di correlazione di Pearson con deeptools per determinare la somiglianza tra i campioni19. Utilizzare la riga di comando multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, seguito da plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualizzare i profili di intensità dell'intero genoma con IGV20 utilizzando i file bedgraph e i picchi di file bed ottenuti da SEACR.
    9. Utilizzare HOMER per l'annotazione dei picchi e la ricerca dei motivi21.
    10. Infine, confrontare i set di dati con quelli pubblicati in precedenza con il browser ChIP-Atlas Peak per visualizzarli su IGV e/o l'analisi dell'arricchimento utilizzando i file bed generati da SEACR come set di dati di input22.

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Representative Results

Le cellule satelliti dei muscoli scheletrici del topo sono state isolate combinando i protocolli di Gunther et al. (di seguito Protocollo 1)12 e di Liu et al.23 (di seguito Protocollo 2). Poiché sono state osservate fibre muscolari non digerite dopo la digestione quando si utilizzava la concentrazione di collagenasi e dispasi proposta nel Protocollo 1, la quantità di enzimi è stata aumentata per migliorare la dissociazione delle fibre muscolari, come descritto nei passaggi 1.2.1 e 1.2.3. Come indicato nel Protocollo 2, i campioni sono stati sottoposti a una leggera agitazione a bagnomaria per mantenere la vitalità cellulare. È stata eseguita la filtrazione attraverso filtri cellulari, come menzionato nel Protocollo 1, e l'incubazione con tampone di lisi dei globuli rossi (vedere i passaggi da 1.2.7 a 1.2.10). Nel Protocollo 1, le cellule sono state caricate su un gradiente di densità Percoll del 30%/70% per isolare le cellule mononucleate all'interfase, il che potrebbe aver portato alla perdita di cellule di interesse. Pertanto, questo passaggio è stato omesso, come proposto nel protocollo 2.

Il gating FSC-A rispetto a SSC-A è stato utilizzato per identificare le cellule mononucleate in base alle dimensioni (FSC) e alla granularità (SSC) (Figura 3A). I detriti sono stati esclusi ignorando gli eventi al di sotto di 40 K sull'asse FSC-A e sono stati selezionati il 38,8% ± il 3,6% delle cellule. Per l'esclusione del doppietto sono stati utilizzati i grafici di densità di gating FSC-A rispetto all'altezza di dispersione diretta (FSC-H) (Figura 3B). Dopo aver selezionato le cellule negative per il marcatore di vitalità fissabile, è stata ottenuta una media del 34,3% ± del 7,7% di cellule vive (Figura 3C).

La percentuale mostrata nel dot plot in Figura 3C, 75,4%, corrisponde alla percentuale di singole cellule viventi, calcolata dalla popolazione di cellule madri, che in questo caso sono le singole. Il 95,7% delle singole celle è ottenuto dagli eventi live che costituiscono il 35% degli eventi totali. Pertanto, la percentuale del 34,3% ottenuta in media, è calcolata dal totale degli eventi e non dalle popolazioni madri.

Circa il 3% delle singole cellule viventi è risultato negativo per i marcatori leucocitari (CD45), monocitari (CD11b), endoteliali (CD31) ed eritroidi specifici (TER119) (Figura 3D). Le cellule CD11b/CD45/CD31/TER119 negative sono state quindi selezionate in base alla loro espressione di marcatori CD34 (ematopoietici, progenitori endoteliali e cellule staminali mesenchimali) e ITGA7 (cellule muscolari cardiache, lisce e scheletriche) (Figura 3E). È stato eseguito un gating finale per CXCR4 (linfociti, ematopoietiche e cellule satelliti) per selezionare le cellule satelliti putative (Figura 3F). Dalle cellule CD34+/ITGA7+, ~80% è risultato positivo per CXCR4, che rappresenta una media dell'1% ± dello 0,15% del totale delle singole cellule viventi e un numero assoluto di 60.000 ± 14.000 cellule satelliti putative per muscoli degli arti di topo tra 14 esperimenti indipendenti. Un'ulteriore valutazione della frazione cellulare CXCR4+ ha rivelato che circa l'80% delle cellule viventi sono state ottenute dopo post-selezione, di cui quasi il 70% erano CXCR4+ (Figura S1), dimostrando l'elevata vitalità e purezza di questa popolazione cellulare isolata da FACS.

Poiché vari studi hanno confrontato l'efficienza della collagenasi e degli enzimi Liberase TL per l'isolamento cellulare24,25, questi due metodi di digestione sono stati elaborati in parallelo. Con 300 μL di Liberase TL, la digestione è stata meno efficiente rispetto alla collagenasi, poiché sono rimaste fibre non digerite. Inoltre, sono stati osservati più detriti cellulari e grandi eventi (Figure S2A,B) e solo il 17,3% delle singole cellule viventi in media è stato ottenuto dopo la selezione FVS 780 (Figura S2C). Un'ulteriore preoccupazione per la digestione di Liberase era il basso numero di cellule CD34+/ITGA7+ rispetto alla collagenasi (Figure S2D-S2E), anche se il gating CXCR4 era simile (Figura S2F). Con 600 μL di Liberase TL, la digestione è risultata più efficiente. Tuttavia, la quantità di detriti cellulari è rimasta elevata e la vitalità cellulare al di sotto dello standard (16,3%) (Figura S3). Pertanto, la digestione con Liberase TL è risultata meno efficiente per l'isolamento delle cellule satelliti.

Al momento del seeding, oltre il 70% delle cellule CD34+/ITGA7+/CXCR4+ (Figura 4A) esprimeva PAX7 (Figura 4B), contrariamente alle cellule CD34+/ITGA7-/CXCR4- che erano PAX7-negative (Figura 4C). Le cellule CD34+/ITGA7+/CXCR4+ sono state in grado di differenziarsi in miofibre quando sono cresciute in un terreno miogenico per altri 7 giorni, come mostrato dalla colorazione della distrofina (DMD) (Figura 4D), confermando il loro potenziale miogenico. Pertanto, le analisi combinate di coltura tissutale e immunofluorescenza hanno dimostrato che le cellule CD34+/ITGA7+/CXCR4+ isolate da FACS sono cellule satelliti.

Per determinare se le cellule satelliti isolate sono adatte per l'analisi CUT&RUN, è stato determinato il profilo genomico della lisina acetilata 27 (H3K27ac) e della lisina dimetilato 4 (H3K4me2) dell'istone H3, due modificazioni istoniche trovate nelle regioni attive del promotore e dell'enhancer. I nostri dati hanno scoperto 68.694 e 13.514 picchi per H3K4me2 e H3K27ac, rispettivamente, con una ripartizione genomica simile tra i due marcatori istonici (Figura S4A). In dettaglio, abbiamo scoperto che un quarto dei picchi si trovava ± 2 kb dal sito di inizio della trascrizione (TSS) del gene più vicino, la maggior parte si trovava da -100 kb a -10 kb o da 10 kb a 100 kb dal TSS (Figura S4B). Da notare che l'analisi di Pearson ha mostrato una correlazione dell'80% tra i profili di lettura H3K27ac e H3K4me2 (Figura S4C). Per valutare che la cromatina preparata dal protocollo sopra menzionato è stata isolata da cellule satelliti, è stata determinata la presenza di H3K27ac e H3K4me2 nel promotore di geni specifici per le cellule satelliti. H3K4me2 è stato arricchito intorno ai TSS di Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 e Vcam1 (Figura 5A), ma non a quelli di Itgam (CD11b) e Ptprc (CD45) (cellule immunitarie), Pecam (CD31; cellule endoteliali) (Figura 5B), Ckm (sviluppo di fibre muscolari) o Myh3 (miosina embrionale a catena pesante veloce, miofibre) (Figura 5C). Risultati simili sono stati ottenuti con H3K27ac (Figura 5). Quasi nessun segnale è stato ottenuto con il campione di IgG (Figura 5). Inoltre, il confronto dei picchi H3K27ac ottenuti da SEACR con quelli risultanti dalla chiamata di picco MACS2 da set di dati ChIP-seq pubblicati ha mostrato un'elevata correlazione, come indicato sotto ciascun pannello (traccia ChIP-Atlas; Figura 5). Insieme, questi risultati indicano che le letture ottenute dopo l'analisi bioinformatica provengono dalla cromatina di cellule satelliti isolate da FACS e sono correlate con quelle precedentemente identificate dalle analisi ChIP-seq.

Mentre gli studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula in cellule satelliti di topo hanno mostrato una sorprendente risposta allo stress, causata dalla procedura di isolamento26, la presenza di H3K4me2 o H3K27ac è stata determinata nei geni di risposta allo stress, come esemplificato con Atf3, Azin1, Gls ed Elf2. I risultati forniscono la prova che il marcatore H3K27ac non è depositato al promotore di tali geni e che i livelli di H3K4me2 rimangono bassi rispetto a quelli ottenuti per i geni specifici delle cellule satelliti (Figura S5). Pertanto, questi dati evidenziano quanto sia lieve la procedura di isolamento.

Successivamente, è stata esaminata l'idoneità del nostro metodo di isolamento per i fattori di trascrizione. L'analisi CUT&RUN per il recettore degli androgeni (AR), un fattore di trascrizione che appartiene alla superfamiglia dei recettori nucleari e che svolge un ruolo importante nel differenziamento miogenico27, ha rivelato 7.840 picchi. Questi picchi erano localizzati principalmente nelle regioni introniche e intergeniche (Figura S4A), da -100 kb a -10 kb o da 10 kb a 100 kb dal TSS (Figura S4B). Le analisi filogenetiche hanno rivelato che l'AR, insieme ai recettori dei glucocorticoidi (GR/Nr3c1), dei mineralcorticoidi (MR/Nr3c2) e del progesterone (PR/Nr3c3), è un membro della sottofamiglia28 dei recettori nucleari degli ososteroidi, che si legano come omodimeri ai segmenti di DNA che sono costituiti da due semisiti palindromi 5′-RGAACA-3′ separati da tre coppie di basi29. La ricerca di un motivo noto per mezzo dell'ottimizzazione ipergeometrica dell'arricchimento del motivo (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) ha rivelato che l'AR è legato al motivo a mezzo sito AR 5′-RGRNCA-3′, al tipico motivo ossosteroide 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ (indicato nella figura come PR) e al motivo di consenso AR 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ nel >32%, 17% e 2% delle regioni target. (Figura 6A). Va notato che proporzioni simili sono state precedentemente ottenute per il recettore dei glucocorticoidi nel muscolo scheletrico16.

L'analisi SEACR ha svelato quasi 500 picchi con un punteggio di picco >50, con più di 200 di loro con un punteggio di >100; alcuni dei quali sono esemplificati nella Figura 6B. La nostra analisi ha anche scoperto un modesto arricchimento di AR nei siti di legame precedentemente descritti dei geni coinvolti nella biosintesi delle poliammine (Amd1, Oat e Smox) e nel cancro alla prostata (Acox1, Fkbp5 e Tmprss2) (Figura S6). È interessante notare che l'AR è stato trovato nei loci dei geni coinvolti nella staminalità delle cellule satelliti (Pax7, Cxcr4 e Cd34) (Figura S7). Da notare che l'elemento di risposta dell'ossosteroide è stato trovato in ciascuna di queste regioni arricchite di AR (Figura S6 e Figura S7), dimostrando che il segnale AR visto nei dati CUT&RUN è altamente specifico.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per l'isolamento delle cellule satelliti dai muscoli degli arti di topo. Il protocollo comprende quattro fasi principali. In breve, i topi vengono sacrificati e i muscoli degli arti posteriori vengono raccolti (passaggi 1.1.1-1.1.3) e tritati meccanicamente usando le forbici (passaggi 1.4-1.5). Seguono i passaggi 1.2.1-1.2.4, durante i quali i muscoli vengono dissociati in un bagno d'acqua utilizzando collagenasi e dispasi. Nelle fasi 1.2.5-1.2.8, la sospensione cellulare viene filtrata attraverso filtri cellulari da 100, 70 e 40 μm, consecutivamente, e gli eritrociti vengono eliminati utilizzando il tampone di lisi dei globuli rossi (fasi 1.2.9-1.2.12). Le restanti popolazioni cellulari sono marcate nella fase 1.3 con anticorpi accoppiati a fluorofori, che sono diretti contro specifici marcatori fenotipici cellulari. La fase 1.4 include campioni che passano attraverso FACS per raccogliere cellule satelliti per ulteriori applicazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi con citometria a flusso di un preparato cellulare non colorato. (A) Selezione della popolazione di interesse in base ai parametri FSC-A e SSC-A. (B) Identificazione di singole cellule basata su FSC-A e FSC-H. (C) Caratterizzazione della soglia di autofluorescenza delle cellule raccolte per APC-Cy7 coniugate alla colorazione di vitalità fissabile (FVS 780) che marca le cellule morte. (D-F). Misurazione dell'autofluorescenza per PE-Cy7 coniugato all'anticorpo CD11b e PE-coniugato ai marcatori TER119/CD45/CD31 (D), nonché per Alexa fluor 488 coniugato a ITGA7, Alexa fluor 405 coniugato a CD34 (E) e APC fluorocromo coniugato a CXCR4 (F). I cancelli sono rappresentati come scatole nere. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Strategia di gating del citometro a flusso per lo smistamento delle cellule satelliti. (A) Selezione della popolazione di interesse in base ai parametri FSC-A e SSC-A. (B) Identificazione di singole cellule basata su FSC-A e FSC-H. (C) Identificazione di cellule viventi con FVS 780. (D) Selezione cellulare negativa basata sugli antigeni CD11b, CD31, CD45 e TER119. (E-F) Selezione cellulare positiva basata sugli antigeni CD34 e ITGA7 (E) e CXCR4 (F). I cancelli sono rappresentati come scatole nere. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Analisi di cellule CD34+/ITGA7+/CXCR4+ e CD34+/ITGA7-/CXCR4- isolate da FACS. (A) Immagini a contrasto di fase di cellule CD34+/ITGA7+/CXCR4+ e CD34+/ITGA7-/CXCR4- coltivate in terreno di crescita. (B) Analisi in immunofluorescenza di cellule CD34+/ITGA7+/CXCR4+ e CD34+/ITGA7-/CXCR4- coltivate in terreno di crescita utilizzando anticorpi diretti contro PAX7 (rosso) e distrofina (DMD, verde). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Le frecce magenta indicano le cellule PAX7-positive. (C) Immagini a contrasto di fase di cellule CD34+/ITGA7+/CXCR4+ cresciute per 5 giorni in terreno di crescita (pannello di sinistra) e per 7 giorni aggiuntivi in terreno miogenico (pannello di destra). (D) Immagini di analisi di immunofluorescenza di cellule CD34+/ITGA7+/CXCR4+ cresciute per 5 giorni in terreno di crescita (pannello di sinistra) e per 7 giorni aggiuntivi in terreno miogenico (pannello di destra) utilizzando anticorpi diretti contro PAX7 (rosso) e distrofina (DMD, verde). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Le frecce magenta indicano le cellule PAX7-positive. Le frecce verdi indicano le cellule DMD-positive. Barre di scala: pannelli in campo chiaro = 25 μm; Pannelli di immunofluorescenza = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Profili genomici della cromatina delle cellule satelliti. Localizzazione di H3K4me2 e H3K27ac in corrispondenza di geni specifici per cellule satelliti (A), geni specifici per cellule immunitarie ed endoteliali (B) e geni specifici per miofibra (C) sulla cromatina di cellule satelliti mediante CUT&RUN. I promotori attivi sono inquadrati in verde, mentre i promotori inattivi sono inquadrati in marrone. CUT&RUN eseguito con IgG è stato utilizzato come controllo negativo. L'analisi dell'arricchimento H3K27ac per i marcatori istonici è presentata sotto ogni traccia. Il punteggio di arricchimento che mostra i livelli di confidenza dei set di dati pubblicati è rappresentato come una mappa termica. Le stelle marroni (*) si riferiscono ai picchi ChIP-seq di H3K27ac eseguiti nelle cellule satelliti muscolari, le stelle blu a H3K4me3 e quelle rosa a H4K16me1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Distribuzione genomica AR sulla cromatina delle cellule satelliti. (A) Analisi dei picchi AR nelle cellule satelliti. PR: recettore del progesterone. L'obiettivo Nb si riferisce al numero di picchi che presentano un particolare motivo. (B) Localizzazione di H3K4me2 e AR in corrispondenza di geni indicati sulla cromatina di cellule satelliti determinata mediante CUT&RUN. CUT&RUN eseguito con IgG è stato utilizzato come controllo negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco di materiali, reagenti e software. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Composizioni tampone. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Riferimenti e concentrazioni degli anticorpi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare 1: Analisi citofluorimetrica della preparazione cellulare post-smistamento. (A) Selezione della popolazione di interesse in base ai parametri FSC-A e SSC-A. (B) Identificazione di singole cellule basata su FSC-A e FSC-H. (C) Identificazione di cellule viventi con colorazione di vitalità fissabile (FVS 780). (D) Selezione cellulare negativa basata sugli antigeni CD11b, CD31, CD45 e TER119. (E-F) Selezione cellulare positiva basata sugli antigeni CD34 e ITGA7 (E) e CXCR4 (F). I cancelli sono rappresentati come scatole nere. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 2 supplementare: Strategia di gating del citometro a flusso per lo smistamento delle cellule satelliti dopo digestione con 300 μL di Liberase TL. (A) Selezione della popolazione di interesse in base ai parametri FSC-A e SSC-A. (B) Identificazione di singole cellule basata su FSC-A e FSC-H. (C) Identificazione di cellule viventi con FVS 780. (D) Selezione cellulare negativa basata sugli antigeni CD11b, CD31, CD45 e TER119. (E-F) Selezione cellulare positiva basata sugli antigeni CD34 e ITGA7 (E) e CXCR4 (F). I cancelli sono rappresentati come scatole nere. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 3 supplementare: Strategia di gating del citometro a flusso per lo smistamento delle cellule satelliti dopo la digestione con 600 μL di Liberase TL. (A) Selezione della popolazione di interesse in base ai parametri FSC-A e SSC-A. (B) Identificazione di singole cellule basata su FSC-A e FSC-H. (C) Identificazione di cellule viventi con FVS 780. (D) Selezione cellulare negativa basata sugli antigeni CD11b, CD31, CD45 e TER119. (E-F) Selezione cellulare positiva basata sugli antigeni CD34 e ITGA7 (E) e CXCR4 (F). I cancelli sono rappresentati come scatole nere. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 4 supplementare: Caratterizzazione delle posizioni genomiche di H3K4me2, H3K27ac e AR. (A) Grafici a torta che illustrano la distribuzione dei picchi di H3K4me2, H3K27ac e AR in base alle caratteristiche del genoma nelle cellule satelliti. (B) Grafici a torta che raffigurano la distribuzione dei picchi di H3K4me2, H3K27ac e AR in base alla loro distanza dal TSS più vicino nelle celle satelliti. (C) Heatmap che mostra la correlazione di Pearson tra H3K4me2, H3K27ac e controllo IgG. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 5 supplementare: Profili genomici della cromatina delle cellule satelliti nei geni indotti dalla risposta allo stress. Localizzazione di H3K4me2 e H3K27ac nei geni indicati sulla cromatina delle cellule satelliti. L'immunoprecipitazione con IgG è stata utilizzata come controllo negativo. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 6 supplementare: Profili genomici della cromatina delle cellule satelliti in corrispondenza di geni bersaglio AR noti. Localizzazione di H3K4me2, H3K27ac e AR in corrispondenza dei geni indicati sulla cromatina delle cellule satelliti determinata mediante CUT&RUN. I picchi AR sono riquadrati in blu e gli elementi AR-responsive corrispondenti sono presentati di seguito. CUT&RUN eseguito con IgG è stato utilizzato come controllo negativo. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 7 supplementare: Profili genomici della cromatina delle cellule satelliti nei loro geni selettivamente espressi. Localizzazione di H3K4me2, H3K27ac e AR in corrispondenza dei geni indicati sulla cromatina delle cellule satelliti determinata mediante CUT&RUN. I picchi AR sono riquadrati in blu e gli elementi AR-responsive corrispondenti sono presentati di seguito. CUT&RUN eseguito con IgG è stato utilizzato come controllo negativo. Fare clic qui per scaricare il file.

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Discussion

Il presente studio riporta un metodo standardizzato, affidabile e di facile esecuzione per l'isolamento e la coltura di cellule satelliti di topo, nonché la valutazione della regolazione trascrizionale mediante il metodo CUT&RUN.

Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la disgregazione muscolare e la digestione delle fibre per garantire un elevato numero di cellule raccolte. Nonostante l'aumento della concentrazione enzimatica, sono state ottenute più cellule viventi rispetto all'utilizzo del Protocollo 1. Le cellule satelliti esprimono un modello specifico di varie proteine di membrana. Per aumentare il rigore del nostro ordinamento, abbiamo utilizzato una combinazione di marcatori cellulari satelliti negativi (CD31, TER119, CD45 e CD11b) e positivi (CD34, ITGA7 e CXCR4)precedentemente descritti. Utilizzando questa strategia, è stata ottenuta una media dell'1% di cellule satelliti putative viventi. Questo risultato è nell'intervallo di quanto ci si aspettava, dal momento che le cellule satelliti rappresentano il 2%-7% della popolazione di cellule muscolari in età adulta nei topi32. Come controllo per i marcatori di selezione delle cellule satelliti, sono state isolate le cellule CD34+/ITGA7-/CXCR4-. La colorazione con immunofluorescenza ha dimostrato che, mentre le cellule CD34+/ITGA7-/CXCR4- non esprimevano PAX7, il 70% delle cellule ordinate CD34+/ITGA7+/CXCR4+ erano positive per questo marcatore cellulo-specifico satellite, dimostrando così che la popolazione isolata di FACS corrisponde alle cellule satelliti. Inoltre, il 70% delle cellule satelliti cresciute in mezzo miogenico per 7 giorni erano PAX7-/DMD+, come dimostrato dall'immunocolorazione, e formavano una miofibra multinucleata allungata, dimostrando che le cellule satelliti isolate conservavano il loro potenziale di staminalità.

La principale limitazione nella preparazione dei campioni potrebbe essere l'uso di un'alta concentrazione di enzimi, che si traduce in una grande quantità di materiale biologico dissociato, ma può contribuire ad aumentare la morte cellulare. Per risolvere questo problema, è stato testato un test che richiedeva una quantità di enzima inferiore. In questo contesto, è stato testato Liberase TL, una forma purificata della tradizionale collagenasi33. Sebbene la digestione fosse apparentemente più efficiente con questo enzima, la quantità di detriti cellulari è rimasta elevata e la vitalità cellulare è stata leggermente ridotta. Queste osservazioni sono in accordo con i rapporti precedenti che hanno confrontato la digestione tissutale mediata da Liberase con questa con la collagenasi ricombinante o la collagenasi personalizzata24,25. Inoltre, anche se la proporzione di cellule endoteliali e immunitarie era simile tra la collagenasi e la digestione di Liberase, la percentuale di cellule satelliti era inferiore nel campione trattato con Liberase, dimostrando nel complesso che Liberase non è raccomandato per l'isolamento delle cellule satelliti. L'uso di questo enzima è adatto per l'analisi fenotipica e quantitativa delle cellule immunitarie e potrebbe eventualmente essere raccomandato nel contesto del muscolo e/o di altri tessuti. Ciò è in accordo con quanto riportato su Liberase TL come il più adatto per isolare efficacemente le cellule immunitarie vitali34,35,36.

Un altro potenziale problema è lo stress causato sia dalla dissociazione che dallo smistamento delle cellule satelliti. Tuttavia, l'assenza di H3K27ac e i bassi livelli di H3K4me2 nella regione del promotore dei geni di risposta allo stress identificati dal sequenziamento dell'RNA a singola cellula nelle cellule satelliti di topo26 mostrano che la procedura è abbastanza lieve da non indurre il repertorio trascrizionale di risposta allo stress. Altre limitazioni da notare sono gli antigeni selezionati che rimangono empirici. Tuttavia, gli studi mostrano un'elevata sovrapposizione tra combinazioni uniche di marcatori di superficie che sono arricchite per le cellule satelliti del muscolo scheletrico30,31.

Un ulteriore passaggio critico è la purificazione dei nuclei dalle cellule selezionate. Per questo, la velocità di smistamento viene mantenuta bassa per non danneggiare le cellule, ma abbastanza veloce da non conservarle troppo a lungo nel tampone FACS. Infatti, i nuclei CUT&RUN non sono fissi, e un tempo di incubazione più lungo potrebbe influenzare la lettura ottenuta dal protocollo. Una preparazione tipica dei due arti posteriori di un topo consente il CUT&RUN con un anticorpo e un controllo IgG, con una quantità di 2,5 ng di cromatina per ciascuno.

Gli esperimenti CUT&RUN, progettati per valutare il legame del fattore di trascrizione e le modificazioni epigenetiche, hanno fornito segnali di lettura forti e robusti per H3K4me2 e H3K27ac. Gli alti livelli di lettura di H3K4me2 e H3K27ac sui geni che sono noti per essere espressi nelle cellule satelliti, rispetto ai geni espressi nelle cellule immunitarie o endoteliali e nelle miofibre, hanno mostrato che il segnale è stato amplificato prevalentemente dai nuclei delle cellule satelliti. Inoltre, questo protocollo ha reso possibile l'identificazione del cistroma dell'AR nelle cellule staminali muscolari, che ad oggi rimane un problema tecnico inerente alla scarsa qualità degli anticorpi AR di topo e ai bassi livelli di espressione AR nelle cellule che non sono altamente sensibili agli androgeni, come le cellule epiteliali della prostata. I dati qui presentati hanno svelato le regioni associate all'AR con punteggi di picco di confidenza elevati. Poiché è stata originariamente valutata una sola replica per anticorpo, la robustezza dei nostri set di dati sarà migliorata aggiungendo almeno due repliche biologiche aggiuntive per condizione. Tuttavia, i geni bersaglio noti dell'AR e i rispettivi marcatori istonici, originariamente descritti come altamente espressi e/o facilmente rilevabili in altri contesti tissutali come la prostata, presentano livelli di espressione più bassi e sono molto difficili da rilevare nelle cellule satelliti.

Un limite dell'approccio CUT&RUN è che viene eseguito in celle non fisse. Pertanto, potremmo aver perso alcuni bersagli AR a causa della natura labile delle interazioni tra i fattori di trascrizione e il loro sito di legame. Allo stesso modo, anche alcune modificazioni post-traduzionali, come l'acetilazione, possono essere piuttosto labili. Pertanto, l'inclusione di una fase di fissazione leggera con formaldeide o paraformaldeide, dopo l'ordinamento FACS e prima di isolare i nuclei, potrebbe essere presa in considerazione per stabilizzare le interazioni proteina/DNA e le modificazioni istoniche.

Sebbene questo documento dimostri che i saggi CUT&RUN possono essere condotti su cellule satelliti isolate da FACS, potrebbero essere eseguite anche altre analisi che utilizzano cromatina non fissa come ATAC-seq. Inoltre, anche se qui i muscoli sono stati prelevati in condizioni fisiologiche basali, questo protocollo può essere applicato a contesti patologici come lesioni o invecchiamento. Tutti questi usi del protocollo consentiranno una comprensione dettagliata dei meccanismi di regolazione genica nelle cellule satelliti e potrebbero aiutare a capire come questi meccanismi potrebbero essere alterati da condizioni fisiopatologiche.

In sintesi, questo protocollo a basso costo ed efficiente in termini di tempo fornisce un ambiente sperimentale efficace per studiare il reclutamento del fattore di trascrizione e il paesaggio della cromatina nelle cellule precursori del muscolo scheletrico. La cromatina preparata da questo protocollo ha fornito la prima analisi dell'intero genoma della cistroma AR nelle cellule satelliti e faciliterà i futuri studi sulla regolazione genica.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo Anastasia Bannwarth per l'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo la struttura IGBMC, la coltura cellulare, l'Istituto clinico del topo (ICS, Illkirch, Francia), l'imaging, la microscopia elettronica, la citometria a flusso e la piattaforma GenomEast, membro del consorzio "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).

Questo lavoro dell'Istituto Tematico Interdisciplinare IMCBio, nell'ambito del programma ITI 2021-2028 dell'Università di Strasburgo, del CNRS e dell'Inserm, è stato sostenuto da IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) e dal progetto SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) e EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) nell'ambito del programma francese Investments for the Future. Ulteriori finanziamenti sono stati erogati dall'INSERM, dal CNRS, dall'Unistra, dall'IGBMC, dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), dal programma strategico AFM-Téléthon 24376 (a D.D.), INSERM young researcher grant (to D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, e da un fondo statale francese gestito dall'ANR nell'ambito del programma quadro Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. è stato sostenuto dal Programma CDFA-07-22 dell'Université franco-allemande e Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, e K.G. dall'Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

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References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

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Analisi CUT&RUN cellule satelliti di topo isolate da FACS campo di cellule staminali popolazioni di piccole cellule protocollo efficiente smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza muscolo degli arti proteine strutturali tritura mezzo dispase collagenasi di tipo I filtri cellulari tampone FACS colorazione di vitalità cellule satelliti immunocolorate Triton X-100 perline magnetiche di concanavalina A fattore di trascrizione modifiche istoniche nucleasi micrococcica della proteina A scissione della cromatina CaCl2 estrazione del DNA Biblioteche Analisi Bioinformatica
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Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

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