Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65215
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

Burada sunulan, fare uzuv kas uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) izolasyonu için, hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT &RUN) kullanılarak salım yoluyla kas liflerinde transkripsiyon regülasyonu çalışmasına uyarlanmış etkili bir protokoldür.

Abstract

Küçük hücre popülasyonları ile genom çapında analizler, özellikle kök hücre alanındaki çalışmalar için büyük bir kısıtlamadır. Bu çalışma, yüksek yapısal protein içeriğine sahip bir doku olan ekstremite kasından uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) izolasyonu için etkili bir protokolü açıklamaktadır. Yetişkin farelerden alınan disseke ekstremite kasları, dispas ve tip I kollajenaz ile takviye edilmiş besiyerinde kıyma ile mekanik olarak bozuldu. Sindirimden sonra, homojenat hücre süzgeçlerinden süzüldü ve hücreler FACS tamponunda süspanse edildi. Canlılık, sabitlenebilir canlılık boyası ile belirlendi ve immün boyalı uydu hücreleri FACS ile izole edildi. Hücreler Triton X-100 ile parçalandı ve serbest bırakılan çekirdekler konkanavalin A manyetik boncuklarına bağlandı. Çekirdek/boncuk kompleksleri, ilgilenilen transkripsiyon faktörüne veya histon modifikasyonlarına karşı antikorlarla inkübe edildi. Yıkamalardan sonra, çekirdek/boncuk kompleksleri protein A-mikrokok nükleazı ile inkübe edildi ve CaCl2 ile kromatin bölünmesi başlatıldı. DNA ekstraksiyonundan sonra, kütüphaneler oluşturuldu ve dizilendi ve genom çapında transkripsiyon faktörü bağlanması ve kovalent histon modifikasyonları için profiller biyoinformatik analiz ile elde edildi. Çeşitli histon işaretleri için elde edilen pikler, bağlanma olaylarının uydu hücrelerine özgü olduğunu gösterdi. Ayrıca, bilinen motif analizi, transkripsiyon faktörünün, aynı kökenli yanıt elemanı aracılığıyla kromatine bağlı olduğunu ortaya çıkardı. Bu nedenle bu protokol, yetişkin farelerde uzuv kas uydu hücrelerinde gen regülasyonunu incelemek için uyarlanmıştır.

Introduction

İskelet çizgili kaslar, toplam insan vücudunun ağırlığının ortalama %40'ını temsil eder1. Kas lifleri, yeni oluşan miyositlerin füzyonu ve hasarlı olanların yerini alan yeni miyoliflerin üretilmesi ile tanımlanan yaralanma üzerine rejenerasyon için dikkate değer bir kapasite sergiler2. 1961'de Alexander Mauro, uydu hücreleri3 olarak adlandırdığı bir mononükleer hücre popülasyonu bildirdi. Bu kök hücreler, transkripsiyon faktörü eşleştirilmiş kutu 7'yi (PAX7) eksprese eder ve bazal lamina ile kas liflerininsarkolemması arasında bulunur 4. Farklılaşma kümesini 34 (CD34; hematopoietik, endotelyal progenitör ve mezenkimal kök hücre belirteci), integrin alfa 7 (ITGA7; pürüzsüz, kardiyak ve iskelet kası belirteci) ve ayrıca CXC kemokin reseptörü tip 4'ü (CXCR4; bir lenfosit, hematopoietik ve uydu hücresi belirteci) ifade ettikleri bildirilmiştir5. Bazal koşullarda, uydu hücreleri, onları hareketsiz bir durumda tutan belirli bir mikro ortamda bulunur6. Kas hasarı üzerine aktive olurlar, çoğalırlar ve miyojenez7'ye uğrarlar. Bununla birlikte, toplam kas hücresi sayısının sadece küçük bir kısmına katkıda bulunan genom çapındaki analizleri, özellikle fizyolojik ortamlarda (toplam hücrelerin% <1'i) özellikle zordur.

Uydu hücrelerinden kromatin izolasyonu için, kromatin immünopresipitasyonunu takiben büyük paralel dizileme (ChIP-seq) veya hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT & Tag) deneylerini içeren çeşitli yöntemler tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu iki teknik, tartışmasız kalan bazı önemli sınırlamalar sunmaktadır. Gerçekten de, ChIP-seq, sonikasyon adımı sırasında büyük bir kısmı kaybolan yeterli kromatin üretmek için yüksek miktarda başlangıç malzemesi gerektirir. CUT & Tag, düşük hücre sayısı için daha uygundur, ancak Tn5 transpozaz aktivitesi nedeniyle ChIP-seq'den daha fazla hedef dışı bölünme bölgesi oluşturur. Ek olarak, bu enzim açık kromatin bölgeleri için yüksek bir afiniteye sahip olduğundan, CUT & Tag yaklaşımı, susturulmuş heterokromatin8,9 yerine, genomun aktif olarak kopyalanan bölgeleriyle ilişkili histon modifikasyonlarını veya transkripsiyon faktörlerini analiz etmek için tercihen kullanılabilir.

Burada, fare uzuv kas uydu hücrelerinin FACS ile hedeflerin altında bölünme için izolasyonuna ve nükleaz (CUT & RUN)10,11 analizi kullanılarak serbest bırakılmasına izin veren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Çeşitli adımlar, dokunun mekanik olarak bozulmasını, hücre sıralamasını ve çekirdek izolasyonunu içerir. Yöntemin, canlı bir hücre süspansiyonunun hazırlanmasına ilişkin etkinliği, kovalent histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörleri için CUT & RUN analizi yapılarak gösterilmiştir. İzole edilmiş hücrelerin kalitesi, tarif edilen yöntemi, doğal genomik doluluk durumunu aslına uygun olarak yakalayan kromatin hazırlamak için özellikle çekici kılar ve kromozom konformasyonunu, spesifik lokuslarda (4C-dizilimi) veya genom çapında seviyelerde (Hi-C) yüksek verimli dizileme ile kombinasyon halinde yakalamak için uygun olması muhtemeldir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fareler, Ulusal Hayvan Bakım Yönergelerine (Avrupa Komisyonu direktifi 86/609/CEE; Fransız kararnamesi no.87-848) laboratuvar hayvanlarının araştırma için kullanımına ilişkindir. Amaçlanan manipülasyonlar, 2010/63/EU direktifine göre etik değerlendirme ve yetkilendirme için Etik Komite'ye (Com'Eth, Strasbourg, Fransa) ve Fransız Araştırma Bakanlığı'na (MESR) APAFIS numarası #22281 altında sunulmuştur.

1. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile uydu hücrelerinin izolasyonu için hücre süspansiyonunun hazırlanması (Şekil 1)

  1. Kas dokusunun izolasyonu
    1. Forseps, neşter ve makas dahil olmak üzere kas diseksiyonu aletlerini bir temizlik maddesi kullanarak dekontamine edin (Tablo 1) ve damıtılmış suyla iyice durulayın.
    2. Her biri 1 mL kas izolasyon tamponu içeren iki adet 2 mL tüp hazırlayın (Tablo 1) ve hasat edilen kasları toplamak için bunları buzun üzerine yerleştirin.
    3. 10 haftalık iki C57 / Bl6J erkek fareyi CO2 boğulması ve ardından servikal çıkık ile kurban edin. Her farenin tamamına% 70 etanol püskürtün. Forseps kullanarak cildi arka bacaktan soyun. Femur, tibia ve fibulayı çevreleyen tüm uzuv kaslarını inceleyin (fare başına yaklaşık 1 mg kas).
      NOT: Uydu hücre sayısı 15 haftalıktan sonra azalır.
    4. Hasat edilen uzuv kaslarını, adım 1.1.2'de hazırlanan 1 mL kas izolasyon tamponu içeren 2 mL'lik tüplere yerleştirin. Aynı prosedürü izleyerek ikinci fareden kasları toplayın. Hasat edilen kasları 1 mm'den küçük3 parça elde edilene kadar buz üzerinde makasla kıyın.
      NOT: Kaslar esas olarak tarif edildiği gibi toplandı ve kıyıldı12. Adım 1.2 veya 1.3'ü izleyerek doku sindirimi gerçekleştirin.
  2. Kollajenaz enzimi ile doku sindirimi
    1. Kıyılmış kas süspansiyonunu iki fareden 18 mL kas izolasyon tamponu (5 mL [5 U / mL] dispas ve 5 mg tip I kollajenaz ile desteklenmiş) içeren 50 mL'lik bir tüpe (Tablo 1) dökerek aktarın (Tablo 1).
    2. Tüpü sıkıca kapatın ve laboratuvar filmi ile kapatın (Tablo 1). 37 °C'de 100 rpm'de 30 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosuna (Tablo 1) yatay olarak yerleştirin.
    3. 30 dakika sonra 5 mg tip I kollajenaz ekleyin. Tüpleri 30 °C'de 37 °C'de 100 rpm'de çalkalanan bir su banyosunda çalkalama altında 30 dakika daha tutun.
    4. Sindirimden sonra, ayrışma etkinliğini artırmak için kas süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün dibinde berrak bir pelet görünecektir. Süpernatanı 10 mL'lik bir pipet kullanarak atın ve tüpte 5 mL ortam bırakın.
      NOT: Ortamı terk etmek, hücrelerin gerilmesini önlemeye yardımcı olur. 10 mL taze kas izolasyon tamponu ekleyin ve 10 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin.
    5. 100 μm, 70 μm ve 40 μm hücre süzgeçlerini (her türden bir tane) (Tablo 1) açık 50 mL'lik tüplere yerleştirin. Süspansiyonu ardışık hücre süzgeçlerine (100 μm, 70 μm, 40 μm) pipetleyin ve akışı 40 μm'nin altındaki hücreler içeren 50 mL'lik tüplerde toplayın.
    6. Süspansiyonu 4 °C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. 2 mL kalana kadar 10 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı atın ve ardından 100-200 μL kalana kadar 0,2-1 mL'lik bir pipet kullanın. Peletin 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edilmesi (Tablo 2). Buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
    7. 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 20-200 μL'lik bir pipet kullanarak atın. Hücreleri 100 μL soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 2). Buzun üzerine yerleştirin.
  3. Liberase termolizin düşük (TL) enzimi ile doku sindirimi için alternatif yöntem
    1. Adım 1.1'deki açıklamaları izleyin. doku izolasyonu için.
    2. Liberaz aracılı doku ayrışması için, adım 1.1.2'de açıklanan kas izolasyon tamponu yerine 2 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) izolasyon tamponunda (Tablo 2) kasları hasat edin.
    3. Kıyılmış kas süspansiyonunu iki fareden 50 mL'lik bir tüpe (Tablo 1) dökerek aktarın 18 mg / mL'de 300 veya 600 μL Liferaz TL ile desteklenmiş 5 mL RPMI izolasyon tamponu içeren (Tablo 1) (yani, 0.083 mg / mL ve 0.167 mg / mL nihai konsantrasyonlar, sırasıyla)13.
    4. Tüpü sıkıca kapatın ve laboratuvar filmi ile kapatın (Tablo 1). 37 °C'de 100 rpm'de 30 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosuna (Tablo 1) yatay olarak yerleştirin.
    5. Sindirimden sonra, ayrışmayı ve ayrışma etkinliğini artırmak için kas süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
    6. 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün dibinde berrak bir pelet görünecektir. Süpernatanı 10 mL'lik bir pipet kullanarak atın ve tüpte 5 mL ortam bırakın. Ortamı terk etmek, hücrelerin strese girmesini önlemeye yardımcı olur. 10 mL taze RPMI izolasyon tamponu ekleyin ve 10 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin.
    7. 100 μm, 70 μm ve 40 μm hücre süzgeçlerini (her türden bir tane) (Tablo 1) açık 50 mL'lik tüplere yerleştirin.
    8. Süspansiyonu ardışık hücre süzgeçlerine (100 μm, 70 μm, 40 μm) pipetleyin ve akışı 40 μm'nin altındaki hücreler içeren 50 mL'lik tüplere toplayın.
    9. Süspansiyonu 4 °C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. 2 mL kalana kadar 10 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı atın ve ardından 100-200 μL kalana kadar 0,2-1 mL'lik bir pipet kullanın.
    10. Peletin 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edilmesi (Tablo 2). Buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
    11. 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 20-200 μL'lik bir pipet kullanarak atın.
    12. Hücreleri 100 μL soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 2). Buzun üzerine yerleştirin.
  4. FACS izolasyonu için hücre süspansiyonunun hazırlanması
    1. Adım 1.2.12'de elde edilen hücre süspansiyonunun 10 μL'sini 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. Bu numune, boyanmamış kontrolü veya negatif kontrolü oluşturacaktır (Şekil 2). 190 μL FACS tamponu ekleyin, 5 mL'lik bir tüpe aktarın (Tablo 1) ve buz üzerinde saklayın.
    2. Adım 1.2.12'de elde edilen hücre süspansiyonunun kalan 90 μL'sini 4 ° C'de 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet (20-200 μL uç hacmi) kullanarak atın. Hücreleri, oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca serumsuz Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) seyreltilmiş 400 μL sabitlenebilir canlılık boyası (Tablo 3) ile inkübe edin.
    3. Hücreleri 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek yıkayın ve 100 μL FACS tamponu ekleyin. Tüpleri üç kez nazikçe ters çevirin ve 4 °C'de 400 x g'da 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    4. Santrifüj süresi boyunca, floroforlara bağlı ve CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 ve CXCR4'e karşı yönlendirilmiş 100 μL'lik bir ana primer antikor karışımı hazırlayın (Tablo 3), FACS tamponunda seyreltilmiş.
    5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin, bir pipet (20-200 μL uç hacmi) kullanarak hücre süpernatanını atın ve 100 μL antikor karışımını ekleyin. Tüpü yavaşça üç kez ters çevirin. Girdap yapmayın. Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
    6. 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı 20-200 μL'lik bir pipet kullanarak atın ve hücreleri yıkamak için 500 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Tüpü yavaşça üç kez ters çevirin. 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da yeniden santrifüjleyin ve süpernatanı 20-200 μL'lik bir pipet kullanarak atın.
    7. Hücre peletini 500 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
      NOT: Liferaz sindiriminden elde edilen hücre süspansiyonu da aynı şekilde işlenir.
  5. FACS ile uydu hücresi seçimi
    1. Hücre süspansiyonunu kısaca vorteksleyin (2-5 saniye) ve hücreleri 100 μm'lik bir nozul ile donatılmış bir akış sitometresinde işleyin (Tablo 1).
    2. Adım 1.4.1'de saklanan boyanmamış numuneye dayalı olarak çeşitli kapı boyutlarını belirleyin (Şekil 2).
    3. Hücre koleksiyonunu iyileştirmek için 5 mL'lik bir tüpü 1 mL saf fetal buzağı serumu (FCS) ile kaplayın ve 500 μL FACS tamponu ekleyin.
    4. Boyanmamış numuneyi antikor etiketli numune ile değiştirin.
    5. İleri saçılma alanına (FSC-A) ve yan saçılma alanına (SSC-A) göre ilgilenilen popülasyonu seçin (Şekil 3A) ve FSC-A ve ileri saçılma yüksekliğine (FSC-H) sahip çift hücreleri çıkarın (Şekil 3B)14.
    6. Sabitlenebilir canlılık lekesi negatif boyama ile canlı hücreleri tanımlayın (Şekil 3C).
    7. CD31, CD45, TER119 ve CD11b için negatif hücreleri seçin (Şekil 3D).
    8. Uydu hücrelerini tanımlamak için, önce CD34 ve ITGA7 için pozitif olan hücreleri seçin (Şekil 3E) ve ardından CD34 ve ITGA7 ile seçilen popülasyondaki CXCR4 pozitif hücreleri seçin (Şekil 3F).
    9. Seçilen hücreleri (preparatın kalitesine göre 40.000 ila 80.000 hücre arasında) 500 μL FACS tamponu içeren 5 mL kaplı tüpte toplayın.

2. İzole edilen popülasyonun doku kültüründe doğrulanması

  1. Hidrojel ile slayt kaplama
    1. 280 μL saf hidrojel insan embriyonik kök hücresi (hESC) nitelikli matrisi (Tablo 1) 12 mL serumsuz DMEM / F12 ortamında seyreltin.
    2. Bir hazne sürgüsünü (Tablo 1) hidrojel çözeltisiyle kaplayın ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    3. Ertesi gün, hücre tohumlamadan önce hazne slaytını 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin.
  2. Hücre büyümesi ve farklılaşması
    1. Kuyucuk başına adım 1.5.9'dan elde edilen yaklaşık 20.000 hücreyi plakalayın ve bunları 5 gün boyunca büyüme ortamında (Tablo 2) büyütün. Preparatın kalitesinden emin olmak için immünofloresan analizi için işlemeden önce parlak alan mikroskobu (Şekil 4A) kullanarak faz kontrastlı görüntüler alın (Şekil 4B).
    2. Miyogenezi indüklemek için, miyojenik ortamda (Tablo 2) adım 2.2.1'den 7 gün daha amplifiye edilmiş uydu hücrelerini büyütün. Preparatın kalitesinden emin olmak için immünofloresan analizi için işlemeden önce parlak alan mikroskobu (Şekil 4C) kullanarak faz kontrastlı görüntüler alın (Şekil 4D).
  3. İmmünositofloresan analizi
    1. Ortamı nazikçe çıkarın, hazne lamında kültürlenen hücreleri 100 μL 1x PBS ile iki kez yıkayın ve 1 saat boyunca RT'de 100 μL %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
      NOT: Bu adım dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Hücrelerin gerilmesini önlemek için haznede her zaman küçük bir hacimde ortam tutulmalı ve PBS haznenin duvarlarından dökülmelidir.
    2. Hücre zarlarını geçirgen hale getirmek için% 0.1 Tween 20 (PBST) ile desteklenmiş 100 μL 1x PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
    3. RT'de 1 saat boyunca% 5 FCS (PBST-FCS) ile desteklenmiş 100 μL 1x PBST'de inkübasyon yoluyla spesifik olmayan sinyalleri bloke edin.
    4. Uydu hücrelerini ve miyofiberleri tespit etmek için hücreleri 100 μL anti-PAX7 ve anti-distrofin (DMD) antikorlarının ana karışımı (1x PBST-FCS'de seyreltilmiş) ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    5. Hücreleri 100 μL 1x PBST ile üç kez yıkayın ve 100 μL keçi anti-fare Cy3 veya keçi anti-tavşan Alexa 488 sekonder antikorları ile inkübe edin (Tablo 3) 1x PBST-FCS'de 1 saat boyunca seyreltilmiş.
    6. Tedarikçi tarafından sağlanan ekipmanı kullanarak hazne kuyularını slayttan ayırın, 20',4-diamidino-6-fenilindol (DAPI) ile 2 μL sulu montaj ortamı ekleyin ve slaydı bir lamel ile kapatın (Tablo 1).
    7. Lekeli hücrelerin görüntüsünü konfokal mikroskopla gözlemleyin ve yakalayın.
    8. Görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntüleri işleyin (Şekil 4B,D).

3. CUT & RUN analizi

  1. FACS ile izole edilmiş uydu hücrelerinde CUT&RUN analizi için numune hazırlama
    NOT: CUT&RUN esasen açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir10,15. Tampon bileşimi şurada sunulur: Tablo 2.
    1. CUT & RUN testi için, test edilmesi gereken numune / antikor başına yöntem 1, adım 1.5.9'da elde edilen hücrelerin yaklaşık 40.000'ini kullanın.
    2. FACS ile izole edilmiş uydu hücrelerini RT'de 500 x g'de 10 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı bir pipet (20-200 μL uç hacmi) kullanarak atın.
    3. Hücreleri 1 mL 1x PBS ile yıkayın, RT'de 500 x g'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı bir pipet (0.2-1 mL uç hacmi) kullanarak atın ve 1 mL soğuk nükleer ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 2). 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.
    4. İnkübasyon sırasında, 850 μL soğuk bağlama tamponu içeren 1.5 mL'lik bir tüp hazırlayın (Tablo 2) ve numune başına 20 μL concanavalin A kaplı manyetik boncuk ekleyin (Tablo 1).
    5. Boncukları manyetik bir raf kullanarak 1 mL soğuk bağlama tamponu ile iki kez yıkayın (Tablo 1). Prosedür boyunca her yıkama veya tampon değişimi için, temizlenmiş süpernatanı bir pipetle (0,2-1 mL uç hacmi) çıkarmadan önce boncukların tüpün yanında manyetik rafta 5 dakika birikmesine izin verin. Ardından, 300 μL soğuk bağlama tamponunda hafifçe yeniden süspanse edin.
    6. Çekirdekleri 4 °C'de 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve 600 μL nükleer ekstraksiyon tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin. 600 μL ekstrakte edilmiş çekirdeği 300 μL concanavalin A boncuk bulamacı ile nazikçe karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    7. Adım 3.1.4'te açıklandığı gibi manyetik bir raf kullanarak süpernatanı çıkarın ve boncukla bağlı çekirdekleri 1 mL soğuk bloke edici tampon ile hafifçe yeniden süspanse edin (Tablo 2). RT'de 5 dakika inkübe edin.
    8. Süpernatanı manyetik bir raf kullanarak çıkarın ve boncukla bağlı çekirdekleri 1 mL soğuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın (Tablo 2). İkinci yıkama sırasında, boncukla bağlı çekirdekleri 1.5 mL'lik tüplere eşit olarak bölün. Her tüp, bir sonraki adımda spesifik bir antikor ile tedavi edilecektir.
      NOT: Bu örnekte, 250 μL boncuk bağlı çekirdek, dört adet 1.5 mL tüpe bölünmüştür.
    9. Süpernatanı adım 3.1.4'te açıklandığı gibi manyetik bir raf kullanarak ayırın ve bir pipetle aspire edin. Çekirdek/boncuk komplekslerini spesifik bir primer antikor (Tablo 3) veya 250 μL soğuk yıkama tamponu içinde seyreltilmiş başka bir türün IgG'si (burada tavşan) ile nazikçe yeniden süspanse edin. Hafif çalkalama ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
      NOT: Burada kullanılan antikorlar AR, H3K4me2 ve H3K27ac'ye yöneliktir.
    10. Süpernatanı adım 3.1.4'te açıklandığı gibi manyetik bir rafla çıkarın, boncuk bağlı çekirdekleri 1 mL soğuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve 100 μL soğuk yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.
    11. Protein A-mikrokok nükleazını soğuk yıkama tamponu numunesi başına 100 μL'de 1.4 ng / μL'de seyreltin.
    12. 3.1.11'de elde edilen 100 μL numuneye 100 μL protein A-mikrokok nükleaz ekleyin ve çalkalama ile 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    13. Süpernatanı adım 3.1.4'te açıklandığı gibi manyetik bir rafla çıkarın, 1 mL soğuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve boncuk bağlı çekirdekleri 150 μL soğuk yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.
    14. DNA bölünmesini başlatmak için, 150 μL numuneye 3 μL 100 mM CaCl2 ekleyin, hafifçe vurarak hızlı bir şekilde karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. 150 μL durdurma tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve RNA'yı sindirmek ve DNA parçalarını serbest bırakmak için 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    15. DNA ekstraksiyonu için, numuneleri 16.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    16. Süpernatanı yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın ve pelet ve boncukları atın.
    17. 3 μL %10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 2.5 μL 20 mg/mL proteinaz K ekleyin. 70 °C'de 10 dakika inkübe edin (çalkalamayın).
    18. 300 μL fenol/kloroform/izoamil alkol ekleyin, girdap yapın, 2 mL faz kilitli tüplere aktarın (16.000 x g'da 5 dakika önceden döndürülmüş) ve 4 ° C'de 16.000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
    19. Aynı tüpe 300 μL kloroform ekleyin ve 4 °C'de 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı (~ 300 μL) bir pipetle (0.2-1 mL uç hacmi) toplayın ve yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
    20. 1 μL glikojen (20 mg/mL konsantrasyon) ekleyin.
    21. 750 μL %100 etanol ekleyin ve gece boyunca -20 °C'de çökeltin.
    22. DNA'yı 4 ° C'de 16.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Peleti 1 mL %100 etanol ile yıkayın, 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın, 16.000 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve sıvıyı bir pipetle (20-200 μL uç hacmi) çıkarın.
    23. Peleti ~5 dakika havayla kurutun. 25 μL 1 mM Tris-HCl (pH 8) ve 0.1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA; pH 8) içinde yeniden süspanse edin.
  2. Biyoinformatik analizi
    1. İmmünokparçalanmış DNA'dan kütüphaneler hazırlayın ve bunları açıklandığı gibi genomik platformun yardımıyla eşleştirilmiş uç 100 bp okumaları olarak sıralayın16.
    2. ENCODE kara liste bölgesi (V2) ile çakışan okumaları kaldırın ve kalan okumaları iki gruba ayırın: parça boyutu <120 bp (nükleozom olmadan, genel olarak transkripsiyon faktörleri için) ve parça boyutu >150 bp (nükleozomlarla, normalde histon işaretleri için). Papyon 2 (v2.3.4.3)17 kullanarak mm10 referans genomuna eşleyin.
    3. bamCoverage ile bigwig dosyaları oluşturun (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Daha fazla analiz için benzersiz bir şekilde eşlenmiş okumaları saklayın.
    5. genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0) ile ham bedgraph dosyaları oluşturun.
    6. Yoğun arama için SEACR 1.3 algoritmasını (sıkı seçenek) kullanın. Hedef veri bedgraph dosyasını, sıfır sinyal içeren bölgeleri atlayan UCSC bedgraph biçiminde yükleyin ve tepe çağrısı18 için ampirik bir eşik oluşturmak üzere kontrol (IgG) veri bedgraph dosyasını kontrol edin.
    7. Örnekler arasındaki benzerliği belirlemek için derin araçlarla bir Pearson korelasyon analizi yapın19. Komut satırını kullanın multiBamSummary bölmeleri --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, ardından plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Okuma Sayılarının Pearson Korelasyonu" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Genom çapında yoğunluk profillerini IGV20 ile yatak grafiği dosyalarını ve SEACR'den elde edilen yatak dosyası piklerini kullanarak görselleştirin.
    9. Tepe açıklama ve motif araması için HOMER'ı kullanın21.
    10. Son olarak, IGV'de görselleştirmek için veri kümelerini ChIP-Atlas Peak tarayıcısıyla daha önce yayınlanmış olanlarla karşılaştırın ve/veya SEACR tarafından oluşturulan yatak dosyalarını girdi veri kümesi olarak kullanarak zenginleştirme analiziyapın 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare iskelet kaslarından uydu hücreleri, Gunther ve ark. (bundan sonra Protokol 1)12 ve Liu ve ark.23 (bundan sonra Protokol 2 olarak anılacaktır). Protokol 1'de önerilen kollajenaz ve dispas konsantrasyonu kullanılırken sindirimden sonra sindirilmemiş kas lifleri gözlendiğinden, adım 1.2.1 ve 1.2.3'te açıklandığı gibi kas lifi ayrışmasını iyileştirmek için enzim miktarı arttırılmıştır. Protokol 2'de belirtildiği gibi, numuneler hücre canlılığını korumak için bir su banyosunda hafif bir çalkalamaya tabi tutuldu. Protokol 1'de belirtildiği gibi hücre süzgeçlerinden filtrasyon ve kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile inkübasyon gerçekleştirdik (bkz. adım 1.2.7 ila 1.2.10). Protokol 1'de, hücreler, interfazda tek çekirdekli hücreleri izole etmek için% 30 /% 70'lik bir Percoll yoğunluk gradyanına yüklendi, bu da ilgilenilen hücrelerin kaybına yol açmış olabilir. Bu nedenle, Protokol 2'de önerildiği gibi bu adım atlanmıştır.

FSC-A'ya karşı SSC-A geçitleme, boyut (FSC) ve tanecikliliğe (SSC) dayalı olarak tek çekirdekli hücreleri tanımlamak için kullanıldı (Şekil 3A). FSC-A ekseninde 40 K'nın altındaki olaylar göz ardı edilerek enkaz dışlandı ve hücrelerin %38.8'i ± %3.6'sı seçildi. Çift dışlama için FSC-A ve ileri saçılma yüksekliği (FSC-H) geçit yoğunluğu grafikleri kullanılmıştır (Şekil 3B). Sabitlenebilir canlılık leke kalemi için negatif hücreler seçildikten sonra, canlı hücrelerin ortalama %34.3 ± %7.7'si elde edildi (Şekil 3C).

Şekil 3C'deki nokta grafiğinde gösterilen yüzde, %75.4, bu durumda tekler olan ana hücre popülasyonundan hesaplanan tek canlı hücrelerin yüzdesine karşılık gelir. Tek hücrelerin %95,7'si, toplam olayların %35'ini oluşturan canlı olaylardan elde edilir. Bu nedenle, ortalama olarak elde edilen %34,3'lük yüzde, ana popülasyonlardan değil, toplam olaylardan hesaplanır.

Tek canlı hücrelerin yaklaşık% 3'ü lökosit- (CD45), monosit- (CD11b), endotelyal- (CD31) ve eritroid spesifik (TER119) belirteçler için negatifti (Şekil 3D). CD11b/CD45/CD31/TER119 negatif hücreler daha sonra CD34 (hematopoietik, endotelyal progenitörler ve mezenkimal kök hücreler) ve ITGA7 (kardiyak, düz ve iskelet kası hücreleri) belirteçlerinin ekspresyonlarına göre seçildi (Şekil 3E). Varsayılan uydu hücrelerini seçmek için CXCR4 (lenfositler, hematopoietik ve uydu hücreleri) için son bir geçit yapıldı (Şekil 3F). CD34 + / ITGA7 + hücrelerinden ~% 80'inin, toplam tek canlı hücrelerin ortalama% 1 ±% 0.15'ini temsil eden CXCR4 için pozitif olduğu ve 14 bağımsız deney arasında fare uzuv kasları başına mutlak 60.000 ± 14.000 varsayılan uydu hücresi olduğu bulundu. CXCR4+ hücre fraksiyonu üzerinde yapılan ek bir başvuru değerlendirmesi, canlı hücrelerin yaklaşık %80'inin son ayıklamadan sonra elde edildiğini ve bunların neredeyse %70'inin CXCR4+ olduğunu ortaya koydu (Şekil S1), bu FACS ile izole edilmiş hücre popülasyonunun yüksek canlılığını ve saflığını gösteriyor.

Kollajenaz ve Liberaz TL enzimlerinin hücre izolasyonu için etkinliği çeşitli çalışmalardakarşılaştırıldığından 24,25, bu iki sindirim yöntemi paralel olarak işlenmiştir. 300 μL Liberase TL ile sindirilmemiş lifler kaldığı için sindirim kollajenazdan daha az verimliydi. Ek olarak, daha fazla hücre kalıntısı ve büyük olaylar gözlendi (Şekil S2A,B) ve FVS 780 seçiminden sonra ortalama olarak tek canlı hücrelerin sadece% 17.3'ü elde edildi (Şekil S2C). Liferaz sindirimi ile ilgili ek bir endişe, CXCR4 kapısı benzer olmasına rağmen (Şekil S2F) kollajenaza kıyasla CD34+/ITGA7+ hücrelerinin sayısının düşük olmasıydı (Şekil S2D-S2E). 600 μL Liberase TL ile sindirim daha verimliydi. Bununla birlikte, hücre enkazı miktarı yüksek kaldı ve hücre canlılığı standartların altında (% 16.3) (Şekil S3). Bu nedenle, Liberase TL ile sindirim, uydu hücre izolasyonu için daha az verimliydi.

Tohumlandığında, CD34+/ITGA7+/CXCR4+ hücrelerinin (Şekil 4A) %70'inden fazlası, PAX7-negatif olan CD34+/ITGA7-/CXCR4- hücrelerinin aksine PAX7'yi (Şekil 4B) eksprese etti (Şekil 4C). CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + hücreleri, distrofin (DMD) boyama ile gösterildiği gibi, 7 ek gün boyunca miyojenik bir ortamda büyütüldüğünde miyoliflere farklılaşabildi (Şekil 4D), miyojenik potansiyellerini doğruladı. Bu nedenle, kombine doku kültürü ve immünofloresan analizleri, FACS izole CD34+/ITGA7+/CXCR4+ hücrelerinin uydu hücreler olduğunu gösterdi.

İzole edilmiş uydu hücrelerinin CUT&RUN analizi için uygun olup olmadığını belirlemek için, aktif promotör ve arttırıcı bölgelerde bulunan iki histon modifikasyonu olan histon H3'ün asetillenmiş lizin 27 (H3K27ac) ve dimetillenmiş lizin 4'ün (H3K4me2) genomik profili belirlendi. Verilerimiz, iki histon işareti arasında benzer bir genomik yeniden bölümleme ile H3K4me2 ve H3K27ac için sırasıyla 68.694 ve 13.514 tepe noktası ortaya çıkardı (Şekil S4A). Ayrıntılı olarak, piklerin dörtte birinin en yakın genin transkripsiyon başlangıç bölgesinden (TSS) 2 kb ± yer aldığını, çoğunluğun -100 kb ila -10 kb veya TSS'den 10 kb ila 100 kb arasında yer aldığını bulduk (Şekil S4B). Pearson analizi, H3K27ac ve H3K4me2 okuma profilleri arasında %80'lik bir korelasyon gösterdi (Şekil S4C). Yukarıda belirtilen protokolden hazırlanan kromatinin uydu hücrelerinden izole edildiğini değerlendirmek için, uydu hücresine özgü genlerin promotöründe H3K27ac ve H3K4me2'nin varlığı belirlendi. H3K4me2, Pax7, Itga7, Lamb2, Cxcr4 ve Vcam1'in TSS'si etrafında zenginleştirilmiştir (Şekil 5A), ancak Itgam (CD11b) ve Ptprc (CD45) (bağışıklık hücreleri), Pecam (CD31; endotel hücreleri) (Şekil 5B), Ckm (gelişmekte olan kas lifleri) veya Myh3 (miyozin ağır zincirli hızlı embriyonik, miyolifler) (Şekil 5C). H3K27ac ile benzer sonuçlar elde edildi (Şekil 5). IgG örneği ile neredeyse hiç sinyal elde edilmedi (Şekil 5). Ayrıca, SEACR'den elde edilen H3K27ac tepe noktalarının, yayınlanmış ChIP-seq veri kümelerinden MACS2 tepe çağrısından kaynaklananlarla karşılaştırılması, her panelin altında belirtildiği gibi yüksek bir korelasyon göstermiştir (ChIP-Atlas izi; Şekil 5). Birlikte, bu sonuçlar, biyoinformatik analizinden sonra elde edilen okumaların, FACS ile izole edilmiş uydu hücrelerinin kromatininden kaynaklandığını ve daha önce ChIP-seq analizleriyle tanımlananlarla ilişkili olduğunu göstermektedir.

Fare uydu hücrelerinde tek hücreli RNA dizileme çalışmaları, izolasyon prosedürünün neden olduğu çarpıcı bir stres tepkisi gösterirken,26, Atf3, Azin1, Gls ve Elf2 ile örneklendiği gibi, stres tepkisi genlerinde H3K4me2 veya H3K27ac'nin varlığı belirlendi. Sonuçlar, H3K27ac işaretinin bu tür genlerin promotöründe birikmediğine ve H3K4me2 seviyelerinin uydu hücresine özgü genler için elde edilenlere kıyasla düşük kaldığına dair kanıt sağlar (Şekil S5). Bu nedenle, bu veriler izolasyon prosedürünün ne kadar hafif olduğunu vurgulamaktadır.

Daha sonra izolasyon yöntemimizin transkripsiyon faktörlerine uygunluğu incelenmiştir. Nükleer reseptörler süper ailesine ait olan ve miyojenik farklılaşmada önemli bir rol oynayan bir transkripsiyon faktörüolan androjen reseptörü (AR) için CUT & RUN analizi 27, 7.840 zirveyi çözdü. Bu pikler esas olarak intron ve intergenik bölgelerde (Şekil S4A), -100 kb ila -10 kb veya TSS'den 10 kb ila 100 kb (Şekil S4B) olarak yerleştirilmiştir. Filogenetik analizler, AR'nin, glukokortikoid (GR/Nr3c1), mineralokortikoid (MR/Nr3c2) ve progesteron (PR/Nr3c3) reseptörlerinin yanı sıra, üç baz çifti ile ayrılmış iki 5′-RGAACA-3′ palindromik yarı bölgeden oluşan DNA segmentlerine homodimer olarak bağlanan oksosteroid nükleer reseptörler alt ailesinin 28 bir üyesi olduğunu ortaya koymuştur 29. Motif zenginleştirmenin hipergeometrik optimizasyonu (HOMER, http://homer.ucsd.edu/homer/) yoluyla bilinen bir motifin araştırılması, AR'nin 5'-RGRNCA-3' AR yarı bölge motifine, tipik 5'-RGNACAnnnTGTNC-3' oksosteroid motifine (şekilde PR olarak anılır) ve hedeflenen bölgelerin %>32, %17 ve %2'sinde 5'-RGNACAnnnTGTNCY-3' AR konsensüs motifine bağlı olduğunu ortaya çıkardı. sırasıyla (Şekil 6A). İskelet kası16'daki glukokortikoid reseptörü için daha önce benzer oranların elde edildiğine dikkat edilmelidir.

SEACR analizi, en yüksek puana >50 olan yaklaşık 500 zirveyi ortaya çıkardı ve bunların 200'den fazlası >100 puanla; bunlardan bazıları Şekil 6B'de örneklenmiştir. Analizimiz ayrıca, poliamin biyosentezinde (Amd1, Yulaf ve Smox) ve prostat kanserinde (Acox1, Fkbp5 ve Tmprss2) yer alan genlerin daha önce tarif edilen bağlanma bölgelerinde mütevazı bir AR zenginleşmesini ortaya çıkardı (Şekil S6). İlginç bir şekilde, AR, uydu hücre sapında (Pax7, Cxcr4 ve Cd34) yer alan genlerin lokuslarında bulundu (Şekil S7). Dikkat çekici bir şekilde, bu AR ile zenginleştirilmiş bölgelerin her birinde oksosteroid yanıt elemanı bulundu (Şekil S6 ve Şekil S7), bu da CUT & RUN verilerinde görülen AR sinyalinin oldukça spesifik olduğunu gösterdi.

Figure 1
Şekil 1: Fare uzuv kaslarından uydu hücresi izolasyonu için kullanılan protokolün şematik gösterimi. Protokol dört ana adımdan oluşur. Kısaca fareler sakrifiye edilir ve arka bacak kasları toplanır (adım 1.1.1-1.1.3) ve makas kullanılarak mekanik olarak kıyılır (adım 1.4-1.5). Bunu, kollajenaz ve dispas kullanılarak bir su banyosunda kasların ayrıştırıldığı 1.2.1-1.2.4 adımları takip eder. Adım 1.2.5-1.2.8'de, hücre süspansiyonu art arda 100, 70 ve 40 μm hücre süzgeçlerinden süzülür ve eritrositler kırmızı kan hücresi lizis tamponu kullanılarak elimine edilir (adım 1.2.9-1.2.12). Kalan hücre popülasyonları, adım 1.3'te, spesifik hücresel fenotipik belirteçlere karşı yönlendirilen floroforlara bağlı antikorlarla etiketlenir. Adım 1.4, daha fazla uygulama için uydu hücrelerini toplamak üzere FACS'den geçen örnekleri içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Boyanmamış bir hücre preparatının akış sitometrisi analizi. (A) FSC-A ve SSC-A parametrelerine dayalı olarak ilgilenilen popülasyonun seçimi. (B) FSC-A ve FSC-H'ye dayalı tek hücre tanımlaması. (C) Ölü hücreleri işaretleyen sabitlenebilir canlılık boyasına (FVS 780) konjuge APC-Cy7 için toplanan hücrelerin oto-floresan eşiğinin karakterizasyonu. (D-F). CD11b antikoruna konjuge PE-Cy7 ve TER119/CD45/CD31 belirteçlerine (D) konjuge PE-konjuge ve ayrıca ITGA7'ye konjuge Alexa fluor 488, CD34 (E) ile konjuge Alexa fluor 405 ve CXCR4 (F) ile konjuge APC florokrom için oto-floresan ölçümü. Kapılar kara kutular olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Uydu hücresi sıralaması için akış sitometresi geçit stratejisi. (A) FSC-A ve SSC-A parametrelerine dayalı olarak ilgilenilen popülasyonun seçimi. (B) FSC-A ve FSC-H'ye dayalı tek hücre tanımlaması. (C) Canlı hücrelerin FVS 780 ile tanımlanması. (D) CD11b, CD31, CD45 ve TER119 antijenlerine dayalı negatif hücre seçimi. (E-F) CD34 ve ITGA7 (E) ile CXCR4 (F) antijenlerine dayalı pozitif hücre seçimi. Kapılar kara kutular olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: FACS ile izole edilmiş CD34+/ITGA7+/CXCR4+ ve CD34+/ITGA7-/CXCR4- hücrelerinin analizi. (A) Büyüme ortamında kültürlenen CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + ve CD34 + / ITGA7- / CXCR4- hücrelerinin faz kontrast görüntüleri. (B) PAX7 (kırmızı) ve distrofine (DMD, yeşil) karşı yönlendirilmiş antikorlar kullanılarak büyüme ortamında kültürlenen CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + ve CD34 + / ITGA7- / CXCR4- hücrelerinin immünofloresan analizi. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Macenta oklar PAX7 pozitif hücreleri gösterir. (C) CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + hücrelerinin faz kontrast görüntüleri, büyüme ortamında 5 gün boyunca (sol panel) ve miyojenik ortamda (sağ panel) 7 gün daha büyütüldü. (D) PAX7 (kırmızı) ve distrofine (DMD, yeşil) karşı antikorlar kullanılarak büyüme ortamında (sol panel) 5 gün ve miyojenik ortamda (sağ panel) 7 gün daha büyütülen CD34 + / ITGA7 + / CXCR4 + hücrelerinin immünofloresan analiz görüntüleri. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Macenta oklar PAX7 pozitif hücreleri gösterir. Yeşil oklar DMD pozitif hücreleri gösterir. Ölçek çubukları: parlak alan panelleri = 25 μm; immünofloresan paneller = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Uydu hücre kromatininin genomik profilleri. H3K4me2 ve H3K27ac'nin uydu hücrelerine özgü genlerde (A), immün ve endotel hücresine özgü genlerde (B) ve miyofibere özgü genlerde (C) uydu hücrelerinin kromatininde CUT&RUN ile lokalizasyonu. Aktif destekleyiciler yeşil renkte, etkin olmayan destekleyiciler ise kahverengi renkte kutulanır. Negatif kontrol olarak IgG ile yapılan CUT&RUN kullanıldı. Histon işaretleri için H3K27ac zenginleştirme analizi her yolun altında sunulmaktadır. Yayımlanan veri kümelerinin güvenilirlik düzeylerini gösteren zenginleştirme puanı, bir ısı haritası olarak gösterilir. Kahverengi yıldızlar (*) kas uydu hücrelerinde gerçekleştirilen H3K27ac ChIP-seq zirvelerini, mavi yıldızlar H3K4me3'ü ve pembe yıldızlar H4K16me1'i ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Uydu hücresi kromatininde AR genomik dağılımı . (A) Uydu hücrelerindeki AR piklerinin HOMER tarafından bilinen motif analizi. PR: progesteron reseptörü. Nb hedefi, belirli bir motifi sunan tepe noktalarının sayısını ifade eder. (B) CUT & RUN tarafından belirlenen uydu hücrelerinin kromatini üzerinde belirtilen genlerde H3K4me2 ve AR'nin lokalizasyonu. Negatif kontrol olarak IgG ile yapılan CUT&RUN kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Malzemelerin, reaktiflerin ve yazılımların listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Tampon bileşimleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Antikor referansları ve konsantrasyonları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Sıralama sonrası hücre preparatının akış sitometrisi analizi. (A) FSC-A ve SSC-A parametrelerine dayalı olarak ilgilenilen popülasyonun seçimi. (B) FSC-A ve FSC-H'ye dayalı tek hücre tanımlaması. (C) Sabitlenebilir canlılık lekesi (FVS 780) ile canlı hücrelerin tanımlanması. (D) CD11b, CD31, CD45 ve TER119 antijenlerine dayalı negatif hücre seçimi. (E-F) CD34 ve ITGA7 (E) ile CXCR4 (F) antijenlerine dayalı pozitif hücre seçimi. Kapılar kara kutular olarak temsil edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: 300 μL Liberaz TL ile sindirimden sonra uydu hücresi sıralaması için akış sitometresi geçit stratejisi. (A) FSC-A ve SSC-A parametrelerine dayalı olarak ilgilenilen popülasyonun seçimi. (B) FSC-A ve FSC-H'ye dayalı tek hücre tanımlaması. (C) Canlı hücrelerin FVS 780 ile tanımlanması. (D) CD11b, CD31, CD45 ve TER119 antijenlerine dayalı negatif hücre seçimi. (E-F) CD34 ve ITGA7 (E) ile CXCR4 (F) antijenlerine dayalı pozitif hücre seçimi. Kapılar kara kutular olarak temsil edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: 600 μL Liberaz TL ile sindirimden sonra uydu hücresi sıralaması için akış sitometresi geçit stratejisi. (A) FSC-A ve SSC-A parametrelerine dayalı olarak ilgilenilen popülasyonun seçimi. (B) FSC-A ve FSC-H'ye dayalı tek hücre tanımlaması. (C) Canlı hücrelerin FVS 780 ile tanımlanması. (D) CD11b, CD31, CD45 ve TER119 antijenlerine dayalı negatif hücre seçimi. (E-F) CD34 ve ITGA7 (E) ile CXCR4 (F) antijenlerine dayalı pozitif hücre seçimi. Kapılar kara kutular olarak temsil edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: H3K4me2, H3K27ac ve AR genomik konumlarının karakterizasyonu. (A) Uydu hücrelerindeki genom özelliklerine göre H3K4me2, H3K27ac ve AR'nin tepe dağılımını gösteren pasta grafikleri. (B) H3K4me2, H3K27ac ve AR'nin uydu hücrelerindeki en yakın TSS'ye olan uzaklıklarına göre tepe dağılımını gösteren pasta grafikleri. (C) H3K4me2, H3K27ac ve IgG kontrolü arasındaki Pearson korelasyonunu gösteren ısı haritası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Strese yanıt ile indüklenen genlerde uydu hücre kromatininin genomik profilleri. H3K4me2 ve H3K27ac'nin uydu hücrelerinin kromatini üzerinde belirtilen genlerde lokalizasyonu. IgG ile immünopresipitasyon negatif kontrol olarak kullanıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: Bilinen AR hedef genlerinde uydu hücre kromatininin genomik profilleri. H3K4me2, H3K27ac ve AR'nin CUT & RUN tarafından belirlenen uydu hücrelerinin kromatini üzerinde belirtilen genlerde lokalizasyonu. AR tepe noktaları mavi renkle kutulanmıştır ve karşılık gelen AR'ye duyarlı öğeler aşağıda sunulmuştur. Negatif kontrol olarak IgG ile yapılan CUT&RUN kullanıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 7: Seçici olarak eksprese edilen genlerinde uydu hücre kromatininin genomik profilleri. H3K4me2, H3K27ac ve AR'nin CUT & RUN tarafından belirlenen uydu hücrelerinin kromatini üzerinde belirtilen genlerde lokalizasyonu. AR tepe noktaları mavi renkle kutulanmıştır ve karşılık gelen AR'ye duyarlı öğeler aşağıda sunulmuştur. Negatif kontrol olarak IgG ile yapılan CUT&RUN kullanıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışma, fare uydu hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için standartlaştırılmış, güvenilir ve gerçekleştirmesi kolay bir yöntemin yanı sıra CUT & RUN yöntemi ile transkripsiyonel regülasyonun değerlendirilmesini bildirmektedir.

Bu protokol birkaç kritik adımı içerir. Birincisi, çok sayıda toplanan hücreyi sağlamak için kas bozulması ve lif sindirimidir. Artan enzim konsantrasyonuna rağmen, Protokol 1 kullanılandan daha fazla canlı hücre elde edildi. Uydu hücreleri, çeşitli zar proteinlerinin belirli bir modelini ifade eder. Sıralamamızın sıkılığını artırmak için, daha önce tanımlanmış negatif (CD31, TER119, CD45 ve CD11b) ve pozitif (CD34, ITGA7 ve CXCR4) uydu hücresi belirteçlerinin bir kombinasyonunu kullandık30,31. Bu strateji kullanılarak, yaşayan varsayılan uydu hücrelerinin ortalama% 1'i elde edildi. Uydu hücreleri, farelerde yetişkinlikte kas hücresi popülasyonunun% 2-7'sini temsil ettiğinden, bu sonuç beklenenin aralığındadır32. Uydu hücre seçim belirteçleri için bir kontrol olarak, CD34+/ITGA7-/CXCR4- hücreleri izole edildi. İmmünofloresan boyama, CD34+/ITGA7-/CXCR4- hücrelerinin PAX7'yi eksprese etmediğini, CD34+/ITGA7+/CXCR4+ sıralanmış hücrelerin %70'inin bu uydu hücresine özgü belirteç için pozitif olduğunu gösterdi, böylece FACS izole popülasyonunun uydu hücrelerine karşılık geldiğini gösterdi. Ek olarak, 7 gün boyunca miyojenik ortamda büyütülen uydu hücrelerinin %70'i, immün boyama ile gösterildiği gibi PAX7- / DMD+ idi ve izole edilmiş uydu hücrelerinin kök potansiyellerini koruduğunu gösteren uzun çok çekirdekli bir miyofiber oluşturdu.

Numune hazırlamadaki en büyük sınırlama, büyük miktarda ayrışmış biyolojik materyal ile sonuçlanan, ancak hücre ölümünün artmasına katkıda bulunabilecek yüksek konsantrasyonda enzimlerin kullanılması olabilir. Bu sorunu çözmek için, daha düşük enzim miktarı gerektiren bir test test edildi. Bu bağlamda, geleneksel kollajenaz33'ün saflaştırılmış bir formu olan Liberaz TL test edilmiştir. Sindirim bu enzimle görünüşte daha verimli olmasına rağmen, hücre kalıntısı miktarı yüksek kaldı ve hücre canlılığı biraz azaldı. Bu gözlemler, Liberaz aracılı doku sindirimini rekombinant kollajenaz veya özel kollajenaz24,25 ile karşılaştıran önceki raporlarla uyumludur. Ek olarak, endotel ve bağışıklık hücrelerinin oranı kollajenaz ve Liberaz sindirimi arasında benzer olsa da, Liberaz ile işlenmiş numunede uydu hücrelerinin yüzdesi daha düşüktü ve genel olarak Liberaz'ın uydu hücre izolasyonu için önerilmediğini gösterdi. Bu enzimin kullanımı, bağışıklık hücrelerinin fenotipik ve kantitatif analizi için uygundur ve sonunda kas ve / veya diğer dokular bağlamında önerilebilir. Bu, canlı bağışıklık hücrelerini etkili bir şekilde izole etmek için en uygun olarak Liferaz TL'de bildirilenlerle uyumludur34,35,36.

Diğer bir potansiyel sorun, uydu hücrelerinin hem ayrıştırılmasının hem de sıralanmasının neden olduğu strestir. Bununla birlikte, fare uydu hücrelerinde26 tek hücreli RNA dizilimi ile tanımlanan stres yanıtı genlerinin promotör bölgesinde H3K27ac'nin yokluğu ve düşük H3K4me2 seviyeleri, prosedürün stres tepkisi transkripsiyonel repertuarını indüklemeyecek kadar hafif olduğunu göstermektedir. Dikkat edilmesi gereken diğer sınırlamalar, ampirik kalan seçilmiş antijenlerdir. Bununla birlikte, çalışmalar, iskelet kası uydu hücreleri için zenginleştirilmiş benzersiz yüzey işaretleyici kombinasyonları arasında yüksek bir örtüşme olduğunu göstermektedir30,31.

Ek bir kritik adım, çekirdeklerin sıralanmış hücrelerden saflaştırılmasıdır. Bunun için, hücrelere zarar vermemek için sıralama hızı düşük tutulur, ancak FACS tamponunda çok uzun süre saklanmayacak kadar hızlıdır. Gerçekten de, CUT&RUN çekirdekleri sabit değildir ve daha uzun bir inkübasyon süresi, protokolden elde edilen okumayı etkileyebilir. Bir farenin iki arka uzvundan elde edilen tipik bir preparat, her biri için 2,5 ng kromatin miktarı ile bir antikor ve bir IgG kontrolü ile CUT & RUN'a izin verir.

Transkripsiyon faktörü bağlanmasını ve epigenetik modifikasyonları değerlendirmek için tasarlanan CUT & RUN deneyleri, H3K4me2 ve H3K27ac için güçlü ve sağlam okuma sinyalleri sağladı. Uydu hücrelerinde eksprese edildiği bilinen genler üzerindeki H3K4me2 ve H3K27ac'nin yüksek okuma seviyeleri, immün veya endotel hücrelerinde ve ayrıca miyofiberlerde eksprese edilen genlerle karşılaştırıldığında, sinyalin ağırlıklı olarak uydu hücre çekirdeklerinden amplifiye edildiğini gösterdi. Ek olarak, bu protokol, kas kök hücrelerinde AR sistromunun tanımlanmasını mümkün kılmıştır, bu da bugüne kadar fare AR antikorlarının düşük kalitesi ve epitelyal prostat hücreleri gibi yüksek androjene duyarlı olmayan hücrelerdeki düşük AR ekspresyon seviyelerine özgü teknik bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada sunulan veriler, yüksek güven zirve puanlarına sahip AR'ye bağlı bölgeleri ortaya çıkardı. Başlangıçta antikor başına yalnızca bir kopya değerlendirildiğinden, veri kümelerimizin sağlamlığı, koşul başına en az iki ek biyolojik kopya eklenerek geliştirilecektir. Bununla birlikte, AR bilinen hedef genler ve orijinal olarak prostat gibi diğer doku bağlamlarında yüksek oranda eksprese edilen ve/veya kolayca tespit edilebilen ilgili histon işaretleri, daha düşük ekspresyon seviyeleri sunar ve uydu hücrelerinde tespit edilmesi çok zordur.

CUT&RUN yaklaşımının bir sınırlaması, sabitlenmemiş hücrelerde gerçekleştirilmesidir. Bu nedenle, transkripsiyon faktörleri ve bağlanma bölgeleri arasındaki etkileşimlerin kararsız doğası nedeniyle bazı AR hedeflerini kaçırmış olabiliriz. Benzer şekilde, asetilasyon gibi bazı translasyon sonrası modifikasyonlar da oldukça kararsız olabilir. Bu nedenle, formaldehit veya paraformaldehit ile bir ışık fiksasyon adımı dahil olmak üzere, FACS sıralamasından sonra ve çekirdekleri izole etmeden önce, protein / DNA etkileşimlerini ve histon modifikasyonlarını stabilize etmek için düşünülebilir.

Bu makale, CUT&RUN testlerinin FACS ile izole edilmiş uydu hücreleri üzerinde yapılabileceğini gösterse de, ATAC-seq gibi sabit olmayan kromatin kullanan diğer analizler de yapılabilir. Ek olarak, burada kaslar bazal fizyolojik koşullarda alınmış olsa da, bu protokol yaralanma veya yaşlanma gibi patolojik bağlamlara uygulanabilir. Tüm bu protokol kullanımları, uydu hücrelerindeki gen düzenleyici mekanizmaların ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlayacak ve bu mekanizmaların patofizyolojik koşullar tarafından nasıl değiştirilebileceğini anlamada yardımcı olabilir.

Özetle, bu düşük maliyetli ve zaman açısından verimli protokol, iskelet kası öncü hücrelerinde transkripsiyon faktörü alımını ve kromatin manzarasını incelemek için etkili bir deneysel ortam sağlar. Bu protokol ile hazırlanan kromatin, uydu hücrelerinde AR sistromunun ilk genom çapında analizini sağlamıştır ve gen regülasyonu ile ilgili gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Mükemmel teknik yardım sağladığı için Anastasia Bannwarth'a teşekkür ederiz. IGBMC hayvan barınağı tesisine, hücre kültürüne, Fare Klinik Enstitüsü'ne (ICS, Illkirch, Fransa), görüntülemeye, elektron mikroskobuna, akış sitometrisine ve 'France Génomique' konsorsiyumunun (ANR-10-INBS-0009) bir üyesi olan GenomEast platformuna teşekkür ederiz.

Strazburg Üniversitesi, CNRS ve Inserm'in ITI 2021-2028 programının bir parçası olarak Disiplinlerarası Tematik Enstitüsü IMCBio'nun bu çalışması, Geleceğe Yönelik Fransız Yatırımları Programı çerçevesinde IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ve SFRI-STRAT'US projesi (ANR 20-SFRI-0012) ve EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) tarafından desteklenmiştir. INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon stratejik programı 24376 (DD'ye), INSERM genç araştırmacı hibesi (DD'ye), ANR-10-LABX-0030-INRT ve ANR tarafından Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02) çerçeve programı kapsamında yönetilen bir Fransız Devlet fonu tarafından ek finansman sağlandı. J.R., Université franco-allemande ve Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation'dan CDFA-07-22 Programı ve K.G. Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Tags

CUT&RUN Analizi FACS İzoleli Fare Uydu Hücreleri Kök Hücre Alanı Küçük Hücre Popülasyonları Verimli Protokol Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralama Uzuv Kası Yapısal Proteinler Kıyma Ortam Dispas Tip I Kollajenaz Hücre Süzgeçleri FACS Tamponu Canlılık Boyası İmmün Lekeli Uydu Hücreleri Triton X-100 Concanavalin A Manyetik Boncuklar Transkripsiyon Faktörü Histon Modifikasyonları Protein A-mikrokok Nükleaz Kromatin Bölünmesi CaCl2 DNA Ekstraksiyonu Kütüphaneler Biyoinformatik Analiz
FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&amp;RUN Analizi için Etkili Bir Protokol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C.,… More

Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter