Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Эффективный протокол для анализа CUT&RUN изолированных FACS-клеток мыши-сателлитов

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Представлен эффективный протокол выделения клеток-сателлитов мышечных конечностей мышечных конечностей мыши, активируемой флуоресценцией (FACS), адаптированный для изучения регуляции транскрипции в мышечных волокнах путем расщепления под мишенями и высвобождения с помощью нуклеазы (CUT&RUN).

Abstract

Полногеномный анализ малых клеточных популяций является основным препятствием для исследований, особенно в области стволовых клеток. В данной работе описан эффективный протокол выделения клеток-сателлитов из мышцы конечности, ткани с высоким содержанием структурных белков методом флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Рассеченные мышцы конечностей взрослых мышей механически разрушались путем измельчения в среде, дополненной диспазой и коллагеназой I типа. После разложения гомогенат фильтровали через клеточные ситечки, а клетки суспендировали в буфере FACS. Жизнеспособность определяли с помощью фиксируемого окрашивания жизнеспособности, а иммуноокрашенные сателлитные клетки выделяли методом FACS. Клетки лизировали с помощью Triton X-100 и высвободившиеся ядра связывали с магнитными шариками конканавалина А. Комплексы ядро/шарики инкубировали с антителами против интересующего транскрипционного фактора или модификаций гистонов. После промывок комплексы ядро/шарик инкубировали с нуклеазой белка А-микрококковой нуклеазой, а расщепление хроматина инициировали с помощью CaCl2. После экстракции ДНК были созданы и секвенированы библиотеки, а также получены профили связывания полногеномных транскрипционных факторов и ковалентных модификаций гистонов с помощью биоинформатического анализа. Пики, полученные для различных меток гистонов, показали, что события связывания были специфичны для клеток-сателлитов. Более того, анализ известных мотивов показал, что транскрипционный фактор связан с хроматином через родственный ему элемент ответа. Таким образом, этот протокол адаптирован для изучения регуляции генов в клетках-сателлитах мышц конечностей взрослых мышей.

Introduction

Поперечнополосатые мышцы скелета составляют в среднем 40% веса всего тела человека1. Мышечные волокна проявляют замечательную способность к регенерации после травмы, которая описывается слиянием новообразованных миоцитов и генерацией новых миоволокон, заменяющихповрежденные. В 1961 году Александр Мауро сообщил о популяции мононуклеарных клеток, которые он назвал сателлитнымиклетками. Эти стволовые клетки экспрессируют парный блок транскрипционного фактора 7 (PAX7) и расположены между базальной пластинкой и сарколеммой мышечных волокон4. Сообщалось, что они экспрессируют кластер дифференцировки 34 (CD34; гемопоэтический, эндотелиальный предшественник и маркер мезенхимальных стволовых клеток), интегрин альфа 7 (ITGA7; маркер гладкой сердечной и скелетной мускулатуры), а также хемокиновый рецептор C-X-C типа 4 (CXCR4; маркер лимфоцитов, гемопоэтических и сателлитных клеток)5. В базальных условиях клетки-сателлиты находятся в особом микроокружении, которое удерживает их в состоянии покоя6. При повреждении мышц они активизируются, размножаются и подвергаются миогенезу7. Тем не менее, поскольку они составляют лишь незначительную часть от общего числа мышечных клеток, их полногеномный анализ является особенно сложным, особенно в физиологических условиях (<1% от общего количества клеток).

Описаны различные методы выделения хроматина из клеток-сателлитов, которые включают иммунопреципитацию хроматина с последующим массивным параллельным секвенированием (ChIP-seq) или расщеплением по мишеням и мечением (CUT&Tag). Тем не менее, эти два метода имеют некоторые существенные ограничения, которые остаются неоспоримыми. Действительно, ChIP-seq требует большого количества исходного материала для получения достаточного количества хроматина, большая часть которого теряется на этапе ультразвуковой обработки. CUT&Tag больше подходит для малого числа клеток, но генерирует больше нецелевых сайтов расщепления, чем ChIP-seq, из-за активности транспозазы Tn5. Кроме того, поскольку этот фермент обладает высоким сродством к открытым областям хроматина, подход CUT&Tag может быть предпочтительно использован для анализа модификаций гистонов или транскрипционных факторов, связанных с активно транскрибируемыми областями генома, а не с заглушенным гетерохроматином 8,9.

Здесь представлен подробный протокол, который позволяет изолировать сателлитные клетки мышц конечностей мышей с помощью FACS для расщепления под мишенями и высвобождения с помощью анализа нуклеаз (CUT&RUN)10,11. Различные этапы включают в себя механическое разрушение тканей, сортировку клеток и изоляцию ядер. Эффективность метода в отношении получения жизнеспособной клеточной суспензии была продемонстрирована путем проведения CUT&RUN анализа ковалентных модификаций гистонов и транскрипционных факторов. Качество изолированных клеток делает описанный метод особенно привлекательным для получения хроматина, который точно фиксирует нативное состояние занятости генома и, вероятно, будет пригоден для захвата конформации хромосом в сочетании с высокопроизводительным секвенированием в определенных локусах (4C-seq) или на уровне всего генома (Hi-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Мыши содержались в аккредитованном животноводческом помещении в соответствии с Национальными рекомендациями по уходу за животными (директива Европейской комиссии 86/609/CEE; Французский декрет No 87-848) об использовании лабораторных животных для исследований. Предполагаемые манипуляции были представлены в Этический комитет (Com'Eth, Страсбург, Франция) и в Министерство исследований Франции (MESR) для этической оценки и авторизации в соответствии с директивой 2010/63/EU под номером APAFIS #22281.

1. Приготовление клеточной суспензии для выделения клеток-сателлитов методом флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) (рис. 1)

  1. Выделение мышечной ткани
    1. Обеззаразить инструменты для рассечения мышц, включая щипцы, скальпели и ножницы, с помощью чистящего средства (табл. 1) и тщательно промыть дистиллированной водой.
    2. Подготовьте две пробирки по 2 мл (табл. 1), каждая из которых содержит 1 мл буфера для изоляции мышц, и поместите их на лед для сбора собранных мышц.
    3. В жертву приносили в жертву двух 10-недельных самцов мышей C57/Bl6J из-за асфиксии CO2 с последующим вывихом шейки матки. Распылите 70% этанола на каждую мышь целиком. Снимите кожу с задней конечности с помощью щипцов. Рассеките все мышцы конечностей, окружающие бедренную, большеберцовую и малоберцовую кости (примерно 1 мг мышц на мышь).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток-сателлитов уменьшается после 15-недельного возраста.
    4. Собранные мышцы конечностей помещают в пробирки объемом 2 мл, содержащие 1 мл мышечного изоляционного буфера, приготовленного на этапе 1.1.2. Соберите мышцы второй мыши, выполнив ту же процедуру. Измельченные мышцы измельчите ножницами на льду до получения3 фрагментов размером менее 1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы собирали и измельчали в основном так, как описано12. Выполните рассасывание тканей, следуя шагу 1.2 или 1.3.
  2. Расщепление тканей ферментом коллагеназой
    1. Перенесите измельченную мышечную суспензию от двух мышей, поместив их в пробирку объемом 50 мл (Таблица 1), содержащую 18 мл буфера для изоляции мышц (с добавлением 5 мл [5 Ед/мл] диспазы и 5 мг коллагеназы I типа) (Таблица 1).
    2. Плотно закройте пробирку и заклейте ее лабораторной пленкой (табл. 1). Поместите его горизонтально на водяную баню для встряхивания (таблица 1) при температуре 37 °C при 100 об/мин на 30 минут.
    3. Через 30 мин добавить 5 мг коллагеназы I типа. Пробирки выдерживают еще 30 мин при перемешивании на водяной бане при температуре 37 °C при 100 об/мин.
    4. После переваривания пипеткой 10 раз вверх и вниз пипеткой объемом 10 мл проведите мышечную суспензию вверх и вниз, чтобы повысить эффективность диссоциации. Центрифуга при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин. На дне тюбика будет видна прозрачная гранула. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл, оставив в пробирке 5 мл среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выход из среды помогает избежать стресса клеток. Добавьте 10 мл свежего буфера для изоляции мышц и повторно суспендируйте гранулу, пипетируя вверх и вниз пипеткой объемом 10 мл.
    5. Поместите сетчатые фильтры 100 мкм, 70 мкм и 40 мкм (по одному каждого типа) (таблица 1) на открытые пробирки объемом 50 мл. Пипеткой распределите суспензию на последовательные сетчатые фильтры (100 мкм, 70 мкм, 40 мкм) и соберите проточную суспензию в пробирки объемом 50 мл, содержащие клетки размером менее 40 мкм.
    6. Центрифугируют суспензию при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл до тех пор, пока не останется 2 мл, а затем используйте пипетку объемом 0,2–1 мл, пока не останется 100–200 мкл. Ресуспендируйте гранулу в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (табл. 2). Инкубировать на льду 3 мин.
    7. Центрифугу при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки 20-200 мкл. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл холодного буфера FACS (табл. 2). Выложите на лед.
  3. Альтернативный метод расщепления тканей с помощью фермента Liberase thermolysin low (TL)
    1. Следуйте описаниям в шаге 1.1. для изоляции тканей.
    2. Для дезагрегации тканей, опосредованной либеразами, соберите мышцы в 2 мл изоляционного буфера Мемориального института Розуэлл-Парка (RPMI) (Таблица 2) вместо буфера для изоляции мышц, описанного в шаге 1.1.2.
    3. Перенесите измельченную мышечную суспензию от двух мышей, поместив их в пробирку объемом 50 мл (таблица 1), содержащую 18 мл изоляционного буфера RPMI, дополненного 300 или 600 мкл либеразы TL в концентрации 5 мг/мл (таблица 1) (т. е. конечные концентрации 0,083 мг/мл и 0,167 мг/мл соответственно)13.
    4. Плотно закройте пробирку и заклейте ее лабораторной пленкой (табл. 1). Поместите его горизонтально на водяную баню для встряхивания (таблица 1) при температуре 37 °C при 100 об/мин на 30 минут.
    5. После переваривания пипеткой 10 мл раздвиньте мышечную суспензию вверх и вниз 10 раз, чтобы диссоциировать и повысить эффективность диссоциации.
    6. Центрифуга при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин. На дне тюбика будет видна прозрачная гранула. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл, оставив в пробирке 5 мл среды. Выход из среды помогает избежать стресса для клеток. Добавьте 10 мл свежего изоляционного буфера RPMI и повторно суспендируйте гранулы, пипетируя вверх и вниз пипеткой объемом 10 мл.
    7. Поместите сетчатые фильтры 100 мкм, 70 мкм и 40 мкм (по одному каждого типа) (таблица 1) на открытые пробирки объемом 50 мл.
    8. Пипетку суспензии распределите по последовательным сетчатым фильтрам (100 мкм, 70 мкм, 40 мкм) и соберите пробирку объемом 50 мл, содержащую клетки размером менее 40 мкм.
    9. Центрифугируют суспензию при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл до тех пор, пока не останется 2 мл, а затем используйте пипетку объемом 0,2–1 мл, пока не останется 100–200 мкл.
    10. Ресуспендируйте гранулу в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (табл. 2). Инкубировать на льду 3 мин.
    11. Центрифугу при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки 20-200 мкл.
    12. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл холодного буфера FACS (табл. 2). Выложите на лед.
  4. Приготовление клеточной суспензии для выделения FACS
    1. Переносят 10 мкл клеточной суспензии, полученной на этапе 1.2.12, в свежую пробирку объемом 1,5 мл. Этот образец будет представлять собой неокрашенный контроль или отрицательный контроль (рис. 2). Добавьте 190 мкл буфера FACS, перелейте в пробирку объемом 5 мл (таблица 1) и храните на льду.
    2. Центрифугируют оставшиеся 90 мкл клеточной суспензии, полученной на стадии 1.2.12, при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин и отбраковывают надосадочную жидкость с помощью пипетки (объем наконечника 20-200 мкл). Инкубируют клетки с 400 мкл фиксируемого красителя жизнеспособности (Таблица 3), разбавленного в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco, не содержащей сыворотки, в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
    3. Промыть клетки центрифугированием при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин и добавить 100 мкл буфера FACS. Осторожно переверните пробирки три раза и снова центрифугируйте при 4 °C при 400 x g в течение 5 минут.
    4. В течение времени центрифугирования готовят 100 мкл маточной смеси первичных антител, связанных с флуорофорами и направленных против CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 и CXCR4 (табл. 3), разбавленных в буфере FACS.
    5. Центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C, удалить надосадочную жидкость с помощью пипетки (объем наконечника 20-200 мкл) и добавить смесь антител объемом 100 мкл. Аккуратно переверните трубку три раза. Не вихритесь. Выдерживают в темноте на льду 30 мин.
    6. Центрифуга при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 20–200 мкл и добавьте 500 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) для промывания клеток. Аккуратно переверните трубку три раза. Повторно центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки 20–200 мкл.
    7. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл буфера FACS и перенесите суспензию в пробирку объемом 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: клеточная суспензия, полученная в результате пищеварения либеразы, обрабатывается таким же образом.
  5. Выбор сателлитных ячеек по FACS
    1. Кратковременно вихрят клеточную суспензию (2-5 сек) и обработают клетки на проточном цитометре, оснащенном соплом 100 мкм (табл. 1).
    2. Определите различные размеры затворов на основе неокрашенного образца, хранящегося на шаге 1.4.1 (рисунок 2).
    3. Покройте пробирку объемом 5 мл 1 мл чистой фетальной телячьей сыворотки (FCS) для улучшения сбора клеток и добавьте 500 мкл буфера FACS.
    4. Замените неокрашенный образец на образец, меченный антителами.
    5. Выберите интересующую совокупность в соответствии с областью прямого рассеяния (FSC-A) и областью бокового рассеяния (SSC-A) (рис. 3A) и удалите ячейки-дублеты с помощью FSC-A и высоты прямого рассеяния (FSC-H) (рис. 3B)14.
    6. Идентификация живых клеток с фиксируемой жизнеспособностью окрашиванием отрицательным окрашиванием (рис. 3C).
    7. Выберите отрицательные клетки для CD31, CD45, TER119 и CD11b (рис. 3D).
    8. Чтобы идентифицировать клетки-сателлиты, сначала выберите клетки, положительные на CD34 и ITGA7 (рисунок 3E), а затем выберите CXCR4-положительные клетки в популяции, отобранной CD34 и ITGA7 (рисунок 3F).
    9. Соберите отобранные клетки (от 40 000 до 80 000 клеток, в зависимости от качества препарата) в пробирку объемом 5 мл, содержащую 500 мкл буфера FACS.

2. Валидация изолированной популяции в культуре тканей

  1. Покрытие предметного стекла гидрогелем
    1. Развести 280 мкл матрицы, сертифицированной на основе эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) (Таблица 1), в 12 мл среды DMEM/F12, не содержащей сыворотки.
    2. Камеру слайда (табл. 1) обмазывают раствором гидрогеля и инкубируют в течение ночи при 4 °С.
    3. На следующий день инкубируют предметное стекло камеры при температуре 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч перед посевом клеток.
  2. Рост и дифференцировка клеток
    1. Выделите примерно 20 000 клеток, полученных на этапе 1.5.9, на лунку и выращивайте их в питательной среде (таблица 2) в течение 5 дней. Сделайте фазово-контрастные изображения с помощью светлопольного микроскопа (рис. 4А), прежде чем обрабатывать их для иммунофлуоресцентного анализа, чтобы убедиться в качестве препарата (рис. 4Б).
    2. Для индуцирования миогенеза выращивают амплифицированные клетки-сателлиты из стадии 2.2.1 в миогенной среде (табл. 2) в течение дополнительных 7 дней. Сделайте фазово-контрастные изображения с помощью светлопольного микроскопа (рис. 4C) перед обработкой их для иммунофлуоресцентного анализа, чтобы убедиться в качестве препарата (рис. 4D).
  3. Иммуноцитофлуоресцентный анализ
    1. Осторожно удаляют среду, промывают клетки, культивируемые на предметном стекле камеры, 100 мкл 1x PBS дважды и фиксируют их 100 мкл 4 % параформальдегида (PFA) при RT в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует выполнять с осторожностью. В камере всегда следует держать небольшой объем среды, чтобы не допустить напряжения клеток, а ПБС следует заливать через стенки камеры.
    2. Промойте клетки три раза 100 мкл 1x PBS с добавлением 0,1% Tween 20 (PBST) для пермеабилизации клеточных мембран.
    3. Блокирование неспецифических сигналов путем инкубации в 100 мкл 1x PBST с добавлением 5% FCS (PBST-FCS) при RT в течение 1 ч.
    4. Инкубируют клетки со 100 мкл мастер-смеси антител к PAX7 и антидистрофину (DMD) (разбавленных в 1x PBST-FCS) при 4 °C в течение ночи, чтобы обнаружить клетки-сателлиты и миоволокна соответственно.
    5. Клетки трижды промывают 100 мкл 1x PBST и инкубируют их со 100 мкл вторичных антител Alexa 488 козьего антимышиного препарата Cy3 или козьего антикроличьего Alexa 488 (таблица 3), разбавленных в 1x PBST-FCS при RT в течение 1 ч.
    6. С помощью оборудования, предоставленного поставщиком, отсоединить лунки камеры от предметного стекла, добавить 20 мкл водной монтажной среды с 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и покрыть предметное стекло покровным стеклом (табл. 1).
    7. Наблюдайте и фиксируйте изображение окрашенных клеток с помощью конфокального микроскопа.
    8. Обработайте изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений (рис. 4B, D).

3. Анализ CUT&RUN

  1. Подготовка образцов для анализа методом CUT&RUN на FACS-изолированных сателлитных ячейках
    Примечание: CUT&RUN выполнялся в основном так, как описано10,15. Состав буфера представлен в виде Таблица 2.
    1. Для анализа CUT&RUN используйте примерно 40 000 клеток, полученных в методе 1, шаг 1.5.9, на образец/антитело, которое необходимо протестировать.
    2. Центрифугируют изолированные FACS-сателлиты при RT при 500 x g в течение 10 мин, затем отбраковывают надосадочную жидкость с помощью пипетки (объем наконечника 20-200 мкл).
    3. Промывают клетки 1 мл 1x PBS, центрифугируют при RT при 500 x g в течение 5 мин, выбрасывают надосадочную жидкость с помощью пипетки (объем наконечника 0,2-1 мл) и ресуспендируют в 1 мл буфера для холодной ядерной экстракции (таблица 2). Инкубировать на льду 20 мин.
    4. Во время инкубации приготовьте одну пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 850 мкл буфера для холодного связывания (Таблица 2), и добавьте 20 мкл магнитных шариков, покрытых конканавалином А, на образец (Таблица 1).
    5. Дважды промыть шарики 1 мл буфера для холодного переплета с помощью магнитной стойки (табл. 1). При каждой промывке или замене буфера на протяжении всей процедуры дайте шарикам скопиться на боковой стороне пробирки на магнитной стойке в течение 5 минут, прежде чем удалить очищенную надосадочную жидкость пипеткой (объем наконечника 0,2-1 мл). Затем осторожно ресуспендируйте в 300 мкл буфера холодного связывания.
    6. Центрифугируют ядра при 4 °C при 600 x g в течение 5 мин и осторожно ресуспендируют в 600 мкл буфера для ядерной экстракции. Осторожно смешайте 600 мкл экстрагированных ядер с 300 мкл суспензии с гранулами конканавалина А и инкубируйте при 4 °C в течение 10 мин.
    7. Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной стойки, как описано в шаге 3.1.4, и осторожно ресуспендируйте ядра, связанные с гранулами, с помощью 1 мл холодного блокирующего буфера (таблица 2). Инкубировать при RT в течение 5 мин.
    8. Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной стойки и дважды промойте ядра, связанные с гранулами, 1 мл буфера для холодной промывки (Таблица 2). Во время второй промывки равномерно разделите ядра, связанные с гранулами, на пробирки по 1,5 мл. На следующем этапе каждая пробирка будет обработана специфическими антителами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере 250 мкл ядер, связанных с шариками, были разделены на четыре пробирки по 1,5 мл.
    9. Отделите надосадочную жидкость с помощью магнитного штатива, как описано в шаге 3.1.4, и аспирируйте пипеткой. Аккуратно ресуспендируйте комплексы ядро/шарики специфическим первичным антителом (Таблица 3) или IgG другого вида (в данном случае кролика), разбавленным в 250 мкл буфера для холодной промывки. Выдерживать при температуре 4 °C в течение ночи при легком перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела, используемые здесь, направлены против AR, H3K4me2 и H3K27ac.
    10. Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной стойки, как описано в шаге 3.1.4, дважды промойте ядра, связанные гранулами, 1 мл буфера для холодной промывки и повторно суспендируйте в 100 мкл буфера для холодной промывки.
    11. Разбавляют нуклеазу белка А-микрококка в концентрации 1,4 нг/мкл в 100 мкл на образец буфера для холодной промывки.
    12. К 100 мкл образца, полученного в 3.1.11, добавляют 100 мкл белковой микрококковой нуклеазы белка А и инкубируют при 4 °С в течение 1 ч при перемешивании.
    13. Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной стойки, как описано в шаге 3.1.4, дважды промойте 1 мл буфера для холодной промывки и повторно суспендируйте ядра, связанные с гранулами, в 150 мкл буфера для холодной промывки.
    14. Чтобы инициировать расщепление ДНК, добавьте 3 мкл 100 мМ CaCl2 к 150 мкл образца, быстро перемешайте и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Остановите реакцию, добавив 150 мкл стоп-буфера, и инкубируйте при 37 °C в течение 20 мин для расщепления РНК и высвобождения фрагментов ДНК.
    15. Для экстракции ДНК центрифугируют образцы при 16 000 x g при 4 °C в течение 5 мин.
    16. Перелейте надосадочную жидкость в новую пробирку для микрофуги и выбросьте гранулы и гранулы.
    17. Добавьте 3 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 2,5 мкл 20 мг/мл протеиназы K. Смешайте инверсией. Инкубировать 10 мин при 70 °C (без встряхивания).
    18. Добавьте 300 мкл фенола/хлороформа/изоамилового спирта, вмешайте, перелейте в пробирки с фазовой автоподстройкой фазы объемом 2 мл (предварительно отжимите в течение 5 мин при 16 000 x g) и центрифугируйте в течение 5 мин при 16 000 x g при 4 °C.
    19. Добавьте 300 мкл хлороформа в ту же пробирку и центрифугируйте в течение 5 минут при 16 000 x g при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость (~300 мкл) пипеткой (объем наконечника 0,2-1 мл) и перелейте в новую пробирку объемом 1,5 мл.
    20. Добавьте 1 мкл гликогена (концентрация 20 мг/мл).
    21. Добавьте 750 мкл 100% этанола и выложите в осадок на ночь при -20 °C.
    22. Гранулируют ДНК центрифугированием в течение 15 мин при 16 000 x g при 4 °C. Промойте гранулу 1 мл 100% этанола, центрифугируйте в течение 5 мин при 16 000 x g, выбросьте надосадочную жидкость, центрифугируйте в течение 30 с при 16 000 x g и удалите жидкость пипеткой (объем наконечника 20-200 мкл).
    23. Высушите гранулу на воздухе в течение ~5 минут. Ресуспендировать в 25 мкл 1 мМ трис-HCl (рН 8) и 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА; рН 8).
  2. Биоинформатический анализ
    1. Подготовьте библиотеки из иммунорасщепленной ДНК и секвенируйте их в виде парных считываний 100.о. с помощью геномной платформы, как описанона стр. 16.
    2. Удалите считывания, перекрывающиеся с областью черного списка ENCODE (V2), и разделите оставшиеся чтения на две группы: размером фрагмента <120.н. (без нуклеосомы, как правило, для транскрипционных факторов) и размером фрагмента >150.н. (с нуклеосомами, обычно для меток гистонов). Сопоставление с референсным геномом mm10 с помощью Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Создание больших файлов с помощью bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Сохраняйте уникально сопоставленные чтения для дальнейшего анализа.
    5. Создание необработанных файлов bedgraph с помощью genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Используйте алгоритм SEACR 1.3 (строгий параметр) для пикового вызова. Загрузите файл графа целевых данных в формате UCSC bedgraph, в котором отсутствуют области, содержащие нулевой сигнал, и файл графа данных управления (IgG), чтобы создать эмпирический порог для пикового вызова18.
    7. Выполните корреляционный анализ Пирсона с помощью инструментов глубокого анализа для определения сходства между выборками19. Используйте командную строку multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, за которым следует plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Визуализируйте полногеномные профили интенсивности с помощью IGV20 с помощью файлов графов и пиков слоя, полученных с помощью SEACR.
    9. Используйте HOMER для аннотации пиков и поиска мотивов21.
    10. Наконец, сравните наборы данных с ранее опубликованными с помощью браузера ChIP-Atlas Peak для их визуализации на IGV, и/или анализ обогащения с использованием файлов ложа, сгенерированных SEACR, в качестве входного набора данных22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сателлитные клетки из скелетных мышц мышей были выделены путем объединения протоколов Gunther et al. (далее Протокол 1)12 и Liu et al.23 (далее Протокол 2). Поскольку после переваривания наблюдались непереваренные мышечные волокна при использовании концентрации коллагеназы и диспазы, предложенной в протоколе 1, количество ферментов было увеличено для улучшения диссоциации мышечных волокон, как описано в шагах 1.2.1 и 1.2.3. Как указано в протоколе 2, образцы подвергали мягкому перемешиванию на водяной бане для поддержания жизнеспособности клеток. Мы проводили фильтрацию через клеточные фильтры, как указано в Протоколе 1, и инкубацию с буфером лизиса эритроцитов (см. шаги 1.2.7 - 1.2.10). В Протоколе 1 клетки нагружали по градиенту плотности Перколла 30%/70% для выделения моноядерных клеток в интерфазе, что могло привести к потере интересующих клеток. Таким образом, этот шаг был опущен, как это было предложено в Протоколе 2.

Для идентификации одноядерных клеток на основе размера (FSC) и зернистости (SSC) использовали сравнение FSC-A и SSC-A (рис. 3A). Обломки были исключены путем игнорирования событий ниже 40 К на оси FSC-A, и были отобраны 38,8% ± 3,6% ячеек. Для исключения дублетов использовались графики плотности стробирования FSC-A в зависимости от высоты прямого рассеяния (FSC-H) (рис. 3B). После отбора клеток, отрицательных по фиксируемому маркеру окрашивания жизнеспособности, было получено в среднем 34,3% ± 7,7% живых клеток (рис. 3В).

Процент, показанный на точечной диаграмме на рисунке 3C, 75,4%, соответствует проценту одиночных живых клеток, рассчитанному по популяции родительских клеток, которой в данном случае являются одиночки. 95,7% одиночных ячеек получаются из живых событий, которые составляют 35% от общего числа событий. Таким образом, процент 34,3%, полученный в среднем, рассчитывается по общему количеству событий, а не по родительским популяциям.

Около 3% одиночных живых клеток были отрицательными на лейкоцитарные (CD45), моноцитарные (CD11b), эндотелиальные (CD31) и эритроид-специфические (TER119) маркеры (рис. 3D). Затем CD11b/CD45/CD31/TER119 были отобраны в соответствии с их экспрессией маркеров CD34 (гемопоэтические, эндотелиальные предшественники и мезенхимальные стволовые клетки) и ITGA7 (клетки сердца, гладкой и скелетной мышц) (рис. 3E). Для отбора предполагаемых сателлитных клеток был проведен окончательный стробирование CXCR4 (лимфоциты, гемопоэтические и сателлитные клетки) (рис. 3F). Из CD34+/ITGA7+ клеток ~80% были положительными на CXCR4, что составляет в среднем от 1% ± 0,15% от общего числа одиночных живых клеток, и абсолютное число 60 000 ± 14 000 предполагаемых сателлитных клеток на мышцы конечностей мыши в 14 независимых экспериментах. Дополнительная оценка фракции клеток CXCR4+ показала, что около 80% живых клеток были получены после постсортировки, из которых почти 70% были CXCR4+ (рис. S1), что свидетельствует о высокой жизнеспособности и чистоте этой популяции клеток, изолированных от FACS.

Поскольку в различных исследованиях сравнивали эффективность ферментов коллагеназы и либеразы TL для выделения клеток24,25, эти два метода пищеварения обрабатывались параллельно. При приеме 300 мкл Liberase TL пищеварение было менее эффективным, чем при приеме коллагеназы, так как оставались непереваренные волокна. Кроме того, наблюдалось больше клеточного мусора и крупных событий (рис. S2A,B), и только 17,3% одиночных живых клеток в среднем были получены после отбора FVS 780 (рис. S2C). Дополнительной проблемой при переваривании либеразы было низкое количество клеток CD34+/ITGA7+ по сравнению с коллагеназой (рис. S2D-S2E), несмотря на то, что стробирование CXCR4 было аналогичным (рис. S2F). При введении 600 мкл Liberase TL пищеварение было более эффективным. Тем не менее, количество клеточного мусора оставалось повышенным, а жизнеспособность клеток — неудовлетворительной (16,3%) (рис. S3). Таким образом, пищеварение с помощью Liberase TL было менее эффективным для изоляции сателлитных клеток.

При посеве более 70% клеток CD34+/ITGA7+/CXCR4+ (рис. 4A) экспрессировали PAX7 (рис. 4B), в отличие от CD34+/ITGA7-/CXCR4-клеток, которые были PAX7-отрицательными (рис. 4C). CD34+/ITGA7+/CXCR4+ клетки способны дифференцироваться в миоволокна при выращивании в миогенной среде в течение 7 дополнительных дней, что было показано окрашиванием дистрофином (МДД) (рис. 4D), подтверждающим их миогенный потенциал. Таким образом, комбинированный анализ тканевой культуры и иммунофлуоресценции показал, что CD34+/ITGA7+/CXCR4+ клетки, изолированные FACS, являются клетками-сателлитами.

Для определения пригодности изолированных клеток-сателлитов для анализа методом CUT&RUN был определен геномный профиль ацетилированного лизина 27 (H3K27ac) и диметилированного лизина 4 (H3K4me2) гистона H3, двух модификаций гистонов, обнаруженных в активных промоторных и энхансерных областях. Наши данные выявили 68 694 и 13 514 пиков для H3K4me2 и H3K27ac соответственно с аналогичным перераспределением генома между двумя гистоновыми метками (рис. S4A). В частности, мы обнаружили, что четверть пиков была расположена на расстоянии ± 2 кбайт от сайта начала транскрипции (TSS) ближайшего гена, причем большинство из них располагались либо на расстоянии от -100 до -10 кб, либо от 10 до 100 кбайт от TSS (рис. S4B). Следует отметить, что анализ Пирсона показал 80%-ную корреляцию между профилями считывания H3K27ac и H3K4me2 (рис. S4C). Для оценки того, что хроматин, приготовленный по вышеуказанному протоколу, был выделен из клеток-сателлитов, было определено наличие H3K27ac и H3K4me2 в промоторе генов, специфичных для сателлитных клеток. H3K4me2 обогащался вокруг TSS Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 и Vcam1 (рис. 5A), но не вокруг Itgam (CD11b) и Ptprc (CD45) (иммунные клетки), Pecam (CD31; эндотелиальные клетки) (рис. 5B), Ckm (развивающиеся мышечные волокна) или Myh3 (миозиновые тяжелые эмбриональные миоволокна) (рис. 5C). Аналогичные результаты были получены и с H3K27ac (рис. 5). С образцом IgG сигнал практически не был получен (рис. 5). Более того, сравнение пиков H3K27ac, полученных с помощью SEACR, с пиками, полученными в результате вызова пиков MACS2 из опубликованных наборов данных ChIP-seq, показало высокую корреляцию, как отмечено под каждой панелью (трек ChIP-Atlas; Рисунок 5). В совокупности эти результаты указывают на то, что считывания, полученные после биоинформатического анализа, происходят из хроматина изолированных FACS-сателлитных клеток и коррелируют с теми, которые ранее были идентифицированы с помощью анализа ChIP-seq.

В то время как исследования секвенирования одноклеточной РНК в клетках-сателлитах мышей показали поразительную реакцию на стресс, вызванную процедурой выделения26, присутствие H3K4me2 или H3K27ac было определено в генах реакции на стресс, как это было показано на примере Atf3, Azin1, Gls и Elf2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что метка H3K27ac не депонируется в промоторе таких генов, и что уровни H3K4me2 остаются низкими по сравнению с уровнями, полученными для генов-сателлитов, специфичных для клеток (рис. S5). Таким образом, эти данные подчеркивают, насколько мягкой является процедура изоляции.

Затем была изучена пригодность нашего метода выделения для транскрипционных факторов. Анализ андрогенного рецептора (АР), транскрипционного фактора, принадлежащего к суперсемейству ядерных рецепторов и играющего важную роль в миогенной дифференцировке27, выявил 7840 пиков. Эти пики в основном располагались в интронных и межгенных областях (рис. S4A), либо от -100 до -10 кбайт, либо от 10 до 100 кбайт от TSS (рис. S4B). Филогенетический анализ показал, что AR, наряду с глюкокортикоидными (GR/Nr3c1), минералокортикоидными (MR/Nr3c2) и прогестероновыми (PR/Nr3c3) рецепторами, является членом подсемейства оксостероидных ядерных рецепторов 28, которые связываются в качестве гомодимеров с сегментами ДНК, состоящими из двух 5'-RGAACA-3′ палиндромных полусайтов, разделенных тремя парами оснований 29. Поиск известного мотива с помощью гипергеометрической оптимизации обогащения мотивов (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) показал, что AR связан с мотивом полусайта AR 5′-RGRNCA-3', с типичным оксостероидным мотивом 5′-RGNACAnnnTGTNC-3′ (обозначенным на рисунке как PR) и с консенсусным мотивом AR 5′-RGNACAnnnTGTNCY-3′ в >32%, 17% и 2% целевых регионов. соответственно (рис. 6А). Следует отметить, что аналогичные пропорции ранее были получены для глюкокортикоидного рецептора в скелетной мышце16.

Анализ SEACR выявил почти 500 пиков с пиковым баллом >50, из них более 200 с оценкой >100; некоторые из них показаны на рисунке 6B. Наш анализ также выявил умеренное обогащение АР в ранее описанных сайтах связывания генов, участвующих в биосинтезе полиаминов (Amd1, Oat, Smox) и при раке предстательной железы (Acox1, Fkbp5 и Tmprss2) (рис. S6). Интересно, что AR был обнаружен в локусах генов, участвующих в стволовости сателлитных клеток (Pax7, Cxcr4 и Cd34) (рис. S7). Следует отметить, что элемент оксостероидного ответа был обнаружен в каждой из этих областей, обогащенных AR (рис. S6 и рис. S7), что свидетельствует о высокой специфичности сигнала AR, наблюдаемого в данных CUT&RUN.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение протокола, используемого для выделения сателлитных клеток из мышц конечностей мыши. Протокол состоит из четырех основных этапов. Вкратце, мышей приносят в жертву, а мышцы задних конечностей собирают (шаги 1.1.1-1.1.3) и механически измельчают ножницами (шаги 1.4-1.5). Затем следуют шаги 1.2.1-1.2.4, во время которых мышцы диссоциируют в водяной бане с помощью коллагеназы и диспазы. На стадиях 1.2.5-1.2.8 клеточную суспензию последовательно фильтруют через клеточные ситечки 100, 70 и 40 мкм, а эритроциты удаляют с помощью буфера лизиса эритроцитов (этапы 1.2.9-1.2.12). Остальные клеточные популяции помечаются на этапе 1.3 антителами, связанными с флуорофорами, которые направлены против специфических клеточных фенотипических маркеров. Этап 1.4 включает в себя пробы, проходящие через FACS для сбора сателлитных ячеек для дальнейшего применения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ проточной цитометрии неокрашенного клеточного препарата. (A) Отбор интересующей популяции на основе параметров FSC-A и SSC-A. (B) Идентификация одиночных клеток на основе FSC-A и FSC-H. (C) Характеристика порога автофлуоресценции собранных клеток для APC-Cy7, конъюгированного с фиксируемым краном жизнеспособности (FVS 780), маркирующим мертвые клетки. (Д-Ж). Автофлуоресцентное измерение PE-Cy7, конъюгированного с антителом CD11b и PE-конъюгированного с маркерами TER119/CD45/CD31 (D), а также для флуора Alexa 488, конъюгированного с ITGA7, флуора Alexa 405, конъюгированного с CD34 (E), и флуорохрома APC, конъюгированного с CXCR4 (F). Ворота представлены в виде черных ящиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Стратегия стробирования проточного цитометра для сортировки сателлитных клеток. (A) Отбор интересующей популяции на основе параметров FSC-A и SSC-A. (B) Идентификация одиночных клеток на основе FSC-A и FSC-H. (C) Идентификация живых клеток с помощью FVS 780. (D) Отрицательный отбор клеток на основе антигенов CD11b, CD31, CD45 и TER119. (Е-Ж) Положительная селекция клеток на основе антигенов CD34 и ITGA7(E), а также CXCR4(F). Ворота представлены в виде черных ящиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ изолированных FACS клеток CD34+/ITGA7+/CXCR4+ и CD34+/ITGA7-/CXCR4-. (A) Фазово-контрастные изображения CD34+/ITGA7+/CXCR4+ и CD34+/ITGA7-/CXCR4-, культивируемых в питательной среде. (B) Иммунофлуоресцентный анализ CD34+/ITGA7+/CXCR4+ и CD34+/ITGA7-/CXCR4-клеток, культивируемых в питательной среде с использованием антител, направленных против PAX7 (красный) и дистрофина (DMD, зеленый). Ядра окрашивали DAPI (синим). Пурпурные стрелки обозначают PAX7-положительные клетки. (C) Фазово-контрастные изображения клеток CD34+/ITGA7+/CXCR4+, выращенных в течение 5 дней в питательной среде (левая панель) и в течение 7 дополнительных дней в миогенной среде (правая панель). (D) Иммунофлуоресцентные изображения клеток CD34+/ITGA7+/CXCR4+, выращенных в течение 5 дней в питательной среде (левая панель) и в течение 7 дополнительных дней в миогенной среде (правая панель) с использованием антител, направленных против PAX7 (красный) и дистрофина (DMD, зеленый). Ядра окрашивали DAPI (синим). Пурпурные стрелки обозначают PAX7-положительные клетки. Зелеными стрелками обозначены DMD-положительные клетки. Масштабные линейки: светлопольные панели = 25 мкм; Иммунофлуоресцентные панели = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Геномные профили хроматина сателлитной клетки. Локализация H3K4me2 и H3K27ac на сателлит-клеточно-специфических генах (А), иммуно- и эндотелиальных клеточно-специфичных генах (В) и миофибер-специфических генах (С) на хроматине клеток-сателлитов методом CUT&RUN. Активные промоутеры обведены зеленым цветом, а неактивные — коричневым. В качестве отрицательного контроля использовали метод CUT&RUN, выполненный с IgG. Анализ обогащения H3K27ac для меток гистонов представлен под каждым треком. Оценка обогащения, показывающая уровни достоверности опубликованных наборов данных, представлена в виде тепловой карты. Коричневые звезды (*) относятся к пикам H3K27ac ChIP-seq, выполняемым в мышечных сателлитных клетках, синие звезды — к H3K4me3, а розовые — к H4K16me1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Распределение генома AR на хроматине сателлитных клеток. (A) Анализ известных ГОМЕРовских мотивов пиков AR в сателлитных клетках. PR: рецептор прогестерона. Цель Nb относится к количеству пиков, представляющих определенный мотив. (B) Локализация H3K4me2 и AR в указанных генах на хроматине клеток-сателлитов, определяемая методом CUT&RUN. В качестве отрицательного контроля использовали метод CUT&RUN, выполненный с IgG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Перечень материалов, реагентов и программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Буферные составы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Референсы и концентрации антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Анализ проточной цитометрии клеточного препарата после сортировки. (A) Отбор интересующей совокупности на основе параметров FSC-A и SSC-A. (B) Идентификация одиночных клеток на основе FSC-A и FSC-H. (C) Идентификация живых клеток с фиксируемым окрашиванием жизнеспособности (FVS 780). (D) Отрицательный отбор клеток на основе антигенов CD11b, CD31, CD45 и TER119. (Е-Ж) Положительный отбор клеток на основе антигенов CD34 и ITGA7 (E), а также CXCR4 (F). Ворота представлены в виде черных ящиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Стратегия стробирования проточного цитометра для сортировки сателлитных клеток после разложения с 300 мкл Liberase TL. (A) Отбор интересующей совокупности на основе параметров FSC-A и SSC-A. (B) Идентификация одиночных клеток на основе FSC-A и FSC-H. (C) Идентификация живых клеток с помощью FVS 780. (D) Отрицательный отбор клеток на основе антигенов CD11b, CD31, CD45 и TER119. (Е-Ж) Положительный отбор клеток на основе антигенов CD34 и ITGA7 (E), а также CXCR4 (F). Ворота представлены в виде черных ящиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Стратегия стробирования проточного цитометра для сортировки сателлитных клеток после разложения с 600 мкл Liberase TL. (A) Отбор интересующей совокупности на основе параметров FSC-A и SSC-A. (B) Идентификация одиночных клеток на основе FSC-A и FSC-H. (C) Идентификация живых клеток с помощью FVS 780. (D) Отрицательный отбор клеток на основе антигенов CD11b, CD31, CD45 и TER119. (Е-Ж) Положительный отбор клеток на основе антигенов CD34 и ITGA7 (E), а также CXCR4 (F). Ворота представлены в виде черных ящиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Характеристика геномных локаций H3K4me2, H3K27ac и AR. (A) Круговые диаграммы, показывающие пиковое распределение H3K4me2, H3K27ac и AR в соответствии с особенностями генома в сателлитных клетках. (B) Круговые диаграммы, показывающие распределение пиков H3K4me2, H3K27ac и AR в соответствии с их расстоянием до ближайшей TSS в спутниковых сотах. (C) Тепловая карта, показывающая корреляцию Пирсона между H3K4me2, H3K27ac и контролем IgG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Геномные профили хроматина сателлитных клеток в генах, индуцированных стресс-реакцией. Локализация H3K4me2 и H3K27ac по указанным генам на хроматине клеток-сателлитов. В качестве отрицательного контроля использовали иммунопреципитацию с IgG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Геномные профили хроматина сателлитных клеток в известных генах-мишенях AR. Локализация H3K4me2, H3K27ac и AR в указанных генах на хроматине клеток-сателлитов, определенная методом CUT&RUN. AR-пики выделены синим цветом, а соответствующие AR-адаптивные элементы представлены ниже. В качестве отрицательного контроля использовали метод CUT&RUN, выполненный с IgG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 7: Геномные профили хроматина сателлитных клеток в их селективно экспрессируемых генах. Локализация H3K4me2, H3K27ac и AR в указанных генах на хроматине клеток-сателлитов, определенная методом CUT&RUN. AR-пики выделены синим цветом, а соответствующие AR-адаптивные элементы представлены ниже. В качестве отрицательного контроля использовали метод CUT&RUN, выполненный с IgG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В настоящем исследовании представлен стандартизированный, надежный и простой в исполнении метод выделения и культивирования клеток-сателлитов мышей, а также оценки транскрипционной регуляции методом CUT&RUN.

Этот протокол включает в себя несколько важных шагов. Во-первых, это разрушение мышц и переваривание клетчатки для обеспечения большого количества собранных клеток. Несмотря на повышенную концентрацию фермента, было получено больше живых клеток, чем при использовании Протокола 1. Клетки-сателлиты экспрессируют специфический паттерн различных мембранных белков. Для повышения строгости нашей сортировки мы использовали комбинацию ранее описанных отрицательных (CD31, TER119, CD45 и CD11b) и положительных (CD34, ITGA7 и CXCR4) сателлитных клеточных маркеров30,31. Используя эту стратегию, было получено в среднем 1% живых предполагаемых спутниковых клеток. Этот результат находится в диапазоне ожидаемых, поскольку сателлитные клетки составляют 2%-7% популяции мышечных клеток во взрослом возрасте у мышей32. В качестве контроля маркеров селекции сателлитных клеток выделяли CD34+/ITGA7-/CXCR4-клетки. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что, в то время как CD34+/ITGA7-/CXCR4- клетки не экспрессируют PAX7, 70% CD34+/ITGA7+/CXCR4+ клеток были положительными на этот сателлит-клеточный специфический маркер, тем самым демонстрируя, что изолированная популяция FACS соответствует сателлитным клеткам. Кроме того, 70% клеток-сателлитов, выращенных в миогенной среде в течение 7 дней, были PAX7-/DMD+, что было показано иммуноокрашиванием, и сформировали удлиненное многоядерное миоклетчатое волокно, демонстрируя, что изолированные сателлитные клетки сохранили свой потенциал стволовости.

Основным ограничением при подготовке образцов может быть использование высокой концентрации ферментов, что приводит к большому количеству диссоциированного биологического материала, но может способствовать усилению гибели клеток. Чтобы решить эту проблему, был проведен анализ, требующий меньшего количества фермента. В этом контексте был протестирован Liberase TL, очищенная форма традиционной коллагеназы33. Несмотря на то, что пищеварение, по-видимому, было более эффективным с помощью этого фермента, количество клеточного мусора оставалось повышенным, а жизнеспособность клеток была немного снижена. Эти наблюдения согласуются с предыдущими отчетами, в которых сравнивали тканевое расщепление, опосредованное либераза, с рекомбинантной коллагеназой или пользовательской коллагеназой24,25. Кроме того, несмотря на то, что соотношение эндотелиальных и иммунных клеток было одинаковым между расщеплением коллагеназы и либеразы, процент клеток-сателлитов был ниже в образце, обработанном Либеразе, что в целом показывает, что Либераза не рекомендуется для выделения сателлитных клеток. Использование этого фермента подходит для фенотипического и количественного анализа иммунных клеток и в конечном итоге может быть рекомендовано в контексте мышечных и/или других тканей. Это согласуется с тем, что было сообщено о Liberase TL как о наиболее подходящем для эффективного выделения жизнеспособных иммунных клеток34,35,36.

Еще одной потенциальной проблемой является стресс, вызванный как диссоциацией, так и сортировкой сателлитных клеток. Тем не менее, отсутствие H3K27ac и низкие уровни H3K4me2 в промоторной области генов ответа на стресс, идентифицированные с помощью секвенирования одноклеточной РНК в клетках-сателлитах мышей26, показывают, что процедура достаточно мягкая, чтобы не индуцировать транскрипционный репертуар стресс-реакции. Другими ограничениями, которые следует отметить, являются выбранные антигены, которые остаются эмпирическими. Тем не менее, исследования показывают высокое перекрытие между уникальными комбинациями поверхностных маркеров, которые обогащены клетками-сателлитами скелетных мышц30,31.

Дополнительным критическим этапом является очистка ядер от отсортированных клеток. Для этого скорость сортировки поддерживается низкой, чтобы не повредить ячейки, но достаточно быстрой, чтобы они не хранились слишком долго в буфере FACS. Действительно, ядра CUT&RUN не являются фиксированными, и более длительный инкубационный период может повлиять на чтение, полученное из протокола. Типичный препарат из двух задних конечностей одной мыши позволяет проводить CUT&RUN с одним антителом и одним контролем IgG, с количеством 2,5 нг хроматина для каждого.

Эксперименты CUT&RUN, предназначенные для оценки связывания транскрипционных факторов и эпигенетических модификаций, обеспечили сильные и надежные сигналы считывания для H3K4me2 и H3K27ac. Высокие уровни считывания H3K4me2 и H3K27ac на генах, которые, как известно, экспрессируются в клетках-сателлитах, по сравнению с генами, экспрессируемыми в иммунных или эндотелиальных клетках, а также в миоволокнах, показали, что сигнал усиливается преимущественно из ядер клеток-сателлитов. Кроме того, этот протокол сделал возможной идентификацию цистромы АР в мышечных стволовых клетках, что на сегодняшний день остается технической проблемой, присущей низкому качеству мышиных антител к АР и низким уровням экспрессии АР в клетках, которые не являются высокоандроген-чувствительными, таких как эпителиальные клетки предстательной железы. Представленные здесь данные выявили регионы, связанные с дополненной реальностью, с высокими пиковыми показателями достоверности. Поскольку первоначально для каждого антитела был оценен только один репликат, надежность наших наборов данных будет улучшена за счет добавления по крайней мере двух дополнительных биологических репликатов для каждого состояния. Тем не менее, известные гены-мишени АР и соответствующие маркеры гистонов, первоначально описанные как высокоэкспрессируемые и/или легко обнаруживаемые в других тканевых контекстах, таких как предстательная железа, имеют более низкие уровни экспрессии и их очень трудно обнаружить в клетках-сателлитах.

Одним из ограничений подхода CUT&RUN является то, что он выполняется в нефиксированных ячейках. Таким образом, мы могли пропустить некоторые мишени АР из-за лабильного характера взаимодействий между транскрипционными факторами и их сайтом связывания. Точно так же некоторые посттрансляционные модификации, такие как ацетилирование, также могут быть довольно лабильными. Таким образом, включение этапа легкой фиксации формальдегидом или параформальдегидом после сортировки FACS и перед выделением ядер может быть рассмотрено для стабилизации взаимодействий белок/ДНК и модификаций гистонов.

Несмотря на то, что в этой статье показано, что анализы CUT&RUN могут быть проведены на изолированных FACS-сателлитных клетках, также могут быть выполнены другие анализы с использованием нефиксированного хроматина, такие как ATAC-seq. Кроме того, несмотря на то, что здесь мышцы были собраны в базальных физиологических условиях, этот протокол может быть применен к патологическим контекстам, таким как травмы или старение. Все эти протоколы позволят детально понять механизмы регуляции генов в клетках-сателлитах и могут помочь в понимании того, как эти механизмы могут быть изменены патофизиологическими условиями.

Таким образом, этот недорогой и эффективный по времени протокол обеспечивает эффективную экспериментальную установку для изучения рекрутирования транскрипционного фактора и ландшафта хроматина в клетках-предшественниках скелетных мышц. Хроматин, подготовленный по этому протоколу, обеспечил первый полногеномный анализ цистромы AR в сателлитных клетках и будет способствовать будущим исследованиям регуляции генов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Благодарим Анастасию Баннварт за оказанную техническую помощь. Мы благодарим животноводческий комплекс IGBMC, клеточную культуру, Клинический институт мышей (ICS, Илькирх, Франция), визуализацию, электронную микроскопию, проточную цитометрию и платформу GenomEast, члена консорциума «France Génomique» (ANR-10-INBS-0009).

Данная работа Междисциплинарного тематического института IMCBio, в рамках программы ITI 2021-2028 Страсбургского университета, CNRS и Inserm, была поддержана IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) и проектом SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) и EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) в рамках французской программы «Инвестиции в будущее». Дополнительное финансирование было предоставлено INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), стратегической программой AFM-Téléthon 24376 (для D.D.), INSERM для молодых исследователей (для D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT и французским государственным фондом, управляемым ANR в рамках рамочной программы Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. был поддержан программой CDFA-07-22 Франко-аллемандского университета и Министерства высшего образования исследований и инноваций, а также Ассоциацией исследований и инноваций (Association pour la Recherche à l'IGBMC) (ARI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Tags

Анализ CUT&RUN FACS-изолированные сателлитные клетки мышей поле стволовых клеток популяции малых клеток эффективный протокол флуоресцентно-активированная сортировка клеток мышцы конечностей структурные белки измельчение среда диспаза коллагеназа I типа ситечки клеток буфер FACS окрашивание жизнеспособности иммуноокрашенные сателлитные клетки тритон X-100 магнитные шарики конканавалина А транскрипционный фактор модификации гистонов белковая микрококковая нуклеаза расщепление хроматина CaCl2 экстракция ДНК Библиотеки Биоинформатический анализ
Эффективный протокол для анализа CUT&amp;RUN изолированных FACS-клеток мыши-сателлитов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter